CN103275173B - 一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(1)将冻存的菌体放于烧杯里，按比例额加上裂解缓冲液，充分混匀；(2)将溶解好的大体积菌体直接用高压匀浆仪充分裂解；(3)将裂解好的菌体置于预冷的离心机里离心，离心好的上清液换新的离心杯后再次离心；(4)将澄清上清液倒于烧杯中，然后将预先平衡的填料加到烧杯中，置于恒温磁力搅拌器上于4℃冰箱搅拌2-3小时；(5)搅拌孵育后，静置30min，将上清液倒出，剩下的底部含有填料的样品再低速离心，去除上清，将离心下来的填料用裂解缓冲液悬起直接上到层析柱中，根据不同的纯化填料用对应的裂解缓冲液洗脱目的蛋白。本发明具有节省人力、质量可控、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法。
背景技术
目前大多数科研机构，CRO公司或高校等机构的实验室大规模纯化重组蛋白流程一般分为以下几点：一、融菌(将冻存的菌体放烧杯里，加上裂解Buffer三羟甲基氨基甲烷缓冲液，将烧杯置于磁力搅拌器上用磁性转子搅动去充分混匀)。二、超声(将溶解的菌体分装到各个小烧瓶中，每个烧杯的菌液一般小于150ml，将烧杯放置在含冰浴的器皿中，然后将超声探头置于菌体的合适位置，最后设定好超声仪器的各项参数，然后开始超声菌体)。三、离心(将超声好的菌体分装于50ml离心管中，两两平衡后置于预冷的离心机里离心(13000rpm，30min)，离心好的上清液换管子后再次离心)。四、上样(将上清液倒出于烧瓶中，然后将上清液加到预先平衡的填料中，通过重力流的方式上样)。五、洗脱目的蛋白(根据不同的纯化填料用对应的Buffer洗脱目的蛋白)。
这样的固定的大规模纯化模式长期存在于很多实验室中，对于追求利益最大化的公司来说这样的方法效率极其低下。根据分析，这种传统的方法缺陷很大，主要有二点：一、纯化工艺耗时长。二、需要人力多，在有限的工作时间里没有办法一个人独立完成。这样的费时费力的传统大规模纯化模式，对于纯化那些易降解和酶活性要求高的蛋白来说是致命的。
近年来，很多靶标蛋白研究越来越热，交叉学科研究越来越多，对于研究型的蛋白需求不断扩大，质量要求上却更加严格，利用传统的大规模纯化方式获得高品质的蛋白显然已经不能满足这种需求。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)融菌
将冻存的菌体放于烧杯里，按比例额加上裂解缓冲液，将装有菌体的烧杯置于电动搅拌机的搅拌桨中充分混匀；
(2)高压匀浆裂解菌体
将溶解好的大体积菌体直接用高压匀浆仪充分裂解；
(3)离心
将裂解好的菌体分装于500ml离心杯中，两两平衡后置于预冷的离心机里离心，离心好的上清液换新的离心杯后再次离心；
(4)搅拌填料上样
将澄清上清液倒于烧杯中，然后将预先平衡的填料加到烧杯中，再放进一个转子，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上于4℃冰箱搅拌2-3小时；
(5)洗脱目的蛋白
搅拌孵育后，静置30min，将上清液倒出，剩下的底部含有填料的样品再用500ml的离心杯低速离心，去除上清，将离心下来的填料用裂解缓冲液悬起直接上到层析柱中，根据不同的纯化填料用对应的裂解缓冲液洗脱目的蛋白。
步骤(1)所述的菌体与裂解缓冲液的比为1g菌体加7-10ml裂解缓冲液。
所述的裂解缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
步骤(1)所述的电动搅拌机的搅拌速度为300-500转每分钟，搅拌时间为1-2小时。
步骤(2)所述的高压匀浆仪的压力为500-800bar，裂解1-2个循环。
步骤(3)所述的离心机的转速为7000～10000rpm，离心时间为30min。
步骤(4)所述的填料为Ni-NTA亲和树脂或GST亲和树脂，填料的添加量为5-10mg蛋白用1ml填料。
步骤(5)所述的低速离心的转速为1000～3000rpm，时间为10min。
本发明已建立起一套成熟的实验室大规模纯化重组蛋白的工艺，采用电动搅拌机彻底溶解，通过高压匀浆仪进行细胞破碎大大节约了时间，体现出了省时间省人力的优越性，有利于工艺的简化和质量的可控，降低了生产成本，提高了产品品质，高效得到目的蛋白，大大提高了市场竞争力。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.节省时间节省人力：溶菌时使用电动搅拌机代替了磁性转子搅动；裂解菌体使用高压匀浆代替了普通超声仪；离心时用500ml离心杯代替了传统的50ml离心管；样品在烧杯中搅拌孵育代替了传统的直接用自流柱上样。
2.有利于工艺的简化和质量的可控：裂解菌体时使用高压匀浆快速裂解，离心时直接用500ml离心杯大体积离心，以及短时间搅拌孵育后直接洗脱蛋白，简化了纯化工艺，相对传统方法耗时大大缩短，同时这样省时省力的工艺有效避免了蛋白长时间暴露在外面，能有效控制蛋白降解和活性降低。
3.降低了生产成本：溶菌使用电动搅拌机，裂解菌体使用高压匀浆，离心时直接用500ml离心杯，以及搅拌孵育后再洗脱的纯化过程简便高效，纯化工艺时间大大缩短，工作量大大降低，有效降低了人力成本以及离心机等仪器的运转成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
取蛋白A菌体700g，用5L缓冲液在烧杯中，用电动搅拌机彻底溶解(传统转子和玻璃棒搅拌，一人操作需要3h，电动搅拌机只要30min)，将溶解好的样品通过高压匀浆仪进行细胞破碎(传统小体积超声需要一台机器一个人操作需要17小时，而高压匀浆一台机器一个人操作只需1小时)，破碎好的样品装到500ml的离心杯中，用高速离心机9000rpm离心30min，离心好的上清液换离心杯后再次离心(此离心过程一台离心机6孔转子需要2.5小时左右，而传统的方法是用50ml离心管离，同样一台离心机8孔转子需要15个小时左右)。将离心好的上清液和事先平衡好的纯化填料一起倒于5L的容器中，通过搅拌器低速搅拌2小时，静置30min，将大部分上清液倒出，剩下的底部含有填料的样品再用500ml的离心杯低速离心，去上清，将离心下来的填料用少量缓冲液悬起直接上到层析柱中，进行后续的洗脱(传统的方法是将离心好的5L样品直接上到层析柱中，以用10根层析柱，每根1ml/min的速度为例，上完样品需要10个小时，这又给后面的洗脱操作带来很大不便，需要二个人去完成)。传统方法操作，在仪器允许情况下，需要二个人不停息工作48小时左右才能完成上述大量纯化工作；而改进后的方法，只需一个人8小时左右就能完成。
实施例2
取蛋白B菌体1300g，用10L缓冲液在烧杯中，用电动搅拌机彻底溶解(传统转子和玻璃棒搅拌，二人操作需要3h；电动搅拌机，一人操作只要50min)，将溶解好的样品通过高压匀浆仪进行细胞破碎(传统小体积超声需要4台机器二个人操作需要8小时，而高压匀浆一台机器一个人操作只需1小时)，破碎好的样品装到500ml的离心杯中，用高速离心机8000rpm离心30min，离心好的上清液换离心杯后再次离心(此离心过程二台离心机6孔转子，一人操作需要2小时左右；而传统的方法是用50ml离心管离，同样二台离心机8孔转子，一人操作需要15个小时左右)。将离心好的上清液和事先平衡好的纯化填料一起倒于2个5L的容器中，通过搅拌器低速搅拌2小时，静置30min，将大部分上清液倒出，剩下的底部含有填料的样品再用500ml的离心杯低速离心，去上清，将离心下来的填料用少量缓冲液悬起直接上到层析柱中，进行后续的洗脱(传统的方法是将离心好的10L样品直接上到层析柱中，以用20根层析柱，每根1ml/min的速度为例，上完样品需要10个小时，洗脱操作至少需要三个人去完成)。
实施例3
一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(1)融菌
将冻存的菌体100g放于烧杯里，加上700ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液，将装有菌体的烧杯置于电动搅拌机的搅拌桨中充分混匀，搅拌速度为300转每分钟，搅拌时间为2小时；
(2)高压匀浆裂解菌体
将溶解好的大体积菌体直接用高压匀浆仪充分裂解；高压匀浆仪的压力为500bar，裂解2个循环；
(3)离心
将裂解好的菌体分装于500ml离心杯中，两两平衡后置于预冷的离心机里离心，离心好的上清液换新的离心杯后再次离心；离心机的转速为7000rpm，离心时间为30min；
(4)搅拌填料上样
将澄清上清液倒于烧杯中，然后将预先平衡的填料Ni-NTA亲和树脂加到烧杯中，再放进一个转子，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上于4℃冰箱搅拌2小时；填料的添加量为5mg蛋白用1ml填料；
(5)洗脱目的蛋白
搅拌孵育后，静置30min，将上清液倒出，剩下的底部含有填料的样品再用500ml的离心杯低速离心，低速离心的转速为1000～3000rpm，时间为10min，去除上清，将离心下来的填料用裂解缓冲液悬起直接上到层析柱中，根据不同的纯化填料用对应的裂解缓冲液洗脱目的蛋白。
实施例4
一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(1)融菌
将冻存的菌体100g放于烧杯里，加上1L4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，将装有菌体的烧杯置于电动搅拌机的搅拌桨中充分混匀，搅拌速度为500转每分钟，搅拌时间为1小时；
(2)高压匀浆裂解菌体
将溶解好的大体积菌体直接用高压匀浆仪充分裂解；高压匀浆仪的压力为800bar，裂解1个循环；
(3)离心
将裂解好的菌体分装于500ml离心杯中，两两平衡后置于预冷的离心机里离心，离心好的上清液换新的离心杯后再次离心；离心机的转速为10000rpm，离心时间为30min；
(4)搅拌填料上样
将澄清上清液倒于烧杯中，然后将预先平衡的填料GST亲和树脂加到烧杯中，再放进一个转子，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上于4℃冰箱搅拌3小时；填料的添加量为10mg蛋白用1ml填料；
(5)洗脱目的蛋白
搅拌孵育后，静置30min，将上清液倒出，剩下的底部含有填料的样品再用500ml的离心杯低速离心，低速离心的转速为1000～3000rpm，时间为10min，去除上清，将离心下来的填料用裂解缓冲液悬起直接上到层析柱中，根据不同的纯化填料用对应的裂解缓冲液洗脱目的蛋白。
Claims (6)
1.一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)融菌
将冻存的菌体放于烧杯里，按比例额加上裂解缓冲液，将装有菌体的烧杯置于电动搅拌机的搅拌桨中充分混匀；
(2)高压匀浆裂解菌体
将溶解好的大体积菌体直接用高压匀浆仪充分裂解；
(3)离心
将裂解好的菌体分装于500ml离心杯中，两两平衡后置于预冷的离心机里离心，离心好的上清液换新的离心杯后再次离心；
(4)搅拌填料上样
将澄清上清液倒于烧杯中，然后将预先平衡的填料加到烧杯中，再放进一个转子，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上于4℃冰箱搅拌2-3小时；
(5)洗脱目的蛋白
搅拌孵育后，静置30min，将上清液倒出，剩下的底部含有填料的样品再用500ml的离心杯低速离心，去除上清，将离心下来的填料用裂解缓冲液悬起直接上到层析柱中，根据不同的纯化填料用对应的裂解缓冲液洗脱目的蛋白；
步骤(1)所述的电动搅拌机的搅拌速度为300-500转每分钟，搅拌时间为1-2小时；
步骤(2)所述的高压匀浆仪的压力为500-800bar，裂解1-2个循环。
2.根据权利要求1所述的一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)所述的菌体与裂解缓冲液的比为1g菌体加7-10ml裂解缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，其特征在于，所述的裂解缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)所述的离心机的转速为7000～10000rpm，离心时间为30min。
5.根据权利要求1所述的一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)所述的填料为Ni-NTA亲和树脂或GST亲和树脂，填料的添加量为5-10mg蛋白用1ml填料。
6.根据权利要求1所述的一种实验室大规模纯化重组蛋白的方法，其特征在于，步骤(5)所述的低速离心的转速为1000～3000rpm，时间为10min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |