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CN106282145B - 一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法 - Google Patents

一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法 Download PDF

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CN106282145B CN201510306409.0A CN201510306409A CN106282145B CN 106282145 B CN106282145 B CN 106282145B CN 201510306409 A CN201510306409 A CN 201510306409A CN 106282145 B CN106282145 B CN 106282145B
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Abstract

本发明涉及微生物发酵酶制剂技术领域，具体涉及一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法。该方法包括如下步骤：(1)菌种活化：曲霉孢子接入培养基培养；(2)种子制备：孢子悬液按1～2.5％接种量接入种子摇瓶培养基培养；(3)种子罐培养：按0.1～0.5％接种量，将种子菌液接入种子罐中培养，其中转速为50～150rpm，通风比为1：0.3～1：1.2；(4)发酵罐生产：按2～10％的接种量，将种子培养液接入发酵罐培养，其中转速100～200rpm，通风比1：0.3～1：1.2。测得腺苷酸脱氨酶酶活水平较高，达2000～3100U/mL，解决了目前脱氨酶生产水平低，生产成本高的问题，具有大规模工业化的应用价值。

Description

一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵酶制剂技术领域，具体涉及一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法。
背景技术
高I+G(5′-肌苷酸钠和5′-鸟核酸钠)酵母抽提物是在原酵母抽提物的基础上，强化了产品中呈味核苷酸物质含量的酵母抽提物，作为天然、营养的高端调味品可替代味精，具有增鲜、提味和降盐等作用，符合现代人的饮食消费习惯和营养需求趋势。酵母抽提物中I+G的含量直接影响着产品的风味品质和生产成本。在国内的研究中，酵母抽提物中I+G含量在10％左右，而国外有I+G含量达到20％的酵母抽提物的专利报道。我单位通过增加对高蛋白高核酸酵母的热提取时间和pH的改进，在抽提物溶液中酵母RNA由原来的13％提高到25％以上，再通过酶解工艺改进可以直接生产出18％以上的I+G产品，再对该产品进行超滤，产品各项性能得到明显改善，产品各项指标达到欧美高端产品质量水平，属国内首创。
高I+G酵母抽提物的生产过程中，首先使用5′-核苷酸的磷酸二酯酶对单链DNA和RNA进行水解，生成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)，再由5′-腺苷酸脱氨酶进行作用，将腺苷酸转化为肌苷酸(IMP)。在高I+G酵母抽提物制备过程中，5′-腺苷酸脱氨酶起着至关重要的作用，5′-腺苷酸脱氨酶的酶活力及作用性能直接影响肌苷酸生成及高I+G酵母抽提物的质量。因此，获得高催化活力、高性能的5′-腺苷酸脱氨酶是解决高I+G酵母抽提物生产的关键技术之一，具有重要的研究意义和市场价值。
5′-腺苷酸脱氨酶最早由鼠骨骼肌和人红血细胞制备，现代化工业生产中使用的酶大都使用酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物发酵法制备，其中使用最多的菌种是米曲霉和蜂蜜曲霉，近年日本也有用基因工程链霉菌进行生产的专利报道。脱氨酶生产早期通常使用的是固态发酵法生产，该方法的缺点是固体原料中的色素、蛋白质、糖及无机盐等被混杂到酶液中而使酶的提取纯化和使用带来困难，而且固体酶的酶活往往很低。随后人们开始采用液体发酵法生产脱氨酶，该方法可以有效地克服固态发酵的某些缺点，但是酶的活性及稳定性仍未解决。5′-腺苷酸脱氨酶的工业化生产，目前，国际上只有日本天野酶株式会社拥有成熟的技术和产品，国内的广西科学院也有产品在试销，但产品的稳定性和应用效果还有待进一步验证。
目前，国内有关5′-腺苷酸脱氨酶的研究报道不多，并且主要仍集中在菌种选育和发酵条件优化方面。刘昌军等通过菌种筛选和发酵工艺优化，利用米曲霉固态发酵方式获得5′-腺苷酸脱氨酶的表达量为1543.48u/g鲜曲；普为民等从多株青霉及曲霉中筛选到一株腺苷酸脱氨酶蜂蜜曲霉产生菌，经紫外线及复合诱变处理及发酵工艺优化后，使原始菌种脱氨酶表达量提高了16倍，最终得到脱氨酶的表达量达到1300u/g；段作营等通过固态发酵方式获得米曲霉脱氨酶的表达量约1560u/g，并使用盐析沉淀方法对该酶进行了纯化并对酶学性质进行了初步研究。
高I+G酵母抽提物是在原酵母抽提物的基础上，强化了产品呈味核苷酸物质的酵母抽提物。该产品具有调味、营养和辅助医疗的作用，产品质量品质更高，可以满足人们对调味原料发展的需要。5′-腺苷酸脱氨酶可以专一地将腺苷酸(AMP)转变为肌苷酸(IMP)，在高I+G酵母抽提物的工业化生产中起着重要的作用；通过曲霉发酵是获取腺苷酸脱氨酶的主要途径，由于大多数菌种产酶活力低下，专一性不强，造成市场上腺苷酸脱氨酶供应紧缺，提高菌种腺苷酸脱氨酶的产酶活力是解决高I+G酵母抽提物生产的关键技术之一，具有重要的研究意义和市场价值。目前市场上以日本天野酶制剂公司的腺苷酸脱氨酶为主要生产商，国内生产腺苷酸脱氨酶的厂家较少，该产品市场开发潜力大。
发明内容
本发明解决的技术问题是现有的采用曲霉发酵法生产腺苷酸脱氨酶的存在发酵酶活低，生产成本高的缺陷。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法，其包括如下步骤：
(1)菌种活化：将曲霉孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；
(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中培养，得到种子培养液，其中转速为50～150rpm，通风比为1：0.3～1：1.2；
(4)发酵罐生产：按照2％～10％重量比的接种量，将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，其中转速为100～200rpm，通风比为1：0.3～1：1.2，发酵结束得到发酵液。
优选的，步骤(1)中所述培养基为PDA培养基。
优选的，步骤(1)中所述菌种置于28～29℃培养2～4天。
优选的，步骤(2)中所述的孢子悬液置于28～29℃培养20～24小时。
优选的，步骤(3)中所述的种子罐培养是在29～31℃温度下，培养24～28小时。
优选的，步骤(4)中所述的发酵罐生产是在29～30℃温度下，培养110～130小时。
优选的，对所述的发酵液采用板框过滤得到粗酶过滤液。
优选的，对所述的粗酶过滤液进行浓缩，浓缩倍数控制在10～20倍，得到浓缩液。
优选的，对所述的浓缩液进行冻干或者喷粉处理，得到固体脱氨酶。
优选的，所述的种子培养基，以100mL水计，包括：黄豆汁8～12g，蔗糖1～3g，K2HPO40.25～0.75g和酵母粉0.05～0.25g，pH值为5.0～7.2。
优选的，所述的发酵培养基，以100mL水计，包括：葡萄糖1～5g，蛋白胨1～4g，三水柠檬酸二钠0.2～0.6g，MgSO4·7H2O 0.02～0.06g，微量元素母液2～6g和吐温-800.08～0.24g，pH值为5.0～7.0。
优选的，所述的微量元素母液，，以100mL水计，包括：硫酸锌0.5～3g和氯化钙1～4g。
其中，步骤(1)中所述菌株为蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)，商购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，也就是说商购自在中国典型培养物保藏中心保藏的菌株，菌株保藏编号为CCTCC AF200042。其保藏地址为武汉市珞珈山武汉大学，该菌株来源于美国模式菌种保藏中心(ATCC)。该菌株的共享方式分为公益性共享，合作研究共享，资源交换性共享；其获取途径包括邮件，现场获取，网上订购。
其中，通风比用每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示。(V/V.min)。
本发明的有益效果是：
本发明通过该生产方法，解决了目前脱氨酶发酵酶活低，生产成本高的问题，从而提高了产量，实现了工业化生产。
腺苷酸脱氨酶目前工业用量最大的为高I+G酵母抽提物行业，由于行业所限，使得与大宗酶(如糖化酶和淀粉酶等)相比，国内科研院所对腺苷酸脱氨酶的研究相对较少，仅有少量研究报道，致使腺苷酸脱氨酶的发展极为缓慢，尚无成熟的自主商业产品。目前国内高I+G酵母抽提物生产中使用的腺苷酸脱氨酶几乎全部为日本进口产品，这使得我国高I+G酵母抽提物生产中所使用的关键酶制剂为人所控，也使得我国高I+G酵母抽提物行业的发展为人所制。因此，从特种酶制剂和快速发展的高I+G酵母抽提物两种行业的久远发展来看，自主开发腺苷酸脱氨酶生产技术，均具有重要的现实和战略意义。
具体实施方式
本发明为了克服现有技术中采用曲霉发酵法生产脱氨酶的方法存在生产成本高、脱氨酶的酶活力低，因而产量低的缺陷，通过发酵法制备得到脱氨酶成品，可用于5’-腺苷酸水解脱氨生成次黄嘌呤核酸-5’-磷酸。
具体而言，本发明提供了一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法，其包括如下步骤：
(1)菌种活化：将曲霉孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；
(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中培养，得到种子培养液，其中转速为50～150rpm，通风比为1：0.3～1：1.2；
(4)发酵罐生产：按照2％～10％重量比的接种量，将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，其中转速为100～200rpm，通风比为1：0.3～1：1.2，发酵结束得到发酵液。
下面通过具体实施例来阐述本发明的实施过程和技术效果，本领域技术人员应当理解的是，这不应被理解为对本发明权利要求范围的限制。
其中，实施例及对比例中所用到的菌株为蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)，保藏在中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC AF200042。值得注意的是，本发明中接种量均指的是重量比。
其中，实施例中所用PDA培养基的配方为：每1000ml水，含土豆(去皮)200g，葡萄糖20g和琼脂20g，pH自然。
其中，本发明所用到的各种培养基以及各种容器均经过高压蒸汽灭菌处理。
实施例中所用的具体试剂和设备均是商购的。
其中试剂的具体来源列于下面的表1中：
表1实施例和对比例中用到的各试剂及厂商
试剂/设备 纯度 生产厂商
蔗糖 工业级 北京康普汇维科技有限公司
酵母粉 工业级 无棣县德大农业有限公司
磷酸氢二钾 工业级 吴江市南风精细化工有限公司
葡萄糖 食品级 济南圣丰工贸有限公司
蛋白胨 工业级 衡水中裕胶业有限公司
三水柠檬酸二钠 食品级 河南新义精细化工有限公司
七水硫酸镁 工业级 莱州市守喜镁业有限公司
硫酸锌 工业级 邹平县润梓化工有限公司
氯化钙 工业级 廊坊纳博化学技术有限公司
吐温-80 工业级 济南腾博化工有限公司
黄豆汁的做法：
取100g黄豆，用榨汁机榨成黄豆汁，定容至1L。其中，黄豆购自荆州市常青农业科技有限公司。
设备生产厂商如下：
冻干设备，上海东富龙科技股份有限公司；
喷粉设备，常州市益民干燥设备有限公司；
超滤浓缩设备，西安滨润环保科技有限公司。
腺苷酸脱氨酶酶活测定方法如下：
1)移取3mL腺苷酸脱氨酶底物(3.475×10-2g/L)在37℃温度下保温5min，加入稀释后的AMP脱氨酶溶液0.1mL，立刻计时反应，反应15min后加入3mL 10％的高氯酸溶液终止反应。
2)对照样品处理方法同上，反应底物保温后用冰水预冷，加入3mL10％的高氯酸溶液终止反应，再加入0.1mL的样品。反应结束后，在265nm处，用石英比色皿，以水为参比测量吸光度。
酶活定义：在上述条件下每分钟吸光值改变0.001，定义为酶的活力单位。
液体酶活(U/mL)＝(△A265×10×K)/(0.001×T)
式中：△A265为空白对照与反应液吸光度的差值；K为酶液稀释倍数；T为酶的反应时间(min)。
实施例1
1.菌种活化：取蜂蜜曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境中接入200gPDA培养基中，至于28℃环境中培养4天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照1％接种量接入3L种子摇瓶培养基中，置于28℃培养24小时，得到种子菌液。其中，种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.1％的接种量，将种子菌液接入到装有300L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中培养，得到种子培养液，培养温度29℃，转速50rpm，通风比1：0.3，培养周期28小时。其中种子培养基以重量％计，由下述组分制成：黄豆汁8％，蔗糖1％，K2HPO40.25％，酵母粉0.25％，其余组分为水，灭菌前pH值调到5.0。
4.发酵罐生产：按照2％的接种量，将种子培养液接入装有15吨发酵培养基的的发酵罐(储存量为25吨)中进行发酵培养，培养温度29℃，转速100rpm，通风比1:0.3，培养周期130小时后结束，放罐测定酶活水平。其中发酵培养基以重量％计，由下述组分制成：葡萄糖1％，蛋白胨4％，三水柠檬酸二钠0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，微量元素母液2％，吐温-800.08％，其余组分为水，灭菌前调pH5.0。以重量％计，微量元素母液由下述组分制成：硫酸锌0.5％，氯化钙4％，其余组分为水。
5.板框处理：采用板框过滤除去菌体得到粗酶过滤液。
6.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在20倍，得到浓缩液。
7.冻干处理：对浓缩液进行冻干处理，得到固体脱氨酶。
实验测得腺苷酸脱氨酶的酶活水平为2036U/mL。
实施例2
1.菌种活化：取蜂蜜曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境中接入200gPDA培养基中，至于29℃环境中培养2天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2.5％接种量接入共计7.5L种子摇瓶培养基中，置于29℃培养20小时，得到种子菌液。其中，种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.5％的接种量，将种子菌液接入到装有1.5吨种子培养基的种子罐(储存量为2吨)中培养，得到种子培养液，培养温度31℃，转速150rpm，通风比1：1.2，培养周期24小时。其中种子培养基以重量％计，由下述组分制成：黄豆汁12％，蔗糖3％，K2HPO40.75％，酵母粉0.05％，其余组分为水，灭菌前pH值调到7.2。
4.发酵罐生产：按照10％的接种量，将种子培养液接入装有15吨发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中进行培养，培养温度30℃，转速200rpm，通风比1:1.2，培养周期110小时后结束，放罐测定酶活水平。其中发酵培养基以重量％计，由下述组分制成：葡萄糖5％，蛋白胨1％，三水柠檬酸二钠0.6％，MgSO4·7H2O 0.06％，微量元素母液6％，吐温-800.24％，其余组分为水，灭菌前调pH7.0。以重量％计，微量元素母液由下述制成制成：硫酸锌3％，氯化钙1％，其余组分为水。
5.板框处理：采用板框过滤除去菌体得到粗酶过滤液。
6.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在15倍，得到浓缩液。
7.喷粉处理：对浓缩液通过喷粉处理，得到固体脱氨酶。
实验测得腺苷酸脱氨酶的酶活水平为2313U/mL。
实施例3
1.菌种活化：取蜂蜜曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境中接入200gPDA培养基中，至于28℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％接种量接入共计2.7L的种子摇瓶培养基中，置于28℃培养22小时，得到种子菌液。其中，种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有900L种子培养基的种子罐(储存量为1吨)中培养，得到种子培养液培养温度30℃，转速100rpm，通风比1：0.7，培养周期26小时。其中种子培养基以重量％计，由下述组分制成：黄豆汁10％，蔗糖2％，K2HPO40.5％，酵母粉0.2％，其余组分为水，灭菌前调pH值为6.0。
4.发酵罐生产：按照6％的接种量，将种子培养液接入装有15吨发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中进行培养，培养温度29℃，转速150rpm，通风比1:0.7，培养周期115小时，发酵结束后放罐测定酶活水平。其中发酵培养基以重量％计，由下述组分制成：葡萄糖3％，蛋白胨2％，三水柠檬酸二钠0.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，微量元素母液5％，吐温-800.12％，其余组分为水，灭菌前调pH6.0。以重量％计，微量元素母液由下述组分制成：硫酸锌2％，氯化钙2％，其余组分为水。
5.板框处理：采用板框过滤除去菌体得到粗酶过滤液。
6.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在10倍，得到浓缩液。
7.冻干处理：对浓缩液通过冻干处理，得到固体脱氨酶。
实验测得腺苷酸脱氨酶的酶活水平为2631U/mL。
实施例4
1.菌种活化：取蜂蜜曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境中接入200gPDA培养基中，至于29℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％接种量接入3.6L种子摇瓶培养基中，置于29℃培养24小时。其中，种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有1.2吨种子培养基的的种子罐(储存量为2吨)中培养，得到种子培养液，培养温度30℃，转速100rpm，通风比1：1，培养周期28小时。其中种子培养基以重量％计，由下述组分制成：黄豆汁10％，蔗糖2％，K2HPO40.5％，酵母粉0.15％，其余组分为水，灭菌前调pH值为6.5。
4.发酵罐生产：按照8％的接种量，将种子培养液接入装有15吨发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中进行培养，培养温度29℃，转速150rpm，通风比1:1，培养周期120小时，发酵结束后放罐测定酶活水平。其中发酵培养基以重量％计，由下述组分制成：葡萄糖3％，蛋白胨2.52％，三水柠檬酸二钠0.4％，MgSO4·7H2O 0.04％，微量元素母液4％，吐温-800.16％，其余组分为水，灭菌前调pH 6.0。以重量％计，微量元素母液由下述组分制成：硫酸锌1％，氯化钙2％，其余组分为水。
5.板框处理：采用板框过滤除去菌体得到粗酶过滤液。
6.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在15倍，得到浓缩液。
7.冻干处理：对浓缩液通过冻干处理，得到固体脱氨酶。
实验测得腺苷酸脱氨酶的酶活水平为3021U/mL。
对比例1
1.菌种活化：取蜂蜜曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境中接入200gPDA培养基中，至于29℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照0.5％接种量接入3.6L种子摇瓶培养基中，置于29℃培养30小时，得到种子菌液。其中种子摇瓶培养基的配方和实施例4相同。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有1.2吨种子培养基的种子罐(储存量为2吨)中培养，得到种子培养液，培养温度30℃，转速100rpm，通风比1：1，培养周期28小时。其中种子培养基的配方和实施例4相同。
4.发酵罐生产：按照8％的接种量，将种子培养液接入装有15吨发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中进行培养，培养温度29℃，转速150rpm，通风比1:1，培养周期120小时，发酵结束后放罐测定酶活水平。其中发酵培养基的配方和实施例4相同。
其他步骤同实施例4中步骤5-7。
实验测得腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1821U/mL。
对比例2
1.菌种活化：取蜂蜜曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境中接入到200gPDA培养基中，至于29℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将该孢子悬液按照3％接种量接入3.6L种子摇瓶培养基中，置于29℃培养15小时，得到种子菌液。其中种子摇瓶培养基的配方和实施例4相同。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有1.2吨种子培养基的种子罐(储存量为2吨)中培养得到种子培养液，其中培养温度30℃，转速100rpm，通风比1：1，培养周期28小时。其中种子培养基的配方和实施例4相同。
4.发酵罐生产：按照8％的接种量，将种子培养液接入装有15吨的发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中进行培养，培养温度29℃，转速150rpm，通风比1:1，培养周期120小时，发酵结束后放罐测定酶活水平。其中发酵培养基的配方和实施例4相同。
其他步骤同实施例4中步骤5-7。
实验测得腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1628U/mL。
对比例3
1.菌种活化：取蜂蜜曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境中接入200gPDA培养基中，至于29℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％接种量接入3.6L种子摇瓶培养基中，置于29℃培养24小时，得到种子菌液。其中种子摇瓶培养基的配方和实施例4相同。
3.种子罐培养：按照0.05％的接种量，将种子菌液接入到装有1.2吨种子培养基的种子罐(储存量为2吨)中培养，得到种子培养液，培养温度30℃，转速25rpm，通风比1：0.2，培养周期35小时。其中种子培养基的配方和实施例4相同。
4.发酵罐生产：按照1％的接种量，将种子培养液接入装有15吨发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中进行培养，培养温度29℃，转速50rpm，通风比1:0.2，培养周期140小时，发酵结束后放罐测定酶活水平。其中发酵培养基的配方和实施例4相同。
其他步骤同实施例4中步骤5-7。
实验测得腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1702U/mL。
对比例4
1.菌种活化：取蜂蜜曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境中接入到200gPDA培养基中，至于29℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％接种量接入3.6L种子摇瓶培养基中，置于29℃培养24小时，得到种子菌液。其中种子摇瓶培养基的配方和实施例4相同。
3.种子罐培养：按照0.7％的接种量，将种子菌液接入到装有1.2吨种子培养基的种子罐(储存量为2吨)中培养，得到种子培养液，其中培养温度30℃，转速200rpm，通风比1：1.5，培养周期18小时。其中种子培养基的配方和实施例4相同。
4.发酵罐生产：按照12％的接种量，将种子培养液接入装有15吨发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中进行培养，培养温度29℃，转速250rpm，通风比1:1.5，培养周期100小时，发酵结束后放罐测定酶活水平。其中发酵培养基的配方和实施例4相同。
其他步骤同实施例4中步骤5-7。
实验测得腺苷酸脱氨酶的酶活水平为1803U/mL。
对比例5
1.菌种活化：取蜂蜜曲霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境中接入200gPDA培养基中，至于25℃环境中培养4天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％接种量接入到3.6L种子摇瓶培养基中，置于25℃培养30小时，得到种子菌液。其中种子摇瓶培养基的配方和实施例4相同。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有1.2吨种子培养基的种子罐(储存量为2吨)中培养，得到种子培养液，其中培养温度25℃，转速100rpm，通风比1：1，培养周期35小时。其中种子培养基的配方和实施例4相同。
4.发酵罐生产：按照8％的接种量，将种子培养液接入装有15吨发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中进行培养，培养温度25℃，转速150rpm，通风比1:1，培养周期150小时，发酵结束后放罐测定酶活水平。其中发酵培养基的配方和实施例4相同。
其他步骤同实施例4中步骤5-7。
实验测得腺苷酸脱氨酶的酶活水平为923U/mL。
各实施例与各对比例的酶活测定结果表明，该蜂蜜曲霉菌株通过本发明的生产方法，所产的腺苷酸脱氨酶的酶活水平较高，酶活力达到2000-3100U/mL，具有大规模工业化的应用价值。

Claims (12)

1.一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）菌种活化：将保藏编号为CCTCC AF200042的蜂蜜曲霉（Aspergillus melleus）孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；
（2）种子制备：将孢子悬液按照1%~2.5%重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，置于28~29℃培养20~24小时，得到种子菌液；
（3）种子罐培养：按照0.1%~0.5%重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中培养，得到种子培养液，其中转速为50~150rpm，通风比为1：0.3~1：1.2，所述的种子罐培养是在29~31℃温度下，培养24~28小时；
（4）发酵罐生产：按照2%~10%重量比的接种量，将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，其中转速为100~200rpm，通风比为1：0.3~1：1.2，发酵结束得到发酵液，所述的发酵罐生产是在29~30℃温度下，培养110~130小时。
2.根据权利要求1所述的液态发酵方法，其特征在于，步骤（1）中所述菌种置于28~29℃培养2~4天。
3.根据权利要求1-2任一所述的液态发酵方法，其特征在于，对所述的发酵液采用板框过滤得到粗酶过滤液。
4.根据权利要求3所述的液态发酵方法，其特征在于，对所述的粗酶过滤液进行浓缩，浓缩倍数控制在10-20倍，得到浓缩液。
5.根据权利要求1-2任一所述的液态发酵方法，其特征在于，所述的种子培养基，以100mL水计，包括：黄豆汁8~12g，蔗糖1~3g，K2HPO4 0.25~0.75g和酵母粉0.05~0.25g，pH值为5.0~7.2。
6.根据权利要求3所述的液态发酵方法，其特征在于，所述的种子培养基，以100mL水计，包括：黄豆汁8~12g，蔗糖1~3g，K2HPO4 0.25~0.75g和酵母粉0.05~0.25g，pH值为5.0~7.2。
7.根据权利要求4所述的液态发酵方法，其特征在于，所述的种子培养基，以100mL水计，包括：黄豆汁8~12g，蔗糖1~3g，K2HPO4 0.25~0.75g和酵母粉0.05~0.25g，pH值为5.0~7.2。
8.根据权利要求1-2任一所述的液态发酵方法，其特征在于，所述的发酵培养基，以100mL水计，包括：葡萄糖1~5g，蛋白胨1~4g，三水柠檬酸二钠0.2~0.6g，MgSO4·7H2O 0.02~0.06g，微量元素母液2~6g和吐温-80 0.08~0.24g，pH值为5.0~7.0。
9.根据权利要求3所述的液态发酵方法，其特征在于，所述的发酵培养基，以100mL水计，包括：葡萄糖1~5g，蛋白胨1~4g，三水柠檬酸二钠0.2~0.6g，MgSO4·7H2O 0.02~0.06g，微量元素母液2~6g和吐温-80 0.08~0.24g，pH值为5.0~7.0。
10.根据权利要求4所述的液态发酵方法，其特征在于，所述的发酵培养基，以100mL水计，包括：葡萄糖1~5g，蛋白胨1~4g，三水柠檬酸二钠0.2~0.6g，MgSO4·7H2O 0.02~0.06g，微量元素母液2~6g和吐温-80 0.08~0.24g，pH值为5.0~7.0。
11.根据权利要求5所述的液态发酵方法，其特征在于，所述的发酵培养基，以100mL水计，包括：葡萄糖1~5g，蛋白胨1~4g，三水柠檬酸二钠0.2~0.6g，MgSO4·7H2O 0.02~0.06g，微量元素母液2~6g和吐温-80 0.08~0.24g，pH值为5.0~7.0。
12.根据权利要求8所述的液态发酵方法，其特征在于，所述的微量元素母液，以100mL水计，包括：硫酸锌0.5~3g和氯化钙1~4g。
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