CN103725706B - 一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体、构建方法、重组工程菌及其表达方法 - Google Patents
一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体、构建方法、重组工程菌及其表达方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体、构建方法、重组工程菌及其表达方法，该重组载体将人半乳糖凝集素1和猪肠三叶肽的基因插入表达质粒中构建而成。本发明通过在重组质粒上插入了人galectin-1基因，从而使肠三叶肽TFF3能够实现在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达，解决了目前大肠杆菌表达目标基因往往会形成不溶性、无活性的包涵体的技术问题，为实现工业化生产可溶性肠三叶肽TFF3提供了理论和实践基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体，同时还涉及该重组载体的构建方法，包含该重组载体的重组工程菌及其表达猪肠三叶肽的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成：（1）宿主：表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。（2）载体：载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。（3）辅助成分：有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。其中，原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。
原核蛋白表达系统以大肠杆菌（E.coli）表达系统为代表，其最早被采用进行研究的，是目前掌握最为成熟的表达系统，也是生产重组蛋白的最常用的系统。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、细胞繁殖快速、诱导表达相对简便、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。对于表达不同的蛋白，需要采用不同的表达载体。表达载体质粒上的元件包括：启动子、多克隆位点、终止密码、复制子、筛选标记或报告基因等。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。
近几年来，国内外大肠杆菌表达系统研究的重点已从构建各种表达载体，建立新的表达系统转移到完善现有的表达系统，解决表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括重组蛋白质的正确折叠，构象形成和分泌，菌体表面表达技术及其应用，重组蛋白质修饰加工研究等内容。
值得重视的是，在大肠杆菌中表达的目标基因往往会形成不溶性、无活性的包涵体，这使大肠杆菌表达系统的应用范围受到了很大限制，虽然到目前为止大肠杆菌细胞内可溶性表达问题还没有完全解决，但也取得了不少研究结果和进展。包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中，大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白因子的量不能满足需要，无法形成正确的构象而产生的。由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工体系相当不完善，因此不能对重组蛋白质进行修饰加工，这是大肠杆菌系统与其它表达系统相比存在的一个比较突出的缺陷。因此关于表达产物的构象、分泌、定位和修饰加工研究是大肠杆菌表达系统研究的重点方向。
肠三叶肽TFF3是三叶肽家族中最重要的小分子多肽，又称为肠三叶因子（ITF），主要分布于肠道。它由59个氨基酸残基构成，分子量约6.7KDa，属于三叶肽家族，由于具有特殊的“三叶草”空间结构，不仅能促进肠粘膜细胞的增殖，还能与肠粘液中的糖蛋白发生结合，起到稳定肠粘液和维护肠粘液屏障的作用，因而其在肠道损害修复以及再生方面具有非常重要的意义。肠三叶肽TFF3是一种具有重要的潜在药用价值的小蛋白分子，因此采用基因工程的方法获取TFF3，对肠三叶肽的研究并加以有效地利用就有非常重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体，采用该表达载体的大肠杆菌表达系统能够表达可溶性猪肠三叶肽。
本发明的目的还在于提供一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法。
本发明的目的还在于提供一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的重组工程菌。
本发明的目的还在于提供一种利用重组工程菌诱导表达可溶性猪肠三叶肽的方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体，将人半乳糖凝集素1和猪肠三叶肽的基因插入表达质粒中构建而成。
所述的表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGTGGTCT GGTCGCCAGCAACCTGAATCTCAAACCTGGAGAGTGCCTTCGAGTGCGAGGCGAGGTGGCT CCTGACGCTAAGAGCTTCGTGCTGAACCTGGGCAAAGACAGCAACAACCTGTGCCTGCACTT CAACCCTCGCTTCAACGCCCACGGCGACGCCAACACCATCGTGTGCAACAGCAAGGACGGC GGGGCCTGGGGGACCGAGCAGCGGGAGGCTGTCTTTCCCTTCCAGCCTGGAAGTGTTGCA GAGGTGTGCATCACCTTCGACCAGGCCAACCTGACCGTCAAGCTGCCAGATGGATACGAATT CAAGTTCCCCAACCGCCTCAACCTGGAGGCCATCAACTACATGGCAGCTGACGGTGACTTCA AGATCAAATGTGTGGCCTTTGACGAGAACCTGTACTTCCAGGGTCACCACCACCACCACCACGGATCCGAATTCGAGCTCGTCGAC CTCGAGGGCTTGGAC
加下划线部分为Galectin-1序列，随后为Tev蛋白酶酶切位点、6×His标签、多克隆位点，最后阴影部分为TFF3序列。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
1）提取猪肠道黏膜总RNA，反转录成cDNA，设计引物PrimerF、PrimerR，扩增猪肠三叶肽TFF3基因；
2）以人cDNA为模板，设计引物Primera、Primerb，扩增人半乳糖凝集素1基因片段；将扩增产物与质粒pMD-19T酶切，连接过夜，得到重组质粒pMD19T-Galectin-1；
3）将重组质粒pMD19T-Galectin-1转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落，然后提取阳性菌落中的重组质粒pMD19T-Galectin-1并酶切，回收酶切产物；
4）将酶切产物与质粒pET28a双酶切，并连接过夜，得到重组质粒pET28a-Galectin-1；随后转化大肠杆菌DH5α，挑取大肠杆菌DH5α菌落培养，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性菌落；
5）培养步骤4）的阳性菌落，提取质粒pET28a-Galectin-1；
6）以质粒pET28a-Galectin-1为模板，设计引物PrimerF1、PrimerR2，进行PCR扩增；
7）以步骤6）的PCR扩增产物为模板，设计引物PrimerF1、PrimerR3，进行PCR扩增；
8）以步骤7）的PCR扩增产物为模板，设计引物PrimerF1、PrimerR4，进行PCR扩增；
9）将步骤8）的扩增产物和质粒pET28a双酶切，连接，转化大肠杆菌DH5α；然后挑取大肠杆菌DH5α菌落培养，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性克隆；
10）提取步骤9）阳性菌落的质粒，然后与步骤1）的猪肠三叶肽TFF3基因双酶切，并连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，大肠杆菌DH5α阳性克隆中的质粒即为表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体。
所述引物PrimerF、PrimerR为：
PrimerF：5’-GTCCCAGCCAAGCTTGGGGAGTATGTGGGCCTGTCG-3’；
PrimerR：5’-GTCCAAGCCCTCGAGTCAGAAGGTGCATTCTGTTTC-3’。
所述引物Primera、Primerb为：
Primera：5’-CGCGGATCCGCTTGTGGTCTGGTCGCCAGCAACCTGAATCTC-3’
Primerb：5’-CGCCCCAAGCTTGGGTCAGTCAAAGGCCACACATTTGATCTTGAAGTC-3’。
所述引物PrimerF1、PrimerR2为：
PrimerF1：5’-GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGT-3’
PrimerR2：5’-ACCCTGGAAGTACAGGTTCTCGTCAAAGGCCACACATTT-3’。
所述引物PrimerF1、PrimerR3为：
PrimerF1：5’-GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGT-3’
PrimerR3：5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTGGAAGTACAGGTTCTCGTCAAAGGC-3’。
所述引物PrimerF1、PrimerR4为：
PrimerF1：5’-GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGT-3’
PrimerR4：5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGAGCTCGAATTCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTGGAAGTA-3’。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种包含表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的重组工程菌，所述重组载体的宿主为大肠杆菌BL21（DE3）pLysS。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种利用重组工程菌诱导表达可溶性猪肠三叶肽的方法，包括以下步骤：
1）将重组工程菌以1%的接种量接种到Kana+/LB培养基中，在220rpm、37℃条件下进行振荡培养至A600为0.6～1.0，加入IPTG，使终浓度为1.0mmol/L，在30℃条件下诱导表达8h；
2）诱导结束后，离心收集菌体沉淀，超声破碎，然后离心取上清液，将上清液过滤并纯化即得。
本发明通过设计与构建一个新的载体，即在pET-28a质粒序列上插入人类galectin-1，其次是Tev蛋白酶裂解位点、6×his-coding序列，和一个multi-cloning位点（插入克隆的目的基因），然后再插入猪肠三叶肽TFF3基因，构建重组质粒pET28a--TFF3。重组质粒构建成功后，转化入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白。收集表达的蛋白，经His60Ni重力柱纯化得到的融合蛋白的galectin-1-TFF3，通过独特的Tev蛋白酶裂解位点，使肠三叶肽TFF3裂解下来。
本发明的方法构建方法简单，通过在重组质粒上插入了人galectin-1基因，从而使肠三叶肽TFF3能够实现在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达，解决了目前大肠杆菌表达目标基因往往会形成不溶性、无活性的包涵体的技术问题，为实现工业化生产可溶性肠三叶肽TFF3提供了理论和实践基础。
附图说明
图1为重组表达质粒构建技术路线；
图2为重组表达质粒结构示意图；
图3为猪肠三叶肽TFF3基因扩增结果；
图4为猪肠三叶肽TFF3基因序列；
图5为人Galectin-1基因PCR扩增结果；
1为DL2000DNAMarker；2-6为PCR产物；
图6为重组质粒pMD19T-Galectin-1转化大肠杆菌DH5α阳性菌落PCR扩增电泳图谱；
1为DL2000DNAMarker；2-4为菌落PCR产物；
图7为人Galectin-1基因序列；
图8为质粒pET28a-Galectin-1酶切人Galectin-1结果；
1为DL2000DNAMarker；2-6为酶切结果；
图9为Galectin-1片段、pET28a片段连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养的菌液PCR电泳结果；
图10为Galectin-1+Tev+6His+MCS片段的电泳结果；
图11为质粒pET28a-Galectin-1+Tev+6His+MCS的酶切电泳结果；
1为DL5000DNAMarker；2为质粒pET-28a；3为EcoRI酶切结果；4为HindIII＋NdeI酶切结果；
图12为重组表达质粒pET28a-TFF3电泳结果；
图13为重组表达质粒pET28a-TFF3转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞，培养的菌液PCR电泳结果；
图14为重组表达质粒pET28a-TFF3转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞，培养的菌液中阳性菌的酶切结果；
左1为DL5000DNAMarker；左2往右依次为个菌落的酶切结果，每个菌落有3个上样孔，上样顺序从左往右依次为：原质粒、BamHI酶切、SmaI酶切；
图15为重组表达质粒pET28a-TFF3转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞，培养的菌液中阳性菌的12%SDS-PAGE鉴定表达结果；
1、蛋白Marker；2、空载体未诱导；3、空载体诱导；4、重组质粒未诱导；5、重组质粒诱导；
图16为图15中目的蛋白的Westernblot鉴定表达结果；
图17为IPTG最佳诱导浓度的筛选；
图18为最佳诱导表达时间的筛选；
图19为可溶性签定图；
图20为重组表达质粒pET28a-TFF3转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞的超声破碎结果；
a为碎菌前；b为碎菌后；
图21为重组表达蛋白的纯化结果；
1为纯化前的重组蛋白；2为纯化后的重组蛋白；
图22为重组表达蛋白Tev酶切结果；
1为酶切前；2为酶切后。
具体实施方式
本发明所用试剂为本领域的常规试剂，培养基的配制方法如下：
1、LB液体培养基：
Tryptone（胰蛋白胨）10g
YeastExtract（酵母提取物）5g
NaCl5g
按以上配方分别称量后，先加入适量去离子水，搅拌使其充分溶解，然后用2mol/LNaOH（约0.4mL）调pH值至7.0，随后加入去离子水定容至1000mL，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌30min。
2、Amp+/LB固体培养基：
按照上面配方先配制1LLB液体培养基，然后加入15g琼脂粉(Agarpowder)，1.031×105Pa高压蒸汽灭菌30min。待培养基冷却至50～60℃时，加入Ampicilin贮存液，至终浓度为100μg/mL，充分混匀，避免产生气泡，铺制平板，30～35mL/90mm培养皿。
3、Kana+/LB固体培养基：
按照上面配方先配制1LLB液体培养基，然后加入15g琼脂粉(Agarpowder)，1.031×105Pa高压蒸汽灭菌30min。待培养基冷却至50～60℃时，加入Kanamycin贮存液，至终浓度为50μg/mL，充分混匀，避免产生气泡，铺制平板，30～35mL/90mm培养皿。
实施例1猪肠三叶肽TFF3基因的克隆
1、猪肠三叶肽TFF3基因克隆引物设计与合成
登陆NCBI，在猪EST数据库中搜索出猪的肠三叶肽TFF3基因序列，用DNAStar设计包括完整ORF的克隆引物（见表1-1），在目的片段的上、下游分别添加了HindIII、XhoI限制性内切酶位点。设计的引物由上海生工生物工程有限公司合成。
表1-1TFF3克隆所用引物
2、猪肠道黏膜总RNA的提取、检测
本发明采用TRIZOL法提取肠道总RNA，方法如下：
（1）从液氮中取出保存的肠道黏膜组织，迅速置于锡箔纸上，取约100mg，放入2.0mL离心管中，加入1mLTrizol，冰浴中用组织匀浆机充分破碎40s，室温静置5min；
（2）加入0.2mL氯仿，扣紧盖子，剧烈震荡3min，室温放置2min；
（3）4℃12000rpm离心15min，可观察到样品分为三层，小心吸取上层水相（约500μL）转移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下缓慢颠倒混匀后，-80℃静置20min，使RNA沉淀下来；
（4）4℃12000rpm离心10min，弃去上清，沉淀用1mL75％乙醇，弹起沉淀；
（5）4℃8000rpm离心5min，弃去上清，倒扣于吸水纸上，自然晾干；
（6）根据沉淀的量加入DEPC水20-100μL溶解，-80℃保存备用；
（7）将提取的肠道黏膜组织的总RNA，用紫外分光光度计检测吸光度值，在1.9～2.1范围内最佳，初步确定提取的总RNA浓度，经甲醛变性胶电泳检测其完整性。
3、提取的总RNA反转录成cDNA
（1）总RNA的纯化，除去总RNA中的DNA：总RNA1μg、10×DNaseBuffer1μL、DNase（1U/μL）1μL、DEPC水补足至10μL，混匀并瞬时离心，37℃30min，之后加入StopSolution1μL，混匀后，65℃10min。按照总RNA1μg、10×DNaseBuffer1μL、DNase（1U/μL） 1μL、DEPC水补足至10μL，37℃30min，来除去DNA。此体系中加入的有DNase以除去DNA。
（2）反转录：将上述体系中加入1μL通用引物（Randomprimer），混匀并瞬离，70℃5min后立即冰浴5min，加入以下反转录体系：
将以上配制好的产物放入PCR仪中，按以下反应程序进行：25℃10min，37℃1h，72℃15min，4℃冷却。反应结束后，加适量的DEPC水稀释cDNA，所得的cDNA置于-20℃保存备用。
4、猪肠三叶肽TFF3基因的克隆
PCR扩增体系：
按照上述体系配置好PCR扩增体系，总体积25μL。将以上混合物放入预热过的PCR仪中，按以下反应程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用3.0%的琼脂糖凝胶电泳检测（图3），然后用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化回收，并置于-20℃保存备用。图3结果显示，PCR扩增片段的长度约为210bp，与预期片段大小相符。猪肠三叶肽TFF3基因序列如图4。
实施例2质粒pET28a的改造
1、人Galectin-1基因及所需三对克隆引物设计与合成
登陆NCBI，在人EST数据库中搜索出人的Galectin-1基因序列，用DNAStar设计包括完整ORF的克隆引物Primera、Primerb（见表1-2），在目的片段的上、下游分别添加了HindIII、BamHI限制性内切酶位点。同时设计了所需的另三对引物，其具有共同的上游引物PrimerF1（见表1-2），得到的产物上、下游分别添加了NcoI、HindIII限制性内切酶位点。设计的引物由上海生工生物工程有限公司合成。
表1-2克隆所用引物
2、人Galectin-1基因的克隆与纯化
利用引物Primera、Primerb，以人cDNA为模板克隆出Galectin-1片段。
PCR扩增体系：
按照上述体系配置好PCR扩增体系，总体积25μL。将以上混合物放入己预热好的PCR仪中，按以下反应程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测（图5），同样用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化回收。图5结果显示，PCR扩增片段长度为429bp，与预期片段大小符合。
3、Galectin-1基因的连接与转化
1）Galectin-1基因与pMD-19T载体连接，构建重组质粒pMD19T-Galectin-1。主要按照TaKaRa宝生物工程有限公司pMD-19T载体说明进行：
按照上面用量配制连接体系，16℃反应过夜。
2）转化（蓝白斑筛选）
a、将连接产物10μL加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞（CaCl2法制备）中，轻轻的吹打混匀；封口，冰浴20min。
b、冰浴结束，42℃水浴热击90s，迅速置于冰浴3min。
c、加入890μLLB液体培养基，摇匀，置于37℃摇床培养60min。
d、在加有Amp的LB平板上先铺40μLX-gal，4μLIPTG，随后铺60μL菌液，37℃培养12-16h。
e、挑取板上的白色菌落，置于37℃，在加有Amp的LB液体培养基中培养约6h，进行菌液PCR，对挑的菌落进行筛选。
PCR体系：
按照上述体系配置好PCR扩增体系，总体积25μL。将以上混合物放入预热过的PCR仪中，按以下反应程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测（图6），挑选阳性结果，保存菌种，并扩大培养。图6结果显示，人Galectin-1基因与pMD-19T连接、转化DH5α感受态细胞，筛选的阳性菌落PCR鉴定得到与人Galectin-1基因PCR扩增同样大小的目的片段。将筛选的阳性菌落的质粒测序，鉴定该目的基因为人Galectin-1基因，如图7所示。
3、质粒pET28a-Galectin-1的构建
1）按照AXYGENAxyPrepPlasmidMiniprepKit说明书提取质粒pMD19T-Galectin-1。
2）将质粒pMD19T-Galectin-1进行HindIII、BamHI限制性内切酶双酶切，得到Galectin-1片段，酶切体系如下：
配置好上述酶切体系，混匀，37℃酶切2h以上。
经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测（图8），同样用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化回收。用紫外分光光度计检测其吸光度值和酶切片段的浓度。图8结果显示，酶切得到的片段长度为414bp，与预期片段大小相符。
3）将质粒pET28a进行HindIII、BamHI限制性内切酶双酶切，然后经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，同样用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化回收。用紫外分光光度计检测其吸光度值和酶切片段的浓度。
4）将酶切回收的Galectin-1片段、pET28a片段在TDNA连接酶条件下16℃连接过夜。随后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将连接产物10μL加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻的吹打混匀。封口，冰浴20min。冰浴结束，42℃水浴热击90s，迅速置于冰浴3min。加入890μLLB液体培养基，摇匀，置于37℃摇床培养60min。随后4000rmp离心3min，弃去800μL上清，然后吹打混匀，取60μL铺Kana平板，37℃过夜培养12-16h。
培养结束，挑取适量数量的菌落，在添加Kana的LB液体培养基中培养，进行菌液PCR。
PCR体系：
按照上述体系配置好PCR扩增体系，总体积25μL。将以上混合物放入己预热好的PCR仪中，按以下反应程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测（图9），挑选阳性结果，保存菌种。
4、Galectin-1+Tev片段的制备
按照AXYGENAxyPrepPlasmidMiniprepKit说明书提取质粒pET28a-Galectin-1。使用引物PrimerF1、PrimerR2，以质粒pET28a-Galectin-1为模板进行PCR扩增。
PCR体系：
退火温度64℃，退时间40s。为PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化回收。用紫外分光光度计检测其吸光度值和浓度。
5、Galectin-1+Tev+6His片段的制备
使用引物PrimerF1、PrimerR3，以步骤4的PCR产物为模板进行PCR扩增。
PCR体系：
退火温度69℃，退时间35s。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化回收。用紫外分光光度计检测其吸光度值和浓度。
6、Galectin-1+Tev+6His+MCS片段的制备
使用引物PrimerF1、PrimerR4，以步骤5的PCR产物为模板进行PCR扩增。
PCR体系：
退火温度75℃，退时间40s。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳（图10），用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化回收。用紫外分光光度计检测其吸光度值和浓度。图10结果显示，PCR扩增产物片段大小为531bp，与片段理论大小相同。
7、质粒pET28a-Galectin-1+Tev+6His+MCS的构建
1）将步骤6的PCR扩增产物进行NcoI、HindIII限制性内切酶双酶切，
酶切体系：
配置好上述酶切体系，混匀，37℃酶切2h以上。酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，按照上面已有的步骤进行切胶纯化、回收。用紫外分光光度计检测其吸光度值和浓度。
2）质粒pET28a用NcoI、HindIII限制性内切酶酶切。
酶切体系：
配置好上述酶切体系，混匀，37℃酶切2h以上。酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，按照上面已有的步骤进行切胶纯化、回收。用紫外分光光度计检测其吸光度值和浓度。
3）前两步的酶切产物进行连接、转化，筛选阳性菌。
连接体系：
16℃连接过夜。随后将连接产物10μL加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻的吹打混匀。封口，冰浴20min。冰浴结束，42℃水浴热击90s，迅速置于冰浴3min。加入890μLLB液体培养基，摇匀，置于37℃摇床培养60min。随后4000rmp离心3min，弃去800μL上清，然后吹打混匀，取60μL铺Kana平板，37℃过夜培养16h。
培养结束，挑取适量数量的菌落，分别在添加Kana的LB液体培养基中培养，进行菌液PCR。
PCR体系：
退火温度75℃,退火时间40s。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，筛选出阳性菌落。
4）提取阳性菌落质粒，酶切鉴定后，测序。至此质粒pET28a的改造完成。
按照AXYGENAxyPrepPlasmidMiniprepKit说明书提取阳性菌落质粒，用紫外分光光度计检测其吸光度值和浓度。通过对整个序列酶切位点的分析，选用EcoRI、HindIII+NdeI两组来进行鉴定。
EcoRI酶切体系：EcoRI0.5μL
10×HBuffer1μL
质粒(22ng/μL)8.5μL
HindIII+NdeI酶切体系：
酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，初步筛选出正确菌落（图11）。图11结果表明：经EcoRI酶切，理论上得到两个片段，分别为136bp、5619bp；经HindIII+NdeI酶切，理论上得到两个片段，分别为505bp、5250bp。电泳结果与理论相符。将其质粒送由上海生工生物工程有限公司进行测序，根据测序结果，再进下一步试验。至此质粒pET28a的改造完成。
实施例3重组表达质粒pET28a-TFF3的构建
1、将实施例1的肠三叶肽TFF3基因和实施例2改造的质粒pET28a均用HindIII、XhoI酶切。
pET28a改造质粒酶切体系：
配置好上述酶切体系，混匀，37℃酶切2h以上。酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化回收。用紫外分光光度计检测其吸光度值和浓度。
TFF3酶切体系：
配置好上述酶切体系，混匀，37℃酶切2h以上。酶切产物经3.0%的琼脂糖凝胶电泳，用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化回收。用紫外分光光度计检测其吸光度值和浓度。
2、将步骤1中的肠三叶肽TFF3基因和改造的质粒pET28a的酶切产物进行连接、转化，筛选阳性菌。
连接体系:
16℃连接过夜。随后将连接产物10μL加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻的吹打混匀。封口，冰浴20min。冰浴结束，42℃水浴热击90s，迅速置于冰浴3min。加入890μLLB液体培养基，摇匀，置于37℃摇床培养60min。随后4000rmp离心3min，弃去800μL上清，然后吹打混匀，取60μL铺Kana平板，37℃过夜培养16h。
培养结束，挑取适量数量的菌落，分别在添加Kana的LB液体培养基中培养，进行菌液PCR。
PCR体系：
退火温度58℃，退火时间45s。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳（图12），理论得到的片段大小约为720bp，筛选出阳性菌落。
3、提取阳性菌落质粒，测序
按照TAXYGENAxyPrepPlasmidMiniprepKit说明书提取阳性菌落质粒，用紫外分光光度计检测其吸光度值和浓度。将其质粒送由上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果符合预期即为表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体pET28a-TFF3的构建成功。
实施例4可溶性猪肠三叶肽的诱导表达
1、将重组质粒pET28a-TFF3转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞，具体步骤为：取重组表达质粒pET28a-TFF3(30ng/μL)10μL加入100μL大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，轻轻的吹打混匀。封口，冰浴20min。冰浴结束，42℃水浴热击90s，迅速置于冰浴3min。加入890μLLB液体培养基，摇匀，置于37℃摇床培养60min。随后4000rmp离心3min，弃去800μL上清，然后吹打混匀，取60μL铺Kana平板，37℃过夜培养16h。同时将pET-28a空载体转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞，作为对照组。
培养结束，挑取适量数量的菌落，分别在添加Kana的LB液体培养基中培养，进行菌液PCR。
PCR体系：
退火温度58℃，退火时间45s。PCR体系产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳（图13），筛选出阳性菌落。图13结果表明，PCR产物片段大小为720bp，与预期的片段大小一致。
为进一步鉴定，提取阳性菌的质粒，进行酶切鉴定，结果如图14。对质粒序列的酶切位点的分析，选取了两组酶，分别为BamHI和SmaI，BamHI将质粒切来成一条片段，理论上大小为5926bp；SmaI将质粒切成两个片段，理论上大小分别为1285bp、4644bp。图14结果表明，酶切片段大小与理论大小一致，证明重组表达质粒pET28a-TFF3转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞成功。
酶切体系1：BamHI0.5μL
10×KBuffer1μL
质粒(41ng/μL)8.5μL
酶切体系2：
挑选的每个菌的质粒分别配制出以上两组酶切体系，30℃反应2h，经产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，再次筛选出阳性菌落。
2、将鉴定正确的阳性菌落，于37℃培养至对数生长期即A600值为0.6～1.0时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，30℃诱导5h。同时设立三个对照分别为重组质粒未诱导、空载体诱导、空载体未诱导，其他处理条件一致。四组各取1mL菌液，4000×g离心15min，弃上清收集菌体，用30μLPBS重悬菌体，加入等体积2×SDS蛋白电泳上样缓冲液，99℃煮沸5min，-20℃保存备用。
3、12%SDS-PAGE鉴定表达结果
对上面鉴定正确的菌进行诱导，1.0mmol/L的IPTG，37℃诱导5h，同时设立三个对照分别为重组质粒未诱导、空载体诱导、空载体未诱导，其他处理条件一致。取样后，经处理上样，12%SDS-PAGE电泳，结束后胶经考马斯亮蓝染色，结果见图15，重组质粒诱导组在25KDa处有条带，而对照三组没有，切条带的大小与预期值相同。由此证明重组表达载体pET28a-TFF3能够表达。
4、Westernblot鉴定表达产物
电泳结束后，进行转膜。将蛋白质转移至NC膜上，使用鼠抗6×His标签的单克隆抗体作为一抗和HRP标记的羊抗鼠IgG检测融合蛋白免疫血清的免疫学活性。同时设立重组菌菌体未诱导产物作为对照组，结果如图16。图16结果表明，被检测的泳道在25.3kDa处出现1条特异的条带，其大小与预期的一致，而IPTG未诱导组在同一位置未出现任何蛋白带，表明pET28a-TFF3经IPTG诱导后表达的重组蛋白可与抗6×His单抗结合，重组子表达的蛋白为所需要的目的蛋白。
5、IPTG最佳诱导条件的优化
1）IPTG最佳诱导浓度的确定
在研究最佳IPTG浓度时，先将诱导表达时间定为6h。先将阳性菌37℃培养至OD值0.4～0.6，分装七管，然后向上述菌液中分别加入计算好量的IPTG，使终浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L。30℃诱导6h后取样，样品处理方法同上。然后通过12%SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色，对重组蛋白的表达量进行检测，以确定这种蛋白的最佳IPTG诱导浓度（图17）。图17结果表明，在25KDa处，均有目的蛋白条带，随着IPTG浓度的增大，蛋白表达量升高，1.0mmol/L时表达量最高，但浓度过高，表达量又会降低。
2）最佳诱导表达时间的确定
在研究最佳诱导表达时间时，将IPTG终浓度定为1.0mmol/L，先将阳性菌37℃培养至OD值0.4～0.6，根据菌液量加入IPTG，诱导温度为30℃，加入IPTG后分别诱导0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、16h，分别在各个时间点取样，样品处理方法同上；然后通过12%SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色，对重组蛋白的表达量进行检测，以确定最佳诱导时间（图18）。图18结果表明，在25KDa处，均有目的蛋白条带，随着IPTG诱导时间的增加，蛋白表达量升高，8h时表达量最高，但诱导时间过长，表达量又会降低。
6、重组表达蛋白的纯化、透析与浓缩
1）大量诱导表达
将转化入大肠杆菌BL21（DE3）的重组质粒pET28a-TFF3以1%的接种量接入新配制的200mL灭菌Kana+/LB培养基中，以220rpm的转速，37℃进行振荡培养至A600为0.6～1.0时，以前面所述的最佳诱导条件在30℃进行诱导。诱导结束后，在4℃，3000g条件下离心菌液30min，弃去上清，收集菌体沉淀。菌体可置于-20℃保存，也可直接进行下步操作。
2）蛋白的纯化
大量诱导表达后收集的菌体沉淀，每100mg菌体湿重加入2mLHis60NixTractorBuffer，1μLDNaseI(4unit/μL)，溶菌酶（终浓度1mg/mL）和50×蛋白酶抑制剂（终浓度1×)，适度轻轻的反复吹打混匀，然后超声裂解菌体2S/7S/100次，功率在200-400W之间。碎菌前后可以进行抹片、吕氏美兰染色、镜检，查看菌体破碎情况。
超声碎菌结束后（图19），4℃，12000rpm离心30分钟，取上清，用孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，滤液可直接上柱纯化，也可置于-20℃保存。至此上柱纯化样品准备结束，开始过柱进行纯化。
可溶性的鉴定
在超声碎菌12000rpm离心30分钟后，将上清转移到新的管内，沉淀中加入与重悬菌体等体积的His60NixTractorBuffer，吹打混匀，以使稀释倍数相同。取相同体积的上清、沉淀重悬液，分别加入2×SDS蛋白电泳上样缓冲液，吹打混匀，99℃煮沸5min。然后通过12%SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色、脱色。观察目的条带主要存在于上清中还是沉淀中。存在于上清中则主要以可溶性形式存在，主要存在于沉淀中，则产物主要以包涵体形式。
超声碎菌结束后（图19），4℃，12000rpm离心30分钟，取上清，用孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，滤液可直接上柱纯化，也可置于-20℃保存。至此上柱纯化样品准备结束，开始过柱进行纯化。
按Clontech的His60NiSuperflowTMResin&GravityColumns说明书进行表达蛋白的纯化（图20）。在整个操作过程中，要尽量防止蛋白变性。
3）蛋白的透析与纯化
根据样品量，先将透析袋剪成适当长度的小段，置于盛有的2%(W/V)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA（pH8.0）烧杯中煮沸10分钟，冷却后用蒸馏水彻底地清洗透析袋，然后再置于1mmol/LEDTA（pH8.0）中煮沸10分钟。冷却后，将其都存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须带手套的。用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
用夹子封住透析袋一端，将样品装入透析袋，再封住另一端，放入装有灭菌水的干净大烧杯中，4℃透析过夜，期间可换水几次。蛋白透析结束，将透析袋置于干净的托盘内，在透析袋表面均匀撒上聚乙二醇8000，置于4℃，进行浓缩，期间不断补加聚乙二醇8000，直至浓缩到需要的体积。检测浓缩后的蛋白浓度。
7、AcTEV酶酶切重组表达蛋白
按照Tev酶使用说明，将浓缩后的蛋白样品配置合适的酶切体系，对重组表达蛋白进行酶切。
酶切体系：
配制酶切体时在冰上操作，配置完成后混匀、顺利后，置于16℃,酶切3～4h。
同时设置对照组，同样的处理，但不进行酶切。
8、Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定酶切产物
酶切反应结束后，采用TCA、丙酮沉淀法沉淀蛋白，如下：
（1）在上面酶切体系中，加入1/9体积的TCA，震荡混匀，混合物在-20℃放置90min。
（2）4℃、12000×g离心20min，弃去上清，加入预冷的丙酮清洗沉淀，充分混匀后，在冰上放置15min,之后4℃、12000×g离心20min，弃去上清。
（3）可重复第二步3次，以将TCA除净。
（4）扣干沉淀，再加入适量的2×SDS蛋白电泳上样缓冲液，吹打混匀，99℃煮沸5min。对照组不进行酶切，但进行同样的处理。
上样，Tricine-SDS-PAGE电泳，结束后，考马斯亮蓝染色（图21）。图21结果表明，经Tev酶切后的片段为16.94kDa和8.36kDa两个，与理论相符。
本发明项目来源于农业部948项目2012-Z29。
Claims (4)
1.一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体，其特征在于：将人半乳糖凝集素1和猪肠三叶肽的基因插入表达质粒中构建而成；包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）提取猪肠道黏膜总RNA，反转录成cDNA，设计引物PrimerF、PrimerR，扩增猪肠三叶肽TFF3基因；
2）以人cDNA为模板，设计引物Primera、Primerb，扩增人半乳糖凝集素1基因片段；将扩增产物与质粒pMD-19T酶切，连接过夜，得到重组质粒pMD19T-Galectin-1；
3）将重组质粒pMD19T-Galectin-1转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落，然后提取阳性菌落中的重组质粒pMD19T-Galectin-1并酶切，回收酶切产物；
4）将酶切产物与质粒pET28a双酶切，并连接过夜，得到重组质粒pET28a-Galectin-1；随后转化大肠杆菌DH5α，挑取大肠杆菌DH5α菌落培养，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性菌落；
5）培养步骤4）的阳性菌落，提取质粒pET28a-Galectin-1；
6）以质粒pET28a-Galectin-1为模板，设计引物PrimerF1、PrimerR2，进行PCR扩增；
7）以步骤6）的PCR扩增产物为模板，设计引物PrimerF1、PrimerR3，进行PCR扩增；
8）以步骤7）的PCR扩增产物为模板，设计引物PrimerF1、PrimerR4，进行PCR扩增；
9）将步骤8）的扩增产物和质粒pET28a双酶切，连接，转化大肠杆菌DH5α；然后挑取大肠杆菌DH5α菌落培养，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性克隆；
10）提取步骤9）阳性菌落的质粒，然后与步骤1）的猪肠三叶肽TFF3基因双酶切，并连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，大肠杆菌DH5α阳性克隆中的质粒即为表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体；
所述引物PrimerF、PrimerR为：
PrimerF：5’-GTCCCAGCCAAGCTTGGGGAGTATGTGGGCCTGTCG-3’，
PrimerR：5’-GTCCAAGCCCTCGAGTCAGAAGGTGCATTCTGTTTC-3’；
所述引物Primera、Primerb为：
Primera：5’-CGCGGATCCGCTTGTGGTCTGGTCGCCAGCAACCTGAATCTC-3’，
Primerb：5’-CGCCCCAAGCTTGGGTCAGTCAAAGGCCACACATTTGATCTTGAAGTC-3’；
所述引物PrimerF1、PrimerR2为：
PrimerF1：5’-GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGT-3’，
PrimerR2：5’-ACCCTGGAAGTACAGGTTCTCGTCAAAGGCCACACATTT-3’；
所述引物PrimerR3、PrimerR4为：
PrimerR3：5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTGGAAGTACAGGTTCTCGTCAAAGGC-3’，
PrimerR4：5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGAGCTCGAATTCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTGGAAGTA-3’。
3.一种包含权利要求1表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的重组工程菌，其特征在于：所述重组载体的宿主为大肠杆菌BL21（DE3）pLysS。
4.一种利用权利要求3重组工程菌诱导表达可溶性猪肠三叶肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将重组工程菌以1%的接种量接种到Kana+/LB培养基中，在220rpm、37℃条件下进行振荡培养至A600为0.6～1.0，加入IPTG，使终浓度为1.0mmol/L，在30℃条件下诱导表达8h；
2）诱导结束后，离心收集菌体沉淀，超声破碎，然后离心取上清液，将上清液过滤并纯化即得。
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