CN106191157B - 一种低聚乳果糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低聚乳果糖的制备方法。步骤如下：(1)将节杆菌发酵液接种于蔗糖与乳糖的混合溶液，反应后，制得低聚乳果糖粗液；所述节杆菌为节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY‑004，保藏号CGMCC No.12855；(2)将低聚乳果糖粗液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩、干燥制得低聚乳果糖。本发明利用节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY‑004发酵液生产低聚乳果糖，该菌种所产生的果糖转移基酶的活性较传统节杆菌所产酶活性提高50％以上，大大提高了蔗糖转化成低聚乳果糖的能力，同时采用流加蔗糖的方法，使终产品中低聚乳果糖含量达到98％，显著优于现有制备获得的产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种低聚乳果糖的制备方法，属于生物技术技术领域。
背景技术
低聚乳果糖是一种功能性低聚糖，具有促进肠道双歧杆菌增殖，调节肠道微生态，改善肠道免疫力等特殊生理功能，甜度为蔗糖的30％，甜味特性类似于蔗糖，甜味质量是各种低聚糖中最佳的，因此可以应用于食品工业中而不必担心其对产品风味产生影响。商业化生产的低聚乳果糖，由于含有蔗糖、乳糖等其他成分，因而甜度要略高一些。与其它低聚糖相比，低聚乳果糖对酸、热具有较高的稳定性，其稳定性与蔗糖相似，在中性条件下稳定，在酸性条件下相对更稳定，pH 7.0下80℃加热2h和pH 3.0下80℃加热2h，都几乎不发生分解，在pH 4.5的条件下，其加热温度甚至可达到120℃。低聚乳果糖还具有高的保湿性，能使食品保持湿润，可防止面包、点心等淀粉类食品老化，延长食品货架期。
2005年调查表明，低聚乳果糖已成为日本第三大功能性低聚糖消费品。近年来许多研究者发现低聚乳果糖具有许多特定的生理功能，有望成为继低聚果糖、低聚半乳糖后又一种被全球认可的功能性食品添加剂。
酶法合成是工业化生产低聚乳果糖的主要途径，酶法合成低聚乳果糖的产率低一直是制约酶法合成发展的重要难题，因此如何提高酶法合成产率和低聚乳果糖的纯度是亟待解决的问题。
如中国专利文献CN104073456A(申请号201410327028.6)公开了一株氯酚节杆菌(Arthrobacter chlorophenolicus)SK33.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013387。以此节杆菌为出发菌株，以蔗糖、乳糖为碳源，与氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵生产果聚糖蔗糖酶。发酵培养基以蔗糖、乳糖为主要碳源，以蛋白胨为主要氮源，发酵后经检测，在发酵液中果聚糖蔗糖酶酶活达2～200U/mL。将果聚糖蔗糖酶加到20％～60％的蔗糖、乳糖溶液中生产低聚乳果糖，转化3～36h，转化率达到35％以上。
中国专利文献CN104480164A(申请号201410726466.X)公开了一种酶法生产乳果低聚糖，包括以下步骤：将氯酚节杆菌SK33.001接入种子培养基中，于30℃下培养12h；种子液接种量为1％，发酵培养基中发酵0.8～2h生产果聚糖蔗糖酶；向质量浓度分别为27％的蔗糖、乳糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶及50mg/L Zn2+催化转化得到含有低聚乳果糖的酶反应液；脱色；浓缩，即得低聚乳果糖糖浆。
由于上述技术方案均采用氯酚节杆菌SK33.001作为酶法的酶来源，由于其酶的局限性导致产率和低聚乳果糖的纯度较低，无法满足实际需求。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种高纯度低聚乳果糖的制备方法。
本发明技术方案如下：
一种低聚乳果糖的制备方法，步骤如下：
(1)将节杆菌发酵液接种于蔗糖与乳糖的混合溶液，在50～60℃条件下，反应10～14小时，然后向反应液中流加蔗糖溶液，维持反应液中蔗糖质量浓度为30％～40％，继续反应12～24h，停止反应，制得低聚乳果糖粗液；
所述节杆菌为节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，该菌株已于2016年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.12855；
(2)将步骤(1)制得的低聚乳果糖粗液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩、干燥制得低聚乳果糖。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，蔗糖与乳糖的混合溶液的溶质质量浓度为20％～60％，蔗糖与乳糖的质量比为(1.2～1.5):1，pH 4～6。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，蔗糖溶液的质量浓度为35～45％；进一步优选的，蔗糖溶液的质量浓度为40％。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，节杆菌发酵液制备方法如下：
I、将节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接种于种子培养基中，在28～35℃的条件下，增殖培养24～48h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
葡萄糖1～2％，酵母膏0.5～1.5％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，磷酸氢二铵0.3～0.6％，七水硫酸镁0.01～0.05％，余量水，pH6.0～7.2；
II、将步骤I制得的种子液按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在28～35℃发酵培养36～60h，制得节杆菌发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖2～4％，乳糖0.5～1％，酵母膏0.5～1.2％，蛋白胨0.4～0.8％，七水硫酸镁0.05～0.1％，磷酸氢二铵0.1～0.4％，余量水，pH 6.0～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中节杆菌发酵液的接种量为混合溶液体积百分比的5％。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，脱色步骤如下：将步骤(1)制得的低聚乳果糖粗液，按质量百分比0.25～1％的比例加入活性炭，80～85℃搅拌30～40min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，过滤采用板框过滤，过滤压力0.2～0.4Mpa，水流量5.0～6.0t/h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，离交为采用连续离子交换系统处理料液，离交后料液透光率≥98％。处理后的料液清澈透明，无异味。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，色谱分离步骤为：
色谱运行压力0.20～0.30MPa，温度60～70℃，水耗比1:1.3～1:1.6，每小时进料1.5～2.0m3，收集低聚乳果糖。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，浓缩为浓缩至原体积的60～65％。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，干燥为喷雾干燥，步骤如下：
浓缩后的液体进入到干燥塔中，进风温度130～150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体。
有益效果
1、本发明以从土壤中筛选获得具有高β-呋喃果糖苷酶活性的节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，并利用其发酵液生产低聚乳果糖，该菌种所产生的果糖转移基酶的活性较传统节杆菌所产酶活性提高50％以上，大大提高了蔗糖转化成低聚乳果糖的能力，同时采用流加蔗糖的方法，使终产品中低聚乳果糖含量达到98％，显著优于现有制备获得的产品；
2、本发明采用节杆菌发酵液直接生产，省去了提取酶的过程，使生产成本大大降低，较传统生产方法降低成本达20％左右，使产品的竞争力大大增强；
3、本发明采用色谱分离与喷雾干燥方法生产固体低聚乳果糖产品，较传统结晶方法省时省力，可节约成本20％左右；
4、本发明产品乳果糖作为低热量甜味剂对酸、热具有较高的稳定性，可广泛应用于食品饮料、化妆品、医药等领域，提高产品附加值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
一株节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，2016年8月16日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号保藏号CGMCC No.12855；
本发明所述节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的原始菌株分离于山东德州百龙创园生产车间附近的土壤，并经过诱变后获得，具体分离过程如下：
(1)富集培养
选取山东德州百龙创园生产车间附近的土壤，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土壤约10g，用无菌水稀释10倍，加入培养基进行富集培养，培养基成分：葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，pH为6.5；培养温度为30℃，培养36h。
(2)纯种分离
采用划线分离法，取一支盛有5ml无菌水的大试管，取步骤(1)中富集培养后的菌液2ml放入其中稀释，充分振荡分散，用接种环以无菌操作挑取稀释液一环先在平板培养基一边做第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约60度角，将接种环上剩余物烧掉，待冷却后同一次划线方法做第二次划线，同法依次做第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，将培养皿倒置，30℃培养36h后，挑取单个菌落接种于10个斜面培养基上，分别编号01-10。
将01-10斜面种子接种于摇瓶培养基中培养32℃培养36h，对01-10摇瓶发酵液β-呋喃果糖苷酶酶活进行测定，04号摇瓶酶活最高，达到505U/ml。
平板培养基成分：葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，琼脂2％，pH为pH6.5。
摇瓶培养基成分：蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸镁0.1％，磷酸氢二铵0.4％，pH6.5。
(3)诱变筛选
对04号菌种进行紫外线诱变，紫外线诱变采用15W紫外线灯20cm照射，照射时间为150s，最终得到高产β-呋喃果糖苷酶的高产菌株命名为BLCY-004，其酶活达到1100U/ml。
酶活定义如下：在pH 6.0，40℃以蔗糖作为底物进行反应时，每分钟使还原能力增加相当于2μmol的D-葡萄糖的量的酶量定于为1个活力单位(U)。
生态学形态
菌株呈乳白色，半透明状，尺寸约2～4μm×1.8～3.5μm。革兰氏染色呈阳性，短杆状，单个或成对排列，培养周期中伴随着杆状、球状形态的变化。
实施例2
一种低聚乳果糖的制备方法，步骤如下：
(1)配制质量浓度为20％的蔗糖与乳糖的混合溶液，蔗糖与乳糖的添加比为1.2:1；调节混合溶液的pH至4，按混合液体积5％的比例接种节杆菌发酵液，在50℃条件下，反应12小时，然后向反应液中流加质量浓度为40％的蔗糖溶液，维持反应液中蔗糖质量浓度为30％，继续反应12h后停止反应，制得低聚乳果糖粗液；
(2)将步骤(1)制得的低聚乳果糖粗液按质量百分比0.5％的比例加入活性炭，80℃搅拌40min；然后经板框过滤，过滤压力0.4Mpa，水流量6.0t/h；采用连续离子交换系统处理料液，离交后料液透光率≥98％；经色谱分离，色谱运行压力0.30MPa，温度60℃，水耗比1:1.6，每小时进料2.0m3，收集低聚乳果糖；然后经六效蒸发器浓缩，浓缩至原体积的60％；浓缩后的液体进入到干燥塔中，进风温度140℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体制得低聚乳果糖。
所述步骤(2)中的节杆菌发酵液按如下方法制备：
I、将节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接种于种子培养基中，在28℃的条件下，增殖培养24h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，余量水，pH6.0；
II、将步骤I制得的种子液按体积比1％的比例接种于发酵培养基中，在28℃发酵培养36h，制得节杆菌发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸镁0.1％，磷酸氢二铵0.4％，余量水，pH 6.0；
经检测，制得的低聚乳果糖纯度达到98.2％，转化率为55.2％，可应用于健康食品、饮料、乳品、保健品、医药等领域。
实施例3
一种低聚乳果糖的制备方法，步骤如下：
(1)配制质量浓度为40％的蔗糖与乳糖的混合溶液，蔗糖与乳糖的添加比为1.3:1；调节混合溶液的pH至5，按混合液体积5％的比例接种节杆菌发酵液，在55℃条件下，反应12小时，然后向反应液中流加质量浓度为40％的蔗糖溶液，维持反应液中蔗糖质量浓度为35％，继续反应18h后停止反应，制得低聚乳果糖粗液；
(2)将步骤(1)制得的低聚乳果糖粗液按质量百分比0.25％的比例加入活性炭，80℃搅拌40min；然后经板框过滤，过滤压力0.2Mpa，水流量5.0t/h；采用连续离子交换系统处理料液，离交后料液透光率≥98％；然后经六效蒸发器浓缩，浓缩至原体积的65％；经色谱分离，色谱运行压力0.20MPa，温度70℃，水耗比1:1.3，每小时进料1.5m3，收集低聚乳果糖；浓缩后的液体进入到干燥塔中，进风温度140℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体制得低聚乳果糖。
所述步骤(2)中的节杆菌发酵液按如下方法制备：
I、将节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接种于种子培养基中，在28℃的条件下，增殖培养24h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，余量水，pH6.0；
II、将步骤I制得的种子液按体积比1％的比例接种于发酵培养基中，在28℃发酵培养36h，制得节杆菌发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸镁0.1％，磷酸氢二铵0.4％，余量水，pH 6.0；
经检测，制得的低聚乳果糖纯度达到98.5％，转化率为56.3％，可应用于健康食品、饮料、乳品、保健品、医药等领域。
实施例4
一种低聚乳果糖的制备方法，步骤如下：
(1)配制质量浓度为60％的蔗糖与乳糖的混合溶液，蔗糖与乳糖的添加比为1.5:1；调节混合溶液的pH至6，按混合液体积5％的比例接种节杆菌发酵液，在60℃条件下，反应12小时，然后向反应液中流加质量浓度为40％的蔗糖溶液，维持反应液中蔗糖质量浓度为40％，继续反应24h后停止反应，制得低聚乳果糖粗液；
(2)将步骤(1)制得的低聚乳果糖粗液按质量百分比1％的比例加入活性炭，85℃搅拌30min；然后经板框过滤，过滤压力0.3Mpa，水流量5.5t/h；采用连续离子交换系统处理料液，离交后料液透光率≥98％；然后经六效蒸发器浓缩，浓缩至原体积的63％；经色谱分离，色谱运行压力0.25MPa，温度65℃，水耗比1:1.4，每小时进料1.6m3，收集低聚乳果糖；浓缩后的液体进入到干燥塔中，进风温度140℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体制得低聚乳果糖。
所述步骤(2)中的节杆菌发酵液按如下方法制备：
I、将节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接种于种子培养基中，在35℃的条件下，增殖培养48h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，余量水，pH6.0；
II、将步骤I制得的种子液按体积比10％的比例接种于发酵培养基中，在35℃发酵培养60h，制得节杆菌发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸镁0.1％，磷酸氢二铵0.4％，余量水，pH 6.0；
经检测，制得的低聚乳果糖纯度达到98.3％，转化率为56.5％，可应用于健康食品、饮料、乳品、保健品、医药等领域。
对比例
如实施例2所述的低聚乳果糖的制备方法，不同之处在于，利用氯酚节杆菌(Arthrobacter chlorophenolicus)SK33.001代替节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004。
经检测，制得的低聚乳果糖纯度达到81.2％，转化率为36.7％。
Claims (11)
1.一种低聚乳果糖的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将节杆菌发酵液接种于蔗糖与乳糖的混合溶液，在50～60℃条件下，反应10～14小时，然后向反应液中流加蔗糖溶液，维持反应液中蔗糖质量浓度为30%～40%，继续反应12～24h，停止反应，制得低聚乳果糖粗液；
所述蔗糖与乳糖的混合溶液的溶质质量浓度为20%～60%，蔗糖与乳糖的质量比为（1.2～1.5）:1，pH 4～6；
所述节杆菌为节杆菌（Arthrobacter sp.）BLCY-004，该菌株已于2016年8月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.12855；
（2）将步骤（1）制得的低聚乳果糖粗液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩、干燥制得低聚乳果糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，流加蔗糖溶液的质量浓度为35～45%。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，流加蔗糖溶液的质量浓度为40%。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，节杆菌发酵液制备方法如下：
I、将节杆菌（Arthrobacter sp.）BLCY-004接种于种子培养基中，在28～35℃的条件下，增殖培养24～48h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
葡萄糖 1～2%，酵母膏 0.5～1.5%，磷酸二氢钾 0.1～0.2%，磷酸氢二铵0.3～0.6%，七水硫酸镁0.01～0.05%，余量水，pH6.0～7.2；
II、将步骤I制得的种子液按体积比1～10%的比例接种于发酵培养基中，在28～35℃发酵培养36～60h，制得节杆菌发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖 2～4%，乳糖0.5～1%，酵母膏0.5～1.2%，蛋白胨0.4～0.8%，七水硫酸镁 0.05～0.1%，磷酸氢二铵 0.1～0.4%，余量水，pH 6.0～7.2。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中节杆菌发酵液的接种量为混合溶液体积百分比的5%。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，脱色步骤如下：将步骤（1）制得的低聚乳果糖粗液，按质量百分比0.25～1%的比例加入活性炭，80～85℃搅拌30～40min。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，过滤采用板框过滤，过滤压力0.2～0.4Mpa，水流量5.0～6.0t/h。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，离交为采用连续离子交换系统处理料液，离交后料液透光率≥98%。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，色谱分离步骤为：
色谱运行压力0.20～0.30MPa，温度60～70℃，水耗比1:1.3～1:1.6，每小时进料1.5～2.0m3，收集低聚乳果糖。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，浓缩为浓缩至原体积的60～65%。
11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，干燥为喷雾干燥，步骤如下：
浓缩后的液体进入到干燥塔中，进风温度130～150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体。
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