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CN102154359A - 大肠杆菌高效分泌表达新系统及其应用 - Google Patents

大肠杆菌高效分泌表达新系统及其应用 Download PDF

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CN102154359A
CN102154359A CN 201010617881 CN201010617881A CN102154359A CN 102154359 A CN102154359 A CN 102154359A CN 201010617881 CN201010617881 CN 201010617881 CN 201010617881 A CN201010617881 A CN 201010617881A CN 102154359 A CN102154359 A CN 102154359A
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CN
China
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expression
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exogenous
expression cassette
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Pending
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CN 201010617881
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English (en)
Inventor
谭树华
吴梧桐
黄翠翠
吕静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Pharmaceutical University
Original Assignee
China Pharmaceutical University
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种新型大肠杆菌高效分泌表达载体及其制备方法与应用。该表达载体是一种环状质粒DNA载体，包含原核复制起始原点、筛选标记基因和两个串联的外源基因表达盒单元。所述的两个串联的外源目的(靶)基因表达盒单元均分别含有依次排布的tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因、强转录终止子rrnBT1T2。本发明公开的新型高效分泌表达载体可以在大肠杆菌宿主细胞中高水平分泌表达多肽/蛋白目的产物，表达产物可以自动形成正确的分子内二硫键，并分泌到细胞外周质/及培养液中，十分有利于表达产物的下游分离提取与纯化，具有重要的应用价值。

Description

大肠杆菌高效分泌表达新系统及其应用
技术领域
本发明涉及一种应用于基因工程领域的以大肠杆菌为宿主的包含两个串联的基因表达盒单元的高效分泌表达载体及其制备方法与应用。
背景技术
多肽蛋白的表达在基因工程技术中并没有通用的法则，为了获得有效的表达，不同的目的产物因其结构性质不同所采取的表达系统与表达方式也不同。大肠杆菌是应用最早的原核表达系统，其表达方式主要有三种形式：非融合表达、融合表达以及分泌表达。非融合表达方式在复性过程中肽链的错误折叠、二硫键的错配往往会造成活性产物得率大大降低。此外由于其N端不可避免地多出一个甲硫氨酸，这将严重影响某些多肽分子的生物活性。融合蛋白虽然容易得到高水平表达，然而融合蛋白的纯化与切割却存在一定问题，化学方法切割难以恢复其天然构象；而酶法切割的切割效率不高，产品的最终收率低。分泌表达方式则是将目的基因嵌合在信号肽基因下游，目的产物在信号肽介导下分泌至细胞外周质或培养基中，同时信号肽被信号肽酶识别并切除，从而可以直接获得成熟的活性多肽产物。
已有的分泌表达载体，如PIN-III-ompA，所采用的是大肠杆菌外膜蛋白(ompA)信号肽序列，其后是用来插入外源基因的多克隆位点，当外源基因插入后，信号肽基因与目的基因间往往存在一段多余的连接序列，这样，为了得到N-端正确的目的产物，必须采用定点诱变技术，以去除信号肽基因与目的基因间的多余序列，操作十分繁锁。
为了解决这一问题，谭树华等(中国发明专利01113526.3)已创建了一种新型分泌表达载体pTASH，其特征在于：含有tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因以及pUC18高拷贝复制原点，其中的L-门冬酰胺酶信号肽简并基因3’端可与目的蛋白(如水蛭素)编码基因5’端拼连组建成重组质粒，该质粒载体可分泌表达基因重组水蛭素及其突变体。
分泌表达载体pTASH的优点之一是任何外源基因通过PCR技术在其5’端引入NheI位点后都可直接与信号肽拼连，而且在信号肽基因与目的基因间不存在多余的连接片段；优点之二是可实现目的蛋白的高效分泌表达，表达产物无需通过变性复性等处理便具有生物活性。
为了增强分泌表达水平，本发明在已有的分泌表达载体pTASH(谭树华等，中国发明专利01113526.3)基础之上构建了一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体，该表达载体是一种环状质粒DNA载体，包含原核复制起始原点、筛选标记基因和两个串联的外源基因表达盒单元。所述的两个串联的外源目的(靶)基因表达盒单元均分别含有依次排布的tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因(如水蛭素基因)、强转录终止子rrnBT1T2。本发明公开的新型高效分泌表达载体可以在大肠杆菌宿主细胞中高水平分泌表达多肽/蛋白目的产物，表达产物可以自动形成正确的分子内二硫键，并分泌到细胞外周质/及培养液中，十分有利于表达产物的下游分离提取与纯化，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是在已有的分泌表达载体pTASH(谭树华等，中国发明专利01113526.3)基础之上构建一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体。
该表达载体是一种环状质粒DNA载体，包含原核复制起始原点、筛选标记基因和两个串联的外源基因表达盒单元。所述的两个串联的外源目的(靶)基因表达盒单元均分别含有依次排布的tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因(如水蛭素基因)、强转录终止子rrnBT1T2。所包含的两个串联的外源基因表达盒单元转录方向可以相同也可以相反。
本发明的具体实施方案如下：以分泌表达载体pTASH(谭树华等，中国发明专利01113526.3)为模板，采用高保真DNA聚合酶(如Pfu酶)，利用PCR技术将该重组质粒上的表达盒单元(包括tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因、强转录终止子rrnBT1T2)扩增出来，插入原分泌表达载体pTASH中表达盒单元上游的BamH I位点，从而形成包含两个串联的外源基因表达盒单元的更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体，其中包含的两个串联的外源基因表达盒单元转录方向可以相同也可以相反。此质粒不仅具备了原有质粒的所有优点，而且包含两个串联的外源基因表达盒单元，目的基因(靶基因)的转录强度较原有质粒pTASH大大增强，从而提高了目的蛋白的表达产量。
权利要求1所述的新型高效分泌表达载体是一种环状质粒DNA载体，包含原核复制起始原点、筛选标记基因和两个串联的外源基因表达盒单元。所述的两个串联的外源目的(靶)基因表达盒单元均分别含有依次排布的tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因(如水蛭素基因)、强转录终止子rrnBT1T2。所包含的两个串联的外源基因表达盒单元转录方向可以相同也可以相反。
为了扩增分泌表达载体pTASH(谭树华等，中国发明专利01113526.3)的表达盒单元(包括tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因、强转录终止子rrnBT1T2)，设计并合成下列两条寡核苷酸PCR引物：
正向引物pkk223-3TAC-f：5’GGA TCC AAG CTG TGG TAT GGC TGT GCA GGT CGTAAATC 3’(下划线指示BamH I酶切位点)
反向引物pkk223-3rrnBT2-r：5’GGA TCC AGC GTT TCT GGG TGA GCAAAAACA GGAAG 3’(下划线指示BamH I酶切位点)
以原分泌表达载体pTASH(谭树华等，中国发明专利01113526.3)为模板，以上述两条寡核苷酸链为引物，在Pfu DNA聚合酶的作用下合成利用PCR技术扩增出表达盒单元(包括tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因、强转录终止子rrnBT1T2)，扩增出的产物两端各含有一个BamH I酶切位点(GGATCC)。扩增出的产物采用TA克隆技术克隆到pMD-19T SimpleVector载体(宝生物大连有限公司产品，Code No：D104A)中，并进行测序验证。
将原分泌表达载体pTASH质粒用BamH I充分酶切，并用碱性磷酸酶将两末端去磷酸化，同时将已克隆到pMD-19T SimpleVector载体中的表达盒单元(包括tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因、强转录终止子rrnBT1T2)用BamH I切出，并采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段。然后，在T4DNA连接酶作用下将BamH I切下的表达盒片段与BamH I线性化并脱磷的pTASH质粒载体片段进行连接，并采用BamH I酶切筛选技术筛选出阳性克隆。由此便得到了包含原核复制起始原点、筛选标记基因和两个串联的外源基因表达盒单元的新型高效分泌表达载体。所述的两个串联的外源目的(靶)基因表达盒单元均分别含有依次排布的tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因(如水蛭素基因)、强转录终止子rrnBT1T2。所包含的两个串联的外源基因表达盒单元转录方向可以相同也可以相反。
本发明的另一个目的是公开一种用于重组水蛭素或其突变体生产的重组质粒的应用方法，其特征是：应用权利要求1所述的重组质粒分泌表达重组水蛭素或其突变体。
附图说明：
图1pTASH质粒图谱
图2pMD-19TpTASH质粒图谱
图3p(TASH)2质粒图谱(A为正向插入，B为反向插入)
图4重组水蛭素III双表达盒克隆p(TASH)2分泌表达重组水蛭素III的活性数据
图5重组水蛭素III双表达盒克隆p(TASH)2与单表达盒克隆pTASH分泌表达水平比较
具体实施方式
下面的优选例对本发明做详细叙述，但并不意味着限制本发明的范围。实施例中常规分子克隆操作参照文献(《分子克隆实验指南》第二版，金冬雁等译，1995年，科学出版社)。
实施例1表达载体pTASH中表达盒基因的扩增
从原始的含pTASH质粒的大肠杆菌菌种(谭树华等，中国发明专利01113526.3)中提取模板质粒pTASH，并设计合成以下引物：
正向引物pkk223-3TAC-f：5’GGA TCC AAG CTG TGG TAT GGC TGT GCA GGT CGTAAATC 3’(下划线指示BamH I酶切位点)
反向引物pkk223-3rrnBT2-r：5’GGA TCC AGC GTT TCT GGG TGA GCA AAA ACA GGAAG 3’(下划线指示BamH I酶切位点)
以质粒pTASH为模板，在Pfu DNA聚合酶的作用下进行聚合酶链式反应。50μl反应体系组成如下：正向引物及反向引物各20pmol；Pfu DNA聚合酶5个单位；10×反应缓冲液5μl；dNTP(10mM each)1μl；MgCl2(25mM)3μl；质粒DNA 1μl；用无菌水补足到50μl。聚合酶链式反应如下：95℃变性5分钟；进入循环反应：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，反应30个循环；72℃延伸10分钟。
聚合酶链式反应的产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，并以DL2,000TMDNA Marker作为对照，检测基因片段大小正确后，回收目的片段。目的片段与T载体在T4DNA连接酶的作用下连接，连接物转化大肠杆菌宿主菌。从阳性克隆中提取质粒，测序确认序列正确，此质粒命名为pMD-19T-TASH。
实施例2双表达盒重组水蛭素高效分泌表达质粒的构建
用碱裂解法提取质粒pMD-19T-TASH，BamH I酶切，以DL2,000TMDNA Marker作为对照，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，并回收酶切片段，得到大小约1.1kb的表达盒片段。
从原始菌种中抽提质粒pTASH，用BamH I酶切，以得到具有与表达盒片段相同的粘性末端的线性化pTASH。为防止线性化的pTASH在连接反应中发生自身环化，需要使用去磷酸酶CIAP将其5’磷酸基团转变为羟基。40μl反应体系如下：10×反应缓冲液4μl，CIAP 2μl，线性化的pTASH 34μl，37℃反应4小时；65℃30分钟灭活处理终止反应，然后用乙醇沉淀得到较纯的去磷酸化的线性pTASH。
将表达盒片段与去磷酸化的线性pTASH在T4DNA连接酶的作用下于16℃进行连接过夜，连接产物直接转化大肠杆菌宿主细胞。
筛选双表达盒质粒采用BamH I酶切方法。由于在新插入的表达盒两端均为BamH I酶切位点，因此酶切后有1.1kb大小片段的克隆即为双表达盒阳性克隆。
此外，为了检测新插入的表达盒的插入方向则可选用EcoR I酶切进行验证，若为正向插入，可切出大小为1162bp的片段；若为反向插入，则可切出大小为462bp的片段。酶切产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，并以DL2,000TMDNAMarker为对照。
实施例3重组水蛭素III的高效分泌表达
筛选出的表达盒插入为正向插入的重组水蛭素III双表达盒克隆p(TASH)2，接入30mlLBA(胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，Amp100μg/ml，pH7.0)液体培养基中进行种液培养，培养条件为37℃220rpm振荡培养14小时，然后以2％接种量转接至发酵培养基(胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，谷氨酸钠4％，麦芽粉1.0％，Amp100μg/ml，KH2PO4 0.374％，Na2HPO4·12H2O 1.75％，pH7.0)中，37℃、220rpm培养24h，测定发酵液上清中抗凝血酶活力。
水蛭素生物活性测定参照Markwardt的凝血酶滴定方法(F.Markwardt，Hirudin as aninhibitor of thrombin，Methods Enzymol.19(1970)924-932.)进行：于酶标板小孔中加200μl0.5％牛血纤维蛋白原(pH7.4，50mM Tris-HCl缓冲液配制)，再加入10-100μl水蛭素溶液，充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(100NIH单位/ml)进行滴定，每次滴定量为5μl(0.5NIH单位)，时间间隔为1min，若在1min内纤维蛋白原发生凝固，说明已达到终点。由于水蛭素与凝血酶是1∶1结合，故每消耗一个凝血酶单位(NIHU)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。因此，可由凝血酶的消耗量换算出水蛭素的单位数。
双表达盒重组水蛭素IIIp(TASH)2克隆分泌表达活性测定结果(见表1)：
表1-1.双表达盒活性测定第一组数据
Figure BSA00000405309900051
表1-2.双表达盒活性测定第二组数据
Figure BSA00000405309900052
表1-3.双表达盒活性测定第三组数据
Figure BSA00000405309900053
单表达盒菌种pTASH重组克隆分泌表达活性测定结果(见表2)：
表2-1.单表达盒活性测定第一组数据
Figure BSA00000405309900054
表2-2.单表达盒活性测定第二组数据
Figure BSA00000405309900055
表2-3.单表达盒活性测定第三组数据
Figure BSA00000405309900056
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国药科大学
<120>大肠杆菌高效分泌表达新系统及其应用
<140>201010617881.3
<141>2010-12-31
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASH为模板设计合成的用以扩增目的基因片段的正向引物，命名为
pkk223-3TAC-f。
<400>1
ggatccaagc tgtggtatgg ctgtgcaggt cgtaaatc                38
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASH为模板设计合成的用以扩增目的基因片段的反向引物，命名为
pkk223-3rrnBT2-r。
<400>2
ggatccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaag                   35

Claims (4)

1.一种环状质粒DNA载体，包含原核复制起始原点、筛选标记基因和两个串联的外源基因表达盒单元。所述的两个串联的外源目的(靶)基因表达盒单元均分别含有依次排布的tac强启动子、L-门冬酰胺酶信号肽简并基因、外源目的(靶)基因、强转录终止子rrnBT1T2。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所包含的两个串联的外源基因表达盒单元转录方向可以相同也可以相反。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于含有一个pUC18高拷贝复制原点。
4.一种用于重组蛋白或多肽生产的大肠杆菌高效分泌表达载体在基因重组水蛭素及其突变体中的应用，其特征在于：应用权利要求1中所述的质粒载体分泌表达基因重组水蛭素及其突变体。
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