CN106226304A - 一种利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学领域，具体涉及一种利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法。本发明测定壳寡糖脱乙酰度的方法包括如下步骤：S1、测定壳寡糖样品中的水分含量作为壳寡糖样品干燥失重项下减失重量；S2、取壳寡糖样品，用蒸馏水溶解后，调节pH值至8.0，加入稀盐酸滴定液，同时滴加1％溴甲酚绿指示剂1‑2滴，混匀后用氢氧化钠滴定液滴定至溶液变为绿色即为滴定终点；S3、计算壳寡糖样品的脱乙酰度。本发明提供的方法是一种准确、快速测定壳寡糖脱乙酰度的方法，同时，本发明提供的方法使用仪器简单，操作简单易行，样品无需特殊的前处理，滴定终点判断明显，测量误差小，适用于壳寡糖制备过程中的质量控制。

Description

一种利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法

技术领域

本发明属于化学领域，尤其涉及一种利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法。

背景技术

壳寡糖是氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的同聚物或异聚物。壳寡糖是壳聚糖的降解产物，但与壳聚糖相比，壳寡糖具有溶解性更好，粘度更低更易被人体吸收的优点，在医药、农业、精细化工等领域有着广泛的应用。壳寡糖不仅具有抗肿瘤、抑菌抗菌、抗氧化等功能，还具有减肥、调脂、增强免疫力等生物功能。

壳寡糖的脱乙酰度能够影响壳寡糖的生物、物理、化学功能与活性，是壳寡糖各种功能的体现，是衡量壳寡糖质量的重要指标之一。壳寡糖的脱乙酰度是指在壳寡糖中总的糖残基数中脱除乙酰基的糖残基数所占的百分比，而游离氨基的含量则是它各种功能的基础。

目前，国内外报道的测定壳聚糖脱乙酰度的方法有很多：包括碱量法(酸碱滴定法、电位滴定法、双突跃滴定法)、红外光谱法、胶体滴定法、折光指数法、破坏样品法(元素分析法、酸水解液相色谱分析与热分析)。甲基橙酸碱指示剂法测定壳聚糖脱乙酰度已收录于2015版《中国药典》，且以甲基橙-苯胺蓝(1∶2)为指示剂的碱量法测定壳聚糖脱乙酰度含量的方法被广泛应用，已成为农业部颁布的中国水产行业标准方法。但采用甲基橙或甲基橙-苯胺蓝为指示剂的测定方法用于测定壳寡糖脱乙酰度时存在着终点颜色变化不明显，重现性差，误差较大的缺点，按照2015版《中国药典》采用甲基橙酸碱指示剂法测定的壳寡糖脱乙酰度误差达到60％以上。核磁共振氢谱(¹H-NMR)作为测定壳聚糖脱乙酰度的金标准，已载入了美国药典，同时，Kim等发表的论文“Oligosaccharides and TheirDerivatives”和王世欣等发表的论文“不同来源的壳寡糖产品的质量分析”公开了可利用核磁共振氢谱法测定壳寡糖的脱乙酰度，测定结果误差小。但¹H-NMR方法由于其仪器成本高且操作需要专业的技术人员，因而无法广泛推广使用。

经检索，现有技术中未见有利用以溴甲酚绿作为指示剂的酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的报道，也尚未建立壳寡糖脱乙酰度的标准方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法。本发明提供的方法是一种准确、快速测定壳寡糖脱乙酰度的方法，同时，本发明提供的方法使用仪器简单，操作简单易行，样品无需特殊的前处理，滴定终点判断明显，测量误差小，适用于壳寡糖制备过程中的质量控制。

本发明提供了一种利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，包括如下步骤：

S1、测定壳寡糖样品中的水分含量作为壳寡糖样品干燥失重项下减失重量；

S2、取壳寡糖样品，用蒸馏水溶解后，调节pH值至8.0，加入稀盐酸滴定液，同时滴加0.1-1％的溴甲酚绿指示剂1-6滴，混匀后用氢氧化钠滴定液滴定至溶液变为绿色即为滴定终点；

S3、计算壳寡糖样品的脱乙酰度，公式如下：

$D.D.\%=\frac{(N_{HC1}\×V_{HC1}-N_{NaOH}\×V_{NaOH1})\×0.016\×100\%}{G\×(100-W)\×9.94\%}$

式中，D.D.％为脱乙酰度，％；N_HCl为盐酸滴定液的浓度，mol/L；V_HCl为盐酸滴定液的体积，mL；N_NaOH为氢氧化钠滴定液的浓度，mol/L；V_NaOH为氢氧化钠滴定液的体积，mL；G为供试品称重，g；W为干燥失重项下减失重量，％；0.016为1mol/L盐酸相当的氨基量，g；9.94％为理论氨基含量。

进一步地，所述壳寡糖样品的浓度为6-10mg/mL。

进一步地，所述稀盐酸滴定液的浓度为0.1-0.5mol/L。

进一步地，所述指示剂的用量为1％的溴甲酚绿指示剂1-2滴。

进一步地，所述氢氧化钠滴定液浓度为0.1-0.5mol/L。

与现有技术相比，本发明有益效果如下：

(1)本发明提供的利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，可以准确、快速地测定壳寡糖脱乙酰度，且本发明提供的方法使用仪器简单，操作简单易行，样品无需特殊的前处理，滴定终点判断明显，测量误差小，适用于壳寡糖制备过程中的质量控制。

(2)本发明提供的利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，以溴甲酚绿作为指示剂，滴定终点颜色变化明显，可准确判断滴定终点，降低测定误差。

(3)本发明发明人在研究酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度过程中，通过大量的研究发现，壳寡糖水溶液pH值对样品脱乙酰度的测定具有很大的影响，壳寡糖水溶液中，乙酰氨基在pH 8.0时刚好达到完全游离出来的状态，此时利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度，准确度高，而壳寡糖水溶液pH小于8.0时造成负误差，pH大于8.0时造成正误差。

附图说明

图1平均分子量≤1000道尔顿的壳寡糖(COS_MW1000)的核磁共振氢谱图(500MHz)，其中，A-E代表糖环上C2-C6位特征氢信号。

图2平均分子量≤3000道尔顿的壳寡糖(COS_MW3000)的核磁共振氢谱图(500MHz)，其中，A-E代表糖环上C2-C6位特征氢信号。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明，且本发明的保护范围不仅仅局限于以下实施例。

本发明实施例中所用原料均为市售产品，其中，涉及的部分设备型号和来源如下：

名称	生产企业
		S-25电位pH计	上海雷磁精密科学仪器有限公司
DK-8D型千分之一电子分析天平	德国赛多利斯集团
		SartouriusMA150红外水分测定仪	德国赛多利斯集团
Bruker500MHz核磁共振仪	德国布鲁克公司

实施例1酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度

S1、称取0.5g壳寡糖样品于红外水分测定仪中测定其水分含量，记录结果作为该批次壳寡糖样品干燥失重项下减失重量；

S2、取壳寡糖样品0.5g，精密称定，精密加入50mL蒸馏水，室温下搅拌使其完全溶解，调pH值至8.0，精密加入0.3mol/L的稀盐酸滴定液18mL，同时滴加1％的溴甲酚绿指示剂1-2滴，混匀后用0.15mol/L的氢氧化钠滴定液滴定至溶液变为绿色即为滴定终点；

S3、计算壳寡糖样品的脱乙酰度，公式如下：

$D.D.\%=\frac{(N_{HC1}\×V_{HC1}-N_{NaOH}\×V_{NaOH1})\×0.016\×100\%}{G\×(100-W)\×9.94\%}$

式中，D.D.％为脱乙酰度，％；N_HCl为盐酸滴定液的浓度，mol/L；V_HCl为盐酸滴定液的体积，mL；N_NaOH为氢氧化钠滴定液的浓度，mol/L；V_NaOH为氢氧化钠滴定液的体积，mL；G为供试品称重，g；W为干燥失重项下减失重量，％；0.016为1mol/L盐酸相当的氨基量，g；9.94％为理论氨基含量。

分别对COS_MW1000(脱乙酰度≥90％，平均分子量≤1000的壳寡糖样品)、COS_MW3000(脱乙酰度≥90％，平均分子量≤3000的壳寡糖样品)进行脱乙酰度测定，结果见表1，表2。

表1COS_MW1000脱乙酰度测定结果

根据表1可以得知，COS_MW1000通过本发明提供的方法，测得其脱乙酰度D.D.值为93.38％，RSD为0.28(n＝6)。

表2COS_MW3000脱乙酰度测定结果

根据表2可以得知，COS_MW3000的壳寡糖样品通过本发明提供的方法，测得其脱乙酰度D.D.值为92.64％，RSD为0.53(n＝6)。

对比例1 ¹H-NMR法测定脱乙酰度

1)¹H-NMR法测定脱乙酰度

分别精密称取20mg COS_MW1000和COS_MW3000溶解在5mL的D₂O(99.96％)中，得浓度为4mg/mL的样品溶液，将所得样品溶液转移至8mm核磁管中进行测定，共振频率为500MHz，测定温度为297k，最后对目标信号积分，其中糖环上C2位乙酰胺基中乙酰基的氢信号(Acetyl-H)在1.9-2.1ppm，糖环上C2-C6位氢信号在2.6-6.0ppm处。COS_MW1000，COS_MW3000核磁共振氢谱图分别见图1，图2。根据表3，对核磁共振氢谱图对应峰进行积分，脱乙酰度计算公式为：

D.D(％)＝{1-[(7*A₂)/(3*A₁)]}*100

其中，A₂代表糖环上C2位乙酰氨基中乙酰基的3个氢信号的积分值；A₁代表糖环上C2-C6位氢信号的积分值。

表3 25℃下壳寡糖氘水溶液氢质子化学位移

利用¹H-NMR法测得COS_MW1000，COS_MW3000对应的脱乙酰度测定结果分别为93.52±0.13(n＝6)，92.81±0.07(n＝6)。

2)¹H-NMR法与本发明酸碱指示剂法测定结果的对比

¹H-NMR法与本发明酸碱指示剂法测定结果的对比结果见表4。

表4 ¹H-NMR与本发明酸碱指示剂法测定结果对比(n＝6)

样品	1H-NMR(％)	溴甲酚绿指示剂法(％)	相对误差
				COSMW1000	93.52±0.13	93.38±0.28	0.14±0.15
COSMW3000	92.81±0.07	92.64±0.53	0.17±0.46

从表4结果可以看出，本发明酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的测定结果相对误差小于0.2％，与¹H-NMR法的测定结果一致。说明本发明提供的酸碱指示剂法用于测定壳寡糖脱乙酰度准确度高。

对比例2甲基橙酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度

参照2015版《中国药典》中壳聚糖脱乙酰度的测定方法测定COS_MW1000和COS_MW3000的脱乙酰度，测定结果如表5和表6所示。

表5COS_MW1000脱乙酰度测定结果

表6COS_MW3000脱乙酰度测定结果

由表5和表6的结果可知，利用2015版《中国药典》中壳聚糖脱乙酰度的测定方法测得COS_MW1000、COS_MW3000对应的脱乙酰度分别为30.39±0.70、30.32±0.56，与利用¹H-NMR法测得的COS_MW1000、COS_MW3000对应的脱乙酰度93.52±0.13、92.81±0.07相比，具有60％以上的测定误差。

壳聚糖样品水溶液是无色溶液，其等电点在3.88左右，甲基橙pH变色范围在3.1-4.4，且酸式色为红色，碱式色为黄色，因此，以甲基橙作为酸碱指示剂利用酸碱滴定法测定壳聚糖的脱乙酰度，滴定终点明显，测量误差小，准确度高。而对于壳寡糖而言，一方面，壳寡糖样品水溶液本身呈现淡黄色，采用甲基橙作为指示剂，使得滴定终点无法准确判断；另一方面，壳寡糖等电点值在4.80左右，超出甲基橙pH变色范围，因此，按照2015版《中国药典》采用甲基橙酸碱指示剂法测定的壳寡糖脱乙酰度误差很大。溴甲酚绿pH变色范围在3.8-5.4，酸式色为黄色，碱式色为绿色(蓝绿色)，采用溴甲酚绿作为酸碱指示剂法的指示剂，滴定终点颜色变化明显，可准确判断滴定终点，从而可显著降低测定误差。

对比例3酚酞酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度

参考2015版《中国药典》中壳聚糖脱乙酰度的测定方法，以酚酞作为指示剂测定COS_MW1000和COS_MW3000的脱乙酰度，测定结果如表7和表8所示。

表7COS_MW1000脱乙酰度测定结果

表8COS_MW3000脱乙酰度测定结果

由表7和表8的结果可知，以酚酞作为指示剂测得COS_MW1000、COS_MW3000对应的脱乙酰度分别为66.72±0.23、62.01±0.29，与利用¹H-NMR法测得的COS_MW1000、COS_MW3000对应的脱乙酰度93.52±0.13、92.81±0.07相比，存在30％左右的测定误差。

对比例4pH的考察

本发明发明人在研究过程中，通过大量的研究发现，壳寡糖水溶液pH值对壳寡糖样品脱乙酰度的测定具有很大的影响。

本发明发明人参考2015版《中国药典》中壳聚糖脱乙酰度的测定方法，采用溴甲酚绿作为酸碱指示剂法的指示剂测定COS_MW1000和COS_MW3000的脱乙酰度，滴定终点颜色变化明显，从而显著降低了测定误差，但与¹H-NMR法的测定方法相比，仍具有10％以上的测定误差。

研究过程中发现，受壳寡糖制备工艺的影响，市售壳寡糖的水溶液的pH值为5.12左右，呈现弱酸性。壳寡糖是一种碱性氨基多糖，若其水溶液呈现弱酸性，利用酸碱指示剂法测定其脱乙酰度时，必定会引起测定误差。

在pH值改变，其他测定条件和方法与实施例1相同的条件下考察pH对酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的测定结果的影响，结果见表9。

表9壳寡糖水溶液不同pH值对壳寡糖脱乙酰度测定结果的影响(n＝6)

pH

7.60

7.80

7.90

8.00

8.10

8.20

D.DMW1000(％)

87.45±0.18

90.94±0.21

91.64±0.31

93.44±0.13

95.62±0.20

97.65±0.25

D.DMW3000(％)

88.14±0.19

89.86±0.20

90.82±0.16

92.69±0.11

94.25±0.18

97.12±0.23

根据表9的结果可知，壳寡糖水溶液pH值对壳寡糖样品脱乙酰度的测定具有很大的影响，原因可能是在酸性环境中乙酰氨基与盐酸结合形成了壳寡糖盐酸盐，使乙酰氨基不能完全游离出来，从而造成了较大的测定误差。随着溶液酸碱性的变化，乙酰氨基慢慢游离出来，在pH＝8.00时达到刚好完全游离出来的状态，pH<8.00造成负误差，pH>8.00造成正误差。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、测定壳寡糖样品中的水分含量作为壳寡糖样品干燥失重项下减失重量；

S2、取壳寡糖样品，用蒸馏水溶解后，调节pH值至8.0，加入稀盐酸滴定液，同时滴加0.1-1％的溴甲酚绿指示剂1-6滴，混匀后用氢氧化钠滴定液滴定至溶液变为绿色即为滴定终点；

S3、计算壳寡糖样品的脱乙酰度，公式如下：

$D.D.\%=\frac{\left(N_{HC1}\&times;V_{HC1}-N_{NaOH}\&times;V_{NaOH1}\right)\&times;0.016\&times;100\%}{G\&times;\left(100-W\right)\&times;9.94\%}$

式中，D.D.％为脱乙酰度，％；N_HCl为盐酸滴定液的浓度，mol/L；V_HCl为盐酸滴定液的体积，mL；N_NaOH为氢氧化钠滴定液的浓度，mol/L；V_NaOH为氢氧化钠滴定液的体积，mL；G为供试品称重，g；W为干燥失重项下减失重量，％；0.016为1mol/L盐酸相当的氨基量，g；9.94％为理论氨基含量。

2.根据权利要求1所述的利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，其特征在于：所述壳寡糖样品的浓度为6-10mg/mL。

3.根据权利要求1所述的利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，其特征在于：所述稀盐酸滴定液的浓度为0.1-0.5mol/L。

4.根据权利要求1所述的利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，其特征在于：所述指示剂的用量为1％的溴甲酚绿指示剂1-2滴。

5.根据权利要求1所述的利用酸碱指示剂法测定壳寡糖脱乙酰度的方法，其特征在于：所述氢氧化钠滴定液浓度为0.1-0.5mol/L。