CN106544361A - 哺乳动物细胞表达载体、表达系统、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种哺乳动物细胞表达载体、表达系统、制备方法和应用，属于基因工程技术领域。该表达载体包含TOP1 MAR序列(GenBank：L23999.1)，通过将外源目的基因插入载体的多克隆位点，能够构建TOP1 MAR‑启动子‑外源基因‑Poly A、启动子‑外源基因‑Poly A‑TOP1 MAR或者TOP1 MAR‑启动子‑外源基因‑Poly A‑TOP1 MAR载体结构，一方面克服转基因沉默，另一方面介导外源基因在宿主细胞中稳定、高效、持久表达。同等条件下，与不含MAR以及含1‑68 MAR的载体相比，本发明中表达载体能显著提高外源基因的表达水平，可用于重组蛋白的生产等。

Description

哺乳动物细胞表达载体、表达系统、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种哺乳动物细胞表达载体，同时还涉及包含该表达载体的表达系统、制备方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

基因工程是以分子遗传学为理论基础，在分子水平用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质DNA片段，经体外切割、拼接形成重组DNA，随后将重组DNA与载体连接形成重组表达载体，并将其导入到不含该DNA的受体细胞中，进行复制、转录和翻译表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。根据目的基因和表达系统的不同，分为原核生物基因工程、植物基因工程、动物基因工程和酵母基因工程。基因工程为工农业生产和医药卫生事业开辟了新的应用途径，也为基因相关性疾病的诊断和治疗提供了有效方法，具有广泛的应用价值。此外，基因工程还可应用于基因的结构、功能及其作用机制的研究，有助于对生命起源和生物进化等重大问题的探究。

目前，随着基因工程技术的发展和广泛应用，转基因沉默(Transgene silencing)和基因表达水平低下已成为转基因表达亟待解决的关键问题。研究证实转基因虽能够整合到宿主的基因组中，且保留完整的拷贝，但是转基因却不能稳定表达或表达水平低下，有时甚至完全被抑制。这种外源基因在宿主细胞中表达受到抑制的现象可称之为转基因沉默。为提高转基因表达水平和稳定性，研究人员在克服转基因沉默等方面进行了许多有益的尝试，比如在构建表达载体时选用强启动子、使用增强子，或在转基因操作时进行去甲基化处理等。其中利用核基质结合区(matrix attachment region，MAR)来提高转基因表达是近年来发展起来的克服外源基因沉默的一种有效方法。

MAR是真核生物细胞内染色质上可与细胞核基质结合的一段特殊DNA序列。该序列位于基因两侧的非编码区，富含AT碱基对。将MAR序列整合到表达载体中能够发挥表观调控因子作用，并降低转基因沉默(Harraghy N,Regamey A,Girod PA,et al.Identificationof a potent MAR element from the mouse genome and assessment of its activityin stable and transient transfections[J].J Biotechnol,2011,154(1):11-20；Harraghy N,Buceta M,Regamey A,et al.Using matrix attachment regions toimprove recombinant protein production[J].Methods Mol Biol,2012,801:93-110)。目前公开报道的4个来自人基因组的MAR序列分别是β-珠蛋白MAR、β-干扰素MAR、X-29和1-68，均已被证实能够显著提高转基因表达，以MAR1-68的效果最为显著(Girod PA,NguyenDQ,Calabrese D,et al.Genome wide prediction of matrix attachment regions thatincrease gene expression in mammalian cells[J].Nat.Methods,2007,4(9):747-753；Kim JD,Yoon Y,Hwang HY,et al.Efficient selection of stable Chinese hamsterovary(CHO)cell lines for expression of recombinant proteins by using humaninterferon beta SAR element[J].Biotechnol Progr,2005,21(3):933-937；Zahn-ZabalM,Kobr M,Girod PA,et al.Development of stable cell lines for production orregulated expression using matrix attachment regions[J].J Biotechnol,2001,87(1):29-42)。但是这些MAR在提高转基因表达水平方面仍不尽理想，一是MAR序列较长，如X-68序列有3614bp，二是转基因表达水平还有待提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种包含TOP1 MAR序列的哺乳动物细胞表达载体，该载体能驱动外源基因高效、持续、稳定表达。

同时，本发明还提供一种上述表达载体的制备方法。

最后，本发明再提供一种包含上述表达载体的哺乳动物细胞表达系统及其制备方法和应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

哺乳动物细胞表达载体，其上插入有TOP1 MAR序列(GenBank：L23999.1)，或者与该序列90％以上同源性的同源序列(如SEQ ID NO:2所示)。

所述表达载体的出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pEGFP-C1、pcDNA1.1、pCHO1.0等哺乳动物表达载体中的任意一种。

所述TOP1 MAR序列或其同源序列位于表达载体的启动子上游、Poly A下游或表达盒的两端。

哺乳动物细胞表达载体可按照基因工程领域的常规方法构建，将TOP1 MAR序列插入出发载体即可。具体制备步骤如下：

1)以人外周血基因组DNA为模板，利用引物P1、P2进行PCR扩增，得到TOP1 MAR序列；

2)利用NruⅠ和MluⅠ酶双酶切上述扩增片段和出发载体，回收酶切后的TOP1 MAR序列和线性质粒DNA，连接、转化后鉴定，即得；

引物P1、P2为：

P1：5′-GTCGCGAGGATCCCAATAGGAGTCATT-3′；

P2：5′-CGACGCGTGAATTCACTTCAGGTAACAT-3′。

步骤1)中扩增的反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，10μmol/L引物P1、P2各1.0μL，25μmol/L dNTP 2.0μL，100ng/μL模板DNA 1.0μL，5U/μL Taq酶0.5μL，ddH₂O 17μL。

步骤1)中扩增的反应程序为：95℃3min，94℃40s，56～60℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃1min，30个循环，72℃3min。

步骤2)中出发载体采用pIRES-neo2时，表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

哺乳动物细胞表达系统，包含上述表达载体。该表达系统可采用常规方法构建，步骤如下：

1)将外源目的基因插入表达载体的启动子下游，构建得到重组表达载体；

2)将重组表达载体转入宿主细胞中，筛选后得到哺乳动物细胞表达系统。

步骤1)中外源目的基因来自人及其他哺乳动物、植物、昆虫或微生物。

步骤2)中宿主细胞选自CHO、HEK293、BHK21、COS-7等中的任意一种。

哺乳动物细胞表达载体、表达系统在制备目的蛋白以及包含目的蛋白的基因治疗制剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明中哺乳动物细胞表达载体包含TOP1 MAR序列(GenBank：L23999.1)，通过将外源目的基因插入载体的多克隆位点，能够构建TOP1 MAR-启动子-外源基因-Poly A、启动子-外源基因-Poly A-TOP1 MAR或者TOP1 MAR-启动子-外源基因-Poly A-TOP1 MAR载体结构，一方面克服转基因沉默，另一方面介导外源基因在宿主细胞中稳定、高效、持久表达。同等条件下，与不含MAR以及含1-68 MAR的表达载体相比，本发明中表达载体能显著提高外源基因的表达水平，可用于重组蛋白的生产等。

附图说明

图1为实施例1中表达载体pIRES-neo2的质粒图谱；

图2为表达载体pIRES-TOP1的质粒图谱；

图3为实施例2表达载体pIRES-TOP1-TOP1的质粒图谱；

图4为实施例4中表达载体pIRES-TOP1-EPO的质粒图谱；

图5为试验例1中表达载体pIRES-1-68的质粒图谱；

图6为流式细胞术检测不同表达载体中EGFP的稳定表达水平；

图7为流式细胞术检测不同表达载体中EGFP的长期表达水平；

图8为试验例2中表达载体pIRES-1-68-EPO的质粒图谱；

图9为ELISA检测EPO在表达载体中的产量。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

哺乳动物细胞表达载体pIRES-TOP1的构建，步骤如下：

1)PCR扩增TOP1 MAR序列

根据TOP1 MAR序列(GenBank：L23999.1，第1～2974位碱基)设计引物P1和P2，引物的5′端分别引入NruⅠ、MluⅠ酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P1：5′-GTCGCGAGGATCCCAATAGGAGTCATT-3′；

P2：5′-CGACGCGTGAATTCACTTCAGGTAACAT-3′。

提取人外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板，使用引物P1、P2扩增TOP1 MAR序列，反应体系见下表1。

表1 PCR扩增体系

反应程序：95℃3min，94℃40s，56～60℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃1min，30个循环，72℃3min。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后并送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的TOP1 MAR片段与Genbank公开的TOP1 MAR序列完全一致。

2)构建含TOP1 MAR序列的表达载体pIRES-TOP1

用NruⅠ、MluⅠ双酶切TOP1 MAR的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用NruⅠ、MluⅠ双酶切pIRES-neo2质粒(质粒图谱见图1)。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的TOP1 MAR序列片段和pIRES-neo2线性质粒DNA。

TOP1 MAR序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NruⅠ、MluⅠ酶各0.5μL，1.157μg/μL TOP1 MAR扩增产物0.86μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

质粒pIRES-neo2的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NruⅠ、MluⅠ酶各0.5μL，1.65μg/μL质粒pIRES-neo2 0.607μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的TOP1 MAR序列片段和pIRES-neo2线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-neo2线性质粒DNA 200ng，酶切后的TOP1 MAR序列片段561.7ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入到E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-TOP1(质粒图谱见图2)，序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2

哺乳动物细胞表达载体pIRES-TOP1-TOP1的构建，步骤如下：

1)PCR扩增TOP1 MAR序列

根据TOP1 MAR序列(GenBank：L23999.1，第1～2974位碱基)设计引物P3和P4，引物的5′端分别引入XhoI酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P3：5′-CCTCGAGGGATCCCAATAGGAGTCATT-3′；

P4：5′-CCTCGAGGAATTCACTTCAGGTAACAT-3′。

提取人外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板，使用引物P3、P4扩增TOP1 MAR基因，反应体系和反应条件基本同实施例1，表1中P1、P2替换为P3、P4即可。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的TOP1 MAR序列完全一致。

2)构建TOP1 MAR序列位于表达载体两端的表达载体pIRES-TOP1-TOP1

用XhoI酶切TOP1 MAR的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用XhoI单酶切pIRES-TOP1质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的TOP1 MAR序列片段和pIRES-TOP1线性质粒DNA。

TOP1 MAR序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL XhoI酶0.5μL，0.72μg/μL TOP1 MAR扩增产物1.39μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

质粒pIRES-TOP1的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL XhoI酶0.5μL，1.65μg/μL质粒pIRES-TOP1 0.607μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的TOP1 MAR序列片段和pIRES-TOP1线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-TOP1线性质粒DNA 200ng，酶切后的TOP1 MAR序列片段264.8ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入到E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-TOP1-TOP1(质粒图谱见图3)。

实施例3

哺乳动物细胞表达系统的构建，步骤如下：

1)PCR扩增EGFP基因

参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因序列(GenBank：U55763.1，第613～1332位碱基)设计引物P5和P6(用于扩增720bp的EGFP基因DNA)，引物的5′端分别引入NheⅠ、AgeⅠ酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P5：5′-CCGGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；

P6：5′-CTAACCGGTGGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。

以pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司)为模板，使用引物P5、P6扩增EGFP基因，反应体系和反应条件基本同实施例1，表1中P1、P2替换为P5、P6即可。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列完全一致。

2)构建含TOP1 MAR和EGFP序列的表达载体pIRES-TOP1-EGFP

用NheⅠ、AgeⅠ双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用NheⅠ、AgeⅠ双酶切pIRES-TOP1质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和pIRES-TOP1线性质粒DNA。

EGFP序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NheⅠ、AgeⅠ酶各0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

pIRES-TOP1质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NheⅠ、AgeⅠ酶各0.5μL，0.81μg/μL质粒pIRES-TOP1 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的EGFP序列片段和pIRES-TOP1线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-TOP1线性质粒DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-TOP1-EGFP。

3)构建哺乳动物细胞表达系统

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)，铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂，将表达载体pIRES-TOP1-EGFP转染进入CHO细胞中。用含浓度为800μg/mL G418的培养基培养细胞，正常CHO细胞(未转染细胞)全部死亡时降低G418浓度，换用含500μg/mL G418的培养基维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆CHO细胞株。

实施例4

哺乳动物细胞表达系统的构建，步骤如下：

1)PCR扩增人EPO基因

根据人EPO序列(GenBank：KF178447.1，第10～591位碱基)设计引物P7和P8(用于扩增582bp的人EPO基因DNA)，引物的5′端分别引入NheⅠ、AgeⅠ酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)：

P7：5′-CCGGCTAGCATGGGGGTGCACGAA-3′；

P8：5′-CTAACCGGTAACTCTGTCCCCTGTCCTG-3′。

提取人外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板，使用引物P7、P8扩增人EPO基因，反应体系和反应条件基本同实施例1，表1中P1、P2替换为P7、P8即可。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的人EPO序列完全一致。

2)构建含TOP1 MAR和EPO序列的表达载体pIRES-TOP1-EPO

用NheⅠ、AgeⅠ双酶切人EPO序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用NheⅠ、AgeⅠ双酶切pIRES-TOP1质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的人EPO序列片段和pIRES-TOP1线性质粒DNA。

人EPO序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NheⅠ、AgeⅠ酶各0.5μL，0.78μg/μL EPO扩增产物1.39μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

pIRES-TOP1质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NheⅠ、AgeⅠ酶各0.5μL，0.854μg/μL质粒pIRES-TOP1 1.17μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的人EPO序列片段和pIRES-TOP1线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-TOP1线性质粒DNA 200ng，酶切后的EPO序列片段70.5ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-TOP1-EPO(质粒图谱见图4)。

3)构建哺乳动物细胞表达系统

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)，铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂，将表达载体pIRES-TOP1-EGFP转染进入CHO细胞中。用含浓度为800μg/mL G418的培养基培养细胞，正常CHO细胞(未转染细胞)全部死亡时降低G418浓度，换用含500μg/mL G418的培养基维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆CHO细胞株。

试验例1

一、MAR序列对外源EGFP基因稳定表达的影响

1、表达载体pIRES-1-68的构建

1)PCR扩增1-68 MAR序列

根据1-68 MAR序列(Genbank：EF694965.1，第1～3614位碱基)设计引物P3和P4，引物的5′端分别引入NruⅠ、MluⅠ酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P3：5′-GTCGCGATCGACTCTAGATTATACCAAC-3′；

P4：5′-CGACGCGTCTCTAGATGTAGTACTATTT-3′。

提取人外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板，使用引物P3、P4扩增1-68 MAR序列，反应体系和反应条件基本同实施例1，表1中P1、P2替换为P3、P4即可。

2)构建含1-68 MAR序列的表达载体pIRES-1-68

用NruⅠ、MluⅠ双酶切1-68 MAR的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用NruⅠ、MluⅠ双酶切pIRES-neo2质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的1-68MAR序列片段和pIRES-neo2线性质粒DNA。

1-68 MAR序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NruⅠ、MluⅠ酶各0.5μL，0.505μg/μL 1-68扩增产物1.98μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

质粒pIRES-neo2的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NruⅠ、MluⅠ酶各0.5μL，1.239μg/μL质粒pIRES-neo2 0.807μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的1-68 MAR片段和pIRES-neo2线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-neo2线性质粒DNA 100ng，酶切后的1-68MAR序列片段341.3ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入到E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-1-68(质粒图谱见图5)。

2、CHO细胞表达系统的构建

1)PCR扩增EGFP基因

操作同实施例3。

2)构建含1-68 MAR和EGFP序列的表达载体pIRES-1-68-EGFP

用NheⅠ、AgeⅠ双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用NheⅠ、AgeⅠ双酶切pIRES-1-68质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和pIRES-1-68线性质粒DNA。

EGFP序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NheⅠ、AgeⅠ酶各0.5μL，0.887μg/μL EGFP扩增产物1.13μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

pIRES-1-68质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NheⅠ、AgeⅠ酶各0.5μL，0.735μg/μL质粒pIRES-1-68 1.36μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的EGFP序列片段和pIRES-1-68线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-1-68线性质粒DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段80.9ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-1-68-EGFP。

以上述相同的方法将EGFP基因连接到不含MAR序列的pIRES-neo2骨架载体NheⅠ/AgeⅠ位点，构建表达载体pIRES-EGFP。

3)不同表达载体转染CHO细胞表达系统

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)。铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂，将各组表达载体转染进入CHO细胞中。共分为4个试验组：①正常CHO细胞组，②对照组-转染不含MAR序列的对照载体pIRES-EGFP，③TOP1组-转染含TOP1 MAR和EGFP序列的质粒pIRES-TOP1-EGFP，④1-68组-转染含1-68 MAR和EGFP序列的质粒pIRES-1-68-EGFP。

3、MAR序列对EGFP基因稳定表达的影响

用含浓度为800μg/mL G418的培养基培养细胞，正常CHO细胞(未转染细胞)全部死亡时降低G418浓度，换用含500μg/mL G418的培养基维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆CHO细胞株。待细胞密度达到1×10⁶个细胞/mL时，收集细胞进行流式细胞检测，分析MAR序列对重组基因稳定表达的影响，试验结果见图6。

由图5可知，与不含MAR的对照载体pIRES-EGFP相比，两个含MAR序列的表达载体均能显著提高EGFP基因的稳定表达水平。TOP1 MAR对提高转基因表达的影响更显著，增加倍数达3.24倍，1-68 MAR可提高转基因表达1.16倍。所有数据均为三次重复试验统计数据。

4、MAR序列对EGFP长期表达的影响

用含浓度为500μg/mL G418的培养基传代培养筛选获得的多克隆CHO细胞30天后，收集各试验组细胞进行流式细胞检测，分析TOP1和1-68 MAR序列对重组目的基因长期表达的影响，试验结果见图7。

由图6可知，与不含MAR的对照载体pIRES-EGFP相比，两个含MAR序列的表达载体均能稳定提高EGFP基因的稳定表达水平。TOP1 MAR对提高转基因表达的影响更显著，增加倍数达2.94倍，1-68 MAR可提高转基因表达1.12倍。所有数据均为三次重复试验统计数据。

试验例2

1、表达载体pIRES-1-68的构建

操作同试验例1。

2、哺乳动物细胞表达系统的构建

1)PCR扩增人EPO基因，操作同实施例4。

2)构建含1-68 MAR和EPO序列的表达载体pIRES-1-68-EPO

用NheⅠ、AgeⅠ双酶切人EPO序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用NheⅠ、AgeⅠ双酶切pIRES-1-68质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的人EPO序列片段和pIRES-1-68线性质粒DNA。

人EPO序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NheⅠ、AgeⅠ酶各0.5μL，1.486μg/μL EPO扩增产物0.67μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

pIRES-1-68质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL NheⅠ、AgeⅠ酶各0.5μL，0.854μg/μL质粒pIRES-1-68 1.17μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的人EPO序列片段和pIRES-1-68线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-TOP1线性质粒DNA 200ng，酶切后的EPO序列片段65.4ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-1-68-EPO(质粒图谱见图8)。

以上述相同的方法将人EPO基因连接到不含MAR序列的pIRES-neo2骨架载体NheⅠ/AgeⅠ位点，构建表达载体pIRES-EPO。

3)不同表达载体转染CHO细胞表达系统

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)。铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂，将各组表达载体转染进入CHO细胞中。共分为4个实验组：①正常CHO细胞组，②对照组-转染不含MAR序列的对照载体pIRES-EPO，③TOP1组-转染含TOP1 MAR和EPO序列的质粒pIRES-TOP1-EPO，④1-68组-转染含1-68 MAR和EPO序列的质粒pIRES-1-68-EPO。

3、MAR序列对人EPO基因稳定表达的影响

用含浓度为800μg/mL G418的培养基培养细胞，正常CHO细胞(未转染细胞)全部死亡时降低G418浓度，换用含500μg/mL G418的培养基维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆CHO细胞株。将稳定转染EPO的多克隆细胞株转入125mL悬浮培养瓶中，初始细胞量为5～6×10⁶个/mL，加入30ml无血清培养基，120rpm悬浮培养。每天细胞计数，并收集细胞上清，用ELISA检测试剂盒测定各组目的蛋白EPO的表达量，试验结果见图9。

由图8可知，转染pIRES-TOP1-EPO的CHO细胞平均每天每个细胞产88.48pg的EPO，转染pIRES-1-68-EPO的CHO细胞平均每天每个细胞产53.25pg的EPO，转染对照表达载体pIRES-EPO的CHO细胞平均每天每个细胞产24.41pg的EPO。说明TOP1 MAR可显著提高提高EPO基因的表达。

未特别指明的，实施例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段，比如参照Sambrook等编著的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW.Molecular cloning:alaboratory manual.2001)，或者产品制造厂商提供的说明书等。

实施例及试验例中所用细胞系、质粒载体、试剂、工具酶等均为市售商品。pIRES-neo2质粒购自美国Clontech公司，中国仓鼠卵巢细胞购自中国科学院上海细胞库。

需要说明的是，说明书中所列实施例仅用于理解发明技术方案，不具有任何限制作用。除了上述实施例外，还可以有其他的实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的任何技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 新乡医学院

<120> 哺乳动物细胞表达载体、表达系统、制备方法和应用

<170> PatentIn version 3.5

<211> 8253

<212> DNA

<213> 序列

<221> 表达载体pIRES-TOP1的核苷酸序列

<222> (1)..(8253)

<400> 1

GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 60

CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120

CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 180

TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG AGGATCCCAA TAGGAGTCAT TAAAGGCCTG 240

GAAAAGTGGT GCCATTAGGA GAAAAAGAAA TGATTTCTTG AGCTTGCTCT CAGTTCTCTT 300

TTAGGCTGTC TTGTACTCAG CAGAATAGTG AGATCTTCAA AGGTTGGGGT TTGATAGTGC 360

CTTGAATAAT TTTTAACTTT ATATTGCCAG CGGAAGAAGC ATTCTCTTTT TAGATTTAAA 420

AAATGTAGAT ACAAATATTA GGGGTTTTAT TTTTAGTGAA ACATTTCAAA CATACAGGAA 480

TAGATAATTA TGTAATGAAC ACTCGTATGT CCACCATCTG GCTTTGTAAA ATCTTAAAAT 540

TATGTCTTAT GTGCTCAATT GTTTTATTTC ATAAAAGATA CTGATAAACA TAGCTGAAGT 600

CACTTGTATA CCATTCACCT TCTTCCCTGT AGATTACTAT GAACTCGGTC TTTTTATTCT 660

CATACATATT TTTTGTATTT TTGCAGTATA TTTATGTGTT CATAAACAAT ATGTAATTTT 720

ACAATATGTA ACACACTAGT AACATACTAA TTTAAAACTT GTTTTTAGTT TACAATATGT 780

TGTAAACTAT TGTAAGCTAA AGACATATTG TACAACCTAT TGTTAAATAA AAACAGGTTT 840

TAGTTTTAAA TTAGGTATGT TACTGGGATC ATTCTGCAAC TTGTTTATTC CTCTCCAGCT 900

TTGATTTTGT GGTTTTATTA TCTTAACCTA CACTTTTAAT TAATCCATTT TATTTGTTAC 960

ATGGTATTCT ATTATATCAT AAAAACTTAT CTATTCTGTT GGTTTTTGTT GTTGGTCATT 1020

TGAGACCATG TCTTCGCTCT GTCACCCAGG CTGGAGTACA GTGGCGTGAT CTTGGCTCAC 1080

TGTGACCTCT GCCTCCCGGA TTCAAGTGGT TTTGGTGCCT CAGCCTCCTG AGTAGCTGGG 1140

ATTATAGGCG TGTGCCACCA TGCCCAGCTA ATTTTTGTAT TTTTAATAGA GACGGGATTT 1200

CACCATGTTG GCCAGGCTGG TCTTGAACTG ACCTCAAGTG ATCTGCTCAC CTCAGCTGCA 1260

CAAAGTGCTG GGATTACAGG TGTTAGCCAA CCAATACCCT GCCTCTATTC TCTTGTTAAG 1320

AGGCATTTAG CATGGTTAAT ACAGTCTCTT GCCCTCATAA ACAGTGCTGG GAAGGAAACA 1380

CATGTTCTTG TGTATATTGA ATGAAATTTG TTTATACATT AGATATTTCC AAATGTTCTC 1440

TTTAAGTACT TCAGTTTACA TCATTACTCT CCTCCTCCCT CCCCTCCCAC CCCCACCCAC 1500

AACAGTATTC CTCTTTTTCC ATATCCTTGC TAATGTTTCA AAGTTTTGCT TTTTACATTT 1560

GGGTCTTAGA TCCACTAGAA TGTATTTTTG CATTGGGATG AAGTTGAAAC CTAATATATT 1620

TTCCAAATGA GTAAACTGTT GTCACAGAAC TATTTAGTTG TATTACCTCC TCTCTTGTAT 1680

ATCAGATATA TCTACATATA TGTCAGACTG TTTCTGGGCT GTCTGTCCTC TTTAATTAGT 1740

TCGTGTATCT GTTTCTGCAT CAGTAGCATA CTGTCTTAAC TACTGTAGCT TTATAAAGTC 1800

TATTGAGTAG GACAAGTTTG TTTCATTCTT CAAAATTGCT TTGGCTATTC TTGGCCCTCT 1860

GCTGTTTCAT ATTAACTTTC AGATAAACTT GTCAAATTCT AATGAAAACT GTTGATAAAC 1920

TTGTTGATTA ACAAATTCTA ATAAAAACTG TTGAGATTTT TATTGGAATT GCAATACATT 1980

TATAGATTAA CGGAGAAAGA TATTGACAAT ACAATTGAGT TTCCAATTCA CGAACATGTT 2040

ATACCTCTCC ATTAATTCAT GTCTTTTGAA TGTATCCACC AATATGGTTT TGTAATTTTC 2100

TTCATAAAGG ACATTTAAAA TTCTTATTTT AAGTGATCTT ATAGTTTTAT GCTAACGTGA 2160

ATGAGATTTT TCCATTATGT TTCTGTTGGT TATTCCTGAA GTGGTAATGC TTATAATTTT 2220

GGGGTGTTGG TCTTGTATCT GGCAGCAGAT ACAAGAGGTG CTCAGAGTTG TTCAGGGTTG 2280

CTGAACTCTT AGTTCTAAAA GTGTCTGTCA TTTGGGGTTT CTATGTAGAT AATTTAATTA 2340

TCTATAAAAA CAGTTCTTCA TTTTCAGTTC ATATATTTCA TATTTTCTTA AGTTTTAATT 2400

TTTATTTTTA AACACAATTA TCCATAAACC CTAACCCTTT CCCTAGTCAA CAGCAGTCAC 2460

AGCCAAATGT TTTATTAATT GCTATACTCA GTGTTTCTTG TATCTCATAC CTTCTGGGGT 2520

TTCTTGTCTT GTTGAAATAC ACCCTTTAAT GTTTCTTTAG TGAAGACCCA ACAGTGGCAC 2580

TCACTCACCT TTGTTTACCT GAAAATTTCT TTATTTTCAT CTTAATTCAT AGTCTGTCTT 2640

TTCTCCAGTC AAGGAAGTGT CTTATAGGGA AGATTCTGGT TTCACTATCG TGTATCCAGG 2700

ATATATATGT ATTTATAGAT AGACTTTTAA TCTGAGGACT AATGTATTTT ATCCTACAGT 2760

ATTACCAATC ATTATTTCTT CCATAACTTC TAGACCATTC CTTTTGTACT TCTTTTTTAG 2820

AGTCCTTATT AGATGAGTGT TGACTCTTTT CAATCTAGAC ATCTTTTTTA AACTATATTT 2880

TCATACTCTT TGTCTCTTTA GGTCTGATTT TTTAAGTTCA GGGGATATTT CATTTTGGGT 2940

GAGTTGTAGC ACTACTTCAA TTCACTAATT CTAATTATAT TTAATCTACA AGTTATTCCA 3000

TCTATAATTT ATTTCAATTA CCACTTTTTG TTTTCAAAAT TTCTAATTTT ATATCTGATT 3060

TTGTTTCATT TTTGTTTTAT AATTTCATGT TCTTTCTAGA TTTTACATCT TTTTATGCAT 3120

ACTAAACATA CTCACTTGAA AGTCTTTGTA AGATTGTTCT ATAAAATGTT ACCTGAAGTG 3180

AATTCACGCG TTGACATTGA TTATTGACTA GTTATTAATA GTAATCAATT ACGGGGTCAT 3240

TAGTTCATAG CCCATATATG GAGTTCCGCG TTACATAACT TACGGTAAAT GGCCCGCCTG 3300

GCTGACCGCC CAACGACCCC CGCCCATTGA CGTCAATAAT GACGTATGTT CCCATAGTAA 3360

CGCCAATAGG GACTTTCCAT TGACGTCAAT GGGTGGACTA TTTACGGTAA ACTGCCCACT 3420

TGGCAGTACA TCAAGTGTAT CATATGCCAA GTACGCCCCC TATTGACGTC AATGACGGTA 3480

AATGGCCCGC CTGGCATTAT GCCCAGTACA TGACCTTATG GGACTTTCCT ACTTGGCAGT 3540

ACATCTACGT ATTAGTCATC GCTATTACCA TGGTGATGCG GTTTTGGCAG TACATCAATG 3600

GGCGTGGATA GCGGTTTGAC TCACGGGGAT TTCCAAGTCT CCACCCCATT GACGTCAATG 3660

GGAGTTTGTT TTGGCACCAA AATCAACGGG ACTTTCCAAA ATGTCGTAAC AACTCCGCCC 3720

CATTGACGCA AATGGGCGGT AGGCGTGTAC GGTGGGAGGT CTATATAAGC AGAGCTCTCT 3780

GGCTAACTAG AGAACCCACT GCTTACTGGC TTATCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG 3840

AGACCCAAGC TTGGTACCGA GCTCGGATCG ATATCTGCGG CCTAGCTAGC GCTTAAGGCC 3900

TGTTAACCGG TCGTACGTCT CCGGATTCGA ATTCGGATCC GCGGCCGCAT AGATAACTGA 3960

TCCAGTGTGC TGGAATTAAT TCGCTGTCTG CGAGGGCCAG CTGTTGGGGT GAGTACTCCC 4020

TCTCAAAAGC GGGCATGACT TCTGCGCTAA GATTGTCAGT TTCCAAAAAC GAGGAGGATT 4080

TGATATTCAC CTGGCCCGCG GTGATGCCTT TGAGGGTGGC CGCGTCCATC TGGTCAGAAA 4140

AGACAATCTT TTTGTTGTCA AGCTTGAGGT GTGGCAGGCT TGAGATCTGG CCATACACTT 4200

GAGTGACAAT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT GTCCACTCCC AGGTCCAACT 4260

GCAGGTCGAG CATGCATCTA GGGCGGCCAA TTCCGCCCCT CTCCCTCCCC CCCCCCTAAC 4320

GTTACTGGCC GAAGCCGCTT GGAATAAGGC CGGTGTGCGT TTGTCTATAT GTGATTTTCC 4380

ACCATATTGC CGTCTTTTGG CAATGTGAGG GCCCGGAAAC CTGGCCCTGT CTTCTTGACG 4440

AGCATTCCTA GGGGTCTTTC CCCTCTCGCC AAAGGAATGC AAGGTCTGTT GAATGTCGTG 4500

AAGGAAGCAG TTCCTCTGGA AGCTTCTTGA AGACAAACAA CGTCTGTAGC GACCCTTTGC 4560

AGGCAGCGGA ACCCCCCACC TGGCGACAGG TGCCTCTGCG GCCAAAAGCC ACGTGTATAA 4620

GATACACCTG CAAAGGCGGC ACAACCCCAG TGCCACGTTG TGAGTTGGAT AGTTGTGGAA 4680

AGAGTCAAAT GGCTCTCCTC AAGCGTATTC AACAAGGGGC TGAAGGATGC CCAGAAGGTA 4740

CCCCATTGTA TGGGATCTGA TCTGGGGCCT CGGTGCACAT GCTTTACATG TGTTTAGTCG 4800

AGGTTAAAAA AACGTCTAGG CCCCCCGAAC CACGGGGACG TGGTTTTCCT TTGAAAAACA 4860

CGATGATAAG CTTGCCACAA CCCGGGATAA TTCCTGCAGC CAATATGGGA TCGGCCATTG 4920

AACAAGATGG ATTGCACGCA GGTTCTCCGG CCGCTTGGGT GGAGAGGCTA TTCGGCTATG 4980

ACTGGGCACA ACAGACAATC GGCTGCTCTG ATGCCGCCGT GTTCCGGCTG TCAGCGCAGG 5040

GGCGCCCGGT TCTTTTTGTC AAGACCGACC TGTCCGGTGC CCTGAATGAA CTGCAGGACG 5100

AGGCAGCGCG GCTATCGTGG CTGGCCACGA CGGGCGTTCC TTGCGCAGCT GTGCTCGACG 5160

TTGTCACTGA AGCGGGAAGG GACTGGCTGC TATTGGGCGA AGTGCCGGGG CAGGATCTCC 5220

TGTCATCTCA CCTTGCTCCT GCCGAGAAAG TATCCATCAT GGCTGATGCA ATGCGGCGGC 5280

TGCATACGCT TGATCCGGCT ACCTGCCCAT TCGACCACCA AGCGAAACAT CGCATCGAGC 5340

GAGCACGTAC TCGGATGGAA GCCGGTCTTG TCGATCAGGA TGATCTGGAC GAAGAGCATC 5400

AGGGGCTCGC GCCAGCCGAA CTGTTCGCCA GGCTCAAGGC GCGCATGCCC GACGGCGATG 5460

ATCTCGTCGT GACCCATGGC GATGCCTGCT TGCCGAATAT CATGGTGGAA AATGGCCGCT 5520

TTTCTGGATT CATCGACTGT GGCCGGCTGG GTGTGGCGGA CCGCTATCAG GACATAGCGT 5580

TGGCTACCCG TGATATTGCT GAAGAGCTTG GCGGCGAATG GGCTGACCGC TTCCTCGTGC 5640

TTTACGGTAT CGCCGCTCCC GATTCGCAGC GCATCGCCTT CTATCGCCTT CTTGACGAGT 5700

TCTTCTGAGG GGATCAATTC TCTAGAGCTC GCTGATCAGC CTCGACTGTG CCTTCTAGTT 5760

GCCAGCCATC TGTTGTTTGC CCCTCCCCCG TGCCTTCCTT GACCCTGGAA GGTGCCACTC 5820

CCACTGTCCT TTCCTAATAA AATGAGGAAA TTGCATCGCA TTGTCTGAGT AGGTGTCATT 5880

CTATTCTGGG GGGTGGGGTG GGGCAGGACA GCAAGGGGGA GGATTGGGAA GACAATAGCA 5940

GGCATGCTGG GGATGCGGTG GGCTCTATGG CTTCTGAGGC GGAAAGAACC AGCTGGGGCT 6000

CGAGTGCATT CTAGTTGTGG TTTGTCCAAA CTCATCAATG TATCTTATCA TGTCTGTATA 6060

CCGTCGACCT CTAGCTAGAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT 6120

TGTTATCCGC TCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG TAAAGCCTGG 6180

GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC GCTCACTGCC CGCTTTCCAG 6240

TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT 6300

TTGCGTATTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG 6360

CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG 6420

GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG 6480

GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA 6540

CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT 6600

GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC 6660

TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CAATGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG 6720

GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC 6780

TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA 6840

CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG 6900

TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT 6960

CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC 7020

ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA 7080

TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA 7140

CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT 7200

TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC 7260

CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT 7320

GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT 7380

GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG 7440

CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT 7500

ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT 7560

GTTGCCATTG CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC 7620

TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT 7680

AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG 7740

GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG 7800

ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT 7860

TGCCCGGCGT CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC 7920

ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT 7980

TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT 8040

TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG 8100

AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT 8160

TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG 8220

CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC GTC 8253

<211> 2989

<212> DNA

<213> 序列

<221> TOP1 MAR序列90%以上同源性的同源序列

<222> (1)..(2989)

<400> 2

GGATCCCTAA ATAGGAGTCA TTAAAAGCCT GGAAAAATGG TGCCATTAGG AGAAAAAGAA 60

ATGATTTCTT GATCTTGCTC TCAGTTCTCT TTTAAAAAAA ATTTTAAAAA GCAGAATAGT 120

GAGGGGAAAA AAATTTGGGG TTTGATAGTT CCTTGAATAA TTTTTAACTT TATATTGCCA 180

GCGGAAGAAG CATTCTCTTT TTATATTTAA AAAATGTAGA TACAAATATT ATGGGTTTTA 240

TTTTTAGTAA AAAATTTCAA ACATAGGGAA AAAAATATTA TGTAATGAAC ACTCGTATGT 300

CCAACATCTT TCTTTGTAAA ATCTTAAAAT TATGTCTTAT GTGCTCAATT GTTTTATTTC 360

ATAAAATTTT TATAAGTAAT GTTGAAGTCA CTTGTATACC ATTCACCTTC TTCCCTGTAG 420

ATTACTATGA ACTCGGTCTT TTTATTCTCA TACATATTTT TTGTATTTTT GCAGTATATT 480

TATGTGTTCA TAAACAATAT GTAATTTTAT AATATGTAAC ACACTAGTAA CATACTAATT 540

TAAAACTTGT TTTTAGTTTA CAATATGTTG TAAACTATTG TAAGCTAAAG ACATATTGTA 600

CAACCTATTG TAAAATAAAA ACAGGTTTTA GTTTTAAATT TTTTTATAAG TAATGTTGAC 660

TGCAACTTGT TTATTCCTCT CCAGCTTTGA TTTTGTGGTT TTATTATCTT AACCTACACT 720

TTTAATTAAT TTATTTTATT TGTTACATGG TATTCTATTA TATCATAAAA ACTTATCTAT 780

TCTTTTGGTT TTTGTTGTTG GTCATTTGGG AAAAAAATTT CGCTCTGTCA CCCAGGCTGG 840

AGTACAGTGG CGTGATCTTG GCTCACTGTG ACCTCTGCCT CCCGGATTCA AGTTGTTTTG 900

GTGCCTCAGT CTCCTGAGTA GCTAGAATTA TAGGCGTGTG CCACCATGCC CAGCTAATTT 960

TTGTATTTTT AATAGAGACG GGATTTCACC ATGTTGGCCA GGCTAGTCTT GAACTGACCT 1020

CAAGTGATAA AAAAATTTTA AAACACAAAG TGCTGGGATT ACAGGTGTTA GCCACCATAA 1080

CCTGCCTCTA TTCTCTTGTT AAGAGGCATT TAGCATGGTT ATACAGTCTC TTAACCTCAT 1140

AAACAGTGCT GGAAGAAACA CATGTTTCTT GTGTATATGA ATGAAAATTT GTTTTATACA 1200

TTAGATATTT CCAAATTGTT CTCTTAAGTA CTTCAGTTTA CATCATTACT CTCCTCCTCC 1260

CTCCCCTCCC ACCCTTTAAT GAGATAATAA CCTCTTTTTC CATATCCTTG CTAATGTTTC 1320

TAAAGTTTTG CTTTTTACAT TTTTTTTATA AGTAATGTTG AGTATTTTTG CATTGGGATG 1380

AAGTTGAAAC CTAATATATT TTCCAAATGA GTAAACTGTT GTCACAGAAC TATTTAGTTG 1440

CATTACCTCC TCTCTTGTAT ATTTTTAATG AGATAATAAA TGTCAGACTG TTTCTGGGCT 1500

GTCTGTCCTC TTTAATTAGT TCGTGTATCT GTTTCTGCAT CAGTGGCATA CTGTCTTAAC 1560

TACTGTAGCT TTATAAAGTC TATTAATAAT AAAATACTTT GTTTCATTCT TCAAAATTGC 1620

TTTGGCTATT CTTGGGAAAA AAATGTTTCA TATTAACTTT CAGATAAACT TGTCTTTAAA 1680

CAAATTCTAA TAAAAACTGT TGATAAACTT GTTGATTAAC AAATTCTAAT AAAAACTGTT 1740

GAGATTTTTA TTGGAATTGC TAAAAAAAAT TTTAAAAAAC GGAGAAAGAT ATTGACAATA 1800

CAATTGAGTT TCCAATTCAC GAACATGTTA TACCTCTCCA TTAATTCATG TCTTTTGAAT 1860

GTATAAAAAA AATTTTAAAA GTAATTTTCT TCATAAAGGT TTTACATTTA AAAAATTCTT 1920

ATTTTTAAGT GATCTTATAG TTTTTATTGC TAATGTGAAT GAGATTTTTT TCCATTATGT 1980

TTCTGTTGGT TATTCCTGAA GTGGTAATGC TTATAATTTT GGGGTGTTGG TCTTGTATAA 2040

AAAAAATTTT AAAAGAGGTG CTCAGAGTTG TTCAGGGTTG CTGAACTCTT AGTTCTAAAA 2100

GTGTCTGTCA TTTGGGGTTT CTATGTAGAT AATTTAATTA TCTATAAAAA CAGTTCTTCA 2160

TTTTCAGTTC ATATATTTCA TATTTCTTTA AGTTTTAATT TTTATTTTTA AACACAATTA 2220

TCCATAAAAC CCTAACCCTT TCCCTAGTCA AGTTTGGGAA ATTCCAAATG TTTTATTAAT 2280

TGCTATATTT TTAATGAGAT AATAACTCAT ACCTTCTGGG GTTTCTTGTC TTGTTGAAAT 2340

ACACCCTTTA ATGTTTCTTT AGTGAAGACC CAACAGTGGC ACTCACTCAC CTTTGTTTAC 2400

CTGAAAATTT CTTTATTTAA AAAAAATTTT AAAATCTGTC TTTTCTCCAG TCAAGGAATT 2460

GTCTTATAGG GAAGATTCTG GTTTCACTAT GCTGTATCCA GGGATATATA TGTATTTATA 2520

GATAGACTTT TAATAATAAT AAAATACGTA TTTTATCCTA CAGTATTACC AATCATTATT 2580

TCTTCCATAA CTTCTAGACC ATTCCTTTTG TACTTCTTTT TTAGAGTCCT ATTAATATAT 2640

TTAATATATT TTCAATCTAG ACATCTTTTT TAAACTATAT TTTCATACTC TTTGTCTCTT 2700

TAGGTCTGAT TTTTTAAGTT CAGGGGAATA TTTCATTTTT GGTGAGTTGT AGCACTCACT 2760

TCCAATTCAC TAATTCTAAT TATATTTAAT CTACAAGTTA TTCCATCTAT AATTTATTTC 2820

AATATTTTTA TATTTTTCCC TGGAGCTGGG ATTTTATATC TGATTTTGTT TCATTTTTGT 2880

TTTATAATTT CATGTTCTTT CTAGATTTTA CATCTTTTTA TGCATACTAA ACATATTCAC 2940

TTGAAAGTCT TTGTAAGATT GTTCTATAAA TGTTACCTGA AGTGAATTC 2989

<211> 27

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P1

<222> (1)..(27)

<400> 3

GTCGCGAGGA TCCCAATAGG AGTCATT 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P2

<222> (1)..(28)

<400> 4

CGACGCGTGA ATTCACTTCA GGTAACAT 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P3

<222> (1)..(28)

<400> 5

GTCGCGATCG ACTCTAGATT ATACCAAC 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P4

<222> (1)..(28)

<400> 6

CGACGCGTAG CTGAGATCTA ATATGGTT 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P5

<222> (1)..(30)

<400> 7

CCGGCTAGCA TGGTGAGCAA GGGCGAGGAG 30

<211> 31

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P6

<222> (1)..(31)

<400> 8

CTAACCGGTT ACCACTCGTT CCCGCTCCTC G 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P7

<222> (1)..(24)

<400> 9

CCGGCTAGCA TGGGGGTGCA CGAA 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 序列

<221> 引物P8

<222> (1)..(27)

<400> 10

CTAACCGGTT ACCCCCACGT GCTTACA 27

Claims (10)

1.哺乳动物细胞表达载体，其特征在于：该载体上插入有GenBank登录号L23999.1的TOP1MAR序列，或者与该序列90％以上同源性的同源序列。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述TOP1MAR序列或其同源序列位于表达载体的Poly A下游、启动子上游，或者表达盒的两端。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：该载体的出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pEGFP-C1、pcDNA1.1、pCHO1.0中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述出发载体采用pIRES-neo2时，表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.如权利要求1～3中任一项所述表达载体的制备方法，其特征在于：将TOP1 MAR序列插入出发载体中，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：

1)以人外周血基因组DNA为模板，利用引物P1、P2进行PCR扩增，得到TOP1 MAR序列；

2)利用NruⅠ和MluⅠ酶双酶切上述扩增片段和出发载体，回收酶切后的TOP1 MAR序列和线性质粒DNA，连接、转化后鉴定，即得；

引物P1、P2为：

P1：5′-GTCGCGAGGATCCCAATAGGAGTCATT-3′；

P2：5′-CGACGCGTGAATTCACTTCAGGTAACAT-3′。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中扩增的反应体系为：10×PCRbuffer 2.5μL，10μmol/L引物P1、P2各1.0μL，25μmol/L dNTP 2.0μL，100ng/μL模板DNA 1.0μL，5U/μL Taq酶0.5μL，ddH₂O 17μL。

8.包含如权利要求1～4中任一项所述表达载体的哺乳动物细胞表达系统。

9.如权利要求8所述哺乳动物细胞表达系统的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将外源目的基因插入表达载体的启动子下游，构建得到重组表达载体；

2)将重组表达载体转入宿主细胞中，筛选后得到哺乳动物细胞表达系统。

10.如权利要求1～4中任一项所述哺乳动物细胞表达载体、权利要求8所述哺乳动物细胞表达系统在制备目的蛋白或者包含目的蛋白的基因治疗制剂中的应用。