CN106366201A - 融合蛋白damp4‑igf‑1的基因序列、载体、重组菌株、重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种融合蛋白DAMP4‑IGF‑1的基因序列。本发明还公开一种融合蛋白DAMP4‑IGF‑1及其制备方法。本发明还公开融合蛋白DAMP4‑IGF‑1的基因序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。本发明公开一种转基因重组菌。本发明公开一种宿主细胞。本发明公开上述基因序列、上述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产融合蛋白DAMP4‑IGF‑1中的应用。本发明利用新型融合标签DAMP4在枯草芽孢杆菌中与IGF‑1进行融合表达，利用DAMP4的特殊性质对融合蛋白进行加热纯化。

Description

融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列、载体、重组菌株、重组蛋白 及其制备方法

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列、载体、重组菌株、重组蛋白及其制备方法。

背景技术

早期断奶对仔猪带来的断奶应激影响着猪生产业的经济利益。诸多研究发现，母猪乳中的一些生长因子如乳源生长因子类胰岛素样生长因子IGF-1可以通过促进仔猪的肠道发育从而减少断奶应激所带来的危害，同时又可以修复受损的肠组织。因此为了深入研究猪源IGF-1与肠道发育之间的关系，人们需要获得大量具有生物学活性的猪源IGF-1。相比较于直接从机体内部分离，利用性价比更高的基因工程技术进行异源重组表达成为人们获取猪源IGF-1的首选。但在实际操作中，对于重组蛋白的纯化始终是制约工业化生产的瓶颈问题。传统的纯化多会选用一些亲和标签蛋白，例如：6×His，GST等。这些标签蛋白的后期纯化往往需要依托于昂贵的仪器和繁琐的纯化步骤。这些因素提高了成本制约了在畜牧行业中的应用。

发明内容

发明目的：本发明的所要解决的技术问题是提供了一种融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种融合蛋白DAMP4-IGF-1。

本发明还要解决的技术问题是提供了上述融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种转基因重组菌。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种宿主细胞。

本发明还要解决的技术问题是提供了上述的基因序列、上述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产融合蛋白DAMP4-IGF-1中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种融合蛋白DAMP4-IGF-1的制备方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是提供了一种融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列如下：

GGATCCATGGACCCTAGTATGAAGCAGCTGGCAGATAGCCTTCATCAGCTGGCTAGGCAAGTATCAAGGTTGGAGCATGCAGATCCAAGTATGAAACAGCTCGCTGATTCACTGCACCAACTGGCAAGACAAGTGTCTCGTCTTGAGCATGCTGATCCATCAATGAAACAGCTGGCCGATAGCCTCCATCAGTTGGCACGACAAGTTTCTCGTCTCGAACATGCAGACCCTTCTATGAAACAACTTGCCGATTCTTTACACCAGTTAGCGAGACAAGTCTCGAGATTAGAACACGCCGACGATGACGACAAATACTTCAACAAACCGACGGGTTATGGATCGAGCAGCCGGCGCGCTCCTCAAACCGGCATTGTTGATGAATGCTGCTTTCGTTCCTGTGATTTGCGGCGGCTTGAAATGTATTGTGCGCCGTTAAAGCCGGCGAAATCCGCGAGATCAGTCCGCGCCCAACGCCATACTGATATGCCGAAAGCGCAGAAAGAAGTGCATCTTAAGAATACATAATAATCTAGA

本发明内容还包括一种融合蛋白DAMP4-IGF-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述的融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

将上述的基因序列插入到枯草芽孢杆菌表达载体中得到含有融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体。

上述枯草芽孢杆菌表达载体为穿梭表达载体pHT43。

本发明内容还包括一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

本发明内容还包括一种宿主细胞，所述宿主细胞是将所述的重组表达载体导入枯草芽孢杆菌中得到。

其中，上述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800n。

其中，上述的基因序列、上述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产融合蛋白DAMP4-IGF-1中的应用。

本发明内容还包括一种融合蛋白DAMP4-IGF-1的制备方法，包括以下步骤：

1)、根据DAMP4和IGF-1的氨基酸序列设计融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列，所述融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列如SEQ ID NO：1所示；

2)、含有融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体构建；

3)、重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌中进行诱导表达获得融合蛋白DAMP4-IGF-1；

4)、融合蛋白DAMP4-IGF-1纯化即得。

本发明的融合蛋白DAMP4-IGF-1的具体的制备方法如下：

1)根据DAMP4和IGF-1的氨基酸序列设计融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列，整条核酸序列在上海生工进行全基因合成；

2)将全基因合成的融合基因和穿梭表达载体pHT43用两个相同的限制酶(BamHI和XabI)进行双酶切处理，处理后的片段利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对目标基因片段进行回收，最终利用T4连接酶进行连接；

3)将连接体系转入大肠杆菌感受态DH5a中进行重组载体的构建，挑取阳性克隆进行PCR、双酶切以及DAN测序分析；

4)将测序结果正确的重组质粒转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌WB800n中，挑取阳性克隆于5mL LB培养基中过夜培养。次日，按1％接种量接种到100mL新鲜的2YT培养基中进行扩大培养，4小时后加入IPTG诱导剂(终浓度1mM)进行重组蛋白的诱导表达；

5)将诱导后12小时的菌液进行离心进行菌体和上清分离。取得一定量的菌液上清样品后，向菌液上清中加入Na₂SO₄(终浓度1M)。将加入Na₂SO₄的菌液上清进行高温加热处理(90℃水浴)30分钟后将样品再次离心，收集沉淀和上清样品进行电泳检测。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明利用新型融合标签DAMP4首次在枯草芽孢杆菌中与IGF-1进行融合表达，利用DAMP4的特殊性质对融合蛋白进行加热纯化。本发明实验结果表明，1、融合蛋白DAMP4-IGF-1在枯草芽孢杆菌中首次成功的获得了分泌表达，Western blotting检测结果表明融合蛋白中具有IGF-1的免疫原活性本试验最大的创新点在于新型融合标签DAMP4的使用，本试验首次利用该融合标签对IGF-1在枯草芽孢杆菌中实现重组表达。另外在纯化过程中，由于利用了该融合标签可以省去复杂的纯化仪器对融合蛋白进行纯化，降低了获得IGF-1的成本，也一定程度的扩展了其应用领域。2、利用高温高盐对上清液进行加热。在该条件下多数蛋白变性沉淀但融合蛋白DAMP4-IGF-1依然保持可溶从而达到了纯化的目的。

附图说明

图1、含有融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体构建图；

图2、含有融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体双酶切鉴定图；泳道1：为双酶切后的DAMP4-IGF-1的基因片段，534bp，泳道2：为15000bp的DNAmaker；

图3、含有融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体的DNA测序比对结果图；

图4、验证正确的融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体成功转入到枯草芽孢WB800n中得到的单克隆菌落；

图5、SDS-PAGE及Western blot分析1mM IPTG 12小时诱导表达结果图；M：200KDa蛋白Marker；1：枯草芽孢杆菌WB800n上清；2：含有空载体pHT43的枯草芽孢杆菌WB800n上清；3：含有重组载体pHT43-IGF-1的枯草芽孢杆菌WB800n上清(未诱导)；4、5：含有重组载体pHT43-IGF-1的枯草芽孢杆菌WB800n(诱导)；

图6、SDS-PAGE分析不同浓度Na₂SO₄对12小时诱导上清中融合蛋白的加热纯化效果图；M：200KDa蛋白Marker；1：含有空载体pHT43的枯草芽孢杆菌WB800n上清(1mM IPTG诱导)；2：含有重组载体pHT43-IGF-1的枯草芽孢杆菌WB800n(1mMIPTG诱导)；3：1M Na₂SO₄加热纯化后沉淀；4：0.5M Na₂SO₄加热纯化后上清；5：0.8M Na₂SO₄加热纯化后上清；6：1M Na₂SO₄加热纯化后上清；7：菌体经1M Na₂SO₄加热纯化后上清；

图7、SDS-PAGE分析经肠激酶作用的融合蛋白以及western blot分析纯化后的IGF-1；a：利用肠激酶对融合蛋白进行切割；b：纯化后的IGF-1以及western blot分析。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

本发明实施例中T4DNA连接酶、DNA marker、限制性内切酶XbaI和BamHI、4×Tricine-SDS样品缓冲液、Taq DNA聚合酶和蛋白marker均购自购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购于天根生化科技(北京)有限公司；低熔点琼脂糖、过硫酸铵(Ammonium Persuifate)等均购自Sigma公司；胰蛋白胨购于Oxoid公司；酵母提取物购于Difco公司；其他试剂均为国产分析纯。基因全合成、引物合成以及测序均由生工生物工程(上海)有限公司完成。

本发明实施例中采用的10mL GMI培养基：1mL 10×最低盐溶液，0.1mL 10％酵母粉，0.25mL 20％葡萄糖，0.2mL 1％水解酪蛋白，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。

10mL GMⅡ培养基：1mL 10×最低盐溶液，0.05mL 10％酵母粉，0.25mL 20％葡萄糖，0.04mL 1％水解酪蛋白，0.05mL 0.1mo l/L CaCl₂，1mL 25mmo l/L MgCl₂，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。

10×最低盐溶液(Spizizen salt)：K₂HPO₄ 70g，KH₂PO₄ 30g，(NH4)₂SO₄ 10g，Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 5g，MgSO₄·7H₂O 1g，在蒸馏水中依次溶解，加水至500ml。过滤除菌或113℃灭菌30min后贮存于棕色瓶内，用黑纸包裹。

实施例1含有融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因的克隆及其重组表达载体的构建

1)根据DAMP4和IGF-1的氨基酸序列设计融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列，整条核酸序列在生工生物工程(上海)有限公司进行全基因合成；

2)将全基因合成的融合基因和穿梭表达载体pHT43用两个相同的限制酶(BamHI和XbaI)进行双酶切处理，处理后的片段利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对目标基因片段进行回收，最终利用T4连接酶进行连接；

目的基因以及表达载体质粒均按以下酶切体系进行：

37℃水浴30min。

目的基因与表达载体的连接体系如下：

4℃过夜连接。

3)将连接体系转入大肠杆菌感受态DH5a中进行重组载体的构建，过夜挑去阳性克隆进行质粒提取并对其进行双酶切鉴定以及DNA测序分析；

(3a)将10μL连接产物加入到200μL感受态细胞E.coli(DH5α)中，冰上放置30min；

(3b)42℃热激90s；

(3c)迅速取出冰浴1～2min；

(3d)向离心管中加入800μL LB培养基，37℃200rpm振荡培养1～1.5h；

(3e)7000rpm离心1min，吸除700μL上清；

(3f)用微量移液枪将剩余的转化产物吹打均匀；

(3g)将转化产物涂布含有25μg/mL氯霉素的LB平板，室温放置3～5min，待液体吸收后，37℃倒置培养至可见单菌落。

双酶切验证体系如下：

本实施例合成的融合基因成功嵌入到表达载体pHT43中，DNA测序结果表明重组质粒pHT43/DAMP4-IGF-1构建成功。具体结果如图1、图2、图3。

实施例3：表达融合蛋白DAMP4-IGF-1的重组菌株的构建

将实施例2中测序结果正确的重组载体转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌WB800n感受态细胞中，挑取阳性克隆于5mL LB培养基中过夜培养得到重组菌株。具体步骤如下：

将大肠杆菌中构建成功的重组表达载体利用化学方法转入到表达宿主菌枯草芽孢杆菌WB800n中(图4)，挑取阳性克隆过夜培养后进行诱导表达。

枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞的制备以及重组质粒的化学转化

(1)挑取一新鲜培养的枯草芽孢杆菌WB800N单菌落接种于25mL GMⅠ培养基中，30℃130～150r/min振荡培养过夜；

(2)将步骤(1)过夜培养物按10％接种量接种于25mL新鲜的GMⅠ培养基中，37℃200～230r/min振荡培养3.5h；

(3)再将步骤(2)培养得到的培养物进行第二次传代，以10％接种于50mL新鲜的GMⅡ培养基中，37℃200～230r/min振荡培养90min；

(4)取1mL步骤(3)培养得到的培养物，5000r/min室温离心5min，用1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。

(5)将5μL测序正确的重组载体加入到100μL枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞中；

(6)37℃水浴中静置30～60min；

(7)37℃200r/min震荡培养2～4h；

(8)将感受态涂布在含有氯霉素(10μg/mL)的LB固体培养基，每100μL转化体系涂到平板，37℃倒置培养过夜得到重组菌株。

实施例4：IPTG诱导表达融合蛋白DAMP4-IGF-1及其纯化

将实施例3得到的重组菌株按1％接种量接种到100mL新鲜的2YT培养基中进行扩大培养，4小时后加入IPTG诱导剂(终浓度1mM)进行重组蛋白的诱导表达。诱导后12小时的菌液进行离心进行菌体和上清分离。取得一定量的菌液上清样品后，向菌液上清中加入Na₂SO₄(终浓度1M)。将加入Na₂SO₄的菌液上清进行高温加热处理(90℃水浴)30分钟后将样品再次离心，收集沉淀和上清样品进行电泳检测。

本实施例使用1mM IPTG对含有重组质粒pHT43/DAMP4-IGF-1的枯草芽孢杆菌WB800n进行诱导表达。结果经过SDS-PAGE分析表明(图5)，经过12个小时诱导后融合蛋白DAMP4-IGF-1(约19Kda)被分泌到培养基中。对特异性条带进行Western blot检测(图5)，结果表明融合蛋白DAMP-IGF-1具有IGF-1免疫原活性。

本实施例利用不同Na₂SO₄(0.5M、0.8M、1M)对分泌表达的蛋白进行加热纯化(90℃，30分钟)，具体结果如图6，上清中19Kda的条带在高温高盐处理后在溶液中保持可溶(图6，第4、5、6泳道)，而上清液中的其他蛋白变性沉淀(图6，第3泳道)。结果表明1MNa₂SO₄浓度纯化效果最好(图6，第6泳道)。纯化后的融合蛋白DAMP4-IGF-1浓度为47mg/每升。

第七泳道是离心后的菌体混合硫酸钠加热和的样品，主要是用来观察菌体内部是否有融合蛋白的残留。

本实施例利用热纯化的融合蛋白利用超滤管浓缩并更换缓冲液后利用肠激酶进行切割(20mM Tris-HCl，200mM NaCl，2mM CaCl₂，pH＝7.2，4℃)。具体结果如图7a，融合蛋白经过肠激酶裂解后利用SDS-PAGE分析，在14.4Kda和6.5Kda之间出现DAMP4和IGF-1的条带。

(1)将高温高盐纯化后的样品进行四度透析过夜，目的为换切割buffer(20mMTris-HCl，200mM NaCl，2mM CaCl₂，pH＝7.2)；

(2)将透析后的样品利用截流量为3Kda的超滤管进行浓缩，12000rpm，10分钟；

(3)向上述100uL的浓缩样品中加入肠激酶，按着每8单位切割1mg的比例向透析液中加入肠激酶。在4℃条件下进行过夜酶切；

(4)将酶切后的样品使用SDS-page检测。

本实施例利用上述的切割方法，将切割后的样品10mL在低盐buffer中进行透析(0.125mM NaSO₄)。利用DAMP4在低盐溶液中不可溶的原理将切割体系中的标签蛋白DAMP4离心去除。将离心后的上清利用SDS-page进行检测，通过SDS-page分析可以观察到，为切割开的融合蛋白DAMP4-IGF-1和切割裂解后的DAMP4都已去除，可在6.5Kda和14.4Kda之间看到IGF-1的条带IGF-1理论分子量为7.6Kda。具体结果如图7b。切割后的IGF-1蛋白的浓度为3mg/每升。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种融合蛋白DAMP4-IGF-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求1所述的融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的基因序列插入到枯草芽孢杆菌表达载体中得到含有融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌表达载体为穿梭表达载体pHT43。

6.一种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是将权利要求4或5所述的重组表达载体导入枯草芽孢杆菌中得到。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800n。

9.权利要求1所述的基因序列、权利要求3所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产融合蛋白DAMP4-IGF-1中的应用。

10.一种融合蛋白DAMP4-IGF-1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、根据DAMP4和IGF-1的氨基酸序列设计融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列，所述融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列如权利要求1所述的SEQ ID NO：1所示；

2)、含有融合蛋白DAMP4-IGF-1的基因序列的重组表达载体构建；

3)、重组表达载体转化到枯草芽孢杆菌中进行诱导表达获得融合蛋白DAMP4-IGF-1；

4)、融合蛋白DAMP4-IGF-1纯化即得。