CN108344819A - 一种低聚木糖含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种低聚木糖含量的检测方法，本发明提供的检测方法可以通过带有紫外检测器的高效液相色谱仪检出，克服了低聚木糖在紫外光下无吸收，因而无法用紫外检测器检出的问题，从而实现了对低聚木糖含量的有效检测。同时，本发明提供的检测方法准确可靠，重复性好，分离度高，灵敏度强且操作简单易实现。实验结果表明，本发明提供的检测方法得到的低聚木糖含量相比于采用带有示差检测器的高效液相色谱仪得到的低聚木糖含量更为准确，示差检测器下的木糖的峰型拖尾，样品分离度低；而本发明的检测方法得到的峰型较好，分离度较高，该方法测定加入内标，可有效减少样品处理过程中产生的误差，使测定结果更准确。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析及仪器分析技术领域，尤其涉及一种低聚木糖含量的检测方法。
背景技术
低聚木糖又称木寡糖，是由2～7个木糖残基以β-1,4糖苷键结合而构成的低聚糖，其组成以木二糖和木七糖为主。低聚木糖作为一种新兴的功能性食品配料，因具有优良的加工特性和多种生理调节功能，被广泛应用于各种功能性食品。比如：低聚木糖能够选择性的促进肠道双歧杆菌等有益菌的增殖，使其成为肠道优势菌群，调节肠道微生态平衡，因此，低聚木糖也被称为“超强双歧因子”。低聚木糖还可以作为一种“益钙因子”在补钙过程中对促进钙的吸收有很好的作用。
目前，检测低聚木糖的方法基本都是高效液相色谱-示差折光检测器法。由于低聚木糖在紫外光下无吸收，因而无法用紫外检测器检出，同时，现有的其他常用的检测物质的方法及仪器均无法对低聚木糖进行有效的检测。而高效液相色谱-示差折光检测器法虽然具有样品处理简单，操作方便的优点，但还是存在很多不足之处，比如：检测灵敏度低，分离度差，且需示差检测器及氨基柱方可完成，对仪器及设备要求较高。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种低聚木糖含量的检测方法，本发明提供的低聚木糖含量的检测方法检测灵敏度高，分离度较优。
本发明提供了一种低聚木糖含量的检测方法，包括：
A)将木糖标准样的溶液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，得到木糖标准样的图谱；
B)取低聚木糖待测样品的一部分，作为用于测定总木糖的样品，质量记为a1，将所述用于测定总木糖的样品进行预处理后，与内标物质的溶液混合，得到第一混合液；取部分所述第一混合液进行水解，得到第二混合液；
将所述第二混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量；
C)取低聚木糖待测样品的另一部分，作为用于测定游离木糖的样品，质量记为a2，将所述用于测定游离木糖的样品进行预处理后，与内标物质的溶液混合，得到第三混合液；
将所述第三混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的含量；
所述低聚木糖待测样品的总质量记为a，所述a1+a2≤a；
所述步骤B)和步骤C)并无顺序限制；
D)取所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量与游离木糖的含量的差值，即为低聚木糖待测样品中的低聚木糖的含量。
优选的，步骤B)中，所述内标物质为甘露糖或D-盐酸氨基葡萄糖；
步骤C)中，所述内标物质为甘露糖或D-盐酸氨基葡萄糖。
优选的，步骤B)中，所述内标物质的溶液的浓度为1.0～3.0mg/mL，所述内标物质的溶液与所述用于测定总木糖的样品的用量比为0.5～2mL：0.5～6mg；
步骤C)中，所述内标物质的溶液的浓度为1.0～3.0mg/mL，所述内标物质的溶液与所述用于测定游离木糖的样品的用量比为0.5～2mL：0.5～6mg。
优选的，步骤B)中，所述水解具体为：
加入浓度为2～6mol/L的酸溶液，在80～150℃下水解1～3h，冷却后，用浓度为2～6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至中性；
所述酸溶液为盐酸或三氟乙酸。
优选的，步骤A)、步骤B)和步骤C)中的带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测的色谱条件相同，具体为：
采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相，以0.02mol/L的乙酸铵溶液为流动相B相；
所述流动相A相与所述流动相B相的体积比为10～20：80～90。
优选的，步骤A)、步骤B)和步骤C)中的带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测的柱温相同，为25～35℃。
优选的，步骤A)、步骤B)和步骤C)中的带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测的波长相同，为240～300nm。
优选的，步骤A)中，所述木糖标准样的溶液的浓度为0.05～2.0mg/mL；所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.3～1.0mol/L；所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L；
所述木糖标准样的溶液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液的体积比为1：1：1；
步骤B)中，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.3～1.0mol/L；所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L；
所述第二混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液的体积比为1：1：1；
步骤C)中，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.3～1.0mol/L；所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L；
所述第三混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液的体积比为1：1：1。
优选的，步骤B)中，所述低聚木糖待测样品为经过透析的低聚木糖待测样品；
步骤C)中，所述低聚木糖待测样品为经过透析的低聚木糖待测样品。
优选的，步骤B)中，所述预处理具体为：
将所述用于测定总木糖的样品与乙醇混合，超声提取，离心，取上清液，干燥，加水溶解；
步骤C)中，所述预处理具体为：
将所述用于测定游离木糖的样品与乙醇混合，超声提取，离心，取上清液，干燥，加水溶解。
本发明提供了一种低聚木糖含量的检测方法，本发明提供的检测方法可以通过带有紫外检测器的高效液相色谱仪检出，克服了低聚木糖在紫外光下无吸收，因而无法用紫外检测器检出的问题，从而实现了对低聚木糖含量的有效检测。同时，本发明提供的检测方法准确可靠，重复性好，分离度高，灵敏度强且操作简单易实现。实验结果表明，本发明提供的检测方法得到的低聚木糖含量相比于采用带有示差检测器的高效液相色谱仪得到的低聚木糖含量更为准确，示差检测器下的木糖的峰型拖尾，样品分离度低；而本发明的检测方法得到的峰型较好，分离度较高，该方法测定加入内标，可有效减少样品处理过程中产生的误差，使测定结果更准确。
本发明提供的检测方法经过线性关系实验、重复性实验、加样回收实验和耐用性等方法学验证，证明该方法准确可靠，重复性好，准确度高，灵敏度强且操作简单易实现。
附图说明
图1为比较例1中所述低聚木糖待测样品中低聚木糖的峰面积的检测图谱；
图2为实施例1中所述低聚木糖待测样品中低聚木糖的峰面积的检测图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种低聚木糖含量的检测方法，包括：
A)将木糖标准样的溶液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，得到木糖标准样的图谱；
B)取低聚木糖待测样品的一部分，作为用于测定总木糖的样品，质量记为a1，将所述用于测定总木糖的样品进行预处理后，与内标物质的溶液混合，得到第一混合液；取部分所述第一混合液进行水解，得到第二混合液；
将所述第二混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量；
C)取低聚木糖待测样品的另一部分，作为用于测定游离木糖的样品，质量记为a2，将所述用于测定游离木糖的样品进行预处理后，与内标物质的溶液混合，得到第三混合液；
将所述第三混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的含量；
所述低聚木糖待测样品的总质量记为a，所述a1+a2≤a；
所述步骤B)和步骤C)并无顺序限制；
D)取所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量与游离木糖的含量的差值，即为低聚木糖待测样品中的低聚木糖的含量。
本发明提供的低聚木糖含量的检测方法先得到木糖标准样的图谱，然后，通过获取低聚木糖待测样品中的总木糖的含量以及游离木糖的含量，从而取两者的差值，得到低聚木糖待测样品中的低聚木糖的含量。
本发明将木糖标准样的溶液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，得到木糖标准样的图谱。
在本发明中，所述木糖标准样的溶液优选按照以下方法进行制备：
将木糖与内标物质的溶液混合，置于容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得到木糖标准样的溶液。
所述内标物质优选为甘露糖或D-盐酸氨基葡萄糖。所述内标物质的溶液优选按照以下方法进行制备：
将内标物质与水混合，得到浓度为1.0～3.0mg/mL的内标物质的溶液。在本发明的某些实施例中，所述内标物质的溶液的浓度为2.5mg/mL。
所述木糖与内标物质的溶液的用量比优选为2.0～3.0mg：0.5～2.0mL。在本发明的某些实施例中，所述木糖与内标物质的溶液的用量比为2.5mg：1mL。
在本发明的某些实施例中，所述容量瓶的规格为25mL。
在本发明中，所述木糖标准样的溶液的浓度优选为0.05～2.0mg/mL。在本发明的某些实施例中，所述木糖标准样的溶液的浓度为2.0mg/mL。
所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度优选为0.3～1.0mol/L。在本发明的某些实施例中，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.5mol/L。
所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。在本发明的某些实施例中，所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.3mol/L。
所述木糖标准样的溶液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液的体积比优选为1：1：1。更优选的，所述木糖标准样的溶液的体积为200～500μL，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的体积为200～500μL，所述氢氧化钠的水溶液的体积为200～500μL。在本发明的某些实施例中，所述木糖标准样的溶液的体积为400μL，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的体积为400μL，所述氢氧化钠的水溶液的体积为400μL。
所述反应的温度为50～100℃。在本发明的某些实施例中，所述反应的温度为70℃。所述反应的时间为60～120min。在本发明的某些实施例中，所述反应的时间为100min。
所述反应完成后，优选将得到的反应溶液与盐酸混匀，用三氯甲烷洗涤，得到的水层离心，取上清液，过孔径为0.22～0.45μm的有机滤膜，再采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量。本发明对所述有机滤膜的来源没有特殊限制，为一般市售品即可。
本发明采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测时，优选采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相，以0.02mol/L的乙酸铵溶液为流动相B相；所述流动相A相与所述流动相B相的体积比为10～20：80～90。在本发明的某些实施例中，所述流动相A相与所述流动相B相的体积比为17：83。
所述带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测的柱温优选为25～35℃。在本发明的某些实施例中，所述检测的柱温为30℃。所述检测的波长优选为240～300nm，在本发明的某些实施例中，所述检测的波长为250nm。所述检测的流动相流速优选为0.8～1.2mL/min。在本发明的某些实施例中，所述检测的流动相流速为1.0mL/min。所述检测的进样量优选为2～20μL。在本发明的某些实施例中，所述检测的进样量为5μL。
本发明对获取低聚木糖待测样品中的总木糖的含量以及游离木糖的含量的顺序并无特殊的限制。
所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量按照下述方法进行检测：
取低聚木糖待测样品的一部分，作为用于测定总木糖的样品，质量记为a1，将所述用于测定总木糖的样品进行预处理后，与内标物质的溶液混合，得到第一混合液；取部分所述第一混合液进行水解，得到第二混合液；
将所述第二混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量。
在本发明中，所述低聚木糖待测样品优选为经过透析的低聚木糖待测样品。所述经过透析的低聚木糖待测样品优选按照以下方法进行制备：
将低聚木糖待测样品与第一溶剂混合，装入10cm可截留的重均分子量为1000的透析袋中，将所述透析袋完全淹没于第二溶剂中进行透析，适时更换透析袋外液，收集合并透析袋外液，浓缩干燥后，得到经过透析的低聚木糖待测样品。
在本发明中，所述第一溶剂优选为水。本发明对所述低聚木糖待测样品与第一溶剂的用量比并无特殊的限制，能够将所述低聚木糖待测样品完全溶解即可。在本发明的某些实施例中，所述低聚木糖待测样品与第一溶剂的用量比为5g：50mL。
所述第二溶剂优选为水。
将所述透析袋完全淹没于第二溶剂中进行透析时，本领域技术人员可以根据实际情况适时更换透析袋外液。在本发明的某些实施例中，适时更换透析袋外液具体为：分别于3h、6h和15h各换一次透析袋外液。
本发明对所述浓缩干燥的温度和时间并无特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的浓缩干燥的温度和时间即可。
所述预处理优选为：
将所述用于测定总木糖的样品与乙醇混合，超声提取，离心，取上清液，干燥，加水溶解。
在本发明中，所述乙醇的体积浓度优选为80％。所述用于测定总木糖的样品与乙醇的用量比优选为10～30mg：10～30mL。在本发明的某些实施例中，所述用于测定总木糖的样品与乙醇的用量比为25mg：25mL。
所述超声提取的时间优选为5～15min。在本发明的某些实施例中，所述超声提取的时间为5min。所述超声提取完成后，离心分离上清液，然后，优选继续加入乙醇，进行超声提取和离心，共反复3次。所述超声提取优选在超声波清洗器中进行。所述离心优选在离心机中进行。
所述干燥的温度优选为40～50℃；所述干燥的时间优选为0.5～2h。
所述预处理后，将所述经过预处理的用于测定总木糖的样品与内标物质的溶液混合，得到第一混合液。
在本发明中，所述内标物质与上文所述的内标物质相同。优选为甘露糖或D-盐酸氨基葡萄糖。所述内标物质的溶液与上文所述的内标物质的溶液相同，优选按照以下方法进行制备：
将内标物质与水混合，得到浓度为1.0～3.0mg/mL的内标物质的溶液。在本发明的某些实施例中，所述内标物质的溶液的浓度为2.5mg/mL。
所述内标物质的溶液与所述用于测定总木糖的样品的用量比优选为0.5～2.0mL：0.5～6.0mg。在本发明的某些实施例中，所述内标物质的溶液与所述用于测定总木糖的样品的用量比为1mL：2.5mg或2mL：5mg。
将所述经过预处理的用于测定总木糖的样品与内标物质的溶液混合优选的，具体为：将所述经过预处理的用于测定总木糖的样品与内标物质的溶液置于容量瓶中，用水稀释至刻度，得到第一混合液。在本发明的某些实施例中，所述容量瓶的规格为25mL。
得到第一混合液后，取部分所述第一混合液进行水解，得到第二混合液。部分所述第一混合液与所述第一混合液的体积比优选为0.5～2：25。在本发明的某些实施例中，部分所述第一混合液与所述第一混合液的体积比为1：25。
所述水解优选的具体为：
加入浓度为2～6mol/L的酸溶液，在80～150℃下水解1～3h，冷却后，用浓度为2～6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至中性；
所述酸溶液为盐酸或三氟乙酸。
然后，将所述第二混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量。
所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度优选为0.3～1.0mol/L。在本发明的某些实施例中，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.5mol/L。
所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。在本发明的某些实施例中，所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.3mol/L。
所述第二混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液的体积比优选为1：1：1。更优选的，所述第二混合液的体积为200～500μL，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的体积为200～500μL，所述氢氧化钠的水溶液的体积为200～500μL。在本发明的某些实施例中，所述第二混合液的体积为400μL，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的体积为400μL，所述氢氧化钠的水溶液的体积为400μL。
所述反应的温度为50～100℃。在本发明的某些实施例中，所述反应的温度为70℃。所述反应的时间为60～120min。在本发明的某些实施例中，所述反应的时间为100min。
所述反应完成后，优选将得到的反应溶液与盐酸混匀，用三氯甲烷洗涤，得到的水层离心，取上清液，过孔径为0.22～0.45μm的有机滤膜，再采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量。本发明对所述有机滤膜的来源没有特殊限制，为一般市售品即可。
本发明采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测时，优选采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相，以0.02mol/L的乙酸铵溶液为流动相B相；所述流动相A相与所述流动相B相的体积比为10～20：80～90。在本发明的某些实施例中，所述流动相A相与所述流动相B相的体积比为17：83。
所述带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测的柱温优选为25～35℃。在本发明的某些实施例中，所述检测的柱温为30℃。所述检测的波长优选为240nm～300nm。在本发明的某些实施例中，所述检测的波长为250nm。所述检测的流动相流速优选为0.8～1.2mL/min。在本发明的某些实施例中，所述检测的流动相流速为1.0mL/min。所述检测的进样量优选为2～20μL。在本发明的某些实施例中，所述检测的进样量为5μL。
所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的含量按照下述方法进行检测：
取低聚木糖待测样品的另一部分，作为用于测定游离木糖的样品，质量记为a2，将所述用于测定游离木糖的样品进行预处理后，与内标物质的溶液混合，得到第三混合液；
将所述第三混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的含量。
所述预处理同上文所述的预处理方法，具体的，优选为：
将所述用于测定游离木糖的样品与乙醇混合，超声提取，离心，取上清液，干燥，加水溶解。
在本发明中，所述乙醇的体积浓度优选为80％。所述用于测定游离木糖的样品与乙醇的用量比优选为10～30mg：10～30mL。在本发明的某些实施例中，所述用于测定游离木糖的样品与乙醇的用量比为25mg：25mL。
所述超声提取的时间优选为5～15min。在本发明的某些实施例中，所述超声提取的时间为5min。所述超声提取完成后，离心分离上清液，然后，优选继续加入乙醇，进行超声提取和离心，共反复3次。
所述干燥的温度优选为40～50℃；所述干燥的时间优选为0.5～2h。
所述预处理后，将所述经过预处理的用于测定游离木糖的样品与内标物质的溶液混合，得到第三混合液。
在本发明中，所述内标物质与上文所述的内标物质相同。优选为甘露糖或D-盐酸氨基葡萄糖。所述内标物质的溶液与上文所述的内标物质的溶液相同，优选按照以下方法进行制备：
将内标物质与水混合，得到浓度为1.0～3.0mg/mL的内标物质的溶液。在本发明的某些实施例中，所述内标物质的溶液的浓度为2.5mg/mL。
所述内标物质的溶液与所述用于测定游离木糖的样品的用量比优选为0.5～2.0mL：0.5～6.0mg。在本发明的某些实施例中，所述内标物质的溶液与所述用于测定总木糖的样品的用量比为1mL：2.5mg或2mL：5mg。
将所述经过预处理的用于测定游离木糖的样品与内标物质的溶液混合优选的，具体为：将所述经过预处理的用于测定游离木糖的样品与内标物质的溶液置于容量瓶中，用水稀释至刻度，得到第三混合液。在本发明的某些实施例中，所述容量瓶的规格为25mL。
然后，将所述第三混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量。
所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度优选为0.3～1.0mol/L。在本发明的某些实施例中，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.5mol/L。
所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。在本发明的某些实施例中，所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.3mol/L。
所述第三混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液的体积比优选为1：1：1。更优选的，所述第三混合液的体积为200～500μL，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的体积为200～500μL，所述氢氧化钠的水溶液的体积为200～500μL。在本发明的某些实施例中，所述第三混合液的体积为400μL，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的体积为400μL，所述氢氧化钠的水溶液的体积为400μL。
所述反应的温度为50～100℃。在本发明的某些实施例中，所述反应的温度为70℃。所述反应的时间为60～120min。在本发明的某些实施例中，所述反应的时间为100min。
所述反应完成后，优选将得到的反应溶液与盐酸混匀，用三氯甲烷洗涤，得到的水层离心，取上清液，过孔径为0.22～0.45μm的有机滤膜，再采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的含量。本发明对所述有机滤膜的来源没有特殊限制，为一般市售品即可。
本发明采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测时，优选采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相，以0.02mol/L的乙酸铵溶液为流动相B相；所述流动相A相与所述流动相B相的体积比为10～20：80～90。在本发明的某些实施例中，所述流动相A相与所述流动相B相的体积比为17：83。
所述带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测的柱温优选为25～35℃。在本发明的某些实施例中，所述检测的柱温为30℃。所述检测的波长优选为240nm～300nm。在本发明的某些实施例中，所述检测的波长为250nm。所述检测的流动相流速优选为0.8～1.2mL/min。在本发明的某些实施例中，所述检测的流动相流速为1.0mL/min。所述检测的进样量优选为2～20μL。在本发明的某些实施例中，所述检测的进样量为5μL。
通过获取低聚木糖待测样品中的总木糖的含量以及游离木糖的含量，从而取两者的差值，得到低聚木糖待测样品中的低聚木糖的含量。
本发明对上述所采用的原料的来源并无特殊的限制，可以为一般市售。
试剂：木糖标准品(纯度≥99.9％，来源：中国食品药品检定院)、D-甘露糖标准品(纯度≥99.4％，来源：中国食品药品检定院)。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种低聚木糖含量的检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
比较例1
1.试剂：
4mol/L硫酸：称取40.00g 98％硫酸，用水稀释至100mL；
40％氢氧化钠：取40.0g氢氧化钠，加入100mL水溶解即可；
无水乙醇：分析纯；
乙腈：色谱级；
0.45μm水相过滤膜。
2.仪器及色谱条件：
2.1仪器：
高压液相系统：2515高压泵(也可用515高压泵)、7725进样阀、柱温箱、2414示差折光检测器、色谱工作站；
电吹风。
2.2色谱条件：
色谱柱：waters氨基键合柱4.6×250mm或同等柱效检测柱；
流动相：乙腈：水＝80：20；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
示差检测器温度：35℃；
进样量：20.0μL。
3.样品处理：
3.1将低聚木糖原料于研钵中研细；
3.2精密称取1.0～1.5g低聚木糖质量含量为70％的原料于50mL小烧杯中，加10.0mL水溶解样品并转入50mL容量瓶中，再加水5.0mL洗涤烧杯并全部转入容量瓶中，最后用无水乙醇定容至刻度，摇匀，以4000r/min离心10min，取上清液25mL于小烧杯中，用电吹风(不大于50℃)吹赶尽乙醇，用水溶解，再转入25mL容量瓶中并定容至刻度。用0.45um的水相过滤膜过滤，上机测定。此滤液为样品水解前上机测定溶液，滤液的体积记为V1。
3.3取步骤3.2得到的滤液10.0mL于水解管中，加入4mol/L硫酸1.8mL，摇匀，于100℃水解2小时，取出冷却至室温。用40％NaOH中和(PH值5-7)，加水定容至25.0mL的容量瓶中，摇匀，取上清液2mL，用无水乙醇定容至10.0mL刻度，摇匀，过滤，取上清液8.0mL于小烧杯中，电吹风吹干；加2.0mL水溶解，用0.45μm水相膜过滤，上机测定。该滤液为样品水解后上机测定溶液，，滤液的体积记为V2。
4.测定：样品的体积V1＝50mL；V2＝156.25mL。
5.样品标准溶液：取纯度99.0％木糖0.1mg于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制定2.0mg/mL木糖标准品溶液，备用。
6.计算
X＝M2-M1 (1)；
其中，M1(g/100g，以木糖计)＝Aspl1/Astd×Cstd×V1×10-3/W1×100
M2(g/100g，以木糖计)＝Aspl2/Astd×Cstd×V2×10-3/W2×100
X：样品中低聚木糖含量(以木糖计)g/100g；
M1：样品水解前低聚木糖含量(g/100g)；
M2：样品水解后低聚木糖含量(g/100g)；
Aspl1：水解前样品中木糖组分峰面积；
Aspl2：水解后样品中木糖组分峰面积；
Astd：木糖标样组分峰面积；
Cstd：木糖标样组分浓度(mg/mL)；
V1：水解前样品总体积(mL)；
V2：水解后样品总体积(mL)；
W1：水解前样品重量，(g)
W2：水解后样品重量，(g)
实验结果表明，使用示差折射光检测器进行检测，测定低聚木糖待测样品中的低聚木糖的质量含量为75.3％。
本比较例给出了所述低聚木糖待测样品中低聚木糖的峰面积的检测图谱，如图1所示。图1为比较例1中所述低聚木糖待测样品中低聚木糖的峰面积的检测图谱。从图1中可以看出，示差检测器下木糖的峰型拖尾，样品分离度低。
实施例1
a、内标物质的溶液配制
取甘露糖适量，精密称定，加水制成浓度为2.5mg/mL的溶液，作为内标物质的溶液。
b、木糖标准样的溶液配制
取木糖2.5mg于25mL容量瓶中，精密加入内标物质的溶液1mL，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。
吸取上述木糖标准样的溶液400μL、0.5mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液400μL和0.3mol/L的氢氧化钠溶液400μL，混匀，70℃水浴反应100min。再加0.3mol/L的盐酸溶液500μL，混匀，用三氯甲烷洗涤5次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，过0.45μm滤膜，注入带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，得到木糖标准样的图谱。
c、样品处理
称取低聚木糖质量含量为70％的原料5g，溶于50mL水中，装入10cm截留分子量为1000的透析袋中，将透析袋放入1000mL烧杯中，加入水，完全覆盖透析袋为准，分别于3h、6h、15h更换一次透析袋外液，收集合并透析袋外液并浓缩干燥，备用。
称取上述干燥样品5mg，记为m1，精密称定，为测定总木糖的样品，加入25mL80％乙醇超声5min，反复3次，合并上清液，低于50℃挥干，残渣加水溶解，再加入2mL内标溶液，定容至25mL，得到第一溶液。取1mL第一溶液加0.5mL 3moL/L盐酸，水解1h后，冷却至室温，加入0.5mL 3moL/L氢氧化钠，混合均匀后，得到第二溶液，备用。
再称取上述干燥样品10mg，记为m2，精密称定，为测定游离木糖的样品，加入25mL80％乙醇超声5min，反复3次，合并上清液，低于50℃挥干，残渣加水溶解，再加入2mL内标溶液，定容至25mL，得到第三溶液，备用。
d、吸取上述第二溶液400μL、0.5mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液400μL和0.3mol/L的氢氧化钠溶液400μL，混匀，70℃水浴反应100min。再加0.3mol/L的盐酸溶液500μL，混匀，用三氯甲烷洗涤5次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，过0.45μm滤膜，注入带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的峰面积；
吸取上述第三溶液400μL、0.5mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液400μL和0.3mol/L的氢氧化钠溶液400μL，混匀，70℃水浴反应100min。再加0.3mol/L的盐酸溶液500μL，混匀，用三氯甲烷洗涤5次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，过0.45μm滤膜，注入带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，获得所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的峰面积。
液相色谱检测条件：
仪器：戴安Ultimate 3000液相色谱仪(带紫外检测器)；
色谱柱：ACE C18(4.6×250mm，5μm)；
流动相：乙腈-0.02mol/L的乙酸铵溶液(17：83)；
柱温：30℃；
波长：250nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：5μL。
计算公式：
式(2)中，As为内标物质的峰面积；
AR为木糖标准样的峰面积；
cs为内标物质的溶液的浓度；
cR为木糖标准样的溶液的浓度。
式(3)中，X1为所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量，g/100g；
Ax1为用于测定总木糖的样品的峰面积；
As′为内标物质的峰面积；
cs′为内标物质的溶液的浓度，mg/mL；
f为内标法校正因子；
V1为稀释得到第一混合液的稀释倍数；
m1为用于测定总木糖的样品的质量，mg。
式(4)中，X2为所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的含量，g/100g；
Ax2为用于测定游离木糖的样品的峰面积；
As′为内标物质的峰面积；
cs′为内标物质的溶液的浓度，mg/mL；
f为内标法校正因子；
V2为稀释得到第三混合液的稀释倍数；
m2为用于测定游离木糖的样品的质量，mg。
X＝X1-X2 (5)；
式(5)中，X为低聚木糖待测样品中的低聚木糖的含量，g/100g。
按照上述步骤测定，得到的低聚木糖待测样品中的低聚木糖的质量含量为74.9％。
本实施例给出了所述低聚木糖待测样品中木糖的峰面积的检测图谱，如图2所示。图2为实施例1中所述低聚木糖待测样品中低聚木糖的峰面积的检测图谱。从图2中可以看出，本发明提供的检测方法峰型较好，分离度高。
由实验结果可知：示差检测器和本发明方法同时进行质量含量为70％的低聚木糖原料的检测，两种方法含量相差不大，但示差检测器下木糖的峰型拖尾，样品分离度低，本发明提供的检测方法峰型较好，分离度高。
进行线性关系实验：
配制上述内标液浓度为0.5mg/mL，配制木糖标准样的溶液浓度为1mg/mL，分别吸取0.1mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL、1mL，每个浓度标准样液均加入1mL内标，定容至5mL，标准曲线的浓度分别为0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL，内标的浓度为0.1mg/mL，以标准样液与内标的浓度比为横坐标，标准样液与内标的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线表明，y＝1.1496x+0.0086，r＝0.9994线性关系良好。
进行重复性实验：
重复性实验分别称取6个样品，平行处理，进样分析，结果：RSD＝1.56％，证明此方法重复性良好。
进行加样回收实验：
分别称取6个样品，平行处理，与上述重复性试验不同的是：步骤d中，原400μL的第二溶液由200μL的第二溶液和200μL的木糖标样溶液的混合溶液代替。结果：回收率均在99％～102％之间，RSD＝1.23％，证明此方法的回收率良好。
进行耐用性实验：
分别考察不同流速(0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min)、不同柱温(25℃、30℃、35℃)下样品的含量变化，结果：RSD分别为0.79％、0.17％、0.57％，证明此方法耐用性较好。
实施例2
考察一种保健食品青青胶囊(以库拉索芦荟全叶冻干粉、低聚木糖、聚葡萄糖为主要原料)中低聚木糖的含量测定，分别取该保健食品中试样品三批，按照下述方法进行测定：
a、内标物质的溶液配制
取D-盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，加水制成浓度为2.5mg/mL的溶液，作为内标物质的溶液。
b、木糖标准样的溶液配制
取木糖2.5mg于25mL容量瓶中，精密加入内标物质的溶液1mL，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；
吸取上述木糖标准样的溶液400μL、0.5mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液400μL和0.3mol/L的氢氧化钠溶液400μL，混匀，70℃水浴反应100min。再加0.3mol/L的盐酸溶液500μL，混匀，用三氯甲烷洗涤5次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，过0.45μm滤膜，注入带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，得到木糖标准样的图谱。
c、样品处理
称取三批样品各5g，将其中的一批溶于50mL水中，装入10cm截留分子量为1000的透析袋中，将透析袋放入1000mL烧杯中，加入水，完全覆盖透析袋为准，分别于3h、6h、15h更换一次透析袋外液，收集合并透析袋外液并浓缩干燥，备用。其他的两批同上述的处理方法。
称取上述其中一批的干燥样品20～25mg，记为m1，精密称定，为测定总木糖的样品，加入25mL80％乙醇超声5min，反复3次，合并上清液，低于50℃挥干，残渣加水溶解，再加入2mL内标溶液，定容至25mL，得到第一溶液。取1mL第一溶液加0.5mL3moL/L盐酸，水解1h后，冷却至室温，加入0.5mL3moL/L氢氧化钠，混合均匀后，得到第二溶液，备用。
再称取上述所提到的其中一批的干燥样品60mg，记为m2，精密称定，为测定游离木糖的样品，加入25mL80％乙醇超声5min，反复3次，合并上清液，低于50℃挥干，残渣加水溶解，再加入2mL内标溶液，定容至25mL，得到第三溶液，备用。
d、吸取上述第二溶液400μL、0.5mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液400μL和0.3mol/L的氢氧化钠溶液400μL，混匀，70℃水浴反应100min。再加0.3mol/L的盐酸溶液500μL，混匀，用三氯甲烷洗涤5次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，过0.45μm滤膜，注入带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的峰面积；
吸取上述第三溶液400μL、0.5mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液400μL和0.3mol/L的氢氧化钠溶液400μL，混匀，70℃水浴反应100min。再加0.3mol/L的盐酸溶液500μL，混匀，用三氯甲烷洗涤5次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，过0.45μm滤膜，注入带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，获得所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的峰面积。
液相色谱检测条件：
仪器：戴安Ultimate 3000液相色谱仪(带紫外检测器)；
色谱柱：ACE C18(4.6×250mm，5μm)；
流动相：乙腈-0.02mol/L的乙酸铵溶液(17：83)；
柱温：30℃；
波长：250nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：5μL。
计算公式：
式(2)中，As为内标物质的峰面积；
AR为木糖标准样的峰面积；
cs为内标物质的溶液的浓度；
cR为木糖标准样的溶液的浓度。
式(3)中，X1为所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量，g/100g；
Ax1为用于测定总木糖的样品的峰面积；
As′为内标物质的峰面积；
cs′为内标物质的溶液的浓度，mg/mL；
f为内标法校正因子；
V1为稀释得到第一混合液的稀释倍数；
m1为用于测定总木糖的样品的质量，mg。
式(4)中，X2为所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的含量，g/100g；
Ax2为用于测定游离木糖的样品的峰面积；
As′为内标物质的峰面积；
cs′为内标物质的溶液的浓度，mg/mL；
f为内标法校正因子；
V2为稀释得到第三混合液的稀释倍数；
m2为用于测定游离木糖的样品的质量，mg。
X＝X1-X2 (5)；
式(5)中，X为低聚木糖待测样品中的低聚木糖的含量，g/100g。
按照上述步骤测定，得到的低聚木糖待测样品中的低聚木糖的质量含量为23.7％。其他的两批同上述的处理方法。其他两批得到的低聚木糖待测样品中的低聚木糖的质量含量为23.2％、23.2％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种低聚木糖含量的检测方法，包括：
A)将木糖标准样的溶液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，得到木糖标准样的图谱；
B)取低聚木糖待测样品的一部分，作为用于测定总木糖的样品，质量记为a1，将所述用于测定总木糖的样品进行预处理后，与内标物质的溶液混合，得到第一混合液；取部分所述第一混合液进行水解，得到第二混合液；
将所述第二混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量；
C)取低聚木糖待测样品的另一部分，作为用于测定游离木糖的样品，质量记为a2，将所述用于测定游离木糖的样品进行预处理后，与内标物质的溶液混合，得到第三混合液；
将所述第三混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液在50～100℃下反应60～120min后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，获得所述低聚木糖待测样品中的游离木糖的含量；
所述低聚木糖待测样品的总质量记为a，所述a1+a2≤a；
所述步骤B)和步骤C)并无顺序限制；
D)取所述低聚木糖待测样品中的总木糖的含量与游离木糖的含量的差值，即为低聚木糖待测样品中的低聚木糖的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)中，所述内标物质为甘露糖或D-盐酸氨基葡萄糖；
步骤C)中，所述内标物质为甘露糖或D-盐酸氨基葡萄糖。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)中，所述内标物质的溶液的浓度为1.0～3.0mg/mL，所述内标物质的溶液与所述用于测定总木糖的样品的用量比为0.5～2mL：0.5～6mg；
步骤C)中，所述内标物质的溶液的浓度为1.0～3.0mg/mL，所述内标物质的溶液与所述用于测定游离木糖的样品的用量比为0.5～2mL：0.5～6mg。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)中，所述水解具体为：
加入浓度为2～6mol/L的酸溶液，在80～150℃下水解1～3h，冷却后，用浓度为2～6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至中性；
所述酸溶液为盐酸或三氟乙酸。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)、步骤B)和步骤C)中的带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测的色谱条件相同，具体为：
采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A相，以0.02mol/L的乙酸铵溶液为流动相B相；
所述流动相A相与所述流动相B相的体积比为10～20：80～90。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)、步骤B)和步骤C)中的带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测的柱温相同，为25～35℃。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)、步骤B)和步骤C)中的带有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测的波长相同，为240～300nm。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)中，所述木糖标准样的溶液的浓度为0.05～2.0mg/mL；所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.3～1.0mol/L；所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L；
所述木糖标准样的溶液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液的体积比为1：1：1；
步骤B)中，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.3～1.0mol/L；所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L；
所述第二混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液的体积比为1：1：1；
步骤C)中，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.3～1.0mol/L；所述氢氧化钠的水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L；
所述第三混合液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和氢氧化钠的水溶液的体积比为1：1：1。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)中，所述低聚木糖待测样品为经过透析的低聚木糖待测样品；
步骤C)中，所述低聚木糖待测样品为经过透析的低聚木糖待测样品。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)中，所述预处理具体为：
将所述用于测定总木糖的样品与乙醇混合，超声提取，离心，取上清液，干燥，加水溶解；
步骤C)中，所述预处理具体为：
将所述用于测定游离木糖的样品与乙醇混合，超声提取，离心，取上清液，干燥，加水溶解。
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|---|---|---|---|
| CN201810179024.6A CN108344819A (zh) | 2018-03-05 | 2018-03-05 | 一种低聚木糖含量的检测方法 |
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