CN104655848B - 检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用，特点是捕获探针为Fe₃O₄@β‑CD、信号探针为胶体铂颗粒和多聚酶螯合物PV的复合物，其制备方法包括Fe₃O₄‑NH₂的制备步骤；捕获探针Fe₃O₄@β‑CD的制备步骤；PtNPs的制备步骤；PtNPs/PV信号标签的制备步骤；免疫复合物的制备步骤；得到的免疫复合物中加入DAB的A液和B液各50µL，避光孵育15‑30min，所得到的DAB显色产物通过酶标仪测定吸光度，根据相应吸光值与莱克多巴胺浓度的关系描绘标准曲线，并根据该标准曲线确定待测样品中莱克多巴胺的浓度，优点是是灵敏度高、选择性强、准确性高且检测速度快。

Description

检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及莱克多巴胺检测技术，尤其是涉及一种基于Fe₃O₄@β-CD作为捕获探针、PtNPs/PV作为信号探针的用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

β₂受体激动剂(β-adrenergic agonists)因可缓解哮喘症状,从而常被用作兽药；然而由于其能增长肌肉、减少脂肪蓄积等也常被添加到饲料中。莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)作为β₂受体激动剂的一员是一种人工合成的克仑巴安，正被作为一种新型瘦肉精在一些养猪场使用。我国农业部、卫生部、国家食品药品监督局联合发布的《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中规定禁止莱克多巴胺作为生长促进剂在饲料中使用。因此，亟需一种快速、高灵敏的莱克多巴胺痕量残留检测方法作为保证食品安全的重要手段。

目前，大量的检测手段已经研究并用于莱克多巴胺的检测，其中较精确可靠的如气相色谱(GC)、液相色谱(LC)以及它们与质谱联用(GC-MS、LC-MS)。但它们都存在仪器操作复杂、仪器昂贵、耗时长等问题，这些问题使得它们很难用于现场快速筛查。快速检测试纸条虽然方便但仅能做到定性，不能定量。同时，传统的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒一般使用竞争法，虽然快捷有效，但仍存在检测限太高、假阳性等缺点。目前国内外还没有公开任何关于利用Fe₃O₄@β-CD作为捕获探针、PtNPs/PV复合物作为酶标抗体用于检测莱克多巴胺的免疫比色法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、准确性和灵敏度高、特异性强且易于操作的用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板和信号探针，所述的酶标板内含有莱克多巴胺抗原和捕获探针Fe₃O₄@β-CD，所述的信号探针为负载了大量PtNPs的PtNPs/PV的复合物，标准品为莱克多巴胺标准品，抗体工作液为抗莱克多巴胺抗体单克隆抗体，显色液为DAB显色体系中的A液和B液，终止液为2M HCl或者2M H₂SO₄，洗液是PBST缓冲液。

一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：

(1)Fe₃O₄-NH₂的制备

将无水醋酸钠、己二胺(1,6-hexanediamine)和FeCl₃·6H₂O混合后加入到乙二醇中，于42-60℃条件下搅拌得到铁源溶液，将铁源溶液转移到马弗炉中，于195-205℃条件下反应6-8h后，用磁铁分离，再分别用水和乙醇冲洗2-3次，除去未完全反应的溶剂，得到粒径为15-25nm的Fe₃O₄-NH₂磁性纳米颗粒；

(2)Fe₃O₄@β-CD的制备

将羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)添加到含羧甲基化β-环糊精(carboxymethyl-β-CD，CM-β-CD)质量浓度为1wt％的PBS溶液(pH＝7.4)中，在室温下搅拌过夜后(以活化β-环糊精上的羧甲基)，再加入步骤(1)制备得到的Fe₃O₄-NH₂磁性纳米颗粒，连续搅拌5-7h后，用磁铁分离，再用去离子水反复清洗，以除去未反应的化学物质，得到的Fe₃O₄@β-CD；

(3)PtNPs的制备

将2ml 1wt％的氯铂酸溶液加入到烧杯中轻搅4-6min后，迅速加入5ml 10mmol/L的硼氢化钠溶液还原，室温下剧烈搅拌，反应结束后通过于10000-12000r/min离心15-25min除去杂质，水洗至少3次后定容至2ml得到PtNPs溶液，在4℃条件下保存备用；其中烧杯经王水浸泡；

(4)PtNPs/PV复合物信号标签的制备

将步骤(3)制备得到的PtNPs溶液在0-4℃(为了使PV酶加进去的时候温度不至于过高而使酶失活)下轻微搅拌5-10min，在搅拌条件下缓慢滴加等体积PV酶试剂(PowerVision，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，搅拌过夜后加入1wt％的牛血清蛋白溶液，于低温0-4℃保持2-6小时(封闭PtNPs上多余的键位)，即得到PtNPs/PV复合物溶液，在4℃条件下保存备用；

(5)酶联免疫试剂盒免疫复合物的制备

在酶标板的每孔中加入5mgFe₃O₄@β-CD和50μL系列稀释的莱克多巴胺的标准品(0.03、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng mL^-1)，50μL抗莱克多巴胺抗体溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液(含有0.05v/v％吐温的0.01mol L^-1pH 7.2-7.4的PBS溶液)洗板3次，磁铁分离，然后每孔加入80μL PtNPs/PV复合物溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液洗板3次，磁铁分离，即得到莱克多巴胺ELISA检测试剂盒；其中莱克多巴胺标准品的稀释液为0.01mol L^-1pH 7.2-7.4的PBS溶液(PBS磷酸盐缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司：0.01M pH 7.2-7.4)。

步骤(1)中无水醋酸钠、己二胺(1,6-hexanediamine)、FeCl₃·6H₂O和乙二醇的混合比例为4g：13g：2g：30ml。

步骤(2)中羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、羧甲基化β-环糊精和Fe₃O₄-NH₂磁性纳米颗粒的质量比为1:1:2:1。

在步骤(5)中得到的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的每孔中加入二氨基联苯胺(DAB显色液是莱克多巴胺检测试剂盒里面的药品，莱克多巴胺试剂盒购自北京华安麦科生物技术有限公司，产品编号：HE09003)的A液和B液各50μL，避光孵育15-30min，所得到的DAB显色产物通过酶标仪测定吸光度。

一种应用上述检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒检测莱克多巴胺浓度的方法，具体步骤如下：以Fe₃O₄@β-CD磁性纳米颗粒作为捕获探针捕获溶液中的莱克多巴胺(RAC)，采用非竞争性免疫的方法使捕获探针上的RAC特异结合所加入的抗体，通过洗板和磁性分离去除游离的抗体及其它游离物仅余固定在板底的抗体；再加入胶体铂标记PV与抗体特异结合，经孵育和洗板，留下莱克多巴胺抗原、抗体、胶体铂标记PV组成的免疫复合物，该免疫复合物的量随样品中莱克多巴胺的增加而增加，最后加入DAB显色，进行比色分析，以比色分析结果确定待测样品中莱克多巴胺的浓度。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用，PowerVision(PV)试剂是一种多聚酶螯合物，含有抗体和大量辣根过氧化物酶(HRP)，相较于传统酶标抗体，该试剂增加了单位抗体上标记的HRP酶，通过增加HRP酶含量的方法达到信号放大的目的。同时，铂胶体颗粒(PtNPs)对HRP催化底物二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)有很强催化效应，且该催化效果和PtNPs的添加量呈比例关系。并且，PtNPs合成步骤简单、颗粒稳定、有很强的生物相容性，能与酶蛋白结合且不会影响其催化效应，可用来负载蛋白酶。

本发明使用β-环糊精(β-cyclodextrins，β-CD)作为捕获探针捕获样液中痕量的莱克多巴胺。β-环糊精作为一种主客体物质，其包合技术在药品和食品工业中应用愈加广泛，它能选择性吸附样液中的苯酚结构，莱克多巴胺两末端为对称性的苯酚结构，从而能有效进入β-环糊精内腔并实现抗原固定。由于β-环糊精是一种可溶性多糖，为了实现样品分离的目的，将β-环糊精接枝到氨基化四氧化三铁上(Fe₃O₄-NH₂)，利用外加磁场达到快速、简单分离。Fe₃O₄-NH₂粒径较小，在紫外230-1000nm范围内没有特征吸收峰，对显色结果的测定没有影响。

综上所述，本发明检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用，利用Fe₃O₄@β-CD作为捕获探针、PtNPs/PV作为信号探针的免疫比色法检测莱克多巴胺残留。Fe₃O₄@β-CD作为捕获探针能大量富集溶液中痕量RAC；PtNPs胶体颗粒本身对显色底物DAB有明显的催化显色效应；同时PV酶试剂作为一种富含辣根过氧化物酶(HRP酶)的高聚酶复合物，其上大量的HRP可以有效催化DAB显色，相较于传统酶标抗体，PV有极强放大效应；另外，PtNPs胶体颗粒有很强生物相容性，可以和PV结合但不影响PV的催化效应。本发明通过PtNPs标记PV来代替传统试剂盒的酶标抗体，共同催化底物DAB产生颜色变化，以达到双重放大效果，从而实现食品中莱克多巴胺痕量残留的可靠、快速、灵敏、高特异性检测，从而在食品、医学等方面有其巨大的应用价值。

附图说明

图1为制备的Fe₃O₄-NH₂的扫描电镜图；

图2为制备的Fe₃O₄@β-CD的扫描电镜图；

图3为制备的PtNPs的透射电镜图；

图4为制备的PtNPs/PV复合物的透射电镜图；

图5为制备PtNPs/PV复合物的表征图；a：制备的PtNPs的紫外可见吸收光谱；b:多聚酶复合物PV的紫外可见吸收光谱；c:制备的PtNPs/PV复合物的紫外可见吸收光谱；

图6为基于PtNPs/PV作为信号探针免疫比色法检测莱克多巴胺的原理图；

图7为目标物莱克多巴胺吸光值与莱克多巴胺浓度建立的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒，包括酶标板和信号探针，酶标板内含有莱克多巴胺抗原和捕获探针Fe₃O₄@β-CD，信号探针为负载了大量PtNPs的PtNPs/PV的复合物，标准品为莱克多巴胺标准品，抗体工作液为抗莱克多巴胺抗体单克隆抗体，显色液为DAB显色体系中的A液和B液，终止液为2M HCl或者2M H₂SO₄，洗液是PBST缓冲液。

该比色法主要是由Fe₃O₄@β-CD磁性纳米颗粒作为捕获探针捕获溶液中的莱克多巴胺(RAC)，并采用非竞争性免疫的方法使捕获探针上的RAC特异结合所加入的抗体，该抗体能特异结合PtNPs/PV复合物上的抗体，经孵育和磁性分离，留下捕获探针、莱克多巴胺抗原、抗体、PtNPs/PV组成的免疫复合物。该免疫复合物的量随样品中莱克多巴胺的增加而增加，与样品中的莱克多巴胺呈线性关系。最后加入DAB显色，进行比色分析。以比色分析结果确定待测样品中莱克多巴胺的浓度。

具体实施例二

一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：

(1)Fe₃O₄-NH₂的制备

将无水醋酸钠、己二胺(1,6-hexanediamine)和FeCl₃·6H₂O混合后加入到乙二醇中，于42-60℃条件下搅拌得到铁源溶液，将铁源溶液转移到马弗炉中，于195-205℃条件下反应6-8h后，用磁铁分离，再分别用水和乙醇冲洗2-3次，除去未完全反应的溶剂，得到粒径为15-25nm的Fe₃O₄-NH₂磁性纳米颗粒；其中无水醋酸钠，己二胺(1,6-hexanediamine)、FeCl₃·6H₂O和按乙二醇的混合比例为4g：13g：2g：30ml；图1为制备的Fe₃O₄-NH₂的扫描电镜图；所制备的磁性Fe₃O₄-NH₂颗粒的粒径约为17nm，其表面不光滑，呈大量沟壑状，这种结构使得该磁性Fe₃O₄-NH₂有极大的表面积用于β-CD的负载，从而提高捕获探针的吸附性；

(2)Fe₃O₄@β-CD的制备

将羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)添加到含羧甲基化β-环糊精(carboxymethyl-β-CD，CM-β-CD)质量浓度为1wt％的PBS溶液(pH＝7.4)中，在室温下搅拌过夜后(以活化β-环糊精上的羧甲基)，再加入步骤(1)制备得到的Fe₃O₄-NH₂磁性纳米颗粒，连续搅拌5-7h后，用磁铁分离，再用去离子水反复清洗，以除去未反应的化学物质，得到的Fe₃O₄@β-CD；其中羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、羧甲基化β-环糊精和Fe₃O₄-NH₂磁性纳米颗粒的质量比为1:1:2:1；图2为制备的Fe₃O₄@β-CD的扫描电镜图；对比图4可以看出，结合了β-CD之后，该磁性颗粒的粒径增大了，这说明捕获探针Fe₃O₄@β-CD已成功合成；

(3)PtNPs的制备

将2ml 1wt％的氯铂酸溶液加入到烧杯中轻搅4-6min后，迅速加入5ml 10mmol/L的硼氢化钠溶液还原，室温下剧烈搅拌，反应结束后于10000-12000r/min离心15-25min除去杂质，水洗至少3次后定容至2ml得到PtNPs溶液，在4℃条件下保存备用；其中烧杯经王水浸泡；其中烧杯经王水浸泡；图3为制备的PtNPs的透射电镜图，所制备的PtNPs颗粒呈现较均匀的球状，其粒径约为8nm；

(4)PtNPs/PV复合物信号标签的制备

将步骤(3)制备得到的PtNPs溶液在0-4℃(为了使PV酶加进去的时候温度不至于过高而使酶失活)下轻微搅拌5-10min，在搅拌条件下缓慢滴加等体积PV酶试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司，型号：PV-6000、规格:3ml，英文名：Polymer Detection SystemFor Immuno-Histological Staining，文献中叫PowerVision)，搅拌过夜后加入1wt％的牛血清蛋白溶液，于低温0-4℃保持2-6小时(封闭PtNPs上多余的键位)，即得到PtNPs/PV复合物溶液，在4℃条件下保存备用；其中PtNPs溶液与POWERVISION试剂的混合体积比为1：1；图4为制备的PtNPs/PV复合物的透射电镜图，对比图3的PtNPs颗粒可以看出，PtNPs/PV复合物中PtNPs颗粒均匀分散在蛋白质上，这说明PtNPs成功结合到PV酶-抗体多聚螯合物上；图5为制备PtNPs/PV复合物的表征图；a：制备的PtNPs的紫外可见吸收光谱；b:多聚酶复合物PV的紫外可见吸收光谱；c:制备的PtNPs/PV复合物的紫外可见吸收光谱；单纯的胶体铂颗粒在230-1000nm范围内无明显吸收峰，仅在300nm以下有一定吸光度，见图5a。单纯的PV在280nm、376nm、506nm处有吸收峰，如图5c所示。图5b为用BSA封闭后的信号探针，它同时拥有单纯的胶体铂颗粒和PowerVision试剂的特征吸收峰，其较大的蛋白吸收峰部分来源于BSA。这说明胶体铂和PowerVision试剂结合而成的PtNPs/PV复合物已成功合成；

(5)酶联免疫试剂盒免疫复合物的制备

在酶标板的每孔中加入5mgFe₃O₄@β-CD和50μL系列稀释的莱克多巴胺的标准品(0.03、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng mL^-1)，50μL抗莱克多巴胺抗体溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液(含有0.05v/v％吐温的0.01mol L^-1pH 7.2-7.4的PBS溶液)洗板3次，磁铁分离，然后每孔加入80μL PtNPs/PV复合物溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液洗板3次，磁铁分离，即得到莱克多巴胺ELISA检测试剂盒；其中莱克多巴胺标准品的稀释液为0.01mol L^-1pH 7.2-7.4的PBS溶液(PBS磷酸盐缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司)。

在莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的每孔中加入二氨基联苯胺(DAB显色液是莱克多巴胺检测试剂盒里面的药品，莱克多巴胺试剂盒购自北京华安麦科生物技术有限公司，产品编号：HE09003)的A液和B液各50μL，避光孵育15-30min，所得到的DAB显色产物通过酶标仪测定吸光度。以比色分析结果确定待测样品中莱克多巴胺的浓度。

具体实施例三

一种应用上述检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒来检测莱克多巴胺浓度的方法，以Fe₃O₄@β-CD磁性纳米颗粒作为捕获探针捕获溶液中的RAC，采用非竞争性免疫的方法使捕获探针上的RAC特异结合所加入的抗体，通过洗板和磁性分离去除游离的抗体及其它游离物；再加入胶体铂标记PV与抗体特异结合，经孵育和洗版，留下莱克多巴胺抗原、抗体、胶体铂标记PV组成的免疫复合物。该免疫复合物的量随样品中莱克多巴胺的增加而增加。最后加入DAB显色，进行比色分析。以比色分析结果确定待测样品中莱克多巴胺的浓度(原理如图6所示)。

PtNPs胶体颗粒本身对显色底物DAB有明显的催化显色效应；同时PV酶试剂作为一种富含HRP酶的高聚酶复合物，其上大量的HRP可以有效催化DAB显色，相较于传统酶标抗体，PV酶试剂有极强放大效应；另外，PtNPs胶体颗粒有很强生物相容性，可以和PV结合但不影响PV的催化效应。

具体实施例四

本发明基于PtNPs/PV的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒对莱克多巴胺检测的灵敏度及线性范围

将利用具体实施例二方法制备的PtNPs/PV复合物作为信号探针，并根据免疫复合物制备过程加入不同浓度的标准品并洗板，标准品溶液浓度依次为:0.001ng mL^-1、0.05ngmL^-1、0.1ng mL^-1、0.3ng mL^-1、0.9ng mL^-1、2.7ng mL^-1、8.1ng mL^-1、20ng mL^-1、40ng mL^-1、60ng mL^-1、80ng mL^-1(标准品溶剂为PBS缓冲溶液)，得到的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的每孔中加入DAB的A液和B液各50μL，避光孵育15-30min(具体时间以显色反应强度为准)；所得到的DAB显色产物通过酶标仪测定吸光度，得到非竞争性实验的标准曲线，曲线方程为y＝0.17884log C_RAC+1.08753；R²＝0.98355如图7所示。此免疫比色法对莱克多巴胺的检测范围为0.001-50ng mL^-1；该实验重现性好，性能稳定，制作简单且容易更新。

由实验测定可知，一般市售的竞争性免疫比色法对莱克多巴胺的检测限为0.1ngmL^-1，本方案提出的用PtNPs/PV复合物作为信号探针的非竞争性免疫比色法对莱克多巴胺的检测限为0.001ng mL^-1，比市售的试剂盒的检测限提高了10倍左右，充分说明了此方案比市售莱克多巴胺检测试剂盒有更大的优势和更大的应用价值。

具体实施例五

高选择性验证实验

为了评估所提出的胶体铂-多聚酶双重放大比色法检测莱克多巴胺的方法的特异性，我们将包括沙丁胺醇(SAL),克伦特罗(CLE)和多巴胺(DOA)等多种β-agonists作为干扰物质进行检测。从结果可知，在最优条件下同质量单纯的沙丁胺醇(SAL),克伦特罗(CLE)和多巴胺(DOA)对该免疫反应结果没有显著影响，并且这些干扰物的混合对检测结果也没有显著影响，交叉反应结果均小于1％。结果表明所提出的免疫方法对莱克多巴胺的实时监测具有极高特异性。

具体实施例六

准确称量1.0±0.05g猪肉样品，装入离心管,向离心管里加入50mL 0.01mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲溶液，使用高速分散器充分涡动混匀；分别加入适量的莱克多巴胺，超声振荡15min，然后在4℃下离心5min，取上清液，加入2M氢氧化钠溶液调节pH值为6.5-7.5,静置5min，取上清液20μL用于分析。将上述具体实施例二制备得到的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的每孔中加入DAB的A液和B液各50μL，避光孵育15-30min(具体时间以显色反应强度为准)；所得到的DAB显色产物通过酶标仪测定吸光度，结果如表1所示。

表1猪肉中莱克多巴胺的检测结果

由表1检测结果可知，所提出的胶体铂-多聚酶双重放大比色法检测莱克多巴胺的方法的平均回收率为94.0～106％，表明基于本发明制备的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒对于莱克多巴胺的检测精密度高，结果准确可靠。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)Fe₃O₄-NH₂的制备

将无水醋酸钠、己二胺和FeCl₃·6H₂O混合后加入到乙二醇中，于42-60℃条件下搅拌得到铁源溶液，将铁源溶液转移到马弗炉中，于195-205℃条件下反应6-8h后，用磁铁分离，再分别用水和乙醇冲洗2-3次，除去未完全反应的溶剂，得到粒径为15-25nm的Fe₃O₄-NH₂磁性纳米颗粒；其中无水醋酸钠、己二胺、FeCl₃·6H₂O和乙二醇的混合比例为4g：13g：2g：30ml；

(2)Fe₃O₄@β-CD的制备

将羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺添加到含羧甲基化β-环糊精质量浓度为1wt％的pH 7.4的PBS溶液中，在室温下搅拌过夜后，再加入步骤(1)制备得到的Fe₃O₄-NH₂磁性纳米颗粒，连续搅拌5-7h后，用磁铁分离，再用去离子水反复清洗，以除去未反应的化学物质，得到的Fe₃O₄@β-CD；其中羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、羧甲基化β-环糊精和Fe₃O₄-NH₂磁性纳米颗粒的质量比为1:1:2:1；

(3)PtNPs的制备

将2ml 1wt％的氯铂酸溶液加入到烧杯中轻搅4-6min后，迅速加入5ml 10mmol/L的硼氢化钠溶液还原，室温下剧烈搅拌，反应结束后通过于10000-12000r/min离心15-25min除去杂质，水洗至少3次后定容至2ml得到PtNPs溶液，在4℃条件下保存备用；其中烧杯经王水浸泡；

(4)PtNPs/PV复合物信号标签的制备

将步骤(3)制备得到的PtNPs溶液在0-4℃下轻微搅拌5-10min，在搅拌条件下缓慢滴加等体积PV酶试剂，搅拌过夜后加入1wt％的牛血清蛋白溶液，于低温0-4℃保持2-6小时，即得到PtNPs/PV复合物溶液，在4℃条件下保存备用；

(5)酶联免疫试剂盒免疫复合物的制备

在酶标板的每孔中加入5mgFe₃O₄@β-CD和50μL系列稀释的莱克多巴胺的标准品，50μL抗莱克多巴胺抗体溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液洗板3次，磁铁分离，然后每孔加入80μL PtNPs/PV复合物溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液洗板3次，磁铁分离，即得到莱克多巴胺ELISA检测试剂盒；其中莱克多巴胺标准品的稀释液为0.01mol L^{- 1}pH 7.2-7.4的PBS溶液，其中PBST缓冲液为含有0.05v/v％吐温的0.01mol L^-1pH 7.2-7.4的PBS溶液。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中得到的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的每孔中加入二氨基联苯胺的A液和B液各50μL，避光孵育15-30min，所得到的DAB显色产物通过酶标仪测定吸光度。