JP6935876B2

JP6935876B2 - 新規ペプチド及びその利用方法

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Publication number: JP6935876B2
Application number: JP2016112986A
Authority: JP
Inventors: 光雄山下; 彰三浦
Original assignee: JX Nippon Mining and Metals Corp; Shibaura Institute of Technology
Current assignee: JX Nippon Mining and Metals Corp; Shibaura Institute of Technology
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2016-06-06
Publication date: 2021-09-15
Anticipated expiration: 2036-06-06
Also published as: AU2017278424A1; JP2017216919A; CA3026798A1; US11168113B2; AU2017278424B2; CA3026798C; CN109476703A; PE20190468A1; CN109476703B; WO2017213153A1; CL2018003485A1; US20190345200A1

Description

本発明は新規ペプチド及びその利用方法に関する。より具体的には特定の元素に特異的に結合する新規ペプチド及びその利用方法に関する。

モリブデンは特殊鋼の合金成分、石油精製の触媒、潤滑剤などに用いられる有価な元素である。このモリブデンは、斑岩銅鉱床（ポーフィリー型鉱床）などに輝水鉛鉱などの硫化鉱物として硫化銅鉱石に付随して存在する場合が多く、モリブデン精鉱として回収される。斑岩銅鉱床から生産されるモリブデン精鉱は、硫化銅鉱物の濃集・精製過程における浮遊選鉱（以下浮選という）の副産物として回収されている。輝水鉛鉱は浮上し易い鉱物であり、浮選剤としてケロシンや軽油等に起泡剤を添加することによって比較的容易に浮上させることができる。ただし、付随する硫化銅鉱物も浮遊性が高いため、硫化銅鉱物の浮上を抑制するための浮上抑制剤として、シアン化合物や水硫化ソーダを添加する必要がある。

しかしながら、シアン化合物利用ではシアン化合物の毒性による環境汚染の危険性があり、水硫化ソーダ利用では鉱石スラリーが酸性を示す場合などに硫化水素が発生する危険性があった。

そこで、モリブデン精鉱精製方法として、毒性物質の利用や発生しない方法として、特許文献１に示すようなオゾン酸化を利用する方法や、特許文献２に示すようなプラズマ照射を行う方法が提案されてきた。また、特許文献３に示すように、アミノ酸を無機材料に担持させてモリブデンを回収する方法も提案されている。

特許第３２７７５３２号公報特開２０１４−１８８４２８号公報特開２０１５−２２４２２５号公報

上述した文献に記載されている方法では、オゾン利用やプラズマ照射のための特別な装置の導入が必要となり、現実的な方法ではなく、現在までに実用化されていない。

本発明は、モリブデンを含む物質を分離するための新規な方法を提供する事を目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定のペプチドおよびペプチドを提示したファージが輝水鉛鉱に選択的に結合することを見出した。また、それらのペプチドが輝水鉛鉱の精製に有効であることを見出した。

上記知見に基づき、本発明は一側面において以下の発明を包含する。

（発明１）
下記アミノ酸配列（１）及び／又は（２）のアミノ酸配列を有するペプチド。
（１）（ＡＬＲＫＮＭＤＦＣＰＱＳＥＴＧＷＨＹＩＶ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＨＰＷＲＫ）−（ＴＳＮＱ）−（ＴＳＮＱ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＴＳＮＱ）−（ＴＳＮＱ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＦＹＷ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＨＰＷＲＫ）
（２）（ＬＩＶＦＡ）−（ＲＨＫ）−（ＴＳＮＱ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＴＳＮＱ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＲＨＫ）−（ＲＨＫ）−（ＨＰＷ）
｛ただし、上記式の（）中の少なくとも１種のアミノ酸のいずれか１つが選択される｝

（発明２）
以下のうち、いずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ

（発明３）
以下のうち、いずれか１つのアミノ酸配列で表されるペプチド。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ

（発明４）
以下のうち、いずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含むペプチド。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ

（発明５）
以下のうち、いずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を含むペプチド。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ

（発明６）
以下のうち、いずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である配列を含むペプチド。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ

（発明７）
以下のいずれか１つのアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含むペプチド。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ

（発明８）
鉱物を選別するための組成物であって、発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチドを含む、該組成物。

（発明９）
発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチドをコードする核酸。

（発明１０）
発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチドをコードする核酸の配列と少なくとも９０％以上同一の配列を有する核酸。

（発明１１）
発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチドをコードする核酸の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。

（発明１２）
発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチドを表面に提示した微生物。

（発明１３）
発明９〜１１のいずれか１つに記載の核酸を有する微生物。

（発明１４）
発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチドを表面に有する微粒子。

（発明１５）
発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチドを有する精製カラム。

（発明１６）
発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチドを有する捕収剤。

（発明１７）
発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチドを使用する、モリブデンを抽出するための方法。

（発明１８）
発明１〜７のいずれか１つに記載のペプチド又は発明８の組成物を使用する、鉱物を選別するための方法。

（発明１９）
発明１８に記載の方法であって、前記鉱物が輝水鉛鉱である、該方法。

（発明２０）
発明１８又は１９に記載の方法であって、
前記ペプチドを表面に有する微生物を、鉱物粒子が分散した液に添加するステップと、
前記鉱物を凝集させ、沈降させるステップと、
前記凝集及び沈降した鉱物を回収するステップと
を含む方法。

（発明２１）
発明１８又は１９に記載の方法であって、
前記ペプチドを担体に固定するステップと、
前記担体をカラムに導入するステップと、
鉱物粒子が分散した液を前記カラムに通過させるステップと
を含む方法。

（発明２２）
発明１８又は１９に記載の方法であって、
前記ペプチドを微粒子に固定するステップと、
鉱物粒子が分散した液に、前記微粒子を添加するステップと
を含む方法。

（発明２３）
発明１８又は１９に記載の方法であって、
前記ペプチドを用いた浮遊選鉱を行うステップ
を含む方法。

（発明２４）
発明１８〜２３いずれか１つに記載の方法であって、鉱物を懸濁させた液のｐＨが４以上である、該方法。

（発明２５）
発明１８〜２３いずれか１つに記載の方法であって、鉱物を懸濁させた液のｐＨが７以上である、該方法。

一側面において、本発明では、ペプチドを活用する。これにより、従来の方法に比べて、大規模な設備を要さない。また、シアン化合物や水硫化ソーダなど毒性を有する化合物もしくは毒性化合物を発生する恐れのある化合物を使用する必要がない。従って、安全に分離を行うことができる。

また、本発明で用いるペプチドは、効率的に分離を行うことを可能にする。さらに言えば、目的の鉱物を選択的に分離することができる。更に、一側面において、本発明のペプチドは特定のｐＨ範囲の環境下で使用することができる。これにより、モリブデンを含む鉱物の結合（更には凝集）を更に促すことができる。

本発明の一実施形態に係るペプチドが、特定の鉱物に選択的に結合することを示すグラフである。各群の５本のバーは、左から順に輝水鉛鉱、硫黄、黄銅鉱、硫砒銅鉱、黄鉄鉱を表す。本発明の一実施形態に係る５０−ｐｈａｇｅ等を用いて輝水鉛鉱を沈降させたときの濁度変化を表すグラフである。本発明の一実施形態に係る５０−ｐｈａｇｅ等を用いて輝水鉛鉱を沈降させたときの粒子径を表す写真である。本発明の一実施形態に係る５０−ｐｈａｇｅ等を用いて輝水鉛鉱を沈降させたときの濁度変化を表すグラフである。本発明の一実施形態に係る５０−ｐｈａｇｅ等を用いて輝水鉛鉱を沈降させたときの最大粒子径の変化とｐＨ依存性を表すグラフである。

以下、本発明の理解を促進するために、具体的な実施形態を挙げて説明する。以下の実施形態の説明は本発明の範囲を限定することを意図したものではない。

１．適用対象の物質
本発明は、一実施形態において、特定の物質を分離する方法に適用することができる。特定の物質として、モリブデンを含む物質が挙げられる。より具体的には、モリブデンを含む鉱物を分離する方法に適用することができる。モリブデンを含む鉱物としては、輝水鉛鉱、モリブデン鉛鉱、パウエライト、鉄水鉛鉱等が挙げられる。実質採掘されているという観点から、典型的なモリブデンを含む鉱物として、輝水鉛鉱が挙げられる。

２．ペプチド
上述した物質を分離するため、本発明は、一実施形態において、ペプチドを用いることができる。より具体的には、少なくとも以下のいずれか１つの配列を含むペプチドを用いることができる。典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０のうちから選択される２つの数で規定される範囲（例：１以上１０以下、５以上２０以下）のアミノ酸をＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加することができる。

（１）（ＡＬＲＫＮＭＤＦＣＰＱＳＥＴＧＷＨＹＩＶ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＨＰＷＲＫ）−（ＴＳＮＱ）−（ＴＳＮＱ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＴＳＮＱ）−（ＴＳＮＱ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＦＹＷ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＨＰＷＲＫ）
（２）（ＬＩＶＦＡ）−（ＲＨＫ）−（ＴＳＮＱ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＴＳＮＱ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＬＩＶＦＡ）−（ＲＨＫ）−（ＲＨＫ）−（ＨＰＷ）
｛ただし、上記式の（）中の少なくとも１種のアミノ酸のいずれか１つが選択される｝

後述する実施例においては、以下のアミノ酸配列のペプチドを用いて、輝水鉛鉱を分離した例が示されている。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ

上記（１）及び（２）に記載のアミノ酸配列と、上記（Ａ）及び（Ｂ）に記載のアミノ酸配列とを対比させると以下の通りとなる。

表１にあるように、配列（Ａ）１番目はグリシンである。グリシンの側鎖は（−Ｈ）なので、これ自体で特定の機能に関与する可能性は低いと考えられる。従って、グリシン部分についてはすべての天然アミノ酸に置換しても同様の効果を有すると考えられる。

配列（Ａ）２番目はロイシンである。ロイシンは疎水性アミノ酸である。従って、同様の性質を持つ、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、アラニン等に置換しても同様の効果を有すると考えられる。

配列（Ａ）３番目はヒスチジンである。ヒスチジンは、ヘテロ環構造を側鎖に有する。従って、同様の性質を持つ、トリプトファンやプロリンに置換しても同様の効果を得られると考えられる。また、ヒスチジンは、極性電荷（塩基性）側鎖を有するアミノ酸である。従って、同様の性質を持つ、アルギニンやリジン（リシン）に置換しても同様の効果を得られると考えられる。

配列（Ａ）４〜５番目はスレオニン（トレオニン）及びセリンである。これらは、極性非電荷側鎖を有する。従って、同様の性質を持つ、スレオニン（トレオニン）、セリン、アスパラギン、グルタミンに置換しても、同様の効果を有すると考えられる。
配列（Ａ）の１０番目はチロシンである。チロシンは芳香族アミノ酸であるため、同様の性質を有するトリプトファンやフェニルアラニンに置換しても、同様の効果を有すると考えられる。

配列（Ｂ）の２番目はアルギニンである。アルギニンは、塩基性の側鎖を有する。従って同様の性質を持つ、リシンやヒスチジンに置換しても同様の効果を有すると考えられる。

以下、他のアミノ酸についても、同様の観点（親水性−疎水性、酸性−中性−塩基性、共通の官能基など）に基づいて置換可能と考えられる。

また、本発明は、一実施形態において、以下のアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ
アミノ酸配列（Ａ）及び（Ｂ）のＮ末端側及び／又はＣ末端側には、任意の数のアミノ酸が付加されてもよい。典型的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０のうちから選択される２つの数で規定される範囲（例：１以上１０以下、５以上２０以下）のアミノ酸をＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加することができる。

また、本発明は、一実施形態において、以下の１２個のアミノ酸配列で表されるペプチドを包含する。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ

上記したアミノ酸配列（Ａ）及び（Ｂ）については、軽微な改変（例：アミノ酸の挿入、置換、付加）を行ったとしても、アミノ酸配列（Ａ）及び（Ｂ）と同様の機能を発揮することができる。例えば、アミノ酸配列（Ａ）及び（Ｂ）と６６％以上、７５％以上、８３％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上同一であるペプチド又は該同一性を有する配列を含むペプチドも同様の機能を発揮することができる。

配列の同一性の数値の算出方法については、当分野で公知の手法を用いることができる。例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）が提供するアミノ酸（又はタンパク質）のホモロジー検索で用いるＢｌａｓｔｐなどで判定される数値に基づいてもよい。

また、本発明は、一実施形態において、以下のいずれか１つのアミノ酸配列において、１〜５個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含むペプチドを包含する。典型的には、４個以下、３個以下、又は２個以下のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含むペプチドを包含する。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ

また、本発明は、一実施形態において、上述したペプチドを含有する組成物を包含する。即ち、上述したペプチドを単独で用いるのみならず、他の成分を含めた組成物でも、同様の機能を発揮することができる。当該組成物は、上述したペプチドの機能を損なわない範囲で任意の成分を含有することができる（緩衝剤、塩化ナトリウム、糖類など）。

４．ペプチドをコードする核酸
本発明は、一実施形態において、上述したペプチドをコードする核酸を包含する。核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。また、本発明は、一実施形態において、上述したペプチドをコードする核酸のセンス鎖に対して相補的な配列を有する核酸であってもよい。

更に、本発明は、一実施形態において、上述したペプチドをコードする核酸をコードする核酸配列と、少なくとも８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上同一の配列を有する核酸を包含する。配列の同一性の算出方法については、上述したアミノ酸配列と同様公知技術を用いて算出できる。例えば、ＢＬＡＳＴのＢｌａｓｔｎ等で検索したときに判定される数値に基づいてもよい。

更に、本発明は、一実施形態において、上述したペプチドをコードする核酸のセンス鎖に対して相補的な配列と、ハイブリダイズすることができる核酸を包含する。より具体的には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる核酸を包含する。ストリンジェントな条件とは、当分野で公知の基準を用いることができる。例えば、特開２０１５−０２３８３１号に記載されているような基準を条件にしてもよい。具体的には、ＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる条件を意味する。

上述したいずれの核酸も、遺伝子工学的な手法を通して、目的とするペプチドを製造するのに有用である。例えば、上述したいずれの核酸を、発現ベクターに組み込んで目的のペプチドを大量に発現させることができる。あるいは後述するファージディスプレイ法を用いて、表面に目的のペプチドを有するファージを製造することができる。

５．ペプチド及び／又は核酸を利用した物
上述したペプチド及び／又は核酸は、様々な形で応用することができる。

５−１．微生物
例えば、遺伝子工学的な手法を用いて（例えば、微生物の遺伝子に上述した核酸を導入して）、微生物に目的のペプチドを大量に生成させることができる。あるいは、微生物の表面に目的のペプチドを発現させて、該微生物を利用して、目的の物質を分離することができる。本明細書で述べる「微生物」には、五界説で述べるところの菌界、モネラ界、又は原生生物界に属する生物が含まれる。また、厳密な意味では生物には該当しないものの、本明細書で述べる「微生物」には、ウイルスも含まれる。典型的には、真菌、細菌、ウイルスを用いる。特に好ましいのは、遺伝子工学的な手法が確立された物である（例：酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、乳酸菌、バクテリオファージなど）。本発明は、一実施形態において、このような微生物を包含する。

５−２．微粒子
本発明は、一実施形態において、ペプチドを表面に有する微粒子を包含する。ペプチドは、上述したペプチドを用いることができる。また、微粒子は、ビーズ（例：磁気ビーズ、ガラスビーズ、高分子ビーズなど）、担体等が挙げられる。微粒子の大きさについては、特に限定されず、用途に応じて適宜調整すればよい。また、微粒子の表面にペプチドを結合させる手法については、当分野で公知の手法を用いることができる。

本発明では、上述したペプチドを表面に有する微粒子を用いて、目的の物質を分離することができる。例えば、後述する方法を用いて、目的の物質を、ペプチドに結合させて沈降させることにより、分離することができる。

５−３．精製カラム
目的の物質を分離する方法としてカラムクロマトグラフィーが挙げられる。カラムクロマトグラフィーは、カラム（カラム表面の官能基）が特定の物質に選択的に結合することを利用する。本発明の一実施形態では、上述したペプチドを担体に担持させることができる。そして、この担体をカラムに導入することができる。こうしたカラムを使用することにより、目的の物質を分離することができる。

５−４．浮遊選鉱の捕収剤
浮遊選鉱（浮選）は、微粒子を気泡にトラップさせることにより分離する方法である。この際に、捕収剤を使用することができる。本発明の一実施形態では、上述したペプチドが気泡にトラップされやすい場合には、ペプチドそのものを捕収剤として用いることができる。もしくは、ペプチドを公知の捕収剤や起泡剤に結合し、気泡にトラップしやすい形態として用いることができる。これにより、目的の物質を気泡にトラップすることができ、結果として分離することができる。

６．応用形態（分離方法）
上述した応用形態に関する方法を以下具体的に説明する。

６−１．分離対象
上述した応用形態はいずれも所定の物質を分離することに関する。ここで、分離対象の物質はモリブデンである。例えば、上述したモリブデン含有鉱物（例えば、輝水鉛鉱）を分離することができる。

６−２．微生物を用いた分離方法
本発明は、一実施形態において、微生物を用いて、物質（具体的には、モリブデン含有鉱物、より具体的には輝水鉛鉱）を分離することができる。微生物としては、上述した微生物であれば、いずれも用いることができる。典型的にはバクテリオファージが挙げられる。

方法としては、まず、公知の遺伝子工学的な手法により、上述したペプチドをコードする核酸配列を微生物に導入し、微生物の表面に発現させることができる。その後、鉱物粒子が分散した液に、微生物を添加することができる。

微生物の添加量については、溶液中に分散している鉱物粒子の量などの諸条件を考慮しながら適宜決定することができる。ファージを用いた例としては、鉱物粒子の量３ｇ／Ｌに対し、０．５×１０⁸ｐｆｕ／ｍＬ〜５×１０⁸ｐｆｕ／ｍＬ、より好ましくは、０．６×１０⁸ｐｆｕ／ｍＬ〜１．５×１０⁸ｐｆｕ／ｍＬである。あるいは、鉱物粒子の量１０ｇ／Ｌに対し、０．５×１０⁹ｐｆｕ／ｍＬ〜５×１０⁹ｐｆｕ／ｍＬ、より好ましくは、０．６×１０⁹ｐｆｕ／ｍＬ〜１．５×１０⁹ｐｆｕ／ｍＬであってもよい。

あるいは、ファージ量（ｐｆｕ／ｍＬ）／鉱物量（ｇ／Ｌ）の比率が、０．１３×１０⁸〜５×１０⁸、より好ましくは０．３３×１０⁸〜１×１０⁸である。

微生物を添加した後、暫く放置すると、微生物表面にあるペプチドが鉱物粒子と結合し、凝集が起こる。そして、溶液の底に沈降する。その後、底に沈降した鉱物を回収することができる。

６−３．カラムクロマトグラフィーを用いた分離方法
本発明は、一実施形態において、カラムクロマトグラフィーを用いて、物質（具体的には、モリブデン含有鉱物、より具体的には輝水鉛鉱）を分離することができる。方法としては、まず、上述したペプチドを、公知の手法により、担体に固定させることができる。その後、その担体を精製用のカラムに導入することができる。前記カラムが準備できたら、分離対象の物質が分散した液を、前記カラムの中に通す。すると、前記物質は、カラムの中に結合するか、又は溶出が遅れる。これにより、特定の物質を分離することができる。

６−４．微粒子を用いた分離方法
本発明は、一実施形態において、微粒子を用いて、物質（具体的には、モリブデン含有鉱物、より具体的には輝水鉛鉱）を分離することができる。まず、上述したペプチドを、公知の手法により、微粒子表面に固定させることができる。その後、鉱物粒子が分散した液に、微粒子を添加することができる。微粒子を添加した後、暫く放置すると、微粒子表面にあるペプチドが鉱物粒子と結合し、凝集が起こる。そして、溶液の底に沈降する。その後、底に沈降した鉱物を回収することができる。あるいは、微粒子として磁気ビーズを用いることができ、沈降することを待つことなく、磁力を用いて、鉱物粒子を回収することができる。

６−５．浮選を用いた分離方法
本発明は、一実施形態において、捕収剤又は起泡剤を用いて、物質（具体的には、モリブデン含有鉱物、より具体的には輝水鉛鉱）を分離することができる。具体的には、捕収剤又は起泡剤を、公知の方法により、上述したペプチドと結合させる。そして、結合させた捕収剤を溶液に導入して撹拌させ（適宜他の薬剤も導入し）、気泡を発生させる。その後、鉱物粒子を導入し、該鉱物粒子を気泡にトラップさせる。これにより、鉱物粒子を回収することができる。あるいは、ペプチドそのものを捕収剤として使用してもよい。

７．鉱物との結合における選択性
上述したペプチドは、特定の鉱物に特に強く結合し、他の鉱物には結合しないという選択性を有する。より具体的には、モリブデンを含む鉱物（例：輝水鉛鉱）には強く結合し、他の鉱物（例えば、硫黄、黄銅鉱、硫砒銅鉱、黄鉄鉱）には、結合しない（又は、モリブデンを含む鉱物の場合と比べて結合度合いが著しく低い）という性質を有する。従って、モリブデンを含む鉱物と他の鉱物との混合物であっても、上述した方法を用いることにより、モリブデンを含む鉱物を分離することができる。

８．ｐＨ依存性
上述したペプチドが、モリブデンを含む鉱物（例：輝水鉛鉱）と結合する際には、溶液を特定のｐＨ範囲に調整することにより、結合（更には凝集）を促すことができる。具体的にはｐＨが増大する程、溶液中の粒度分布における最大粒子径が増大する。例えば、ｐＨが４〜１２の範囲、より好ましくはｐＨが５以上の範囲で、最大粒子径を増大させることができる。

９．ペプチドの作成方法
上述したペプチドは、様々な方法で製造することができる。上述したペプチドをコードするＤＮＡを、発現ベクターに組み込んで、微生物等に導入し、大量にペプチドを発現させて回収することができる。

あるいは、表面に上述したペプチドを提示したファージ（例えばＭ１３ファージ）を製造する場合には、ファージディスプレイ法を用いることができる。目的のペプチドを表面に提示した微生物については、公知の遺伝子工学的手法により製造することが可能である。

以下、実施例により、上述した本発明の実施形態をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）ファージディスプレイ法による輝水鉛鉱吸着ファージの選択
輝水鉛鉱に吸着するペプチド分子の選択としては、ファージディスプレイ法を用いた。具体的には、アミノ酸１２個がランダムに結合したＭ１３バクテリオファージライブラリーを用い、粒度７５μｍ以下に粉砕した輝水鉛鉱と接触させ、輝水鉛鉱に吸着したバクテリオファージのみを回収し、回収したファージについて大腸菌に感染させ再度増殖後、再び輝水鉛鉱に接触させ、吸着したファージのみを回収した。この吸着・回収操作（パニング）を数回繰り返し、選択されたファージのＤＮＡ配列を解析し、ファージに結合したアミノ酸配列を特定した。

１回目の選択では接触させる輝水鉛鉱パルプ濃度を３００ｐｐｍとしてパニングを５回繰り返した。２回目の選択では輝水鉛鉱パルプ濃度を３０００ｐｐｍとしてパニングを４回繰り返した。最終的に得られたファージのＤＮＡ配列を解析した結果、それぞれ以下（Ａ）および（Ｂ）に示すアミノ酸配列を持つペプチドが結合したファージが選択されたことを確認した。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ
以後、（Ａ）に示すペプチドが結合したファージを５０−ｐｈａｇｅ、（Ｂ）に示すペプチドが結合したファージをＭ４８−ｐｈａｇｅと呼ぶ。

（実施例２）輝水鉛鉱結合ファージのＥＬＩＳＡ分析
輝水鉛鉱と実施例１にて選択した５０−ｐｈａｇｅ、Ｍ４８−ｐｈａｇｅについて、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ、酵素結合免疫吸着法）により、輝水鉛鉱との結合量を測定した。具体的には輝水鉛鉱３０００ｍｇ／Ｌを懸濁した液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに添加し、それぞれのウェルに各ファージを添加後、未結合のファージを洗浄した。さらにこの懸濁液に酵素（ペルオキシダーゼ）標識した抗Ｍ１３ファージ抗体を添加したのち、未結合の抗ファージ抗体を洗浄した。ここに酵素の基質となる２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）を添加し、青色の発色をマイクロプレートリーダーで波長４０５ｎｍにて吸光度測定した。更に、これらの手順を、他の鉱物（硫黄、黄銅鉱、硫砒銅鉱、黄鉄鉱）に変更したうえで行った。

ペプチドを提示していないＭ１３ファージ（ｎｕｌｌ−ｐｈａｇｅ）と輝水鉛鉱とを接触させたときのＥＬＩＳＡ分析での吸光度を１００％したときの各鉱物および各ペプチド提示ファージでの吸光度の比率（すなわち、「ｎｕｌｌ−ｐｈａｇｅの輝水鉛鉱への結合量」に対する「ペプチド提示ファージの各鉱物への結合量の割合」）を図１に示す。図１に示す通り、５０−ｐｈａｇｅの輝水鉛鉱への結合量はｎｕｌｌ−ｐｈａｇｅを輝水鉛鉱に接触させた時の１２１％、Ｍ４８−ｐｈａｇｅの結合量は１０６％となった。また、他の鉱物（硫黄、黄銅鉱、硫砒銅鉱、黄鉄鉱）に対する５０−ｐｈａｇｅやＭ４８−ｐｈａｇｅ結合量は、輝水鉛鉱に対する結合量に対して極端に低く、ｎｕｌｌ−ｐｈａｇｅ結合量と比較すると有意な増加は見られなかった。従って、両ファージ（より具体的には、両ファージの表面に提示されたペプチド）が輝水鉛鉱に特異的に結合することが示された。

（実施例３）輝水鉛鉱３ｇ／Ｌ時の沈降速度測定と顕微鏡観察
温度３０℃において、粒子径７５μｍ以下の輝水鉛鉱を３ｇ／Ｌのパルプ濃度となるように水に懸濁した。この懸濁液に、５０−ｐｈａｇｅおよびｎｕｌｌ−ｐｈａｇｅの各ファージを１０⁷〜１０⁹ｐｆｕ／ｍｌとなる濃度に添加し、添加後ただちに懸濁液上部における濁度を波長６６０ｎｍにて分光光度計で添加時から５秒ごとに測定した。図２にその時の濁度の推移を示す（ファージ添加時＝０秒を１００％とする）。その結果、５０−ｐｈａｇｅを１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ添加した場合、迅速な濁度の低下すなわち輝水鉛鉱粒子の急速な沈降が確認された。また同条件における輝水鉛鉱粒子を光学顕微鏡にて観察したところ（図３）、５０−ｐｈａｇｅを輝水鉛鉱に添加した場合に、より顕著に輝水鉛鉱粒子が凝集することが確認された。本結果から、５０−ｐｈａｇｅを輝水鉛鉱懸濁液に適切な濃度で添加することで、輝水鉛鉱を選択的に分離回収できる可能性が示された。

（実施例４）５０−ｐｈａｇｅ添加時の沈降速度測定と顕微鏡観察
輝水鉛鉱粒子のパルプ濃度を１０ｇ／Ｌとした以外は実施例３と同様の方法にて５０−ｐｈａｇｅ添加時の沈降速度を測定した。その結果を図４に示す。輝水鉛鉱１０ｇ／Ｌ時には、５０−ｐｈａｇｅ濃度１０⁹ｐｆｕ／ｍｌにおいて輝水鉛鉱の沈降が顕著に進むことがわかった。

（実施例５）５０−ｐｈａｇｅ添加時の最大粒子径の変化とｐＨ依存性
温度３０℃において、粒子径７５μｍ以下の輝水鉛鉱を１０ｇ／Ｌのパルプ濃度となるように水に懸濁した。この懸濁液に、５０−ｐｈａｇｅを１０⁹ｐｆｕ／ｍｌとなる濃度で添加し、添加後、ＮａＯＨおよびＨＣｌで懸濁液のｐＨを所定の値に調整した。粒子径をＡｃｏｕｓｔｏＳｉｚｅｒＩＩｘ（協和界面科学（株）製）で測定した。結果を図５に示す。ｐＨが大きくなるほど、最大粒子径が増加する傾向が見られた。特にｐＨ４以上の場合に、輝水鉛鉱だけと比べて５０−ｐｈａｇｅを添加すると最大粒子径が顕著に増加する傾向が見られた。

Claims

モリブデンを含む鉱物を選別するための組成物であって、
前記組成物は、以下のうち、いずれか１つのアミノ酸配列で表されるペプチドを含み、前記ペプチドは、モリブデンを含む鉱物に結合する活性を有する、組成物。
（Ａ）Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
（Ｂ）Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ
請求項１のペプチドを使用する、モリブデンを含む鉱物を選別するための方法。
請求項２に記載の方法であって、前記鉱物が輝水鉛鉱である、該方法。
請求項２又は３に記載の方法であって、
前記ペプチドを表面に有する微生物を、鉱物粒子が分散した液に添加するステップと、
前記鉱物を凝集させ、沈降させるステップと、
前記凝集及び沈降した鉱物を回収するステップと
を含む方法。
請求項２又は３に記載の方法であって、
前記ペプチドを担体に固定するステップと、
前記担体をカラムに導入するステップと、
鉱物粒子が分散した液を前記カラムに通過させるステップと
を含む方法。
請求項２又は３に記載の方法であって、
前記ペプチドを微粒子に固定するステップと、
鉱物粒子が分散した液に、前記微粒子を添加するステップと
を含む方法。
請求項２又は３に記載の方法であって、
前記ペプチドを用いた浮遊選鉱を行うステップ
を含む方法。
請求項２〜７いずれか１項に記載の方法であって、鉱物を懸濁させた液のｐＨが４以上である、該方法。
請求項２〜７いずれか１項に記載の方法であって、鉱物を懸濁させた液のｐＨが７以上である、該方法。