CN103060359A - 一种利用缩短后l2蛋白标签纯化重组蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明利用缩短后的L2蛋白与小分子泛素样修饰物(SUMO)融合伴侣用于目标蛋白的纯化。由于采用了能特异性吸附含硅材料和阳离子交换树脂的缩短后的L2蛋白，可以利用廉价的含硅材料或离子交换树脂快速的从发酵液或细胞破碎液中分离出目的融合蛋白，然后在带纯化标签的SUMO蛋白酶的作用下，快速的将目的蛋白从融合蛋白上释放出来。此过程只需简单的过滤，旋液分离，或离心操作，易于大规模放大。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的重组蛋白纯化标签，以及该纯化标签结合SUMO融合伴侣在基因重组蛋白纯化中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
重组蛋白的亲和纯化方式在实验室规模下，简单方便，应用广泛。然而开发高效率，低成本，环境友好型的用于大规模规模下基因重组蛋白纯化的亲和纯化技术仍是一个巨大的挑战。传统的亲和纯化技术难以应用于大规模的重组蛋白纯化，主要是存在两个缺陷：1.纯化标签一般会影响目的蛋白的结构或功能特性，所以需要借助一些方法去除标签。标签的去除一般采用化学法(CNBr，甲酸等)，酶法(肠激酶，Xa因子等)，可诱导末端切割蛋白(微型内含肽)等，存在目的蛋白被意外切割，蛋白酶识别位点暴露不足，酶切效率低下等问题；2.亲和纯化树脂及其使用溶液的成本较高。传统亲和纯化技术难以应用于大规模的基因重组蛋白的纯化，需要从亲和纯化标签及标签去除技术改良与亲和纯化树脂的低成本化两方面进行。
2007年，Taniguchi等提出将50S核糖体亚基上的L2蛋白用于在二氧化硅表面固定化重组蛋白，之后Akio Kuroda研究小组又提出将L2蛋白用于重组蛋白的纯化。由于L2有273个氨基酸，较大的L2蛋白导致较低的目的蛋白得率。L2蛋白的微型化，选择合适的低成本的亲和吸附材料和高效的标签去除技术是实现缩短后的L2蛋白介导的亲和纯化技术从实验室规模走向工业化规模的关键。较大的L2蛋白会影响目的蛋白的得率，在保证其吸附特性的基础上将L2蛋白进行合适的修剪将更有利于提高目的蛋白的回收。二氧化硅，硅胶，硅藻土，离子交换树脂等都是一些较为廉价的吸附材料，作为亲和吸附材料将极大地降低吸附介质的成本。酿酒酵母泛素样特异性蛋白酶1(Ubiquitin-like specific protease 1，Ulp1)，也称SUMO蛋白酶，其中第403aa到621aa活性片段Ulp1p表现出具有全长的Ulp1酶切活性，能够水解以α-氨基连接的SUMO-目的蛋白偶合物。它特异性识别小分子泛素样修饰物(SUMO)蛋白的三级结构，而不像其它蛋白酶只识别特定的氨基酸序列，故该蛋白酶可以切割重组融合蛋白的SUMO。SUMO蛋白酶作用温度为30℃，该酶作用温度(4-37℃)和pH范围(pH7-9)都比较广泛。采用重叠PCR将目的蛋白与SUMO进行无缝拼接，最终能得到天然末端的目的蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效的缩短的L2蛋白-SUMO为融合伴侣的亲和纯化技术。采用的亲和吸附材料为硅胶，硅藻土，离子交换树脂等廉价的吸附介质。
本发明提供一种新的带缩短L2蛋白标签的SUMO蛋白酶纯化方法。
根据本发明的一个方面，由缩短的L2蛋白(L2s)和SUMO基因融合目的蛋白，进行目的蛋白的一般纯化过程，其示意图如图1，所述纯化过程包括以下步骤：
1.将L2s-SUMO-目的蛋白编码基因克隆到原核表达载体pET28a(+)，构建表达质粒；
2.将所述表达质粒转化入大肠菌株BL21(DE3)，并进行培养表达；
3.对所述大肠杆菌进行超声裂解或高压匀浆，裂解菌液进行低温离心和过滤，取清液；
4.通过将所述清夜与硅胶或硅藻土或离子交换树脂等吸附介质混合，常温搅拌30-60min后，离心或过滤，除去上清；
5.用适当的缓冲液重悬吸附介质，按1∶300～1∶1000(L2-SUMO蛋白酶：L2s-SUMO-目的蛋白，w/w)加纯化的L2s-SUMO蛋白酶，常温搅拌30min-3h，或低温(0℃-15℃)搅拌3-12h，然后离心或过滤，得到清液，去标签后目的蛋白存在于清夜中。
根据本发明的另一个方面，由缩短的L2蛋白(L2s)和SUMO蛋白酶进行融合表达，比未缩短前的L2蛋白和SUMO蛋白酶进行融合表达所得到的目的蛋白增加了20％，示意图如图
1，其进行的一般纯化过程，其示意图如图2，所述纯化过程包括以下步骤：
(1)将L2s-SUMO蛋白酶编码基因克隆到原核表达载体pET28a(+)，构建表达质粒；
(2)将所述表达质粒转化入大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)，并进行培养表达；
(3)对所述大肠杆菌进行超声裂解或高压匀浆，裂解菌液进行低温离心和过滤，取清液；
(4)通过将所述清夜与合适的离子交换树脂混合，常温搅拌30-60min后，离心或过滤，除去上清；
(5)采用0.1-0.6M NaCl清洗树脂，然后用1M NaCl将L2s-SUMO蛋白酶从离子交换树脂上洗脱下来，按合适比例加入到重悬后的吸附有L2s-SUMO-目的蛋白的介质中进行酶切。
本发明使用的表达载体为pET-28a(+)，受体菌为大肠杆菌大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。商品化的大肠杆菌表达载体有几十种，市售的大肠杆菌表达宿主也有多种菌株，采用其它的大肠杆菌表达载体和表达宿主也可以应用L2s-SUMO-目的蛋白和L2s-SUMO蛋白酶耦合的亲和吸附纯化技术。
另外，采用大肠杆菌以外的宿主如酵母、真菌、动植物细胞也能使用上述亲和吸附纯化技术。
本发明的基因克隆技术：参照Sambrook等分子克隆手册(Sambrook，et al.1989，MolecularCloning.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)菌株，用含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基培养转化菌株。
附图说明
图1是全长L2蛋白和缩短L2蛋白介导的亲和纯化技术比较示意图；
图2是本发明缩短的L2蛋白-SUMO为融合伴侣的亲和纯化技术示意图；
图3是采用本发明技术纯化增强型绿色荧光蛋白示意电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：大肠杆菌BL21(DE3)细胞破碎液；2：吸附上清；3-5：采用不同含硅材料下纯化的增强型绿色荧光蛋白；
图4是采用本发明技术纯化硫氧还蛋白示意电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：大肠杆菌BL21(DE3)细胞破碎液；2：吸附上清；3：纯化的硫氧还蛋白。
具体实施方式
实施例1
L2s-SUMO-EGFP和L2s-SUMO蛋白酶表达载载体和宿主菌的构建：
根据2007年Taniguchi等人报道的方法从大肠杆菌得到L2蛋白编码基因(Taniguchi K，Nomura K，Hata Y，Nishimura T，Ksami Y，Kuroda A：The Si-Tag for immobilizing proteinson a silica surface.Biotechnology Bioengineering，2007，96(6)：1023-1029.)，然后将L2蛋白的N端的60个氨基酸，中间的RNA结合域，C端的73个氨基酸编码基因进行两两拼接，得缩短后的L2蛋白(L2s)编码基因。根据Malakhov等人报道的方法(MalakhovMP，Mattern MR，Malakhova OA，Drinker M，Weeks SD，Butt TR：SUMO fusions andSUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins.Journal of structural and functional genomics，2004，5：75-86.)从酿酒酵母中得到SUMO和SUMO蛋白酶编码基因，将其分别与L2s进行连接，并在SUMO后面连接增强型绿色荧光蛋白编码基因或大肠杆菌硫氧还蛋白编码基因，克隆于pET28a(+)，分别得到表达载体pET28a-L2s-SUMO-EGFP/Trx和pET28a-L2s-SUMO蛋白酶。
将构建的表达载体pET28a-L2s-SUMO-目的蛋白和pET28a-L2s-SUMO蛋白酶，参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloning.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，USA)，用CaCl2的方法分别将质粒转化入E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta(DE3)，用含卡那霉素的LB平板培养转化菌株。
实施例2
重组L2s-SUMO-EGFP/Trx和L2s-SUMO蛋白酶的表达与纯化：
将含有重组质粒的pET28a-L2s-SUMO-目的蛋白和pET28a-L2s-SUMO蛋白酶的表达宿主菌单菌落接种于Kana+的LB液体培养中，37℃200rpm培养12小时，作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种与无菌的Kana+ZYM5052培养基中，37℃200rpm培养3小时，将温度调到25℃培养12小时。将50mL诱导后的菌液进行离心收菌，用4mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬菌体，然后细胞破碎。将裂解菌液4000g离心5分钟或直接过滤，去除不溶性的菌体蛋白。L2s-SUMO-EGFP/Trx的细胞破碎清液与含硅材料进行混合吸附，常温搅拌30-60min后，离心或过滤，除去上清。将L2s-SUMO蛋白酶的细胞破碎清夜与合适的离子交换树脂混合，常温搅拌30-60min后，离心或过滤，除去上清；采用0.1-0.6M NaCl清洗树脂，然后用1M NaCl将L2s-SUMO蛋白酶从离子交换树脂上洗脱下来，按1∶300～1∶1000比例加入到重悬后的吸附有L2s-SUMO-目的蛋白的介质中进行酶切，常温搅拌30min-3h，或低温(0℃-15℃)搅拌3-12h，然后离心或过滤，得到清液，去标签后EGFP或Trx存在于清夜中。
Claims (6)
1.一种利用缩短后L2蛋白标签纯化重组蛋白的方法，其特征是由缩短后L2蛋白(L2s)基因和SUMO基因融合编码的融合伴侣，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。由缩短后L2蛋白(L2s)基因和SUMO蛋白酶基因融合编码的L2s-SUMO蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。其制备方法为：
(1)将L2s-SUMO-编码基因或L2s-SUMO蛋白酶或带其它纯化标签(如聚阳离子标签，聚组氨酸标签等)的SUMO蛋白酶编码基因克隆到原核表达载体pET28a(+)目的蛋白基因克隆到SUMO后面，构建表达质粒；
(2)将所述表达质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)或Rosetta(DE3)，并进行培养表达；
(3)对所述大肠杆菌进行超声破碎或高压匀浆，裂解菌液进行低温离心，取上清液；
(4)将所述上清液L2s-SUMO-目的蛋白或L2s-SUMO蛋白酶与硅微粉，石英粉，珍珠岩，氧化铝，凹凸棒土，高岭土，硅胶，硅藻土，离子交换树脂等吸附材料混合，吸附一段时间，然后清洗至清洗液中无杂蛋白，将吸附L2s-SUMO-目的蛋白的吸附材料与纯化的L2s-SUMO蛋白酶或聚阳离子标签纯化的SUMO混合，搅拌或震荡一段时间后，离心或过滤，上清液中即是释放出的目的蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述培养表达是将单菌落接种于Kana+的LB液体培养基中，37℃ 200rpm培养12小时，作为种子菌；取种子菌接种于新鲜的TB，2×YT，ZYM5052，LB，SOC等合适的发酵培养基37℃培养至合适菌密度后，加诱导剂或不加诱导剂，在20℃-37℃温度下继续培养12-20h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于L2s-SUMO蛋白酶采用与L2s-SUMO-目的蛋白同样的或不同的吸附材料纯化。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于L2s-SUMO蛋白酶细胞破碎液吸附在合适的吸附材料上，清洗后，洗脱得到纯化的L2s-SUMO蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于L2s-SUMO蛋白酶应用于L2s-SUMO-目的蛋白的切割。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于L2s-SUMO蛋白酶在切割融合蛋白后，直接吸附于融合蛋白所吸附的吸附材料上，无额外的SUMO蛋白酶去除步骤。
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