KR101765256B1

KR101765256B1 - 류코노스톡 속 균주 발현용 고복제수 셔틀벡터

Info

Publication number: KR101765256B1
Application number: KR1020160046935A
Authority: KR
Inventors: 정기준; 손연정; 한남수; 이령
Original assignee: 한국과학기술원; 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-18
Filing date: 2016-04-18
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2036-04-18

Abstract

본 발명은 류코노스톡 속 균주 발현용 고복제수 셔틀벡터 및 상기 고복제수를 나타내는 벡터로 형질전환된 미생물을 이용하여 목적 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 고복제수 플라스미드를 사용하면, 기존의 류코노스톡 속 균주에서 재조합 유전자 발현에 이용되던 저복제수 플라스미드에 비하여 유전자가 현저히 높은 비율료 발현되어, 류코노스톡 속에서 생산되는 재조합 단백질을 보다 높은 수율로 생산할 수 있다.

Description

류코노스톡 속 균주 발현용 고복제수 셔틀벡터{High-Copy Number Shuttle Vector for Expression in Leuconostoc sp.}

본 발명은 류코노스톡 속 균주 발현용 고복제수 셔틀벡터에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 류코노스톡 속 균주 발현용 고복제수 셔틀벡터 및 상기 고복제수를 나타내는 벡터로 형질전환된 미생물을 이용하여 목적 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

류코노스톡 시트리움 균주는 그람 양성균에 속하는 유산균의 일종으로, 전통적으로 우유, 야채, 고기와 그 외의 다양한 식품의 발효에 이용되어 온 미생물이다. 최근 몇십년간, 류코노스톡 종을 포함한 유산균주는 재조합 단백질의 생산에 유용하게 이용되고 있으며, 특히 food-grade 박테리아로써 안전성이 입증되어 백신이나 치료용 단백질 생산 등의 분야에서의 연구가 활발하다. Lactococcus 종과 Lactobacillus 종에 대한 연구는 매우 활발히 진행되고 있으나, 류코노스톡 종에 대한 연구는 아직 시작 단계이며, 류코노스톡 종을 이용하여 다양한 생산물을 얻기 위해서는 기본적으로 적합한 유전자 발현 및 조작 시스템이 필요하다.

한편, 플라스미드는 박테리아 세포 내에 존재하는 작은 DNA 분자로, 염색체 DNA와는 별도로 존재하며 독립적으로 복제한다. 세포의 생존과는 무관하며, 다른 종의 세포로도 전달이 가능하기 때문에, 생명공학 분야에서 재조합 유전자를 운반하기 위한 벡터로 사용된다. 이러한 플라스미드는 재조합 유전자 조작과 단백질 발현을 위한 기본이 되는 것으로, 적합한 플라스미드 시스템의 구축이 필수적이다.

기존에 개발된 류코노스톡 발현용 플라스미드는 복제수가 낮아 단백질의 고생산에 적합하지 않았다(Eom HJ, et al., Biotechnol Bioproc Eng., 15:946-952, 2010). 따라서 산업적으로 유용한 류코노스톡을 숙주 세포로 이용하여 유전학적 연구를 진행하기 위해서는 고복제수 플라스미드의 개발이 시급하다.

이에, 본 발명자들은 류코노스톡에서 고복제수를 나타내는 플라스미드를 개발하고자 예의 노력한 결과, 기존의 저복제수 류코노스톡-대장균 셔틀 벡터를 기반으로 복제에 관련된 서열을 변이시켜 개량한 벡터가 높은 복제수를 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 류코노스톡에서 고복제수를 나타내는 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 고복제수를 나타내는 벡터로 형질전환된 미생물을 이용하여, 목적 단백질을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 류코노스톡에서 고복제수를 나타내는 벡터의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 DNA 단편을 함유하는 벡터 및 상기 벡터에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 의하여 발현되는 목적단백질을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드에서 복제에 관련된 염기서열에 무작위 돌연변이를 유발한 플라스미드 라이브러리를 제작하는 단계; (b) 상기 라이브러리를 류코노스톡 속 균주에 형질전환시켜 스크리닝용 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 상기 스크리닝용 라이브러리를 배양하여, 리포터 유전자가 대조군에 비하여 강하게 발현되는 균주를 스크리닝하는 단계; 및 (d) 상기 스크리닝된 균주에서 고복제 플라스미드를 수득하는 단계를 포함하는 류코노스톡 균주 발현용 고복제 플라스미드의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 고복제수 플라스미드를 사용하면, 기존의 류코노스톡 속 균주에서 재조합 유전자 발현에 이용되던 저복제수 플라스미드에 비하여 유전자가 현저히 높은 비율료 발현되어, 류코노스톡 속에서 생산되는 재조합 단백질을 보다 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 플라스미드 랜덤 라이브러리의 벡터 시스템을 나타낸 것이다.
도 2는 형광 활성 세포 분류기를 통한 플라스미드 랜덤 라이브러리의 스크리닝 과정을 나타낸 것이다. 연두색은 돌연변이가 없는 기존의 pCB4170 플라스미드를 이용해 발현한 녹색형광단백질, 빨간색은 original library, 파란색은 1^st sorted library, 주황색은 2^nd sorted library를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 랜덤 라이브러리에서 발굴한 플라스미드에 의하여 발현되는 녹색형광단백질의 발현 정도를 (b) FACS를 이용하여 형광세기를 비교 분석한 것이고 (빨간색 : pCB4170 벡터를 함유한 류코노스톡; 파란색 : pCB4170 백터에 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 함유하는 류코노스톡 시트리움, 연두색 : pCB4170 돌연변이 벡터(pCB4270)에 710 프로모터와 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 함유하는 류코노스톡), (b) 웨스턴 블럿을 통하여 확인한 것이다 (pCB4170 벡터를 함유하는 류코노스톡 시트리움 : (1, 2번 레인); pCB4170에 와 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 함유하는 류코노스톡 시트리움 : (3, 4번 레인); pCB4170 돌연변이 벡터(pCB4270)에 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 함유하는 류코노스톡 시트리움: (5, 6번 레인).
도 4는 pCB4170과 돌연변이 벡터 pCB4270의 복제수를 qPCR을 통해 측정하고 분석한 결과이다.
도 5은 pCB4170 및 pCB4270 벡터에 재조합 단백질을 연결하여 발현양 및 활성도를 분석한 것으로, (a)는 SDS-PAGE를 통한 glutathione S-transferase (GST)의 발현양을 비교 분석한 것이며(pCB4170 벡터를 함유하는 류코노스톡 시트리움 : (1, 2번 레인); pCB4170 벡터에 GST유전자를 연결한 벡터를 함유하는 류코노스톡 시트리움 : (3, 4번 레인); pCB4270 벡터에 GST 유전자를 연결한 벡터를 함유하는 류코노스톡 시트리움 : (5, 6번 레인)), (b)는 알파 아밀라아제의 활성도를 전분 배지에서 iodine test를 이용해 분석한 것이고, (c)는 amylase activity assay kit를 이용하여 아밀라아제의 전분 분해 활성을 비교분석한 것이다.

본 발명에서는 안정성이 입증되어 재조합 단백질의 생산에 이용되고 있는 류코노스톡 종에서 목적단백질을 고수율로 발현시킬 수 있는 벡터를 개발하고자, 기존의 대장균-류코노스톡 셔틀벡터로 사용되어 왔던 pCB4170의 염기서열을 PCR을 통하여 변이시킨 벡터 라이브러리에서 류코노스톡 균주 내에서 고복제수를 나타내는 벡터를 스크리닝하였으며, 본 발명의 고복제수 벡터는 리포터 단백질로 녹색형광단백질을 사용하였을 경우, 모벡터인 pCB1740에 비하여, 30배 증가된 복제수를 가지는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 DNA 단편을 함유하는 벡터 및 상기 벡터에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서는 pCB4170에서 복제에 관여하는 염기서열 1587개 염기서열을 무작위적으로 돌연변이시키고, 리포터 유전자로 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하여, 플라스미드 랜덤 라이브러리를 제작하였으며, 제작된 라이브러리를 대장균을 거처, 류코노스톡 시트리움 균주에 형질전환하여, 녹색형광단백질의 발현이 현저히 높은 균주를 스크리닝하고, 상기 균주에서 고복제수를 나타내는 플라스미드를 수득하였다.

다른 관점에서 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균 또는 류코노스톡 속 미생물인 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 의하여 발현되는 목적단백질을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서는 목적단백질로 GST를 사용하고, 대조군인 pCB4170-GST와 본 발명의 pCB4270-GST로 각각 형질전환된 류코노스톡 균주의 경우, 웨스턴 블럿으로 단백질의 발현을 확인하였을 때, 대조군인 pCB4170-GST는 발현이 확인되지 않았고, pCB4270-GST에서는 GST의 발현을 확인하였다.

본 발명의 다른 양태에서는 아밀라아제를 목적단백질로 사용하고, 대조군 인pCB4170-Amy와 본 발명의 pCB4270-Amy로 각각 형질전환된 류코노스톡 균주의 경우, 발현된 아밀라아제 활성을 정량 측정하였을 때, 대조군에 비하여, pCB4270-Amy로 형질전환된 균주가 약 9.5배의 아밀라아제 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명은 또한, (a) 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드에서 복제에 관련된 염기서열에 무작위 돌연변이를 유발한 플라스미드 라이브러리를 제작하는 단계; (b) 상기 라이브러리를 류코노스톡 속 균주에 형질전환시켜 스크리닝용 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 상기 스크리닝용 라이브러리를 배양하여, 리포터 유전자가 대조군에 비하여 강하게 발현되는 균주를 스크리닝하는 단계; 및 (d) 상기 스크리닝된 균주에서 고복제 플라스미드를 수득하는 단계를 포함하는 고복제 플라스미드의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서, 용어 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 목적단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 플라스미드 랜덤 라이브러리의 제작

류코노스톡에서 단백질의 대량 생산에 사용될 수 있는 류코노스톡 발현용 고복제수 플라스미드를 스크리닝하기 위한 라이브러리를 구축하였다. 랜덤 라이브러리의 골격이 되는 모벡터는 대장균-류코노스톡 셔틀벡터 (shuttle vector)인 pLeuCM42를 최적화한 플라스미드 pCB4170(충북대학교 농업생명환경대학 식품생명공학과 한남수 교수 연구실)를 사용하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 복제수를 증가시키기 위해 기존 pCB4170 벡터에서 플라스미드의 복제에 관여하는 1587개의 염기서열에 무작위적 돌연변이를 유발하고, 녹색형광단백질을 리포터 단백질로 연결하여 플라스미드 랜덤 라이브러리를 제작하였다.

먼저 형질전환 효율이 높은 대장균 균주 XL1-Blue (Invitrogen,미국)을 사용하여 라이브러리를 구축하였다. 대장균에서 구축한 라이브러리에서 플라스미드를 분리해 류코노스톡 시트리움 CB2567 균주(KACC 91348P)에 형질전환하였다.

플라스미드 랜덤 라이브러리 부분 및 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자 절편을 제작하기 위해 PCR이 사용되었고, 이를 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드들의 T_m은 모두 55℃ 이상으로 제작하였다.

먼저 류코노스톡 메센트로이드의 염색체에서 유래한 프로모터 710과 녹색형광단백질을 pCB4170 벡터에 연결하기 위해 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자를 주형으로 하고 정방향 프라이머 (서열번호 3)와 역방향 프라이머 (서열번호 4)를 사용하여 PCR을 진행하였다. PCR의 결과로 710 프로모터와 녹색형광단백질이 연결된 유전자 절편을 얻었다.

서열번호 3: CTGTTATAATTGATATAACCAGAAGTCGACTAGCTTGAAAGGATAGAAAAAATGAGCAAAG GAGAAGAACTTTTCAC

서열번호 4: AAGGTTCTGCAGGCGGCCGCTTATTATTTGTAGAGCTCATCCATGC

녹색형광단백질 유전자의 주형으로는 Addgene plasmid 40127(Addgene, USA)를 이용하였다.

상기 PCR에서 얻어진 유전자를 벡터 pCB4170에 연결하기 위해, 벡터와 PCR 유전자 절편을 제한효소 HindIII와 PstI으로 절단한 후, T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션 하여 pCB4170-sfGFP 플라스미드를 제작하였다.

플라스미드 랜덤 라이브러리는 플라스미드의 복제에 관여하는 약 1600개 염기서열의 앞, 뒤에 부착하도록 디자인된 정방향 프라이머 (서열번호 5)와 역방향 프라이머 (서열번호 6)를 사용하고, 무작위적 돌연변이가 유발되는 유전자 중합 효소 rTaq을 이용하여 0.2%의 error rate으로 PCR을 통해 합성하였다.

서열번호 5: TTCCAAGGATCCCCGGGTACCG

서열번호 6: AAGGCCGAATTCGAGCTCGGTACCATG

상기 PCR에서 얻어진 유전자 절편과 벡터 pCB4170-sfGFP는 제한효소 BamHI과 EcoRI으로 절단하고, T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션 하였다.

상기 제조된 플라스미드를 류코노스톡 시트리움 CB2567에 형질전환하여 플라스미드 랜덤 라이브러리를 제작하였다.

실시예 2: 형광 활성 세포 분류기를 통한 플라스미드 랜덤 라이브러리의 스크리닝

실시예 1에서 제작된 류코노스톡 시트리움 플라스미드 랜덤 라이브러리를 MRS 배지에 접종하여 약 12시간동안 30℃, 200 rpm에서 배양한 후, 신선한 MRS 배지로 1/50의 부피만큼 옮겨져 동일한 조건에서 8시간동안 배양되었다. 배양한 류코노스톡 시트리움을 4℃에서 6000rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 수득하고, PBS(phosphate buffered saline)으로 2회 씻어준 후, 같은 방법으로 원심분리하였다. 수득된 류코노스톡 시트리움을 PBS에 현탁하여, 녹색형광단백질의 발현에 의해 높은 형광값을 가지는 상위 1%의 세포를 형광활성 세포분류기를 통해 분리하였다.

분류한 류코노스톡 시트리움은 고체 MRS 아가 플레이트에서 배양하였고, 배양된 균은 다시 수득하여 MRS 배지에서 같은 조건에 배양한 후, 스크리닝을 2회까지 반복하였다(도 2). 최종적으로 분류된 류코노스톡 시트리움은 고체 MRS agar 플레이트에서 배양하여 개별 콜로니를 수득하여 분석하였다.

실시예 3: 발굴한 고복제수 플라스미드의 서열분석 및 녹색형광단백질 발현을 통한 비교분석

실시예 1에서 개별 콜로니 분석을 통해 높은 형광 값을 가지는 하나의 고복제수 플라스미드를 발굴하였고, pCB4270-sfGFP라고 명명하였다. 서열을 분석한 결과, 기존 pCB4170 플라스미드의 4690 번째 염기 서열이 시토신에서 티민으로 바뀌었음을 확인하였다(도 3a). pCB4170에서 4690 번째 염기서열을 티민으로 바꾼 플라스미드를 제작하고 pCB4270이라 명명하였다. pCB4270 벡터 중 류코노스톡 내에서 플라스미드의 복제에 관련된 3980번째부터 5567번째까지의 염기서열을 서열번호 1에 표시하였다.

상기 돌연변이를 함유하는 pCB4270 플라스미드와 대조군인 pCB4170 플라스미드를 이용하여 녹색형광단백질의 발현에 따른 형광 세기와 발현양을 비교 분석하였다(도 3b).

pCB4170 벡터를 가진 류코노스톡 시트리움과, 710 프로모터에 녹색형광단백질이 연결된 유전자를 함유하는 pCB4170 (pCB4170-sfGFP), pCB4270 벡터에 710프로모터와 녹색형광단백질이 연결된 벡터 (pCB4270-sfGFP)를 가지는 류코노스톡 시트리움을 MRS 배지에 접종하여 약 12시간동안 30 ℃, 200 rpm에서 배양한 후, 신선한 MRS 배지로 1/50의 부피만큼 옮겨 동일 조건에서 12시간동안 배양하였다. 각각의 류코노스톡 시트리움 균주 배양액을 동일한 세포양만큼 습득하여 6000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 균체를 수득하고, PBS에 현탁하여 형광세포분석기와 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿으로 녹색형광단백질의 발현양을 분석하였다.

형광분석기를 통한 분석 형광 세기 분석 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 pCB4270에 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 가진 류코노스톡 균주가 기존의 pCB4170에 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 가지는 류코노스톡 균주보다 약 15배 가량 높은 형광 세기를 나타내었다.

웨스턴 블럿 분석을 위하여, 각각 균체를 PBS에 현탁하고 수득한 류코노스톡 균체를 초음파로 용해시키고 세포 lysate로 웨스턴 블럿을 수행하여 녹색형광단백질의 발현양을 비교하였다. 웨스턴 블럿 실험에서는 anti-GFP 항체에 horseradish peroxidase (HRP)가 연결된 항체 (Abcam, 영국)를 사용하였다. 그 결과 도 3b, c에 나타난 것과 같이, 발굴된 pCB4270 벡터를 이용한 녹색형광단백질의 발현이 기존 pCB4170 벡터를 이용한 발현보다 월등히 더 높다는 것을 확인하였다.

실시예 4: 발굴한 플라스미드의 복제수 분석

녹색형광단백질의 발현 증가가 복제수의 증가로부터 비롯된 것인지 확인하기 위하여, qPCR을 통해 각각 플라스미드의 복제수를 분석하였다.

먼저, pCB4170 벡터를 함유하는 류코노스톡, pCB4170-sfGFP 벡터를 함유하는 류코노스톡, 스크리닝을 통해 발굴한 pCB4270 벡터를 함유하는 류코노스톡, pCB4270-sfGFP를 함유하는 류코노스톡 네 가지에 대해 각각 MRS 배지에 접종하여 12시간동안 30℃, 200rpm에서 배양한 후, 신선한 MRS 배지에 1/50의 부피만큼 옮겨져 12시간 배양하였다. 각각의 배양된 류코노스톡의 게놈 유전자(genomic DNA) 추출을 위해 Masterpure™ DNA6 Purification Kit를 사용하여 제공된 프로토콜에 따라 유전자 총체를 분리하였다. 분리한 유전자 총체를 이용하여, one-step SYBR PrimeScript RT-PCR (TAKARA Bio, 일본)과 LightCycler96 (Roche, 스위스)를 이용하여 qPCR을 수행하였다. 플라스미드의 복제수를 측정하기 위한 유전자는 클로람페니콜 저항 유전자(Cm)를 선정하여 서열번호 7, 8의 프라이머를 이용하여 PCR 하였고, 크로모좀의 유전자 중 단일 복제수를 가지는 phosphoketolase(pho)를 레퍼런스로 선정해 서열번호 9, 10의 프라이머로 PCR 하였다. 플라스미드 복제 수는 각각 유전자의 quantitative value(Cq) 값과 PCR 증폭 효율(E)를 이용하여 아래 식을 통해 계산하였다.

Plasmid copy number(PCN) = (E_pho)^Cqpho / (E_Cm)^CqCm

서열번호 7: TTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTC

서열번호 8: CGGAGAGTTAGGTTATTGGGATA

서열번호 9: ACACAACTAACCGTCAATGGATG

서열번호 10: CCTTCAAGCCAACCTTCAGC

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, pCB4270과 pCB4270-sfGFP 플라스미드의 복제 수는 각각 61.23, 69.89로 측정되었고, 기존 pCB4270 대비 30배 가량 증가된 복제수를 가진 것으로 확인되었다.

실시예 5: 발굴한 플라스미드를 이용한 재조합 단백질(GST, 알파-아밀라아제) 생산

재조합 단백질의 고발현을 위한 발굴한 고복제수 플라스미드의 유용성을 입증하기 위해, 류코노스톡 시트리움에서 pCB4270을 이용하여 GST와 알파-아밀라아제 두 종류의 단백질이 생산되었다.

먼저 GST는 류코노스톡의 세포질 내에서 생산되었고, GST는 서열번호 11, 12의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 유전자 절편을 수득하였다. 수득한 GST 유전자 절편과 pCB4170-sfGFP 벡터, pCB4270-sfGFP 벡터를 각각 제한효소 SalI과 PstI으로 처리하여 각각 벡터와 GST를 라이게이션 하였다. 그 결과, pCB4170에 710 프로모터와 GST가 연결된 벡터 (pCB4170-GST) 그리고 pCB4270에 710 프로모터와 GST가 연결된 벡터 (pCB4270-GST)를 얻을 수 있었다.

서열번호 11: AACCTTGTCGACGAAAGGATAGAAAAAATGTCCCCTATACTAGGTTATTG

서열번호 12: AAGGTTCTGCAGTTATTAATCCGATTTTGGAGGATGGTC

pCB4170을 함유하는 류코노스톡, pCB4170-GST 벡터를 함유하는 류코노스톡 그리고 pCB4270-GST 벡터를 가진 류코노스톡 세가지를 MRS 배지에 접종하여 12시간 동안 30 ℃, 200 rpm에서 배양하였고, 1/50 부피만큼을 새로운 MRS 배지에 옮겨 동일한 조건에서 12시간 배양하였다. 배양된 류코노스톡을 같은 양만큼 6000rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 수득하였고, PBS에 현탁하여 초음파 용해를 통해 세포 내부의 단백질을 수득하였다. 상기 수득한 단백질로 웨스턴 블럿을 수행하였고, 항체로는 anti-GST-HRP conjugated antibody (GE Healthcare)를 사용하였다.

그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, pCB4170-GST는 발현이 확인되지 않았고, pCB4270-GST의 경우 GST의 발현이 확실히 확인되었다.

알파-아밀라아제의 경우, 아밀라아제 자체의 signal sequence를 그대로 이용하여 세포 외로 분비생산되었다. 아밀라아제와 그 signal sequence의 유전자 절편은 PCR을 통해 제작하였다. 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 (서열번호 13 및14)을 이용하였고, 각 프라이머들의 Tm은 모두 55℃ 이상으로 제작하였다. PCR에 이용된 유전자의 주형으로는 락토바실러스 아미로보로스(Lactobacillus amylovorus) KCTC3597의 염색체 DNA를 이용하였다.

서열번호 13: AACCTTGTCGACTTTCAATATTTTAATAAAGGGGGCAGTAAAAAGTG

서열번호 14: AAGGTTACTAGTGCTGGTATCGGCTTACG

제작된 아밀라아제 유전자 절편과 벡터 pCB4170-sfGFP, pCB4270-sfGFP를 각각 제한효소 SalI과 PstI으로 처리하여 T4 라이게이즈를 이용하여 각각 라이게이션 하였다. 그 결과로 pCB4170-Amy, pCB4270-Amy 벡터가 생성되었다.

아밀라아제의 활성도를 비교하기 위해 i) 아밀라아제의 녹말 분해에 따른 요오드 반응 그리고 ii) 형광물질을 이용한 아밀라아제 활성 측정 키트 두가지 방법을 이용하였다.

먼저, 요오드 반응 실험을 위해 pCB4170, pCB4170-Amy, pCB4270, pCB4270-Amy를 함유하는 류코노스톡을 30℃, 200 rpm에서 12시간 배양하였다. 배양액을 0.5% 가용성 녹말과 10mg/L의 클로람페니콜 항생제가 함유된 MRS 플레이트에 작은 점의 크기로 도포하였고, 아밀라아제가 충분히 녹말을 분해할 수 있도록 플레이트를 30℃에서 24시간 배양하였다.

이후 MRS 플레이트 위에 루골요오드용액(요오드-요오드화 칼륨 용액)을 고르게 도포하여 분해되지 않은 녹말과의 반응을 유도하였다. 아밀라아제 활성을 가질 경우, 세포 주변의 녹말이 분해되어 요오드-녹말 반응이 일어나지 않아 배지의 색깔이 짙은 보라색으로 변하지 않는다.

그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이 pCB4170 또는 pCB4270의 공벡터를 함유한 류코노스톡은 아밀라아제 활성을 보이지 않았다. 또한 pCB4170-Amy에 비해 pCB4270-Amy를 함유한 류코노스톡의 주변에 확연히 더 넓은 투명한 원이 나타난 것으로 보아, pCB4270-Amy를 함유한 류코노스톡의 아밀라아제 활성도가 기존 pCB4170-Amy에 비해 상당량 증가한 것을 알 수 있다.

아밀라아제 활성을 정량적으로 측정하기 위해, EnzChek　 Ultra Amylase Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, 미국)를 이용하였다. pCB4170-Amy, pCB4270-Amy를 함유하는 류코노스톡을 30℃, 200rpm에서 12시간 배양하였고, 신선한 MRS 배지에 각각 옮겨져 같은 조건에서 8시간 배양하였다. 류코노스톡 시트리움 배양액을 13000rpm에서 10분 원심분리한 후, 상층액으로 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다. 각각 벡터에서 분비생산된 아밀라아제의 활성을 비교한 결과, pCB4170-Amy를 함유한 류코노스톡의 경우 활성값이 17 U/L, pCB4270-Amy를 함유한 류코노스톡의 활성값은 162 U/L로 측정되어 발굴한 pCB4270 고복제수 플라스미드를 이용하였을 때 아밀라아제의 활성이 약 9.5배 증가하는 것을 확인하였다(도 5c).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Chungbuk National University Industry-University Cooperation Foundation <120> High-Copy Number Shuttle Vector for Expression in Leuconostoc sp. <130> P16-B090 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1587 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3980~5567 sequence of pCB4270 <400> 1 gttccatatt tgttcccttc ctacgccatt atattacttt gacaacaaat ttatttctag 60 caaatatttc ttgcattgtt catttagcaa tgataacaag ggcaatcagt ttgatttgag 120 cagagaaagc cctaagtatt taggactttt aagattgttc aaggtataat tcagaatcat 180 atcgcttgta tcaaccacgt atatcgctct aatttctctt ctatcgtctg cccaatagaa 240 acccttactt ttataagtca ataaggttag aacacgtcag acaccgctta agtcgcttta 300 tatgcgattt aaaccatata gtgtgctaat tctatatgcc acttctttgc caattacttg 360 cgggcgagcc tacccataat cgaattgttc attccccaca atctcgcttt gattgctttg 420 gacgtggttt agacgacctt tcagccctct tgacggatac acgcctgttc cgtattagtt 480 gttaggataa cgtccgacaa cgattgaaca gacgtaaaaa gcgtatcctc gtgcttagtt 540 aggctggagg atacgctttc atagtcgttt atagttcttt tttgagtaaa gctgtttact 600 ctgagtctat aagtttgtat aatagtaagt attctaagcc attgcagagg tctaattctg 660 taatggcaaa accctgatag ttgtaatatc taggtcacca agtcctaacc tttgcagggg 720 ttgaggtctt tttatttgta tttaaatgtt gatatgagta tagcattaag aactatacat 780 gacaataaac aaacaaataa tcttatgttt taataattaa acgaccaact taaaacgtca 840 acaatatagt aaacttaaaa cgtaaacttt acatcgctta agtttacgtt tggagagact 900 gatgacacac gaatttgata ccattatcgc gatagcagac gaactagaaa tatctcgtca 960 agccttaaat agaaaggcta aacgccttaa tatagattta tctaaaaagt cattcaccga 1020 taaagaatgg caacttttag tgtcaaacaa acgtaaaccc aaaaagtcaa cttcaagtaa 1080 ctatgttgac acttttacag cgcaacaact agctgaaaaa gatgatttaa ttaattattt 1140 aaaatcacaa attaaagaaa aagataaaca aattgatcat gcgcaacaat tacaattaat 1200 tgctgaacaa agattaacag agacaaataa aaccctaatt gagtatcaag aaaaagaaaa 1260 tcagccaaag aaaggattct ggcaaaggtt atttaaatag ttttctaata gtacttttat 1320 agcgtccgtt ttgtttgtta gtatttttcg ttcatcaacc gtccgcttat caaaattgat 1380 tttaattaaa aaagggattg ggaatttccc aaacaaaaac atatcaattt agatatattt 1440 ttacctcatg tgtgaccaca catagtatgc tcgcaacaag aacttttgtt gtttttcaag 1500 ttgtcgataa cagcgacttc tgatacatat ttttgagcgc aaacaactcc attttagaag 1560 tggagtgtaa gtgcgcatta aactcat 1587 <210> 2 <211> 5578 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCB4270 <400> 2 gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 60 acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 120 actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 180 gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 240 cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 300 tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 360 gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 420 ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 480 aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 540 tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 600 ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 660 gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 720 tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 780 caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 840 ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 900 cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 960 ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 1020 cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 1080 gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 1140 aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 1200 acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 1260 gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 1320 cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 1380 cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 1440 tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 1500 cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 1560 gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 1620 cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 1680 ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 1740 gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 1800 taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 1860 gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 1920 acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 1980 aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 2040 cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 2100 atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 2160 gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 2220 cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 2280 gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 2340 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 2400 gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 2460 ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 2520 gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 2580 ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct 2640 tgcatgcctg caggtcgatt ataggtatgt ggttttgtat tggaatggca ttttttgcta 2700 tcaaggttat taaaaataaa aattagacca cgcatttatg ccgagaaaat ttattgtgcg 2760 ttgagaagaa cccttaacta aacttgcaga cgaatgtcgg catagcgtga gctattaagc 2820 cgaccattcg acaagttttg ggattgttaa gggttccgag gctcaacgtc aataaagcaa 2880 ttggaataaa gaagcgaaaa aggagaagtc ggttcagaaa aagaaggata tggatctgga 2940 gctgtaatat aaaaaccttc ttcaactaac ggggcaggtt agtgacatta gaaaaccgac 3000 tgtaaaaagt acagtcggca ttatctcata ttataaaagc cagtcattag gcctatctga 3060 caattcctga atagagttca taaacaatcc tgcatgataa ccatcacaaa cagaatgatg 3120 tacctgtaaa gatagcggta aatatattga attaccttta ttaatgaatt ttcctgctgt 3180 aataatgggt agaaggtaat tactattatt attgatattt aagttaaacc cagtaaatga 3240 agtccatgga ataatagaaa gagaaaaagc attttcaggt ataggtgttt tgggaaacaa 3300 tttccccgaa ccattatatt tctctacatc agaaaggtat aaatcataaa actctttgaa 3360 gtcattcttt acaggagtcc aaataccaga gaatgtttta gatacaccat caaaaattgt 3420 ataaagtggc tctaacttat cccaataacc taactctccg tcgctattgt aaccagttct 3480 aaaagctgta tttgagttta tcacccttgt cactaagaaa ataaatgcag ggtaaaattt 3540 atatccttct tgttttatgt ttcggtataa aacactaata tcaatttctg tggttatact 3600 aaaagtcgtt tgttggttca aataatgatt aaatatctct tttctcttcc aattgtctaa 3660 atcaatttta ttaaagttca tttgatatgc ctcctaaatt tttatctaaa gtgaatttag 3720 gaggcttact tgtctgcttt cttcattaga atcaatcctt ttttaaaagt caatattact 3780 gtaacataaa tatatatttt aaaaatatcc cactttatcc aattttcgtt tgttgaacta 3840 atgggtgctt tagttgaaga ataaagacca cattaaaaaa tgtggtcttt tgtgtttttt 3900 taaaggattt gagcgtagcg aaaaatcctt ttctttctta tcttgataat aagggtactc 3960 tagaggatcc ccgggtaccg ttccatattt gttcccttcc tacgccatta tattactttg 4020 acaacaaatt tatttctagc aaatatttct tgcattgttc atttagcaat gataacaagg 4080 gcaatcagtt tgatttgagc agagaaagcc ctaagtattt aggactttta agattgttca 4140 aggtataatt cagaatcata tcgcttgtat caaccacgta tatcgctcta atttctcttc 4200 tatcgtctgc ccaatagaaa cccttacttt tataagtcaa taaggttaga acacgtcaga 4260 caccgcttaa gtcgctttat atgcgattta aaccatatag tgtgctaatt ctatatgcca 4320 cttctttgcc aattacttgc gggcgagcct acccataatc gaattgttca ttccccacaa 4380 tctcgctttg attgctttgg acgtggttta gacgaccttt cagccctctt gacggataca 4440 cgcctgttcc gtattagttg ttaggataac gtccgacaac gattgaacag acgtaaaaag 4500 cgtatcctcg tgcttagtta ggctggagga tacgctttca tagtcgttta tagttctttt 4560 ttgagtaaag ctgtttactc tgagtctata agtttgtata atagtaagta ttctaagcca 4620 ttgcagaggt ctaattctgt aatggcaaaa ccctgatagt tgtaatatct aggtcaccaa 4680 gtcctaacct ttgcaggggt tgaggtcttt ttatttgtat ttaaatgttg atatgagtat 4740 agcattaaga actatacatg acaataaaca aacaaataat cttatgtttt aataattaaa 4800 cgaccaactt aaaacgtcaa caatatagta aacttaaaac gtaaacttta catcgcttaa 4860 gtttacgttt ggagagactg atgacacacg aatttgatac cattatcgcg atagcagacg 4920 aactagaaat atctcgtcaa gccttaaata gaaaggctaa acgccttaat atagatttat 4980 ctaaaaagtc attcaccgat aaagaatggc aacttttagt gtcaaacaaa cgtaaaccca 5040 aaaagtcaac ttcaagtaac tatgttgaca cttttacagc gcaacaacta gctgaaaaag 5100 atgatttaat taattattta aaatcacaaa ttaaagaaaa agataaacaa attgatcatg 5160 cgcaacaatt acaattaatt gctgaacaaa gattaacaga gacaaataaa accctaattg 5220 agtatcaaga aaaagaaaat cagccaaaga aaggattctg gcaaaggtta tttaaatagt 5280 tttctaatag tacttttata gcgtccgttt tgtttgttag tatttttcgt tcatcaaccg 5340 tccgcttatc aaaattgatt ttaattaaaa aagggattgg gaatttccca aacaaaaaca 5400 tatcaattta gatatatttt tacctcatgt gtgaccacac atagtatgct cgcaacaaga 5460 acttttgttg tttttcaagt tgtcgataac agcgacttct gatacatatt tttgagcgca 5520 aacaactcca ttttagaagt ggagtgtaag tgcgcattaa actcatggta ccgagctc 5578 <210> 3 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctgttataat tgatataacc agaagtcgac tagcttgaaa ggatagaaaa aatgagcaaa 60 ggagaagaac ttttcac 77 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aaggttctgc aggcggccgc ttattatttg tagagctcat ccatgc 46 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttccaaggat ccccgggtac cg 22 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aaggccgaat tcgagctcgg taccatg 27 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttgaagtcat tctttacagg agtc 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cggagagtta ggttattggg ata 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 acacaactaa ccgtcaatgg atg 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ccttcaagcc aaccttcagc 20 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aaccttgtcg acgaaaggat agaaaaaatg tcccctatac taggttattg 50 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aaggttctgc agttattaat ccgattttgg aggatggtc 39 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aaccttgtcg actttcaata ttttaataaa gggggcagta aaaagtg 47 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aaggttacta gtgctggtat cggcttacg 29

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 DNA 단편을 함유하는 벡터.
제1항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 벡터.
제1항에 있어서, 대장균-류코노스톡 셔틀벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
제1항의 벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자 삽입되어 있는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
제5항에 있어서, 대장균 또는 류코노스톡 속 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
다음 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법:
(a) 제5항 또는 제6항의 재조합 미생물을 배양하여, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 의하여 발현되는 목적단백질을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 목적단백질을 수득하는 단계.
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