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CN106565826B - 大肠杆菌o157：h7亲和十二肽及其筛选方法和应用 - Google Patents

大肠杆菌o157：h7亲和十二肽及其筛选方法和应用 Download PDF

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CN106565826B CN201610979747.5A CN201610979747A CN106565826B CN 106565826 B CN106565826 B CN 106565826B CN 201610979747 A CN201610979747 A CN 201610979747A CN 106565826 B CN106565826 B CN 106565826B
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Abstract

本发明公开大肠杆菌O157：H7亲和十二肽及其筛选方法和应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示。本发明以食源性致病菌大肠杆菌O157：H7为靶标进行筛选，获得针对大肠杆菌O157：H7全细胞亲和性较强的几段多肽，丢弃筛选所用离心管的负筛选步骤减少了离心管材料聚苯乙烯PS对筛选结果的影响；所筛选得到的包含亲和多肽的噬菌体单克隆对大肠杆菌O157：H7具备强于原始肽库的亲和力；筛选得到的四段多肽具备在大肠杆菌O157：H7细胞表面富集的特征，利用大肠杆菌O157：H7亲和十二肽制备获得的新型溶菌酶具备靶向亲和到大肠杆菌上的效果，具有较高酶活。

Description

大肠杆菌O157：H7亲和十二肽及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于微生物领域，更具体地讲，涉及大肠杆菌O157：H7亲和十二肽及其筛选方法和应用。
背景技术
食源性疾病的发病率在过去的几年里有所增加，并成为全球主要的公共卫生问题。食源性致病菌是导致食源性疾病的一个重要的诱因，因此，对食源性致病菌进行分析检测、并控制其蔓延具有重要意义。大肠杆菌O157：H7是重要的食源性致病菌，危害广泛，容易出现在蔬菜水果等食品中。而这类即食食品的清洗消毒和其中大肠杆菌O157：H7的检测还没有实现快速、安全、环保和有效。
利用噬菌体展示技术对多肽进行筛选，是分子生物学领域的重要研究技术。对噬菌体展示肽库进行淘选可以得到针对材料或者生物分子以及有机小分子的亲和肽。目前已有许多针对材料、小分子以及生物分子和全细胞进行的筛选。而针对病原微生物大肠杆菌O157：H7的亲和多肽还没有报道。
抗菌酶作为新型生物抗菌剂，具有高效、无毒、无残留等优点，在食品工业、医疗消毒以及洗涤剂等的应用中必将具有广阔的前景。它在实际应用中面临一些问题与挑战，主要表现在：酶的价格较高；抗菌酶作用效率还不够高，因此使用量也要提高；实际应用抗菌酶时，其稳定性及环境因素也需考虑。如何提高酶活并保持酶的稳定性，提高酶对目标微生物的靶向性和利用效率是需要重点关注的。
溶菌酶通过水解某些细菌种类的细胞壁肽聚糖层杀死细菌，因此其可被推荐为天然抗菌剂。然而，溶酶菌只对革兰氏阳性细菌起作用，所以促使科学家通过几种类型的化学修改来提高溶菌酶的抗菌效果。在针对改性溶菌酶在食品中对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌增长的控制效果的研究中，修饰不仅增强了溶菌酶的功能属性(如溶解度和热稳定性)，而且扩展了溶菌酶的活性范围。总的来说改性溶菌酶是应用在食品工业中极好的天然食品清洗剂。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供大肠杆菌O157：H7亲和十二肽。
本发明的第二个目的在于提供大肠杆菌O157：H7亲和十二肽的筛选方法。
本发明的第三个目的在于提供大肠杆菌O157：H7亲和十二肽的应用。
本发明第四个目的在于提供一种新型溶菌酶。
本发明第五个目的在于提供新型溶菌酶的应用。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：大肠杆菌O157：H7亲和十二肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：大肠杆菌O157：H7亲和十二肽的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以大肠杆菌O157：H7细菌全细胞作为靶分子，将其与噬菌体展示十二肽库混合，通过离心分离对肽库进行筛选，并通过丢弃筛选所用离心管的方法去除聚苯乙烯PS材料对筛选带来的影响，最后对筛选得到的噬菌体克隆进行DNA测序和分析，并采用ELISA比较亲和性。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备针对大肠杆菌的抗菌材料中的应用。
大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备针对大肠杆菌的检测试剂或检测芯片中的应用。
大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备新型溶菌酶中的应用，其特征在于，将SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.4任一所示十二肽与人溶菌酶进行融合表达，得到对大肠杆菌具备亲和性的新型溶菌酶。
大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备食品清洗消毒剂中的应用。
为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案：一种新型溶菌酶，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示十二肽与人溶菌酶进行融合表达获得，其氨基酸序列为SEQ IDNO.5所示。
为实现本发明第五个目的，本发明公开以下技术方案：新型溶菌酶在制备食品清洗消毒剂中的应用。
本发明筛选的4条十二肽的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.1：SGVYKVAYDWQH(P1)；SEQ ID NO.2：GLHTSATNLYLH(P2)；SEQ ID NO.3：VVSPDMNLLLTN(P3)；SEQ ID NO.4：VFSSMVHVLNTH(P4)。
本发明获得的新型溶菌酶氨基酸序列为SEQ ID NO.5：MKALIVLGLVLLSVTVQGKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGVGGGGSSGVYKVAYDWQH。
本发明的优点在于：本发明是以食源性致病菌大肠杆菌O157：H7为靶标进行筛选，获得针对大肠杆菌O157：H7全细胞亲和性较强的几段多肽，丢弃筛选所用离心管的负筛选步骤减少了离心管材料聚苯乙烯PS对筛选结果的影响；所筛选得到的包含亲和多肽的噬菌体单克隆对大肠杆菌O157：H7具备强于原始肽库的亲和力；筛选得到的四段多肽具备在大肠杆菌O157：H7细胞表面富集的特征。为开发以亲和多肽为基础的抗菌材料、食品清洗消毒剂、检测试剂或检测芯片等提供了物质基础和有效途径。利用大肠杆菌O157：H7亲和十二肽制备获得的新型溶菌酶具备靶向亲和到大肠杆菌上的效果，具有较高酶活。该溶菌酶具备强于单独溶菌酶的酶活，在抑制界面上病原菌的生长效果方面表现突出，明显好于单独的溶菌酶，在清洗蔬菜水果方面具有一定的效果，可作为食品清洗剂来使用。这为开发新一代抗菌剂和食品清洗消毒剂提供有效途径。
附图说明
图1.筛选得到的所有十二肽中氨基酸残基出现的频率。
图2.四段多肽的二级结构模拟图。
图3.ELISA测定多肽P1对大肠杆菌O157：H7的亲和性。
图4.四段多肽对三种菌的亲和度柱状图。
图5.四段多肽在大肠杆菌O157：H7菌膜上的吸附柱状图。
图6.基因测序结果。
图7.表达蛋白的SDS-PAGE电泳，1-5：人溶菌酶诱导前、诱导后、培养液、破碎上清、破碎沉淀、6：Marker、7-11:新型溶菌酶诱导前、诱导后、培养液、破碎上清、破碎沉淀。
图8.表达蛋白的酶活测定。
图9.葡萄糖氧化酶、溶菌酶、过氧化氢酶、融合蛋白的抑菌效果。
图10.溶菌酶和包含亲和肽的溶菌酶清除蔬菜水果表面微生物效果比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.肠杆菌O157：H7亲和十二肽筛选
淘选过程简述(reference：J.Phys.:Condens.Matter 19(2007)395011(13pp))：
1.选用OD6600.5的O157:H7细胞，加入10μL噬菌体肽库(1011)，悬浮于1mLPBS溶液,室温下温育60min；
2.在16,000×g下离心5min,将细菌和噬菌体沉淀下来；
3.去除未吸附的噬菌体，用1mL的TBS/Tween缓冲液洗10次，16,000×g，5min，最后一遍更换新的离心管；
4.亲和的噬菌体与细胞最后被200μL的0.2M glycine-HCl(pH2.2)洗脱,室温下轻微震荡10min,离心取上清；
5.最后用150μL的1M Tris-HCl(pH9.1)中和。
6.测定噬菌体滴度：
①细菌的准备：接种ER2738单克隆至5mL LB培养基中，37℃振荡培养至对数生长中期(OD600约0.5)。
②准备琼脂平板：将LB/IPTG/Xgal放置于37℃培养箱中预温备用，每个噬菌体稀释梯度对应一个平板。
③准备顶层琼脂：将顶层琼脂在微波炉里融化后，分装成3mL等份与灭菌过的试管中，在45℃保温备用。
④噬菌体系列梯度稀释：洗脱中和的噬菌体用LB培养基进行10倍梯度稀释。梯度范围为101-104。
⑤感染与铺板：当细菌培养到对数中期后，分装成200mL等份于干净EP管中，每个噬菌体稀释梯度对应一管。吸取10μl不同稀释度的噬菌体加入到ER2738中，快速振荡混匀，室温静置1min。将感染后的细胞加入到45℃保温的顶层琼脂试管中，一次一管，快速混匀后立即倒入37℃保温的LB/IPTG/Xgal平板上，轻旋令顶层琼脂铺开到平板上。
⑥培养及计数：待平板室温冷却5min后，37℃倒置过夜培养。第二日，选择约有100个噬菌斑的平板进行计数，然后以该数目乘以该板的噬菌体稀释倍数得到每10μl洗脱液的pfu(plage forming units)。
7.洗脱噬菌体的扩增
①挑选ER2738单克隆接种到含四环素的LB培养基中过夜培养，第二天按1:100的比例稀释到20mL的LB培养基中。
②将洗脱中和后的噬菌体(约80μl)加入到20mL LB培养基中，37℃强力震动培养4.5h。
③将培养物转入到50mL离心管中，4℃12,000g离心10min。将上清转移到新的50mL离心管中再次离心，尽量去除残留菌体及碎片。
④收集上清约80％到新的无菌离心管中，加入1/6体积的20％PEG/NaCl溶液混匀，4℃静置至少2h。
⑤4℃，12000g离心PEG沉淀15min。弃去上清再短暂离心，吸尽残留上清液，在离心管内有指印大小的噬菌体沉淀残留。
⑥用1mL TBS溶液将沉淀溶解，将悬液移入1.5mL无菌EP管中，4℃，12,000rpm离心5min。上清转移到新的无菌EP管后加入1/6体积的20％PEG/NaCl溶液混匀，冰上孵育45min。
⑦4℃，14,000rpm离心10min，弃去上清，再短暂离心一次，吸尽残液。然后沉淀重悬于200μl TBS溶液中，离心1min后将上清转移到新的无菌EP管中。扩增后的噬菌体存放于4℃，用于滴度测定和下一轮的筛选。
(7)根据步骤(5)中的方法测定洗脱扩增物中的噬菌体滴度，每轮筛选所获得的噬菌体滴度见下表1。
(8)进行第二轮筛选：用上一轮筛选后扩增的洗脱物中的2×1011pfu的噬菌体量重复步骤(2)-(4)，在清洗步骤中将Tween浓度调整到0.3％(v/v)。第二轮洗脱物扩增后测定滴度用于第三轮的筛选。
(9)第三轮筛选：第二轮洗脱物扩增后测定滴度后用于第三轮的筛选。同时使用0.4％(v/v)Tween20浓度用于清洗步骤。第四至五轮筛选按上述步骤进行。第五轮筛选后所得的洗脱物在LB/IPTG/Xgal平板上测定滴度。平板可贮存于4℃冰箱中，在1-3天内挑选蓝色噬菌斑进行测序。
(10)噬菌斑的扩增
①挑选ER2738单克隆接种到含四环素的LB培养基中过夜培养，第二天按1:100的比例稀释到LB培养基中，将培养基1mL每管分装到培养管中。每个噬菌斑需要一个培养管。在第三轮洗脱物测定滴度的平板上挑选蓝色噬菌斑到1mL含菌培养管中。
②37℃震荡培养4.5h。
③将上一步扩增的后的菌液转移到1mL干净EP管中，离心30s后将上清转移到另一干净EP管中，再次离心后取80％上清转移到干净EP管中。
(11)噬菌斑测序：使用biomiga M13单链噬菌体DNA提取试剂盒对扩增后的噬菌斑进行提取DNA，然后送上海睿迪生物技术有限公司测序。
表1.每轮筛选所获得的噬菌体滴度
Figure BDA0001147915830000061
单克隆噬菌体的测序
1.采用-96引物进行自动测序。测序过程由上海生工完成。
2.按噬菌体肽库的说明书中方法对测序所得结果进行分析，找出随机7肽的基因编码区，并按照说明书中提供精简遗传密码表(如下表2)写出相应的氨基酸序列。
表2精简遗传密码表
Figure BDA0001147915830000071
Elisa实验流程：
1.在5mL试管中过夜培养宿主菌ER2738，加入5μL四环素。
2.将过夜培养的ER2738按1:100的比例稀释于20mL LB培养基中。
3.对每一个要鉴定的噬菌斑克隆，于每瓶ER2738培养液中加入5μL噬菌体上清，37℃通气培养4.5hrs。
4.上述培养物转入离心管中，10,000rpm离心10min。上清移入新鲜离心管，再离心。
5.取80％上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀至少1hr或过夜。
6.4℃10,000rpm 15min离心沉淀，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。
7.沉淀重悬于1mL TBS中，悬液转入微量离心管，4℃离心5min除去沉淀中的残留细胞。
8.上清转入新鲜微量离心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用15-60min。4℃离心10min，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。
9.沉淀重悬于50μL TBS中，取10μL测定噬菌体滴度，37℃过夜培养。剩余噬菌体4℃贮存。
10.用100μL的E.coli O157:H7细菌细胞(溶于pH7.4PBS溶液中)包被96孔板。4℃包被过夜。
11.甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液。每孔加满封阻液(脱脂奶粉溶于PBS/Tween)。在将噬菌体加入靶分子包被板前，还要再准备一个微量滴定板进行噬菌体的系列稀释，这个板也要封阻。单独在另外一个封阻板中进行稀释是为了避免稀释过程中有噬菌体吸附到靶分子上。所有封阻板4℃封阻1-2hrs。
12.甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液，Tween浓度应当与淘选清洗步骤中所用浓度相同(0.05％)。
13.在单独的封阻板中每孔预先加入200μL TBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒子开始对噬菌体进行2倍梯度稀释至第12孔4.8×108个病毒子。
14.用多通道移液器将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中。室温震荡作用1-2hrs。
15.用1×TBS/Tween洗板6次(同步骤12)。
16.在封阻液中以1:5,000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体(GE)。每孔加入200μL稀释抗体，室温震荡作用1hr。
17.用1×TBS/Tween洗板6次(同步骤12)。
18.按下述方法准备HRP底物溶液：
ABTS贮液可以提前准备：将11mg ABTS(Sigma#A1888)溶于50mL,50mM的柠檬酸钠溶液(pH 4.0)中，过滤除菌，4℃贮存。对每个待检测板，于检测步骤前将86μL 30％的H2O2加入50mL ABTS贮液中。
19.每孔加200μL底物溶液，室温作用10-60min。
20.用读板仪记录405nm处的吸光值。
21.多肽P1对大肠杆菌O157:H7的亲和性见图3。
筛选多肽序列性质分析
针对测序出的噬菌体单克隆的单链DNA序列，通过序列比对获得外源插入的DNA序列，从而推出多肽的氨基酸序列，多肽的二级结构通过强耀生物的多肽计算器获得(http://www.chinapeptides.com/toolcfuben.php)，见图1，图2。
序列表：
Figure BDA0001147915830000091
进行多次筛选，一共筛得23条多肽，上表为7条多肽在23条中的出现概率。其中P1～P4重复率较高。
BCA试剂盒法对多肽吸附三种细菌的吸附量进行测定
1.配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A，1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2.稀释标准品：取10μl标准品用PBS稀释至100μl(标准品一般可用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到 96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20μl。
3.在96孔板中培养大肠杆菌O157：H7，枯草杆菌和大肠杆菌DH-5α
4.加适当体积多肽溶液到96孔板中，补加PBS到 20μl。
5.各孔加入 200μl BCA工作液，37℃放置30分钟。
6.冷却到室温，用酶标仪测定A562处的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度，从何测得四段多肽对三种菌的亲和度，见图4。
BCA试剂盒法对四条多肽吸附大肠杆菌O157：H7菌膜的吸附量进行测定
1.配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A，1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2.稀释标准品：取10μl标准品用PBS稀释至100μl(标准品一般可用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到 96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20μl。
3.在96孔板中培养大肠杆菌O157：H7菌膜。
4.加适当体积多肽溶液到96孔板中，补加PBS到 20μl。
5.各孔加入 200μl BCA工作液，37℃放置30分钟。
6.冷却到室温，用酶标仪测定A562处的吸光度，根据标准曲线计算出上清液蛋白浓度，从何测得四段多肽对大肠杆菌O157：H7的亲和度，见图5。
实施例2.利用大肠杆菌O157：H7亲和十二肽制备新型溶菌酶
PCR引物设计、合成与PCR扩增
引物设计与合成
正向引物：
5’—CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAT—3’(SEQ ID NO.9)
反向引物：
5’—CCGCTCGAGTTAGTGCTGCCAGTCATAGGCCTCCTTATACACACCGCTGCTACCACCACCACCAACACCGCAAC—3’(SEQ ID NO.10)
目的基因PCR扩增
针对大肠杆菌，筛选得到的多肽：
P1：SGVYKVAYDWQH(SEQ ID NO.1)，根据大肠杆菌密码子偏好性查得：AGCGGUGUGUAUAAGGUGGCCUAUGACUGGCAGCAC(SEQ ID NO.13)
PCR反应体系：引物、聚合酶、模板(人溶菌酶hly)、缓冲液
PCR反应热循环程序：95℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
克隆载体的构建
目的基因与载体的连接
以实验室筛选得到的多肽P1，载体质粒pET28a，通过分段合成引物，利用PCR的方法在P1的上游5’端引入编码激酶识别位点的序列和Thrombin酶切位点，在下游5’端引入终止密码子和BamH I酶切位点。
以Nde I/BamH I双酶切阳性克隆质粒，回收编码P1的DNA片段，与经同样双酶切的pETl5b进行连接。转化Ecoli DH5α感受态细胞。筛选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定。
通过PCR搭桥方法，最终获得编码P1-溶菌酶融合蛋白的DNA片段。将该片段目的蛋白克隆至原核表达载体pET28a中，从而获得重组质粒。以正向引物：
5’—CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAT—3’(SEQ ID NO.11)
反向引物：
5’—CCGCTCGAGTTAGTGCTGCCAGTCATAGGCCTCCTTATACACACCGCTGCTACCACCACCACCAACACCGCAAC—3’(SEQ ID NO.12)
为上下游引物，扩增出编码P1-溶菌酶融合蛋白的DNA片段，并连接到大肠杆菌表达载体pET-28a中，获得重组表达质粒。并按照上述的方法获得对照重组表达质粒。将质粒转化到大肠杆菌中，卡那霉素抗性筛选重组转化子并送上海睿迪生物科技有限公司进行测序，测序结果见图6。
目的基因的诱导表达及复性
目的基因的诱导表达
从4C,5C培养液中各取1mL培养液到三角烧瓶培养基中，放置37℃摇床中培养2h。
各取50μL菌液接入到三角烧瓶培养基中，37℃摇床中过夜培养。
表达物的提取
将全部培养液放置离心管中，进行离心(8000rpm)，离心两分钟。倒掉上层清液，剩余的细菌沉淀用PB7.4缓冲溶液摇匀。
用真空细胞破碎机进行破碎细菌沉淀，蛋白质从而被破碎出来(重复操作2-3次)，放置装有冰块杯子中，然后在放置于冰箱中保存，待下一操作步骤。
蛋白质脱离：
脱离柱用PB液过滤两次，倒入细菌破碎液，过滤完后接上PB7.4缓冲溶液洗过的针头。倒入10mL的50mmol/L的吡唑溶液，用离心管接流下的液体；加10mL的100mmol/L的吡唑溶液并接流下液体；加10mL的200mmol/L的吡唑溶液并接流下液体。去掉针头，加入约10mL的500mmol/L的吡唑溶液过滤，再加入70％酒精进行过滤，过滤到剩一半酒精时封好出口放置保存待用。4C,5C细菌破碎液按以上步骤各操作一次，所得脱离产物放置冰箱保存。
包涵体的复性和梯度复性
透析复性：
透析袋的预处理：
在2％NaHCO3和1mM EDTA(PH 8.8)中煮沸10min，用超纯水彻底清洗透析袋，再在1mM EDTA(pH 8.8)中煮沸10min，冷却后存放于20％乙醇中。
包涵体的洗涤：
以100mL菌体破碎液加10mL洗涤液的比例添加洗涤液。本次实验4C，5C两离心管各200mL，因此各加20mL洗涤液。每次洗涤10min，再离心15min(保留1mL上层清液和2μg沉淀)。剩余沉淀再洗涤两次，每次离心后均保留1mL上层清液和2μg沉淀。
洗涤液配制：15％葡萄糖，pH8.0，5mmol/L EDTA，0.5mmol/L PMSF,1％Triton x-100PBS。
包涵体溶解：
以菌体破碎液：溶解液比例为100:10加入溶解液，搅拌2h，包涵体溶解液在4℃条件下，离心机10000rpm离心15min(沉淀和上层清液分别取样1mL，沉淀用PBS来溶解)，取上层清液，随后进行透析。
溶解液(蛋白复性溶解液)配制：50mmol/L Tris-HCl,5mol/L盐酸胍，pH8.0。
透析：
将上层清液蛋白放入透析袋中，用专用夹子夹紧透析袋的两边，以防蛋白液漏出。然后将装有蛋白液的的透析袋放入透析液(500mL)中，透析进行6小时。重复透析两次。以上步骤都在冰浴或者在4℃条件下进行操作，以确保融合蛋白活性不丢失。
透析液配制：50mmol/L Tris-HCl,0.1％Triton x-100，pH8.0。
Tris-HCl溶液配制：0.5mol/L Tris pH8.0。
梯度复性：
透析液配制：
(1)4mol/L盐酸胍，50mmol/L Tris-HCl,0.1％Triton x-100，pH8.0。
(2)2mol/L盐酸胍，50mmol/L Tris-HCl,0.1％Triton x-100，pH8.0。
(3)1mol/L盐酸胍，50mmol/L Tris-HCl,0.1％Triton x-100，pH8.0。
(4)0mol/L盐酸胍，50mmol/L Tris-HCl,0.1％Triton x-100，pH8.0。
将上层清液蛋白(5C)放入透析袋中，用专用夹子夹紧透析袋的两边，以防蛋白液漏出。然后将装有蛋白液的的透析袋放入透析液(500mL)中，透析进行6小时。按以上透析浓度由高到低分别进行透析，每次6小时，共四次。
表达的蛋白电泳见图7。
溶菌酶的酶活测定
培养基的配制：蛋白胨5g；牛肉膏3g；氯化钠5g；琼脂粉20g；蒸馏水1000mL；调节pH至7.0～7.2。
菌悬液的制备：将溶壁微球菌(Micrococcus Lysodeiklicus)接种到液体培养基上，摇床温度35℃，转速200r/min，培养时间24h；将上述扩大培养后的液体装入离心管，离心(4000r/min，20min)，弃上清液，所得的沉淀即为菌体，加入少量0.9％的灭菌生理盐水洗涤菌体，再离心弃上清液，如此反复洗涤离心菌体3次，所得的菌体沉淀添加少量 20％的灭菌甘油做保护剂，冰箱中冷冻保存。使用时冰浴解冻，然后在灭菌研钵中充分研磨20min，用pH 6.2的磷酸盐缓冲液稀释研磨后的菌悬液并测定其在450nm处的OD值，调节菌悬液OD450在1.0左右。
活力测定：将待测酶液和菌悬液分别置于25℃水浴30min，吸取菌悬液2.8mL置1cm比色杯中测定其在450nm处的OD值，此为零时读数，然后加入酶液0.2mL，迅速摇匀，从加入酶液起计时，每隔一分钟测定一次OD450，共测定三次。本试验酶活力单位定义为每分钟OD值下降0.001为一个活力单位(25℃、pH 6.2)。
酶活力(U)＝(ΔOD450/min)*103
酶比活力(U/mg)＝(ΔOD450/min)*103/样品毫克数
结果见图8。
验证体相溶液中、界面上的抗菌活性
96孔平板法：
大肠杆菌接种于试管培养基中，37℃条件下摇床中过夜培养。
平板每孔：加入100μl大肠杆菌菌液，共加50孔，然后放置37℃条件下摇床中培养12小时以上。
平板每孔：吸出培养基，加200μl PBS缓冲液洗涤3次，再加入15μl甲醇，放置室温条件下自然烘干15min。
选择3-5个孔：加入100μl 0.1％结晶紫染液染色5min，再吸出染液，用PBS缓冲液进行清洗。
显微镜下观察是否有大肠杆菌吸附，观察结果显示未观察到大肠杆菌，所以大肠杆菌并未形成膜从而吸附在平板上，只能用简单方法(平板划线法)进行验证。
平板划线法：
100微升大肠杆菌中加入10μl溶菌酶，划线接种进行对比菌落数量和菌落大小，从而对比每种抗菌酶对大肠杆菌的抗菌效果。各取2mg酶溶于1mL无菌PBS缓冲溶液中，配制成2mg/mL浓度的酶溶液，或者各取2μl酶溶于1mL无菌PBS缓冲溶液中，配制成2μl/mL浓度的酶溶液，放置冰箱中备用。取4支离心管，分别加入100μl大肠杆菌O157菌液，再各加入100μl酶溶液。然后用接种环迅速沾取大肠杆菌O157菌液进行平板划线。结果见图9。
注意，每次的样品操作步骤要一致，时间长短控制在一致范围内。各步骤均在无菌超净台条件下操作，以确保无其它杂菌混入从而影响到实验结果的正确性和可对比性。
实施例3.实际蔬菜水果表面细菌的清除效果
本次试验用的水果是小番茄，通过以上对比发现各种商业抗菌酶中溶菌酶抗菌效果较好，所以主要用溶菌酶与融合蛋白进行实际蔬菜水果表面细菌清洗效果的比较。每个样品操作步骤、时间、条件均要控制在相同情况下，以排除其他干扰因素影响实验结果，从而确保最终溶菌酶与融合蛋白抗菌效果相比较的实验结果的准确性和可靠性。
水中以50：2的比例加入融合蛋白、溶菌酶和空白组，用来比较清洗效果(用涂板法和平板划线法进行各自对照比较水果的清洗效果)。
用50mL超纯水加入2mL表达产物融合蛋白来清洗三颗小番茄；50mL超纯水加入2mL2mg/mL溶菌酶清洗三颗小番茄；50mL超纯水清洗三颗小番茄。三者清洗后进行划线培养、涂板培养对比。结果见图10。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东理工大学
<120> 大肠杆菌O157：H7亲和十二肽及其筛选方法和应用
<130> /
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala Tyr Asp Trp Gln His
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Gly Leu His Thr Ser Ala Thr Asn Leu Tyr Leu His
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Val Val Ser Pro Asp Met Asn Leu Leu Leu Thr Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Val Phe Ser Ser Met Val His Val Leu Asn Thr His
1 5 10
<210> 5
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val
1 5 10 15
Gln Gly Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg
20 25 30
Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys
35 40 45
Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg
65 70 75 80
Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His
85 90 95
Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala
100 105 110
Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val
115 120 125
Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln
130 135 140
Gly Cys Gly Val Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala
145 150 155 160
Tyr Asp Trp Gln His
165
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Gly Ser Ala Pro Leu Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Cys Tyr Ala Gly His Asp Leu Tyr Val Ala Ala Asp
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Ser Leu Ser Trp Leu Thr Lys Met Gln Met Glu Met
1 5 10
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ctttaagaag gagatatacc atggat 26
<210> 10
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ccgctcgagt tagtgctgcc agtcataggc ctccttatac acaccgctgc taccaccacc 60
accaacaccg caac 74
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ctttaagaag gagatatacc atggat 26
<210> 12
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
ccgctcgagt tagtgctgcc agtcataggc ctccttatac acaccgctgc taccaccacc 60
accaacaccg caac 74
<210> 13
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 13
agcggugugu auaagguggc cuaugacugg cagcac 36

Claims (6)

1.大肠杆菌O157：H7亲和十二肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
2.大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备针对大肠杆菌O157：H7的抗菌材料中的应用，其特征在于，所述亲和十二肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示。
3.大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备针对大肠杆菌O157：H7的检测试剂或检测芯片中的应用，其特征在于，所述亲和十二肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示。
4.大肠杆菌O157：H7亲和十二肽在制备溶菌酶中的应用，其特征在于，将SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示十二肽与人溶菌酶进行融合表达，得到对大肠杆菌O157：H7具备亲和性的溶菌酶。
5.一种溶菌酶，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示十二肽与人溶菌酶进行融合表达获得，其氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。
6.权利要求5所述溶菌酶在制备食品清洗消毒剂中的应用。
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