CN107064492B - 一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，包括以下步骤：将口蹄疫合成肽疫苗破乳，将破乳后的抗原样品采用竞争ELISA方法进行定性定量检测；所述破乳方法为：将口蹄疫合成疫苗与破乳剂混合，分层后得水相抗原样品；所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。本发明提供的破乳方法破乳能力更强，使样品无需进行纯化处理即可测定，缩短了检测时间；本发明采用竞争ELISA方法进行定性定量检测抗原浓度，得到的标准曲线斜率会大于常规间接竞争法，从而大大提高了检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及油佐剂疫苗检测技术领域，具体涉及一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法。
背景技术
现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用本动物进行检验，由于国家实行100％的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，而且动物攻毒对实验设施要求高(BSL3级实验室)、耗时长(一个月以上)、资金花费大。如果采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的质量检测一直困扰着兽药监测部门和相关生产企业。因此需要尽快研制体外检验技术，代替现有的本动物试验。
当前国家对疫苗的检验正逐步过渡到对疫苗内抗原的检测，而当前较为普遍的方法为疫苗破乳后对抗原进行检测，通过将疫苗进行破乳处理，使抗原转移至水相中，继而对其进行后续的检测分析。由于疫苗乳化过程中所使用的油佐剂中成分复杂，含有表面活性剂，免疫增强剂等物质存在，破乳后的水相中往往会含有上述杂质和破乳剂，行业内并没有能够去除上述杂质和破乳剂的方法，而杂质及破乳剂等还会大大影响其后的检测过程，造成信号掩盖或干扰，压低了抗原信号的强度，甚至无法有效检测到其中的抗原，由于其中杂质的随机分配性，造成其检测方法的重复性不佳，同时增加了仪器维护成本。
口蹄疫合成肽疫苗是一种通过人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成的保护性短肽。现有定量测定方法通常有Lowry法、BCA法、HPLC等方法。且现有的定量方法中，由于疫苗破乳后，疫苗水相成分较复杂，待检样品通常需要耗费大量时间纯化后才能达到检测要求，且很多常规方法检测灵敏度有限。
酶联免疫吸附试验(ELISA)一起快速、方便、特异、可定量等优点，在很多领域中得到广泛应用。常规的间接竞争ELISA中，抗原与有限浓度的抗体同时加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中进行反应，抗体与游离的抗原、固相化的抗原结合率概率为50％，得到的结果绘制的标准曲线斜率较低，这使得检测灵敏度较低。不能很好的反应口蹄疫合成肽疫苗中有效抗原含量。
目前，对于口蹄疫合成肽疫苗抗原含量定量检测没有通用准确的方法。急需研发一直更加快速，有效，方便的油佐剂疫苗的定性定量检测方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法。通过将口蹄疫合成肽疫苗采用特殊的破乳方法进行破乳，再对破乳后的水相抗原样品直接进行竞争ELISA方法，可准确对疫苗进行定性定量分析。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，包括以下步骤：将口蹄疫合成肽疫苗破乳，将破乳后的抗原样品采用竞争ELISA方法进行定性定量检测；
所述破乳方法为：将口蹄疫合成疫苗与破乳剂混合，分层后得水相抗原样品；所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。取水相经液相色谱检测，抗原回收率可达90％以上。
优选地，破乳剂中有机溶剂选自乙腈、乙醇中的一种，酸选自三氟乙酸、盐酸中的一种。
优选地，油佐剂疫苗与破乳剂按体积比9:1～5:5进行混合。破乳剂含量过高会增加后续对水相样品冻干或浓缩的处理时间，过低则无法破乳。
优选地，所述破乳剂中酸与有机溶剂的体积比为(0.05～0.5)：100。
采用所述的破乳方法，由于抗原回收率高，得到的抗原样品无需进一步纯化，即可直接用于抗原的定量定性检测。
优选地，所述竞争ELISA方法采用的步骤如下：
抗原包被：将已知浓度人工合成的口蹄疫抗原固相化吸附到ELISA板子上；
稀释抗体：将已知效价的抗体进行稀释，抗体稀释后效价为1:250000-1:1100000；
抗原稀释：在血清稀释板上，用稀释液将待检抗原样品稀释，标准抗原进行不同比例稀释形成不同浓度的标准抗原稀释液；
抗原标准曲线绘制及待检抗原样品的定量检测：将稀释好的待检抗原样品和不同浓度的标准抗原稀释液分别与稀释好的抗体在稀释板中进行完全反应，然后将各完全反应后的反应液分别加入到固相化抗原的ELISA板子中继续反应；反应结束后，各加入酶标记物、底物依次反应，再各加入终止液终止，测定OD值，采用不同浓度的标准抗原的OD值绘制抗原标准曲线，然后将待检抗原样品的OD值对应到所述抗原标准曲线中计算得待测抗原样品浓度，再乘以稀释倍数，除以破乳效率，除以稀释效应即为待测抗原样品中抗原实际含量。
优选地，抗原包被步骤中，所述人工合成的口蹄疫抗原浓度为0.5μg/mL-5μg/mL。
优选地，抗原标准曲线绘制及待检抗原样品的定量检测步骤中，所述完全反应的时间大于等于60min，反应温度为37℃。该反应时间可尽可能的保证反应完全。
优选地，抗原标准曲线绘制及待检抗原样品的定量检测步骤中，所述各完全反应后的反应液分别加入到固相化抗原的ELISA板子中继续反应大于等于30min，反应温度为37℃。该反应时间若小于30min，会导致反应不彻底，最终OD值偏低，影响结果的准确性。
优选地，抗原标准曲线绘制及待检抗原样品的定量检测步骤中，所述酶标记物为SPA-HRP，或者为羊抗猪生物素-IgG和亲和素-HRP。
更优选地，所述酶标记物为羊抗猪生物素-IgG和亲和素-HRP。采用羊抗猪生物素-IgG和亲和素-HRP作为酶标记物，由于生物素亲和素之间高亲和力的牢固结合及多级放大效应，可使抗原的检测限更低。
优选地，所述稀释后酶标记物的用量为100μL，稀释比例为1:5000-1:10000。
优选地，所述底物为：TMB溶液。
优选地，所述终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
本发明的原理是：乙腈作为一种极佳的有机溶剂，对乳化膜有很强的溶解作用，能够将疫苗乳化膜溶解，从而释放出其中的抗原水相，抗原易溶于乙腈，乙腈与水互溶，能将抗原带入水相中，大大提高了水相中的抗原回收率。三氟乙酸类似催化剂，促进破乳，加速乳化膜的破解，减少乙腈的用量。再将破乳后得到的水相抗原样品采用竞争ELISA方法，使抗原样品与有限浓度的抗体先在稀释板中反应，待抗原抗体反应完全后，将反应液加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中进行反应，之后加入酶标记物进行反应，最后与底物显色进行检测。最终的检测结果表现为抗原浓度越高，显色后检测的OD值越低，成反比关系。将标准抗原进行不同比例稀释进行竞争ELISA检测绘制标准曲线，检测样品与标准曲线关联从而达到定性定量的要求。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1)本发明提供的破乳方法破乳能力更强，能保证抗原主要分布于水相中，且水相与油相能完全分离，能真实反应出疫苗内有效抗原的含量及质量，抗原回收率可达90％以上。
2)本发明采用竞争ELISA方法，先将抗原与有限浓度的抗体先在稀释板中反应，抗体与待检抗原先完全中和，达到完全抑制的目的。在随后固相化吸附有抗原的ELISA板中，固相化抗原与抗体结合随之减少，使得固相化抗原、待测抗原与抗体结合机会不均等。因此，得到的标准曲线斜率会大于常规间接竞争法，从而大大提高检测灵敏度。
3)由于疫苗破乳后，水相成分较复杂。该方法简单，操作简便，破乳后水相样品无需进行纯化处理即可进行测定，相比较其他检测方法花费时间较短。
4)由于抗原抗体反应具有较高特异性，当抗原材料中的干扰物质不易去除，或不易得到足够的纯化抗原时，采用本发明的竞争法达到可检测目的。同时反应抗体稀释后浓度较低，降低了非特异反应和交叉反应的干扰。
5)本发明采用间接法，利用很少量的酶可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色现象，使得抗原能在较低浓度下进行定量，灵敏度较高，且重复性好。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1的抗原标准曲线；
图2为实施例2的抗原标准曲线；
图3为对比例1的方法破乳后水相中抗原浓度HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
1)选用市售的猪口蹄疫疫苗苗(疫苗浓度为50μg/mL)按照如下方法破乳处理：
将待检疫苗与破乳剂混合，所述破乳剂中有机溶剂选用乙腈，酸选用三氟乙酸，乙腈与三氟乙酸的体积比为100:0.05。取8ml待检疫苗置于离心管内，疫苗与破乳剂以体积比8:2混合，震荡混匀，在4℃条件下，以3000G离心15分钟，离心后用10ml注射器小心抽取下层水相。经液相色谱分析后，与疫苗中理论抗原浓度标准进行对比，其中，疫苗中理论抗原浓度的HPLC检测图谱样品出峰位置的积分信息如表1所示，采用本实施例破乳方法破乳后水相中抗原样品浓度的HPLC检测图谱样品出峰位置的积分信息如表2所示。经对比分析，使用该方法抗原回收率为91.7％，即破乳效率为91.7％，相比于现有方法，抗原回收率大大提高。
表1
表2
注：
疫苗由佐剂与抗原乳化，其佐剂与抗原的体积比为1:1，因此破乳后得到的水相为待检疫苗体积的50％，由于本实施例中破乳剂与水互溶，因此经本发明方法破乳后其水相体积较疫苗内水相多出破乳剂的体积，即稀释作用，因此本实施例中水相较理论水相(4ml)增多50％(2ml)，本实施例中破乳得到的水相检测的积分结果应计算稀释效应，即检测积分结果除以66.67％。
2)竞争ELISA检测
2.1抗原包被：将3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；
2.2稀释抗体：将已知效价的抗体进行一定比例稀释，稀释后抗体效价为1:250000；
2.3待检抗原(所述待检抗原为步骤1得到的水相抗原样品)与标准抗原稀释：在血清稀释板上，用稀释液将待检抗原按1:100稀释，标准抗原分别按稀释后浓度为1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL进行稀释；
2.4抗原抗体反应：在稀释板中，将100μL稀释好的待检抗原和标准抗原中分别加入等量稀释好的抗体并混匀，于37℃下孵育60min；
2.5孵育结束后，将血清稀释板中的各反应液分别吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；
2.6孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μL1:10000稀释好的SPA-HRP，于37℃下孵育30min；
2.7孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μLTMB溶液，于37℃下避光显色15min；
2.8显色结束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH2SO4溶液终止反应，并于450nm波长下测定OD值；
2.9根据测定的OD值，将各标准抗原浓度以10为底对数作为横坐标，各标准抗原测得的OD450为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线的回归方程为y＝-0.357x+1.448，如图1所示；将待检抗原的OD值带入标准曲线中算出待测对应抗原浓度，抗原实际含量＝[(对应抗原浓度×稀释倍数)/(破乳效率×稀释效应)]/2即为样品中抗原实际含量。即为样品中抗原实际含量。本实施例中，测得待检抗原的OD值为0.466，计算得样品中抗原的实际含量为45.99μg/mL。
注：由于疫苗破乳后，油相与水相分离，水相中实际抗原浓度增大1倍，计算疫苗实际抗原浓度需除以2。
实施例2
本实施例提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，具体采用以下步骤：
1)选用市售的猪口蹄疫疫苗苗(疫苗浓度为50μg/mL)按照如下方法破乳处理：
将待检疫苗与破乳剂混合，所述破乳剂中有机溶剂选用乙腈，酸选用三氟乙酸，乙腈与三氟乙酸的体积比为100:0.05。取5ml待检疫苗与破乳剂以体积比5:5混合，震荡混匀，在4℃条件下，以3000G离心15分钟，得水相抗原样品。
采用本实施例的方法对口蹄疫疫苗进行破乳，得破乳效率为90.3％，稀释效应为33.33％。
2)竞争ELISA检测
2.1抗原包被：将3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；
2.2稀释抗体：将已知效价的抗体进行一定比例稀释，稀释后抗体效价为1:1100000；
2.3待检抗原(所述待检抗原为步骤1得到的水相抗原样品)与标准抗原稀释：在血清稀释板上，将待检抗原用稀释液按1:100稀释，已知标准抗原进行稀释，稀释浓度分别为1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL；
2.4抗原抗体反应：在稀释板中，将100μL稀释好的待检抗原和标准抗原中加入等量稀释好的抗体并混匀，于37℃下孵育60min；
2.5孵育结束后，将血清稀释板中的反应液吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；
2.6孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μL1:10000稀释好的羊抗猪生物素-IgG，于37℃下孵育30min；
2.7孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μL1:5000稀释好的亲和素-HRP，于37℃下孵育30min；
2.8孵育结束后，以PBST为洗液，洗板5次并拍干板中液体，向ELISA板中加入100μLTMB溶液，于37℃下避光显色15min；
2.9显色结束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH2SO4溶液终止反应，并于450nm波长下测定OD值；
2.10根据测定的OD值，以标准抗原浓度以10为底对数作为横坐标，OD450为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线的回归方程为y＝-0.403x+1.523，如图2所示；将待检抗原的OD值带入标准曲线中算出待测对应抗原浓度，抗原实际含量＝[(对应抗原浓度×稀释倍数)/(破乳效率×稀释效应)]/2即为样品中抗原实际含量。即为样品中抗原实际含量。本实施例中，测得待检抗原的OD值为0.528，计算得样品中抗原的实际含量为49.02μg/mL。
注：由于疫苗破乳后，油相与水相分离，水相中实际抗原浓度增大1倍，计算疫苗实际抗原浓度需除以2。
采用本实施例方法对该样品的10个平行样进行同时测定，其结果的波动范围在±0.80内，说明其重复性良好。
实施例3
本实施例提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，具体采用以下步骤：
1)选用市售的猪口蹄疫疫苗苗(疫苗浓度为50μg/mL)按照如下方法破乳处理：
将待检疫苗与破乳剂混合，所述破乳剂中有机溶剂选用乙醇，酸选用盐酸，乙醇与盐酸的体积比为100:0.33，取7ml待检疫苗与破乳剂以体积比7:3混合，震荡混匀，在4℃条件下，以3000G离心15分钟，得水相抗原样品。
采用本实施例的方法对口蹄疫疫苗进行破乳，破乳效率为93.5％，稀释效应为53.85％。
2)竞争ELISA检测
采用的竞争ELISA方法与实施例2相同。计算得样品中抗原的实际含量为48.52μg/mL。
对比例1
本实施例提供了一种口蹄疫合成肽疫苗(采用实施例1的疫苗)的定性定量检测方法，与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于：本对比例破乳剂采用正丁醇。
采用本对比例的方法测得水相中的抗原实际含量为零。该对比例采用正丁醇破乳后的水相中抗原浓度HPLC检测图谱如图3所示，从该图中可看出，在抗原理论保留时间内并未检出抗原，说明样品中含有的抗原量极低，本对比例的抗原回收率基本为零，其破乳效率基本为零。因此无法满足后续检测要求。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将口蹄疫合成肽疫苗破乳，将破乳后的抗原样品采用竞争ELISA方法进行定性定量检测；
所述破乳方法为：将口蹄疫合成疫苗与破乳剂混合，分层后得水相抗原样品；所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物；所述破乳剂中有机溶剂选用乙腈，酸选用三氟乙酸，乙腈与三氟乙酸的体积比为100:0.05；或者，所述破乳剂中有机溶剂选用乙醇，酸选用盐酸，乙醇与盐酸的体积比为100:0.33；
油佐剂疫苗与破乳剂按体积比9:1～5:5进行混合。
2.根据权利要求1所述的油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，所述竞争ELISA方法采用的步骤如下：
抗原包被：将已知浓度人工合成的口蹄疫抗原固相化吸附到ELISA板子上；
稀释抗体：将已知效价的抗体进行稀释，抗体稀释后效价为1:250000-1:1100000；
抗原稀释：在血清稀释板上，用稀释液将待检抗原样品稀释，标准抗原进行不同比例稀释形成不同浓度的标准抗原稀释液；
抗原标准曲线绘制及待检抗原样品的定量检测：将稀释好的待检抗原样品和不同浓度的标准抗原稀释液分别与稀释好的抗体在稀释板中进行完全反应，然后将各完全反应后的反应液分别加入到固相化抗原的ELISA板子中继续反应；反应结束后，各加入酶标记物、底物依次反应，再各加入终止液终止，测定OD值，采用不同浓度的标准抗原的OD值绘制抗原标准曲线，然后将待检抗原样品的OD值对应到所述抗原标准曲线中计算得待测抗原样品浓度，再乘以稀释倍数，除以破乳效率，除以稀释效应即为待测抗原样品中抗原实际含量。
3.根据权利要求2所述的油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，抗原包被步骤中，所述人工合成的口蹄疫抗原浓度为0.5μg/mL-5μg/mL。
4.根据权利要求2所述的油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，抗原标准曲线绘制及待检抗原样品的定量检测步骤中，所述完全反应的时间大于等于60min，反应温度为37℃。
5.根据权利要求2所述的油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，抗原标准曲线绘制及待检抗原样品的定量检测步骤中，所述各完全反应后的反应液分别加入到固相化抗原的ELISA板子中继续反应大于等于30min，反应温度为37℃。
6.根据权利要求2所述的油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，抗原标准曲线绘制及待检抗原样品的定量检测步骤中，所述酶标记物为SPA-HRP，或者为羊抗猪生物素-IgG和亲和素-HRP。
7.根据权利要求2所述的油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，其特征在于，所述稀释后酶标记物的用量为100μL，稀释比例为1:5000-1:10000。
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