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CN106132990A - 抗mcam抗体和相关使用方法 - Google Patents

抗mcam抗体和相关使用方法 Download PDF

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CN106132990A
CN106132990A CN201580013418.9A CN201580013418A CN106132990A CN 106132990 A CN106132990 A CN 106132990A CN 201580013418 A CN201580013418 A CN 201580013418A CN 106132990 A CN106132990 A CN 106132990A
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CN
China
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antibody
seq
mcam
variable region
aminoacid sequence
Prior art date
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Pending
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CN201580013418.9A
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刘跃
P·加里代尔
A·兰格
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Prothena Biosciences Ltd
Original Assignee
Prothena Biosciences Ltd
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52823724&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN106132990(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Prothena Biosciences Ltd filed Critical Prothena Biosciences Ltd
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Abstract

本发明提供抑制人MCAM结合层粘连蛋白α‑4链的能力的抗MCAM抗体。本发明也提供药物组合物和药物制剂、产生此类抗体的方法、以及它们制造用于治疗神经炎性疾病、自体免疫疾病或癌症的药剂的用途。

Description

抗MCAM抗体和相关使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年3月12日提交的美国临时申请号61/952,116、2014年3月13日提交的美国临时申请号61/952,833、2014年7月11日提交的美国临时申请号62/023,724以及2014年10月24日提交的美国临时申请号62/068,419的优先权，以上提及的申请各自出于所有目的整体并入本文。
对序列表、表格或计算机程序列表的引用
“ANTI-MCAM ANTIBODIES AND ASSOCIATED METHODS OF USE”的以于2015年3月4日创建的文件458911SEQLIST.txt写成的序列表是154千字节。这个文件中含有的信息据此以引用的方式并入本文。
背景
称为TH17细胞(T辅助17细胞)的CD4+T细胞子组已牵涉于许多自体免疫疾病的发病机理中，所述疾病特别是涉及T细胞的CNS浸润的那些神经炎症性病状，诸如多发性硬化症和动物模型实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)。已报道TH17细胞分泌许多所选细胞因子，包括IL-17和IL-22。已报道TH17细胞经受特异性组织募集和浸润。已报道MCAM在TH17细胞上表达，并且结合作为配体的层粘连蛋白α-4。
要求保护的发明的概述
本发明提供包含以下的抗体：成熟重链可变区，其包含SEQ ID NO:161的三个Kabat CDR，例外之处是位置32(Kabat编号)可为N、S或Q，并且位置33(Kabat编号)可为G或A，并且其中位置1(Kabat编号)被E占据；和成熟轻链可变区，其包含SEQ ID NO:123的三个Kabat CDR。在一些抗体中，成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少90％同一，并且成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少90％同一。一些此类抗体是人源化抗体。在一些此类抗体中，成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少95％、96％、97％、98％或99％同一，并且成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少98％或99％同一。在一些此类抗体中，成熟重链可变区与SEQ IDNO:161至少95％、96％、97％、98％或99％同一，并且成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少95％、96％、97％、98％或99％同一。在一些此类抗体中，成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:161，并且其中成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少95％同一。在一些此类抗体中，成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少95％同一，并且成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:121、SEQID NO:122或SEQ ID NO:123。在一些此类抗体中，成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ IDNO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:161，并且成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123。在一些此类抗体中，成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:161，并且成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:123。在一些此类抗体中，重链恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:171或172和/或轻链恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:168。
本发明进一步提供在包括氨基酸残基141的表位处结合人MCAM(SEQ ID NO:11)的抗MCAM抗体。在一些抗体中，表位包含氨基酸残基145。在一些抗体中，表位包含人MCAM的至少五个连续氨基酸残基，所述连续氨基酸残基包括氨基酸残基141。在一些此类抗体中，抗体不是选自由以下组成的组的抗体：
(a)具有对应于SEQ ID NO:18的成熟重链可变区和对应于SEQID NO:13的成熟轻链可变区的克隆15；
(b)具有对应于SEQ ID NO:7的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:2的成熟轻链可变区的克隆17；
(c)具有对应于SEQ ID NO:35的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:30的成熟轻链可变区的1174.1.3；；
(d)具有对应于SEQ ID NO:45的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:40的成熟轻链可变区的1414.1.2；
(e)具有对应于SEQ ID NO:55的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:50的成熟轻链可变区的1415.1.1；
(f)具有对应于SEQ ID NO:65的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:60的成熟轻链可变区的1749.1.3；
(g)具有对应于SEQ ID NO:77的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:70的成熟轻链可变区的2120.4.19；
(h)具有对应于SEQ ID NO:89的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:84的成熟轻链可变区的2107.4.10；和
(i)包含大致上来自单克隆抗体1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1、1749.1.3、2120.4.19和2107.4.10的CDR的抗体。在一些此类抗体中，抗体是单克隆抗体。在一些此类抗体中，抗体是嵌合、人源化、镶饰或人抗体。
在一些此类抗体中，抗体不是选自由以下组成的组的抗体：
(a)具有对应于SEQ ID NO:18的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:13的成熟轻链可变区的克隆15；
(b)具有对应于SEQ ID NO:7的成熟重链可变区和对应于SEQID NO:2的成熟轻链可变区的克隆17；
(c)具有对应于SEQ ID NO:35的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:30的成熟轻链可变区的1174.1.3；；
(d)具有对应于SEQ ID NO:45的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:40的成熟轻链可变区的1414.1.2；
(e)具有对应于SEQ ID NO:55的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:50的成熟轻链可变区的1415.1.1；
(f)具有对应于SEQ ID NO:65的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:60的成熟轻链可变区的1749.1.3；
(g)具有对应于SEQ ID NO:77的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:70、71或72的成熟轻链可变区的2120.4.19；
(h)具有对应于SEQ ID NO:89的成熟重链可变区和对应于SEQ ID NO:82或84的成熟轻链可变区的2107.4.10；和
(i)包含大致上来自单克隆抗体1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1、1749.1.3、2120.4.19和2107.4.10的CDR的抗体。在一些此类抗体中，抗体是单克隆抗体。在一些此类抗体中，抗体是嵌合、人源化、镶饰或人抗体。
本发明进一步提供包含任何以上提及的抗体的药物组合物。
本发明进一步提供药物制剂，其包含(a)以约1mg/mL至约100mg/mL范围内的浓度存在的任何本文所述的抗体；(b)以约10mM至约30mM范围内的浓度存在的缓冲剂，诸如组氨酸缓冲剂；(c)以约200mM至约260mM范围内的浓度存在的糖和/或多元醇，诸如蔗糖或海藻糖；和(d)以约0.005重量％至约0.05重量％范围内的浓度存在的表面活性剂，诸如聚山梨醇酯20；其中制剂的特征在于pH在约5.5至约7的范围内。
示例性药物制剂包含(a)任何本文所述的抗体，其中所述抗体以约40mg/mL的浓度存在；(b)以约20mM的浓度存在的组氨酸缓冲剂；(c)以约220mM的浓度存在的蔗糖；(d)以约0.02％的浓度存在的聚山梨醇酯20；和(e)约6.0的pH。
另一示例性药物制剂包含(a)任何本文所述的抗体，其中所述抗体以约40mg/mL的浓度存在；(b)以约20mM的浓度存在的组氨酸缓冲剂；(c)以约220mM的浓度存在的海藻糖；(d)以约0.02％的浓度存在的聚山梨醇酯20；和(e)约6.5的pH。
由本发明提供的一些制剂进一步包含填充剂，是无菌的，和/或在冷冻和解冻时是稳定的。在一些制剂中，在38-42℃下储存至少30天之后和/或在38-42℃下储存至少3个月之后，根据疏水相互作用色谱法，至少65％的抗体显现为单峰。在一些制剂中，在38-42℃下储存至少30天之后和/或在38-42℃下储存至少3个月之后，根据高效尺寸排阻色谱法，聚集蛋白质不超过5重量％。
由本发明提供的抗体制剂可呈冻干制剂形式。举例来说，代表性冻干制剂可包含：(a)任何本文所述的抗体；(b)组氨酸缓冲剂；(c)蔗糖或海藻糖；和(d)聚山梨醇酯20。冻干制剂可包含约10mg至约40mg抗体和在约0.005重量％至约0.05重量％范围内的浓度下的聚山梨醇酯20。在复原之后，冻干制剂可包含约10mM至约30mM组氨酸缓冲剂和约200mM至约260mM蔗糖或海藻糖。在复原之后，冻干制剂产生具有约6至约7之间的pH，诸如pH 6.0或6.5的水溶液。
在复原之后，示例性冻干制剂可包含：(a)任何本文所述的抗体，其以约40mg/mL的浓度存在；(b)以约20mM的浓度存在的组氨酸缓冲剂；(c)以约220mM的浓度存在的蔗糖；(d)以约0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇酯20；和(e)约6.0的pH。这种冻干制剂可包含约200mg抗体、约15.5mg组氨酸、约376mg蔗糖和约1mg聚山梨醇酯20。
在复原之后，另一示例性冻干制剂可包含：(a)任何本文所述的抗体，其以约40mg/mL的浓度存在；(b)以约20mM的浓度存在的组氨酸缓冲剂；(c)以约220mM的浓度存在的海藻糖二水合物；(d)以约0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇酯20；和(e)约6.5的pH。这种冻干制剂可包含约200mg抗体、约15.5mg组氨酸、约416mg海藻糖二水合物和约1mg聚山梨醇酯20。
本发明进一步提供任何以上提及的抗体制造用于治疗炎性病症的药剂的用途，所述炎性病症的特征在于MCAM表达性细胞浸润至体内炎症部位中。这种炎性病症可为特征在于MCAM表达性细胞浸润至CNS中的中枢神经系统(CNS)炎性病症。
本发明进一步提供任何以上提及的抗体制造用于治疗多发性硬化症、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、过敏性接触性皮炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、类肉瘤病、炎性肠病、克罗恩氏病(Crohn’s disease)或癌症(例如实体或血液学肿瘤)(诸如黑素瘤)的药剂的用途。
本发明进一步提供一种治疗特征在于MCAM表达性细胞浸润至炎症部位中的炎性病症的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用有效量的任何以上提及的抗体。在一些方法中，疾病是多发性硬化症、帕金森氏病、过敏性接触性皮炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、类肉瘤病、炎性肠病、克罗恩氏病或癌症(例如实体或血液学肿瘤)，诸如黑素瘤。在一些方法中，MCAM表达性细胞是TH17细胞。在一些方法中，哺乳动物受试者是人。在一些方法中，抗体抑制MCAM结合包含层粘连蛋白α-4链的蛋白质。在一些方法中，哺乳动物受试者是人。在一些方法中，MCAM表达性细胞是TH17细胞。
本发明进一步提供一种包含用于结合抗MCAM单克隆抗体的表位的分离的肽，其中所述肽包含人MCAM(SEQ ID NO:11)的5-50个连续氨基酸残基，所述连续氨基酸残基包括氨基酸残基141。在这些肽中的一些中，肽连接于载体多肽。在这些肽中的一些中，肽与佐剂组合。
本发明进一步提供一种产生抑制人MCAM结合层粘连蛋白α-4链的抗体的方法，其包括：
(a)用上述肽免疫受试者；
(b)从所述受试者分离B细胞，其中所述B细胞分泌抗体；
(c)筛选所述抗体以鉴定抑制人MCAM结合层粘连蛋白α-4链的抗体。在一些方法中，所述方法进一步包括：
(d)使所述B细胞与培养物中的永生化细胞融合以形成单克隆抗体产生性杂交瘤细胞；
(e)培养所述杂交瘤细胞；以及，
(f)从培养物分离单克隆抗体。
附图简述
图1描绘对关键克隆的鉴定。将平均2120.4.19结合值相对于它的平均表面表达值绘图(灰色菱形)。将<30％单克隆抗体反应性和>50％小鼠血清结合的阈值应用于鉴定就抗体结合而言呈阴性，但就表面表达而言呈阳性的克隆(黑色菱形)。
图2A-C.图2A，由带状图表示的人MCAM的同源性模型。图2B描绘人BCAM、人MCAM和小鼠MCAM序列的部分比对，其指示人MCAM的在位置141(I141)和位置145(P145)处的目标残基。图2C描绘带状图，其描绘人MCAM的I141和P145残基的位置和暴露。
图3A和B.图3A显示以下各物的可变重链的序列比对：大鼠2120.4.19抗MCAM抗体(2120.4.19.6_VH_topo_pro；SEQ ID NO:114)；2120VH1人源化抗MCAM抗体(h2120VH1；SEQID NO:115)；2120VH2人源化抗MCAM抗体(h2120VH2；SEQ ID NO:116)；2120VH3人源化抗MCAM抗体(h2120VH3；SEQ ID NO:117)；2120VH4人源化抗MCAM抗体(h2120VH4；SEQ ID NO:118)；2120VH5人源化抗MCAM抗体(h2120VH5；SEQ ID NO:119)；和用作框架供体的重链人可变AF062133IGHV2-26*01序列(AF062133_VH；SEQ ID NO:108)。使用Kabat编号，并且将从大鼠2120.4.19.6抗体向可变重链可变AF062133IGHV2-26*01框架移植的高变区(HVR)加框。S30T、I37V、L48I和K71R突变与(i)CDR-H1中的加框N/D残基的突变，例如N32S(VH3)、N32Q(VH4)或G33A(VH5)组合提供N脱酰胺突变体。人源化抗体序列中的粗体氨基酸残基不同于大鼠抗体序列中的对应残基。可影响CDR接触或CDR结构的标准和界面氨基酸残基的位置由星号指示。由于存在N-脱氨位点或N-糖基化位点而使突变聚集的地方的残基以括号框显示。
图3B显示以下各物的可变轻链的序列比对：大鼠2120.4.19.6抗MCAM抗体(2120.4.19.6_VL_topo_pro；SEQ ID NO:120)；2120VL1人源化抗MCAM抗体(h2120VL1SEQID NO:121)；2120VL2人源化抗MCAM抗体(h2120VL2SEQ ID NO:122)；2120VL3人源化抗MCAM抗体(h2120VL3SEQ ID NO:123)；和用作框架供体的轻链人可变X84343IGKV2-26*01序列(X84343_VL SEQ ID NO:124)。使用Kabat编号，并且将从大鼠2120.4.19.6抗体向可变轻链可变X84343IGKV2-26*01框架移植的高变区(HVR)加框。人源化抗体序列中的粗体氨基酸残基不同于大鼠抗体序列中的对应残基。可影响CDR接触或CDR结构的标准和界面氨基酸残基的位置由星号指示。
图4A显示以下各物的成熟重链可变区的序列比对：大鼠2120.4.19抗MCAM抗体(2120.4.19.6_VH_topo_pro；SEQ ID NO:114)；2120VH1.Q1E人源化抗MCAM抗体(h2120VH1.Q1E；SEQ IDNO:157)；2120VH2.Q1E人源化抗MCAM抗体(h2120VH2.Q1E；SEQ IDNO:158)；2120VH3.Q1E人源化抗MCAM抗体(h2120VH3.Q1E；SEQ ID NO:159)；2120VH4.Q1E人源化抗MCAM抗体(h2120VH4.Q1E；SEQ ID NO:160)；2120VH5.Q1E人源化抗MCAM抗体(h2120VH5.Q1E；SEQ ID NO:161)；和用作框架供体的重链人可变AF062133IGHV2-26*01序列(AF062133_VH；SEQ ID NO:108)。使用Kabat编号，并且将从大鼠2120.4.19.6抗体向可变重链可变AF062133IGHV2-26*01框架移植的高变区(HVR)加框。位置Q1E取代由框加以轮廓化。
图4B显示以下各物的可变轻链的序列比对：大鼠2120.4.19.6抗MCAM抗体(2120.4.19.6_VL_topo_pro；SEQ ID NO:120)；2120VL1人源化抗MCAM抗体(h2120VL1；SEQID NO:121)；2120VL2人源化抗MCAM抗体(h2120VL2；SEQ ID NO:122)；2120VL3人源化抗MCAM抗体(h2120VL3；SEQ ID NO:123)；和用作框架供体的轻链人可变X84343IGKV2-26*01序列(X84343_VL SEQ ID NO:124)。使用Kabat编号，并且将从大鼠2120.4.19.6抗体向可变轻链可变X84343IGKV2-26*01框架移植的高变区(HVR)加框。
序列简述
SEQ ID NO:1是编码抗体克隆17的成熟轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:2是抗体克隆17的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是抗体克隆17的CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是抗体克隆17的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是抗体克隆17的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是编码抗体克隆17的成熟重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:7是抗体克隆17的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是抗体克隆17的CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是抗体克隆17的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是抗体克隆17的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是人MCAM登记号CAA48332的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是编码抗体克隆15的成熟轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:13是抗体克隆15的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是抗体克隆15的CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是抗体克隆15的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是抗体克隆15的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是编码抗体克隆15的成熟重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:18是抗体克隆15的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是抗体克隆15的CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是抗体克隆15的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是抗体克隆15的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是人MCAM结构域1的氨基酸序列(残基19-129)。
SEQ ID NO:23是人MCAM结构域2的氨基酸序列(残基139-242)。
SEQ ID NO:24是人MCAM结构域3的氨基酸序列(残基244-321)。
SEQ ID NO:25是人MCAM结构域4的氨基酸序列(残基355-424)。
SEQ ID NO:26是人MCAM结构域5的氨基酸序列(残基430-510)。
SEQ ID NO:27是人层粘连蛋白411的α4链亚型的氨基酸序列(登记号NP001098676)。
SEQ ID NO:28是人层粘连蛋白411的α4链亚型的氨基酸序列(登记号CAA48332)。
SEQ ID NO:29是编码抗体1174.1.3的成熟轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:30是抗体1174.1.3的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是抗体1174.1.3的CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32是抗体1174.1.3的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是抗体1174.1.3的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是编码抗体1174.1.3的成熟重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:35是抗体1174.1.3的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是抗体1174.1.3的CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是抗体1174.1.3的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38是抗体1174.1.3的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是编码抗体1414.1.2的成熟轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:40是抗体1414.1.2的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41是抗体1414.1.2的CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是抗体1414.1.2的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43是抗体1414.1.2的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44是编码抗体1414.1.2的成熟重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:45是抗体1414.1.2的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46是抗体1414.1.2的CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47是抗体1414.1.2的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48是抗体1414.1.2的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49是编码抗体1415.1.1的成熟轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:50是抗体1415.1.1的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51是抗体1415.1.1的CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52是抗体1415.1.1的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53是抗体1415.1.1的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:54是编码抗体1415.1.1的成熟重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:55是抗体1415.1.1的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:56是抗体1415.1.1的CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57是抗体1415.1.1的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:58是抗体1415.1.1的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:59是编码抗体1749.1.3的成熟轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:60是抗体1749.1.3的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61是抗体1749.1.3的CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:62是抗体1749.1.3的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:63是抗体1749.1.3的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:64是编码抗体1749.1.3的成熟重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:65是抗体1749.1.3的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:66是抗体1749.1.3的CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:67是抗体1749.1.3的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:68是抗体1749.1.3的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:69是编码抗体2120.4.19的成熟轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:70是在SEQ ID NO:69示出的抗体2120.4.19的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:71是抗体2120.4.19的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:72是抗体2120.4.19的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:73是抗体2120.4.19的CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:74是抗体2120.4.19的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:75是抗体2120.4.19的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:76是编码抗体2120.4.19的成熟重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:77是抗体2120.4.19的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:78是抗体2120.4.19的CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:79是抗体2120.4.19的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:80是抗体2120.4.19的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:81是编码抗体2107.4.10的成熟轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:82是在SEQ ID NO:81中示出的抗体2107.4.10的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:83是编码抗体2107.4.10的成熟轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:84是在SEQ ID NO:83中示出的抗体2107.4.10的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:85是抗体2107.4.10的CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:86是抗体2107.4.10的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87是抗体2107.4.10的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:88是编码抗体2107.4.10的成熟重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:89是抗体2107.4.10的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:90是抗体2107.4.10的CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:91是抗体2107.4.10的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:92是抗体2107.4.10的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:93是抗体1749.1.3的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:94是人源化抗体1749形式1的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH1)。
SEQ ID NO:95是人源化抗体1749形式2的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH2)。
SEQ ID NO:96是重链可变框架供体U96282_VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:97是抗体1749.1.3的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:98是人源化抗体1749形式1的成熟轻链可变区的氨基酸序列(VL1)。
SEQ ID NO:99是人源化抗体1749形式2的成熟轻链可变区的氨基酸序列(VL2)。
SEQ ID NO:100是轻链可变框架供体X02990_VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO:101是抗体2107.4.10.18的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:102是人源化抗体2107形式1的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH1)。
SEQ ID NO:103是人源化抗体2107形式2的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH2)。
SEQ ID NO:104是人源化抗体2107形式3的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH3)。
SEQ ID NO:105是人源化抗体2107形式4A的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH4A)。
SEQ ID NO:106是人源化抗体2107形式5A的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH5A)。
SEQ ID NO:107是人源化抗体2107形式6的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH6)。
SEQ ID NO:108是重链可变框架供体AF062133_VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:109是抗体2107.4.10.18的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:110是人源化抗体2107形式1的成熟轻链可变区的氨基酸序列(VL1)。
SEQ ID NO:111是人源化抗体2107形式2的成熟轻链可变区的氨基酸序列(VL2)。
SEQ ID NO:112是人源化抗体2107形式3的成熟轻链可变区的氨基酸序列(VL3)。
SEQ ID NO:113是轻链可变框架供体U86803的氨基酸序列。
SEQ ID NO:114是抗体2120.4.19.6的成熟重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:115是人源化抗体2120形式1的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH1)。
SEQ ID NO:116是人源化抗体2120形式2的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH2)。
SEQ ID NO:117是人源化抗体2120形式3的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH3)。
SEQ ID NO:118是人源化抗体2120形式4的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH4)。
SEQ ID NO:119是人源化抗体2120形式5的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH5)。
SEQ ID NO:120是抗体2120.4.19.6的成熟轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:121是人源化抗体2120形式1的成熟轻链可变区的氨基酸序列(VL1)。
SEQ ID NO:122是人源化抗体2120形式2的成熟轻链可变区的氨基酸序列(VL2)。
SEQ ID NO:123是人源化抗体2120形式3的成熟轻链可变区的氨基酸序列(VL3)。
SEQ ID NO:124是轻链可变框架供体X84343_VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO:125是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:126是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:127是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:128是人源化重链/轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:129是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:130是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:131是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:132是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:133是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:134是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:135是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:136是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:137是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:138是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:139是人源化抗体2120形式3的CDRH1的氨基酸序列(VH3)。
SEQ ID NO:140是人源化抗体2120形式4的CDRH1的氨基酸序列(VH4)。
SEQ ID NO:141是人源化抗体2120形式5的CDRH1的氨基酸序列(VH5)。
SEQ ID NO:142是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:143是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:144是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:145是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:146是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:147是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:148是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:149是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:150是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:151是人源化抗体2107形式1的CDRH1的氨基酸序列(VH1)。
SEQ ID NO:152是人源化抗体2107形式4的CDRH1的氨基酸序列(VH4)。
SEQ ID NO:153是人源化抗体2120形式1-5的CDRH3的氨基酸序列(VH1-VH5)。
SEQ ID NO:154是人源化轻链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:155是人源化重链框架区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:156是抗体2120.4.19.Q1E的成熟重链可变区的氨基酸序列，其中位置1(Kabat编号)被E占据。
SEQ ID NO:157是人源化抗体2120形式1Q1E的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH1.Q1E)，其中位置1(Kabat编号)被E占据。
SEQ ID NO:158是人源化抗体2120形式2Q1E的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH2.Q1E)，其中位置1(Kabat编号)被E占据。
SEQ ID NO:159是人源化抗体2120形式3Q1E的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH3.Q1E)，其中位置1(Kabat编号)被E占据。
SEQ ID NO:160是人源化抗体2120形式4Q1E的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH4.Q1E)，其中位置1(Kabat编号)被E占据。
SEQ ID NO:161是人源化抗体2120形式5Q1E的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH5.Q1E)，其中位置1(Kabat编号)被E占据。
SEQ ID NO:162是编码可融合于成熟重链或成熟轻链可变区的示例性信号肽的核酸序列。
SEQ ID NO:163是由核酸序列SEQ ID NO:162编码的示例性信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:164是编码可融合于成熟重链或成熟轻链可变区的示例性信号肽的核酸序列。
SEQ ID NO:165是由核酸序列SEQ ID NO:164编码的示例性信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:166是编码可融合于成熟重链或成熟轻链可变区的示例性信号肽的核酸序列。
SEQ ID NO:167是由核酸序列SEQ ID NO:166编码的示例性信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:168是在N末端具有精氨酸的人源化2120轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:169是在N末端不具有精氨酸的人源化2120的氨基酸序列。
SEQ ID NO:170是人源化2120重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:171是BIP形式重链G1m3同种异型恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:172是BIP形式重链G1m3同种异型恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:173是人源化抗体2120形式3的成熟轻链区的氨基酸序列(VL3+轻链恒定区)。
SEQ ID NO:174是人源化抗体2120形式5的成熟重链区的氨基酸序列(VH5+BIP形式重链G1m3同种异型恒定区)。
SEQ ID NO:175是人源化抗体2120形式5的成熟重链区的氨基酸序列(VH5+BIP形式重链G1m3同种异型恒定区)。
SEQ ID NO:176是人源化抗体2120形式5Q1E的成熟重链区的氨基酸序列(VH5.Q1E+BIP形式重链G1m3同种异型恒定区)。
SEQ ID NO:177是人源化抗体2120形式5Q1E的成熟重链区的氨基酸序列(VH5.Q1E+BIP形式重链G1m3同种异型恒定区)。
SEQ ID NO:178是人源化抗体2107形式4B的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH4B)。
SEQ ID NO:179是人源化抗体2107形式5B的成熟重链可变区的氨基酸序列(VH5B)。
定义
单克隆抗体通常以分离形式提供。这意味着抗体关于因它的产生或纯化而产生的蛋白质和其它大分子通常是至少50％w/w纯的，但不排除单克隆抗体与意图促进它的用途的过量药物可接受载体或其它媒介物组合的可能性。有时，单克隆抗体关于由产生或纯化所致的蛋白质和其它大分子是至少60％、70％、80％、90％、95或99％w/w纯的。
单克隆抗体与它的靶标抗原特异性结合意指亲和力是至少106、107、108、109或1010M-1。特异性结合在量级方面可检测地高于以及可区分于与至少一种无关靶标发生的非特异性结合。特异性结合可为在特定官能团之间形成键，或形成特定空间配合(例如锁和匙类型)的结果，而非特异性结合通常是范德华(van der Waals)力的结果。然而，特异性结合未必暗示单克隆抗体结合一种并且唯一一种靶标。
基本抗体结构单元是亚单位的四聚体。各四聚体包括两对相同多肽链，各对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括具有约100至110个或更多个氨基酸，主要负责抗原识别的可变区。这个可变区初始在连接于可裂解信号肽下被表达。无信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，举例来说，轻链成熟可变区意指无轻链信号肽的轻链可变区。各链的羧基末端部分界定主要负责效应物功能的恒定区。
轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由具有约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链也包括具有约10个或更多个氨基酸的“D”区。(大体上参见Fundamental Immunology(Paul,W.编,第2版Raven Press,N.Y.,1989,第7章，出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。
各轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点。除在双功能性或双特异性抗体中之外，两个结合位点是相同的。各链全都展现相对保守框架区(FR)由也称为互补决定区或CDR的三个高变区接合的相同一般性结构。来自各对的两个链的CDR通过框架区加以对准，从而使得能够结合特定表位。从N末端至C末端，轻链与重链两者均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对各结构域的氨基酸指定是根据Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health,Bethesda,MD,1987和1991)或Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等,Nature 342:878-883(1989)的定义。Kabat也提供广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被指定相同编号(例如H83意指成熟重链可变区中根据Kabat编号的位置83；同样地，位置L36意指成熟轻链可变区中根据Kabat编号的位置36)。除非另外明确陈述，否则在提及抗体的可变区中的位置时，始终使用Kabat编号。
术语“抗体”包括完整抗体及其抗原结合片段。通常，片段与它们所源自的完整抗体竞争特异性结合靶标，所述片段包括单独重链、轻链Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、双链抗体、Dab、纳米体和Fv。可通过重组DNA技术，或通过酶促或化学分开完整免疫球蛋白来产生片段。
术语“抗体”也包括双特异性抗体和/或嵌合抗体和/或人源化抗体。双特异性或双功能性抗体是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体(参见例如Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等,J.Immunol.148:1547-53(1992))。在一些双特异性抗体中，两个不同重链/轻链对可包括人源化重链/轻链对和对不同表位具有特异性的重链/轻链对。
在一些双特异性抗体中，一个重链轻链对是如下进一步公开的人源化抗体，并且重链轻链对来自结合在血脑屏障上表达的受体的抗体，所述受体诸如胰岛素受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体、瘦素受体或脂蛋白受体或转铁蛋白受体(Friden等,PNAS 88:4771-4775,1991；Friden等,Science 259:373-377,1993)。这种双特异性抗体可通过受体介导的胞转(transcytosis)来跨越血脑屏障加以传递。可通过工程改造双特异性抗体以降低它对血脑屏障受体的亲和力来进一步增强双特异性抗体的脑摄取。对受体的亲和力降低导致在脑中较广泛分布(参见例如Atwal.等Sci.Trans.Med.3,84ra43,2011；Yu等Sci.Trans.Med.3,84ra44,2011)。
示例性双特异性抗体也可为(1)双重可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中各轻链和重链含有两个通过短肽键联串联的可变结构域(Wu等,Generation and Characterizationof a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,AntibodyEngineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(2)Tandab，其是两个单链微型双功能抗体的融合物，从而产生针对各靶标抗原都具有两个结合位点的四价双特异性抗体；(3)柔性抗体，其是scFv与微型双功能抗体的组合，从而产生多价分子；(4)所谓“对接和锁定”分子，所述分子基于蛋白质激酶A中的“二聚化和对接结构域”，所述结构域在应用于Fab时可产生由连接于不同Fab片段的两个相同Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(5)所谓Scorpion分子，其包含例如融合于人Fc区的两个末端的两个scFv。适用于制备双特异性抗体的平台的实例包括但不限于BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、Fcab和Mab2(F-star)、Fc工程改造的IgGl(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab)。
术语“表位”是指抗原上由抗体所结合的位点。表位可由连续氨基酸或通过一个或多个蛋白质的三级折叠而毗连的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丧失。表位通常包括至少3个，并且更通常至少5个或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线结晶学和2维核磁共振。参见例如Epitope MappingProtocols,Methods in Molecular Biology,第66卷,Glenn E.Morris编(1996)。
“拮抗剂”抗体或其它结合剂是抑制它所结合的抗原的生物活性的抗体或结合剂。此类抗体可大致上或完全抑制抗原的生物活性。
关于MCAM的术语“生物活性”和“生物活性的”是指它能够特异性结合它的配体(层粘连蛋白α4链，例如层粘连蛋白411的α4链)和/或促进例如TH17细胞的MCAM表达性细胞浸润至CNS中。
“抑制”意指药剂降低至少一种靶标(例如MCAM)的生物活性。这种抑制剂使至少一种靶标的活性抑制至少约至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％或至少100％。
“受试者”包括接受防治性或治疗性治疗的人或其它哺乳动物受试者。
出于将氨基酸取代分类为保守性或非保守性取代的目的，将氨基酸如下分组：组I(疏水性侧链)：met、ala、val、leu、ile；组II(中性亲水性侧链)：cys、ser、thr；组III(酸性侧链)：asp、glu；组IV(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；组V(影响链定向的残基)：gly、pro；和组VI(芳族侧链)：trp、tyr、phe。保守性取代涉及在相同类别中的氨基酸之间取代。非保守性取代等同于将这些类别中的一个的成员交换成另一类别的成员。
序列同一性百分比是在根据Kabat编号惯例，使抗体序列最大限度进行对准来确定。在对准之后，如果主题抗体区域(例如重链或轻链的整个成熟可变区)与参照抗体的相同区域进行比较，那么主题抗体区域与参照抗体区域之间的序列同一性百分比是在主题抗体区域与参照抗体区域两者中由相同氨基酸占据的位置的数目除以两个区域的不计数空位的比对位置的总数，乘以100以换算成百分比。
“包含”一个或多个叙述的要素的组合物或方法可包括未明确叙述的其它要素。举例来说，包含抗体的组合物可含有单独或与其它成分组合的抗体。
对值的范围的指定包括所述范围内或界定所述范围的所有整数，以及由所述范围内的整数界定的所有子范围。
除非另外根据上下文显而易知，否则术语“约”涵盖在陈述值的标准测量误差界限(SEM)内的值。
统计显著性意指p≤0.05。
详述
I.概要
具有抑制MCAM结合层粘连蛋白411的层粘连蛋白α4链的适用性质的抗体公开于WO/2012/170071和PCT/US2013/058773中。本申请尤其(a)提供2120.4.19抗体的新型人源化形式，(b)定位这个抗体所结合的表位，(c)提供结合相同表位的抗体，并且(d)提供公开的抗体的新型制剂。
术语“2120.4.19”、“m2120”、“小鼠2120”抗体是指具有对应于SEQ ID NO:114的成熟可变重链和对应于SEQ ID NO:120的成熟可变轻链的啮齿动物源性单克隆抗体克隆。“人源化2120”或“hu2120”是指2120.4.19克隆的人源化变体。
II.靶标分子
天然人野生型MCAM(黑素瘤细胞粘着分子，也称为CD146和MUC18)是一种具有以下氨基酸序列的646个氨基酸的蛋白质：
MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEKRTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPLGIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYCELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKEGDRVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTNDNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEASGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTGLSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRGVVIVAVIVCILVLAVLGAVLYFLYKKGKLPCRRSGKQEITLPPSRKTELVVEVKSDKLPEEMGLLQGSSGDKRAPGDQGEKYIDLRH(SEQ ID NO:11)。
(GenBank数据库，根据登记号AAA20922.1(CAA48332))。MCAM是一种属于免疫球蛋白超家族，参与细胞粘着中以及内皮单层在血管组织中的细胞间接合点处的粘附中的细胞表面糖蛋白。它也促进诸如实体肿瘤，包括黑素瘤和前列腺癌的许多癌症的肿瘤进展。已知它以同型/亲同种方式进行相互作用，并且也可结合其它配体。人MCAM包括五个免疫球蛋白结构域(1：氨基酸残基19-129；2：氨基酸残基139-242；3：氨基酸残基244-321；4：氨基酸残基335-424；和5：氨基酸残基430-510)，显示为SEQ ID NO:22-26。
除非另外根据上下文显而易知，否则提及MCAM或它的片段包括以上指示的天然人野生型氨基酸序列及其人等位基因变体。
层粘连蛋白α4是指见于在(基底膜的)基层中表达的层粘连蛋白分子中的一个多肽链，所述基层是大多数细胞和器官的蛋白质网络基础。已知层粘连蛋白通过质膜分子结合细胞膜，并且促进细胞附着。层粘连蛋白α4链通常与层粘连蛋白β链和层粘连蛋白γ链形成复合物。层粘连蛋白α4链见于包括层粘连蛋白411(层粘连蛋白8或α4β1γ1)；层粘连蛋白421(层粘连蛋白9或α4β2γ1)和层粘连蛋白423(层粘连蛋白14或α4β2γ3)的众多层粘连蛋白分子中。存在人层粘连蛋白α4链的两个主要亚型：GenBank登记号NP001098676和NP001098677(分别是SEQ ID NO:27和28)。“层粘连蛋白411”是指由以下三个多肽亚单位或链组成的三聚多肽复合物：α4链、β1链和γ1链。
针对MCAM的拮抗剂包括抗体、受体或配体与IgG恒定区的融合蛋白、其它生物结合分子和小分子。抗体可为单克隆或多克隆抗体。抗体可为非人(诸如小鼠或大鼠、非人灵长类动物)抗体，或可为人抗体。抗体可为嵌合、镶饰、人源化、灵长类动物源化抗体等。
MCAM拮抗剂是指完全或部分抑制MCAM(i)特异性结合它的配体：层粘连蛋白α4链，例如层粘连蛋白411的α4链；和/或(ii)促进例如TH17细胞的MCAM表达性细胞浸润至或迁移至受试者的组织中的能力的拮抗剂。MCAM拮抗剂包括结合MCAM或它的配体层粘连蛋白α4的抗体或其它拮抗剂。
III.抗体
A.抗体2120.4.19及其嵌合、镶饰和人源化形式
人源化抗体是遗传工程改造抗体，其中来自非人“供体”抗体(即2120.4.19)的CDR被移植至人“接受体”抗体序列中(参见例如Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205 6,881,557；Foote,US 6,881,557)。接受体抗体序列可为例如成熟人抗体序列、所述序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区序列。人接受体抗体序列可任选选自许多已知人抗体序列之中以提供人接受体序列可变区框架与供体抗体链的对应可变区框架之间的高度序列同一性(例如65-85％同一性)。因此，人源化抗体是具有完全或大致上来自供体抗体的一些或全部CDR和完全或大致上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在)的抗体。类似地，人源化重链具有至少一个、两个以及通常全部三个完全或大致上来自供体抗体重链的CDR、以及大致上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在)。类似地，人源化轻链具有至少一个、两个以及通常全部三个完全或大致上来自供体抗体轻链的CDR、以及大致上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在)。不同于纳米体和dAb，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。当在对应CDR之间至少85％、90％、95％或100％的对应残基(如由Kabat所定义)是同一的，例外之处是CDRH1可具有多达两个取代，并且CHDRH2可在位置H60-65处具有取代时，人源化抗体中的CDR大致上来自非人抗体中的对应CDR。当至少85％、90％、95％或100％的由Kabat定义的对应残基是同一的时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别大致上来自人可变区框架序列或人恒定区。
尽管人源化抗体常并有来自小鼠抗体的全部六个CDR(优选如由Kabat所定义)，但也可使它们具有少于来自小鼠抗体的全部CDR(例如至少3、4或5个CDR)(例如Pascalis等,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等,Journal of Molecular Biology,320:415-428,2002；Iwahashi等,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura等,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。
在一些抗体中，仅一部分CDR(即为结合所需的CDR残基子组，称为SDR)为在人源化抗体中保留结合所需。不接触抗原以及不在SDR中的CDR残基可基于先前研究(例如CDR H2中的残基H60-H65常常是不需要的)，从位于Chothia高变环外部的Kabat CDR的区域(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)，通过分子建模和/或凭经验，或如Gonzales等,Mol.Immunol.41:863,2004中所述加以鉴定。在所述人源化抗体中，在其中不存在一个或多个供体CDR残基或其中省略整个供体CDR的位置处，占据位置的氨基酸可为占据接受体抗体序列中对应位置(根据Kabat编号)的氨基酸。CDR中待包括的接受体氨基酸对供体氨基酸的所述取代的数目反映竞争性考虑事项的平衡。所述取代在降低人源化抗体中小鼠氨基酸的数目以及因此降低潜在免疫原性方面是潜在有利的。然而，取代也可导致亲和力变化，并且优选避免亲和力显著降低。也可凭经验选择CDR内的取代位置和待取代的氨基酸。
针对MCAM的2120.4.19大鼠抗体公开于PCT/US2013/058773中，并且在本文中如由SEQ ID NO:69-80所定义。2120.4.19抗体的嵌合、镶饰和人源化形式也公开于‘773申请中。公开的人源化形式在本文中如由SEQ ID NO:115-119、121-123、139-141和153所定义。包括由这些SEQ ID NO.表示的人源化重链和人源化轻链的任何排列的公开形式可用于本发明的一些方面，诸如药物组合物和制剂中。
本申请提供2120.4.19抗体的额外人源化形式，其中在重链可变区的位置1(Kabat编号)处，谷氨酰胺被取代成谷氨酸(即Q1E)。重链可变区中的Q1E取代是不预期会对抗体的结合特征产生实质性影响，但可改进抗体稳定性的保守性取代。
除非另外根据上下文显而易知，否则以下描述包括PCT/US2013/058773中公开的人源化抗体和本文公开的Q1E变体。
本发明提供包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含Kabat CDR1SEQ ID NO:78：GFSLTSNGVS；Kabat CDR2SEQ ID NO:79：AISSGGTTYYNSAFKS；和Kabat CDR3SEQ ID NO:80：RYGYGWYFDF。一些抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含Kabat CDR1SEQ ID NO:73：KASQNIYNSLA；Kabat CDR2SEQ ID NO:74：NANSLQT；和Kabat CDR3SEQ ID NO:75：QQFYSGYT。一些此类抗体在SEQ ID NO:78的Kabat CDR1中包含N32S取代或N32Q取代，并且一些在SEQ ID NO:78的Kabat CDR1中包含G33A取代。已发现这些取代会提供改进的特征，包括抗体亲和力和效价增加。
本发明也提供抗MCAM抗体，其中成熟重链可变区与SEQ ID NO:161具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。一些此类抗体包括完全或大致上与供体2120.4.19抗体的CDR区同一的三个重链和三个轻链CDR。如果不同一，那么CDR优选具有处于本文诸如在先前段落中定义的类型和位置下的取代。CDR区可通过任何常规定义(例如Chothia)来定义，但优选如由Kabat所定义。
任何上述抗体都可为人源化抗体。一些人源化抗体包含成熟重链可变区，所述成熟重链可变区包含SEQ ID NO:161的三个Kabat CDR(其与SEQ ID NO:156的CDR相同)，例外之处是位置32(Kabat编号)可为N、S或Q，并且位置33(Kabat编号)可为G或A；和成熟轻链可变区，所述成熟轻链可变区包含SEQ ID NO:123的三个Kabat CDR(其与SEQ ID NO:120的CDR相同)，优选其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少90％同一，并且优选其中所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少90％同一。任何所述抗体都可在位置H1(根据Kabat编号)处具有Q或E(即Q1E取代)。
本文提供的在成熟重链可变区中具有Q1E取代的抗体包括包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:156(即2120.4.19.Q1E)、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQID NO:160或SEQ ID NO:161的成熟重链可变区的抗体。一些此类抗体包含具有指定为SEQID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123的氨基酸序列的成熟轻链可变区。成熟重链和轻链可变区可以任何可能的排列加以组合。示例性组合是包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:161的成熟重链可变区和具有指定为SEQ ID NO:123的氨基酸序列的成熟轻链可变区的抗体。这些抗体的诸如已描述于PCT/US2013/058773中的无Q1E取代形式也可用于本发明的一些方面，诸如药物组合物和制剂中。
本发明进一步提供抗体，其中重链成熟可变区与SEQ IDNO:156(即2120.4.19.Q1E)、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160或SEQID NO:161中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且轻链与SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123中的任一个具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。此类抗体优选是人源化抗体。任何所述抗体都可在位置H1(根据Kabat编号)处具有Q或E(即Q1E取代)。
公开的SEQ ID NO的变体与成熟重链和轻链可变区序列的不同之处通常在于少数(轻链或重链成熟可变区框架或两者中通常不超过1、2、3、5或10个)置换、缺失或插入。任何变化都优选是保守性取代。
B.恒定区的选择
可使嵌合、镶饰或人源化抗体的重链和轻链可变区连接于至少一部分人恒定区。对恒定区的选择部分地取决于是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性。举例来说，人同种型IgG1和IgG3具有补体依赖性细胞毒性，而人同种型IgG2和IgG4不具有。人IgG1和IgG3也比人IgG2和IgG4诱导更强细胞介导的效应物功能。轻链恒定区可为λ或κ轻链恒定区。
在轻链和/或重链的氨基或羧基末端处的一个或若干个氨基酸(诸如重链的C末端赖氨酸)在一定比例或全部分子中可丢失或衍生化。可在恒定区中进行取代以降低或增加效应物功能，诸如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见例如Winter等,美国专利号5,624,821；Tso等,美国专利号5,834,597；以及Lazar等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:4005,2006)，或延长在人中的半衰期(参见例如Hinton等,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。示例性取代包括用于增加抗体的半衰期的在位置250处的Gln和/或在位置428处的Leu(EU编号在这个段落中用于恒定区)。在位置234、235、236和/或237中的任一个或全部处的取代使对Fcγ受体，特别是FcγRI受体的亲和力降低(参见例如US6,624,821)。在人IgG1的位置234、235和237处的丙氨酸取代可用于降低效应物功能。一些抗体在人IgG1的位置234、235和237处具有用于降低效应物功能的丙氨酸取代。任选地，人IgG2中的位置234、236和/或237被丙氨酸取代，并且位置235被谷氨酰胺取代(参见例如US 5,624,821)。在一些抗体中，使用在人IgG1的位置241、264、265、270、296、297、322、329和331(根据EU编号)中的一个或多个处的突变。在一些抗体中，使用在人IgG1的位置318、320和322(根据EU编号)中的一个或多个处的突变。在一些抗体中，位置234和/或235被丙氨酸取代，和/或位置329被甘氨酸取代。在一些抗体中，位置234和235被丙氨酸取代，诸如在SEQ ID NO:172中。在一些抗体中，同种型是人IgG2或IgG4。示例性人轻链κ恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:168。可省略SEQ ID NO:168的N末端精氨酸，在所述情况下，轻链κ恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:169。示例性人IgG1重链恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:170(具有或不具有C末端赖氨酸)。抗体可被表达为含有两个轻链和两个重链的四聚体、单独重链、轻链、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv、或其中重链和轻链成熟可变结构域通过间隔体连接的单链抗体。
人恒定区显示不同个体之间的同种异型变化和同族同种异型变化，也就是说在不同个体中，恒定区可在一个或多个多态性位置处不同。同族同种异型不同于同种异型，因为识别同族同种异型的血清结合一种或多种其它同种型的非多态性区域。因此，举例来说，另一重链恒定区具有IgG1G1m3同种异型，并且具有氨基酸序列SEQ ID NO:171。另一重链恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:171，例外之处是它缺乏C末端赖氨酸。另一重链恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:172。重链恒定区具有氨基酸序列SEQ ID NO:172，例外之处是它缺乏C末端赖氨酸。
本发明进一步提供编码任何以上恒定区的核酸。任选地，所述核酸进一步编码信号肽，并且可在信号肽连接于恒定区的情况下表达。
C.重组抗体的表达
可通过重组表达来产生抗体。编码抗体的核酸可针对在所需细胞类型(例如CHO或Sp2/0)中表达加以密码子优化。重组核酸构建体通常包括可操作地连接于抗体链的编码序列的表达控制序列，包括天然相关或异源性启动子区域。表达控制序列可为能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体已并入适当宿主中，即在适于高水平表达核苷酸序列以及收集和纯化交叉反应抗体的条件下维持宿主。一种或多种编码抗体链的载体也可含有可选择基因(诸如二氢叶酸还原酶)以允许扩增编码抗体链的核酸的拷贝数。
大肠杆菌(E.coli)是一种特别适用于表达抗体，特别是抗体片段的原核宿主。诸如酵母的微生物也适用于表达。酵母属(Saccharomyces)是酵母宿主的一实例，其中适合载体具有如所需的表达控制序列、复制起点、终止序列等。典型启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶启动子。诱导性酵母启动子尤其包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
哺乳动物细胞可用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段。参见Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。本领域中已开发许多能够分泌完整异源性蛋白质的适合宿主细胞系，并且包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞和非抗体产生性骨髓瘤，包括Sp2/0和NS0。可为有利的是使用非人细胞。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子、增强子(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986))；以及必要加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。适合的表达控制序列是源于内源性基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒等的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。
在已将编码抗体重链和轻链的载体引入细胞培养物中的情况下，可在无血清培养基中针对生长产力和产物品质筛选细胞汇合物。可接着使顶端产生性细胞汇合物经受基于FACS的单细胞克隆以产生单克隆株系。对应于大于7.5g/L培养物的产物滴度的每天每个细胞高于50pg或100pg的比产力可为有利的。也可测试由单细胞克隆产生的抗体的浊度、过滤性质、PAGE、IEF、UV扫描、HP–SEC、碳水化合物-寡糖定位、质谱和结合测定，诸如ELISA或Biacore。可接着将所选克隆储存在多个小瓶中，并且冷冻储存以供随后使用。
一旦表达，即可根据标准技术程序纯化抗体，所述程序包括蛋白A捕集、柱色谱法(例如疏水相互作用或离子交换)、低pH病毒失活等(大体上参见Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag,NY,1982))。
用于商业产生抗体的方法学包括密码子优化；启动子、转录元件和终止子的选择；无血清单细胞克隆；细胞储存；使用选择标记扩增拷贝数；CHO终止子；无血清单细胞克隆；改进蛋白质滴度(参见例如US 5,786,464、US 5,888,809、US 6,063,598、US 6,114,148、US7,569,339、WO2004/050884、WO2005/019442、WO2008/012142、WO2008/012142、WO2008/107388和WO2009/027471)。
D.核酸
本发明进一步提供编码任何上述重链和轻链的核酸。通常，核酸也编码融合于成熟重链和轻链的信号肽(例如具有可由SEQ ID NO:162、164和166编码的氨基酸序列SEQ IDNO:163、165和167的信号肽)。核酸上的编码序列可与调控序列可操作连接以确保表达编码序列，所述调控序列诸如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸可以分离形式存在，或可被克隆至一种或多种载体中。可通过例如固态合成或重叠寡核苷酸的PCR来合成核酸。编码重链和轻链的核酸可例如在表达载体内接合为一个连续核酸，或可为分开的，例如各自被克隆至它自身的表达载体中。
E.对用于抗体结合的MCAM表位的表征以及结合MCAM表位的抗体的产生
1.用于抗体结合的MCAM表位
本发明提供结合人MCAM蛋白内的特定表位的单克隆抗体，其中一些与指定为2120.4.19的抗体(m2120)结合相同或重叠表位。
在MCAM(SEQ ID NO:11)的残基39、62、133、141、159、212、220、221、223、227、238、241和/或392处的突变破坏m2120的特异性结合(例如相较于阳性对照野生型MCAM，与突变MCAM的结合<30％，如同实施例所描述)。在残基145、167、175、206、207、216和225处的突变被鉴定为对m2120的特异性结合具有最大影响(降低)。因为相对少许残基影响结合，并且残基比典型线性表位(例如3-20个连续氨基酸)更广泛间隔，所以这些结果提供以下指示：m2120可结合构象性表位，或替代地，一个或多个影响结合的残基可在不与抗体直接接触下以变构方式进行此举。
抗体可能与m2120共有有用的抑制性质，所述抗体结合包括MCAM的残基39、62、133、141、145、159、167、175、206、207、212、216、220、221、223、225、227、238、241和392中的一个或多个的表位，并且特别是结合包括残基141和145中的一个或多个的表位。因此，特异性结合由于MCAM的残基141和145中的一个或多个，并且特别是残基141的诱变而受抑制的抗体可能与m2120共有类似性质。一些此类抗体结合MCAM的包括残基141和/或145或由残基141和/或145组成的表位。表位可为线性的，诸如包括指定氨基酸(141和145)中的一个或两个的表位(例如2-5、3-5、3-10、3-15、3-20、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、5-50、5-60或5-70个连续氨基酸)，或可为构象性的，包括指定氨基酸中的一个或两个或由指定氨基酸中的一个或两个组成。
2.结合特定MCAM表位的抗体的产生
一些抗体与m2120抗体结合相同或重叠表位。针对人MCAM的其它非人单克隆抗体(例如鼠类、豚鼠、灵长类动物、兔或大鼠单克隆抗体)的产生可通过以下方式来实现：例如用包括所需表位的人MCAM或其肽片段或展示人MCAM或人MCAM cDNA(由逆转录病毒编码或用基因枪免疫)的细胞系(“免疫原”)免疫动物，以及针对与MCAM的结合，任选针对与m2120竞争对MCAM的结合来筛选所得抗体(参见出于所有目的以引用的方式并入本文的Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(CSHP NY,1988))。任选地，使免疫原缀合于载体分子。任选地，与佐剂一起施用免疫原。可如下所述使用若干类型的佐剂。对于免疫实验室动物，完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant)继之以不完全佐剂是优选的。兔或豚鼠通常用于制备多克隆抗体。小鼠通常用于制备单克隆抗体。针对与MCAM内所需表位的特异性结合来筛选抗体。
本发明提供MCAM的用于产生针对上述表位的抗体的肽片段。所述肽的实例包括长度在2-5、3-5、3-10、3-15、3-20、5-10、5-15、5-20、5-30、5-40、5-50、5-60或5-70个连续氨基酸之间，并且包括MCAM的氨基酸残基141和145中的至少一个的肽。在这些肽中的一些中，肽包括氨基酸残基141与145两者。
可使免疫原缀合于载体分子，通常是载体多肽，并且由此帮助引发针对缀合于载体的片段的免疫应答。可使单一试剂连接于单一载体，可使试剂的多个拷贝连接于载体的多个拷贝，其转而彼此连接，可使试剂的多个拷贝连接于载体的单一拷贝，或可使试剂的单一拷贝连接于载体的多个拷贝或不同载体。适合载体包括血清白蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素或来自诸如白喉(例如CRM197)、大肠杆菌、霍乱或幽门螺旋杆菌(H.pylori)的其它病原性细菌的类毒素或减弱的毒素衍生物。
免疫原常常与药学上可接受的佐剂一起施用。相对于如果单独使用肽的情况，佐剂使诱导的抗体的滴度和/或诱导的抗体的结合亲和力增加。多种佐剂可与MCAM的免疫原性片段组合用于引发免疫应答。优选佐剂加强对免疫原的固有应答而不导致免疫原中影响应答的定性形式的构象变化。示例性佐剂包括氢氧化铝和磷酸铝、3脱氧酰化单磷酰基脂质A(MPLTM)(参见GB 2220211(RIBI ImmunoChem Research Inc.,Hamilton,Montana，现时是Corixa的一部分))。StimulonTM QS-21是从见于南美洲的莫利那皂树(Quillaja SaponariaMolina)的树皮分离的三萜烯糖苷或皂素(参见Kensil等,Vaccine Design:The Subunitand Adjuvant Approach(Powell和Newman编,Plenum Press,NY,1995)；US 5,057,540)(Aquila BioPharmaceuticals,Framingham,MA；现时是Antigenics,Inc.,New York,NY)。其它佐剂是水包油乳剂(诸如角鲨烯或花生油)，任选与免疫刺激剂，诸如单磷酰基脂质A(参见Stoute等,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))、普洛尼克(pluronic)聚合物和杀灭的分支杆菌组合。另一佐剂是CpG(WO98/40100)。佐剂可作为治疗性组合物的组分与活性剂一起施用，或可在施用治疗剂之前、与施用治疗剂并行或在施用治疗剂之后分开施用。
3.抗体的类型
抗体可为单克隆或多克隆抗体。抗体可为非人(诸如小鼠或大鼠、非人灵长类动物)抗体，或可为人抗体。抗体可为嵌合、镶饰、人源化、灵长类动物源化抗体等。
使用上述方法和Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205 6,881,557；Foote,US 6,881,557中所述的方法使单克隆抗体人源化。接受体抗体序列可为例如成熟人抗体可变区序列、所述序列的复合物、人抗体可变区序列的共有序列(例如Kabat,1991(上文)的轻链和重链可变区共有序列)或种系可变区序列。因此，人源化抗体是具有完全或大致上来自供体抗体的一些或全部CDR和完全或大致上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在)的抗体。类似地，人源化重链具有至少一个、两个以及通常全部三个完全或大致上来自供体抗体重链的CDR、以及大致上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在)。类似地，人源化轻链具有至少一个、两个以及通常全部三个完全或大致上来自供体抗体轻链的CDR、以及大致上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在)。不同于纳米体和dAb，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。当在对应CDR之间至少85％、90％、95％或100％的对应残基(如由Kabat所确定)是同一的时，人源化抗体中的CDR大致上来自非人抗体中的对应CDR。当至少85％、90％、95％或100％的由Kabat确定的对应残基是同一的时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别大致上来自人可变区框架序列或人恒定区。
尽管人源化抗体常并有来自小鼠抗体的全部六个CDR(优选如由Kabat所确定)，但也可使它们具有少于来自小鼠抗体的全部CDR(例如至少3、4或5个CDR)(例如Pascalis等,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等,Journal of Molecular Biology,320:415-428,2002；Iwahashi等,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura等,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。
在一些抗体中，仅一部分CDR(即为结合所需的CDR残基子组，称为SDR)为在人源化抗体中保留结合所需。不接触抗原以及不在SDR中的CDR残基可基于先前研究(例如CDR H2中的残基H60-H65常常是不需要的)，从Kabat CDR的位于Chothia高变环(Chothia,J.Mol.Biol.196:901,1987)外部的区域，通过分子建模和/或凭经验，或如Gonzales等,Mol.Immunol.41:863,2004中所述加以鉴定。在所述人源化抗体中，在其中不存在一个或多个供体CDR残基或其中省略整个供体CR的位置处，占据位置的氨基酸可为占据接受体抗体序列中对应位置(根据Kabat编号)的氨基酸。CDR中待包括的接受体氨基酸对供体氨基酸的所述取代的数目反映竞争性考虑事项的平衡。所述取代在降低人源化抗体中小鼠氨基酸的数目以及因此降低潜在免疫原性方面是潜在有利的。然而，取代也可导致亲和力变化，并且亲和力显著降低应优选被避免。也可凭经验选择CDR内的取代位置和待取代的氨基酸。
人接受体抗体序列可任选地选自许多已知人抗体序列之中以提供人接受体序列可变区框架与供体抗体链的对应可变区框架之间的高度序列同一性(例如65-85％同一性)。
来自人可变区框架残基的某些氨基酸可基于它们对CDR构象和/或与抗原的结合的可能影响被选择用于取代。对所述可能的影响的探究是通过建模，考查在特定位置处的氨基酸的特征，或凭经验观察特定氨基酸的取代或诱变的影响来进行。
举例来说，当在鼠类可变区框架残基与所选人可变区框架残基之间氨基酸不同时，在合理预期人框架氨基酸处于以下情况时，人框架氨基酸可被来自小鼠抗体的等效框架氨基酸取代：
(1)直接非共价结合抗原，
(2)邻近于CDR区，
(3)另外与CDR区相互作用(例如在CDR区的约内)。
其它取代候选物是对于人免疫球蛋白在那个位置处不常见的接受体人框架氨基酸。这些氨基酸可被来自小鼠供体抗体的等效位置或来自更典型人免疫球蛋白的等效位置的氨基酸取代。其它取代候选物是对于人免疫球蛋白在那个位置处不常见的接受体人框架氨基酸。
本发明进一步提供特异性结合上述MCAM表位的非人抗体的嵌合和镶饰形式。
嵌合抗体是其中非人抗体(例如小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链和重链恒定区组合的抗体。此类抗体大致上或完全保留小鼠抗体的结合特异性，并且具有约三分之二人序列。
镶饰抗体是一种类型的人源化抗体，其保留非人抗体的一些以及通常全部CDR和一些非人可变区框架残基，但用来自人抗体序列的对应位置的残基置换可促成B或T细胞表位的其它可变区框架残基，例如暴露的残基(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)。所得物是其中CDR完全或大致上来自非人抗体，并且通过取代来使得非人抗体的可变区框架更具人样的抗体。
通过下述多种技术来提供针对MCAM的人抗体。通过竞争性结合实验，通过以上Winter的噬菌体展示方法，或以其它方式来选择一些人抗体以与特定小鼠抗体(诸如实施例中所述的一种小鼠单克隆体)具有相同表位特异性。也可通过仅使用MCAM的片段作为靶标抗原，和/或通过筛选针对MCAM的一批缺失突变体的抗体来针对特定表位特异性筛选人抗体。
用于产生人抗体的方法包括Oestberg等,Hybridoma 2:361-367(1983)；Oestberg,美国专利号4,634,664；以及Engleman等,美国专利4,634,666的三源杂交瘤方法；使用包括人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(参见例如Lonberg等,WO93/12227(1993)；US5,877,397；US 5,874,299；US 5,814,318；US 5,789,650；US 5,770,429；US 5,661,016；US5,633,425；US 5,625,126；US 5,569,825；US 5,545,806；Nature 148,1547-1553(1994)；Nature Biotechnology 14,826(1996)；Kucherlapati,WO 91/10741(1991))以及噬菌体展示方法(参见例如Dower等,WO 91/17271以及McCafferty等,WO 92/01047；US 5,877,218；US 5,871,907；US 5,858,657；US 5,837,242；US 5,733,743和US 5,565,332)。
通常通过如上所述的重组表达来产生嵌合、人源化(包括镶饰)和人抗体。
本发明进一步提供非抗体结合分子。非抗体结合分子包括例如抗运载蛋白，其基于载脂蛋白骨架，即一种特征在于具有支撑形成配体结合位点的四个高变环的刚性β桶的蛋白质结构。通过在环区域中的靶向随机诱变与功能性展示和导向选择联合来工程改造新型结合特异性(Skerra(2008)FEBS J.275:2677-2683)。其它适合骨架可包括例如纤维连接蛋白或单域抗体，其基于人纤维结合蛋白III的第十细胞外结构域(Koide和Koide(2007)Methods Mol.Biol.352:95-109)；亲和体，其基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域(Nygren等(2008)FEBS J.275:2668-2676))；DARPin，其基于锚蛋白重复蛋白质(Stumpp等(2008)Drug.Discov.Today 13:695-701)；fynomer，其基于人Fyn蛋白质激酶的SH3结构域(Grabulovski等(2007)J.Biol.Chem.282:3196-3204)；affitin，其基于来自Sulfolobusacidolarius的Sac7d(Krehenbrink等(2008)J.Mol.Biol.383:1058-1068)；affilin，其基于人y-B-晶状体蛋白(Ebersbach等(2007)J.Mol.Biol.372:172-185)；高亲和性多聚体，其基于膜受体蛋白质的A结构域(Silverman等(2005)Biotechnol.23:1556-1561)；富含半胱氨酸的打结素肽(Kolmar(2008)FEBS J.275:2684-2690)；和工程改造的Kunitz型抑制剂(Nixon和Wood(2006)Curr.Opin.Drug.Discov.Dev.9:261-268)。对于综述，参见Gebauer和Skerra(2009)Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-255。
在这些抗体中的一些中，抗体不是以下抗体中的任一个：WO/2012/170071和PCT/US2013/058773中所述的抗体或包括完全或大致上来自WO/2012/170071和PCT/US2013/058773中所述的抗体的CDR(如由Kabat、Chothia或其复合法所定义)的抗体，特别是在WO/2012/170071中指定为克隆15(由SEQ ID NO:12-21定义)和克隆17(由SEQ ID NO:1-10定义)的抗体以及PCT/US2013/058773中所述的指定为1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1和1749.1.3的小鼠抗人MCAM单克隆克隆和指定为2120.4.19和2107.4.10的大鼠抗人MCAM单克隆抗体克隆。
4.针对活性筛选抗体的方法
可通过各种方法来测定本文所述的MCAM抗体的抑制活性，所述方法包括用结合相同或大致上类似表位的抗体(例如m2120)进行的竞争性结合测定以及阻断MCAM与它的配体，即层粘连蛋白411的层粘连蛋白α4链的结合。
举例来说，可如下筛选MCAM抗体用以抑制MCAM与层粘连蛋白411的层粘连蛋白α4链之间的相互作用的活性。使MCAM表达性细胞(a)与包含层粘连蛋白α4链(例如层粘连蛋白411的α4链)的重组多肽一起在存在或不存在候选抗体下孵育；(b)例如通过荧光显微术或流式细胞计量术来监测层粘连蛋白α4与细胞的结合水平；以及(c)如果层粘连蛋白α4结合水平在存在候选抗体下比在不存在候选抗体下低，那么将所述候选抗体鉴定为MCAM/层粘连蛋白α4相互作用的抑制剂。替代性筛选方案涉及使用表达层粘连蛋白α4链的细胞的群体，其可与MCAM一起在存在和不存在候选抗体下孵育，以及监测MCAM与细胞群体的结合。如果MCAM与细胞群体的结合在存在候选抗体下比在它不存在下低，那么候选抗体是MCAM拮抗剂。
其它监测方法包括荧光激活的细胞分选(FACS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。
基于MCAM拮抗剂抑制MCAM与它的配体(例如层粘连蛋白α4链)结合的能力鉴定的MCAM拮抗剂是用于治疗特征在于MCAM表达性细胞的浸润的炎症性病状的候选物。
也可在体内评估MCAM抗体的抑制活性。用于评估MCAM抗体的抑制活性的方法学的实例是用实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)模型来执行。EAE是一种在实验室动物中产生，用以产生与人中的多发性硬化症(MS)的症状类似的症状的疾病。参见例如Bauer等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 106:1920-1925(2009)。通常通过用来自其它动物的中枢神经系统的不同蛋白质(例如髓磷脂碱性蛋白和整个脊髓或脑组织的提取物)，或用与髓磷脂特异性反应的T细胞注射动物来产生EAE。EAE通常用于追踪复发性或进行性形式的MS的过程。已充当适于开发针对MS的治疗剂与研究MS的特定疾病进程两者的动物模型。参见例如Gold等,Brain 129:1953-1971(2006)；也参见Steinman等,Ann.Neurol.60:12-21(2006)。
可在EAE的治疗模型中考查MCAM阻断对疾病进展的影响，其中在体内发生TH17极化。用PLP 139-151肽使小鼠免疫以诱发EAE。在疾病发作之后，用候选抗MCAM抗体或同种型对照腹膜内治疗小鼠，并且此后每天如此。以盲化方式每日监测小鼠并评分，并且每2-3天获得体重。用候选MCAM抗体治疗的小鼠中的复发延迟和症状严重性显著减轻指示成功候选抗体。
F.缀合抗体
特异性结合MCAM的缀合抗体可适用于靶向癌或肿瘤细胞以达成破坏，或适用于靶向自体免疫疾病或神经炎性疾病中涉及的细胞。此类抗体也可适用于靶向至少部分地通过MCAM的表达来介导的任何疾病。举例来说，可使此类抗体与其它治疗剂、其它蛋白质、其它抗体和/或可检测标记缀合。参见WO 03/057838；US 8,455,622。所述治疗剂可为可用于治疗、抗击、改善、预防或改进患者的非所要病状或疾病，诸如自体免疫疾病、神经炎性疾病或癌症的任何药剂。治疗剂可包括细胞毒性剂、细胞抑制剂、放射冶疗剂、免疫调节剂或促进或增强抗体的活性的任何生物活性剂。细胞毒性剂可为对细胞具有毒性的任何药剂。细胞抑制剂可为抑制细胞增殖的任何药剂。免疫调节剂可为刺激或抑制免疫应答的产生或维持的任何药剂。放射冶疗剂可为发出放射线的任何分子或化合物。如果使所述治疗剂偶联于MCAM特异性抗体，诸如本文所述的抗体，那么偶联的治疗剂将对MCAM表达性细胞(例如免疫细胞，诸如TH17表达性细胞；或癌细胞，诸如恶性黑素细胞)具有超过对其它细胞的特异性亲和力。因此，缀合抗体的施用直接靶向MCAM表达性细胞，而对其它周围细胞和组织具有最小影响。这可特别适用于毒性太大以致不能独自施用的治疗剂。此外，可使用较小量的治疗剂。
抗体可被修饰以充当免疫毒素。参见例如美国专利号5,194,594。举例来说，可通过使用双官能试剂S-乙酰基巯基丁二酸酐(用于抗体)和3-(2-吡啶基二硫基)丙酸丁二酰亚胺酯(用于篦麻毒素)来使源于植物的细胞毒素篦麻毒素偶联于抗体。参见Pietersz等,Cancer Res.48(16):4469-4476(1998)。偶联导致篦麻毒素的B链结合活性丧失，而既不损害篦麻毒素的A链的毒性潜力，也不损害抗体的活性。类似地，可通过化学插入的硫氢基之间的二硫键来使核糖体装配抑制剂皂素偶联于抗体。参见Polito等,Leukemia 18:1215-1222(2004)。
也可使放射性同位素连接于抗体，所述放射性同位素例如像钇90(90Y)、铟111(111In)、131I、99mTc、放射性银-111、放射性银-199和铋213。放射性同位素与抗体的连接可用常规双官能螯合物进行。对于放射性银-11和放射性银-199连接，可使用基于硫的接头。参见Hazra等,Cell Biophys.24-25:1-7(1994)。银放射性同位素的连接可涉及用抗坏血酸还原免疫球蛋白。对于诸如111In和90Y的放射性同位素，替伊莫单抗(ibritumomab；tiuxetan)可被使用，并且将与所述同位素反应以分别形成111In-替伊莫单抗和90Y-替伊莫单抗。参见Witzig,Cancer Chemother.Pharmacol.,48增刊1:S91-S95(2001)。
也可使其它治疗剂连接于抗体。治疗剂通常具有细胞毒性或细胞抑制性。举例来说，可使抗体与毒性化学治疗药物(诸如美登素(maytansine)、格尔德霉素(geldanamycin))、微管蛋白抑制剂(诸如奥莉斯汀(auristatin))或小沟结合剂(诸如卡奇霉素(calicheamicin))缀合。其它代表性的治疗剂包括已知适用于治疗、管理或改善自体免疫疾病、神经炎性疾病或癌症、或自体免疫疾病、神经炎性疾病或癌症的症状的药剂。所述治疗剂的实例在本文中其它地方加以公开。
也可使抗体与其它蛋白质偶联。举例来说，可使抗体与Fynomer偶联。Fynomer是源于人Fyn SH3结构域的小结合蛋白(例如7kDa)。它们可为稳定的和可溶的，并且它们可缺乏半胱氨酸残基和二硫键。Fynomer可被工程改造来与抗体以相同亲和力和特异性结合靶标分子。它们适于产生基于抗体的多特异性融合蛋白。举例来说，可使Fynomer融合于抗体的N末端和/或C末端以产生具有不同构造的双特异性和三特异性FynomAb。可利用Fynomer文库，通过使用FACS、Biacore和基于细胞的测定进行的允许高效选择具有最优性质的Fynomer的筛选技术来选择Fynomer。Fynomer的实例公开于Grabulovski等,J.Biol.Chem.282:3196-3204(2007)；Bertschinger等,Protein Eng.Des.Sel.20:57-68(2007)；Schlatter等,MAbs.4:497-508(2011)；Banner等,Acta.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.69(Pt6):1124-1137(2013)；以及Brack等,Mol.Cancer Ther.13:2030-2039(2014)中。
也可使本文公开的抗体偶联或缀合于一种或多种其它抗体(例如以形成抗体异源缀合物)。所述其它抗体可结合MCAM内的不同表位，或可结合不同靶标抗原。
也可使抗体与可检测标记偶联。此类抗体可用于例如诊断自体免疫疾病、神经炎性疾病或癌症，监测自体免疫疾病、神经炎性疾病或癌症的进展，和/或评估治疗的功效。此类抗体可适用于在患有或易感自体免疫疾病、神经炎性疾病或癌症的受试者中，或在从所述受试者获得的适当生物样品中进行所述测定。可被偶联或连接于抗体的代表性可检测标记包括各种酶，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如抗生蛋白链菌素/生物素和抗生蛋白/生物素；荧光物质，诸如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质，诸如鲁米诺(luminol)；生物发光物质，诸如荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；放射性物质，诸如放射性银-111、放射性银-199、铋213、碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(5S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；在使用各种正电子发射断层摄影术的情况下的正电子发射金属；非放射性顺磁性金属离子；和被放射性标记或缀合于特定放射性同位素的分子。
可使用本领域中已知的技术直接或通过中间体(例如接头)间接使治疗剂、其它蛋白质、其它抗体和/或可检测标记偶联或缀合于鼠类、嵌合、镶饰或人源化抗体。参见例如Arnon等,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy,"Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(编),第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等,"Antibodies For Drug Delivery,"ControlledDrug Delivery(第2版),Robinson等(编),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,"Monoclonal Antibodies84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编),第475-506(1985)页；"Analysis,Results,And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,"Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy,Baldwin等(编),第303-16页(Academic Press 1985)；以及Thorpe等,Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。适合接头包括例如可裂解和非可裂解接头。可采用在酸性或还原性条件下或在暴露于特定蛋白酶时释放药物的不同接头。同样，可采用在酸性或还原性条件下，在暴露于特定蛋白酶时，或在其它界定条件下释放偶联的治疗剂、蛋白质、抗体和/或可检测标记的不同接头。
IV.治疗方法
本文公开的抗体或其它拮抗剂可用于对尤其患有(例如满足本领域认可的准则，诸如DSM-IV-TR或DSM-V的那些)自体免疫疾病、神经炎性疾病和癌症或相对于一般群体尤其处于自体免疫疾病、神经炎性疾病和癌症的升高的风险下的受试者治疗或实现防治。可根据一种或多种与疾病相关的遗传或生物化学标志物或一种或多种与疾病一致，但不足以允许确定诊断的症状的存在性评估升高的风险。以上提及的种类或疾病未必是彼此互相排斥的；例如多发性硬化症可被分类为神经炎症性或自体免疫疾病。可通过本发明方法治疗的一些特定示例性疾病包括多发性硬化症、帕金森氏病、过敏性接触性皮炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、类肉瘤病、炎性肠病、克罗恩氏病和癌症，特别是实体肿瘤，诸如黑素瘤。尽管方法的实施不依赖于对机理的理解，但据信在一些方法中，抗体或其它拮抗剂至少部分地通过抑制在T细胞(例如TH17细胞)上表达的MCAM和层粘连蛋白α4链(例如在内皮细胞的表面上表达的层粘连蛋白411的α4链)的相互作用来起作用。抗体-药物缀合物可通常在摄取于靶向细胞内之后具有额外作用机理，包括连接的药剂的细胞毒性或细胞抑制性作用。抗体-药物缀合物也可诱导肿瘤相关的巨噬细胞毒性。
神经炎症性病状的特征在于CNS炎症和/或细胞/组织损害。征候可包括神经胶质活化增加、促炎性细胞因子/趋化因子水平(例如TNFα、INFγ、IL-1β)增加、血脑屏障可渗透性增加和/或免疫细胞(例如白细胞)向CNS募集/侵袭增加。神经炎症常常是慢性的，伴有免疫系统的细胞的慢性活化(即自体免疫相关神经炎症)，但可或者或另外具有急性发作。
多发性硬化症是适于治疗的疾病，呈它的至少四个亚型中的任一个。复发-缓解型MS(RR-MS)是最常见形式的MS，并且特征在于具有明确确定的恶化/复发(急性发作)，继之以部分或完全康复。在复发时期之间不存在疾病进展。最初(在诊断时)，RR-MS占所有新诊断受试者的约85％。对复发的定义要求新症状或征象存在至少24小时，不伴有发热或间发疾病(诸如“流感”或泌尿道感染)，因为体温升高可揭露沉默或陈旧病变。
原发进行型(PP-MS)是从开始连续的，不具有明确复发。可存在平稳状态(稳定时期)。所有MS受试者中的10-15％处于这个组中，并且它倾向于发生在年长个体中。不同于其中女性以约2:1占优势的其它形式，在这个组中，女性与男性比率是相等的。此外，PP-MS倾向于呈现有较少脑MRI变化和更多脊髓病/脊髓相关变化。
继发进行性形式(SP-MS)以RR-MS开始，并且稍后稳定进展在伴有或不伴有复发下发生。近似50％的复发-缓解型受试者进展成继发进行性形式。
发生在约5％的个体中的进行性复发形式(PR-MS)是从发作开始进行性的，具有叠加复发(伴有或不伴有康复)。
对MS的诊断通常基于医疗史、神经检查和各种测试，包括磁共振成像(MRI)、诱发电位(EP)和脊髓液分析。对MS的明确诊断要求在中枢神经系统(CNS)的至少两个单独区域中存在损害迹象，所述区域包括脑、脊髓和视神经；以及有迹象表明损害相隔至少一个月发生，并且排除所有其它可能的诊断。像治疗性治疗根据本领域认可的准则而诊断有MS的受试者一样，本发明方法也可防治性地用于治疗具有MS的至少一种征象或症状的个体，所述征象或症状将他们置于相较于一般健康个体群体，进展成MS的风险增加下。举例来说，方法可用于治疗MS样症状—被称为临床孤立综合征(CIS)已发作(也称为复发或恶化)一次，可或可不继续下去以显现MS的个体。处于显现MS的风险下的个体也可通过针对蛋白KIR4.1的抗体在他们的血清中的存在性以及其它方法来鉴定。
神经炎性疾病也包括帕金森氏病。帕金森氏病的症状包括震颤(例如手、臂、腿、颚和面部颤抖)；肢体和躯干僵化或僵硬；运动徐缓或运动缓慢；姿势不稳定或平衡和调协受损；抑郁和其它情绪变化；吞咽、咀嚼和言语困难；泌尿问题或便秘；皮肤问题；睡眠破坏。帕金森氏病可根据所述症状和/或脑扫描和/或用以排除其它疾病的其它测试加以诊断。
本发明方法可用于抑制癌生长或转移。癌可为造血性恶性肿瘤或良性或恶性实体肿瘤，即由过度细胞生长或增殖所致的细胞团块，包括癌前病变。癌可为良性的、恶性的或转移性的。转移性癌是指已从它首先开始所处的地点扩散至体内另一地点的癌。由转移性癌细胞形成的肿瘤被称为转移性肿瘤或转移，其是也用于指代癌细胞向身体的其它部分扩散所采用的过程的术语。一般来说，转移性癌与原始或原发性癌具有相同名称和相同类型的癌细胞。癌的实例包括实体肿瘤，诸如黑素瘤、癌瘤、母细胞瘤和肉瘤。癌也包括血液学恶性肿瘤，诸如白血病或淋巴性恶性肿瘤，诸如淋巴瘤。所述癌的更特定实例包括鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric/stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈部癌。
自体免疫疾病包括全身性自体免疫疾病、器官或组织特异性自体免疫疾病和展现自体免疫型表现的疾病。在这些疾病中，身体产生针对它自身的一种抗原的细胞和/或体液免疫应答，从而导致破坏那个抗原以及潜在损坏性和/或致命性后果。如果存在，那么细胞应答可为B细胞应答或T细胞应答或两者。TH17细胞，作为一种特征在于产生白介素(IL)-17和IL-22的谱系T辅助细胞，已被报道会进入组织中以促进病原性自体免疫应答，包括人的多发性硬化症和小鼠的实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)。参见例如Cua等,Nature 421:744-748(2003)；Ivonov等,Cell 126:1121-1133(2006)。TH17细胞可通过它们特异性募集至组织并浸润组织来引发或传播炎症性应答。
自体免疫疾病的实例包括格雷福斯病(Graves'disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、自体免疫多腺性综合征、胰岛素依赖性糖尿病(1型糖尿病)、胰岛素抗性糖尿病(2型糖尿病)、免疫介导的不育、自体免疫阿狄森氏病(autoimmuneAddison's disease)、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、疱疹样皮炎、自体免疫脱发、白癜风、自体免疫溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫血小板减少性紫癜、恶性贫血、重症肌无力、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、僵人综合征(stiff mansyndrome)、急性风湿热、交感性眼炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、自体免疫葡萄膜炎、颞动脉炎、白塞氏病(Bechet's disease)、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性硬化、自体免疫肝炎、自体免疫卵巢炎、纤维肌痛、多发性肌炎、皮肌炎、僵直性脊椎炎、高安动脉炎(Takayashu arteritis)、脂膜炎、类天疱疮、未明原因的血管炎、anca阴性血管炎、anca阳性血管炎、全身性红斑狼疮、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、全身性坏死性脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、CREST综合征、抗磷脂综合征、休格连氏综合征(Sjogren's syndrome)、嗜酸粒细胞性胃肠炎、非典型表面皮炎、心肌病变、感染后综合征、感染后心肌膜炎、乳糜泻、多发性硬化症、类肉瘤病、克罗恩氏病和牛皮癣。
以使发作延迟、减轻严重性、抑制进一步退化和/或改善所治疗疾病(例如癌症)的至少一种征象或症状的有效方案施用抗体或其它拮抗剂，所述方案意指剂量、施用途径和施用频率。如果患者已罹患病症，那么方案可被称为治疗有效方案。如果患者相对于一般群体处于病症风险升高下，但尚未经历症状，那么方案可被称为防治有效方案。在一些情况下，可相对于历史对照或在同一患者中的过往经历，观察个别患者中的治疗或防治功效。在其它情况下，可在临床前或临床试验中，相对于未治疗患者的对照群体，在治疗患者的群体中证明治疗或防治功效。
抗体的示例性剂量是0.1-20或0.5-5mg/kg体重(例如0.5、1、2、3、4或5mg/kg)，或作为固定剂量的10-1500mg。剂量取决于患者的状况和对先前治疗的响应(如果有的话)，治疗是防治性的抑或是治疗性的，以及病症是急性的抑或是慢性的，以及其它因素。
施用可为胃肠外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌肉内施用。对于一些抗体以及在一些情况下，通过静脉内或皮下施用向全身性循环中施用是优选的。静脉内施用可例如通过历经诸如30-90分钟的时期进行输注来达成。
施用频率取决于抗体在循环中的半衰期、患者的病状和施用途径以及其它因素。响应于患者的状况的变化或所治疗病症的进展，频率可为每日、每周、每月、每季度或在不定期间隔下。用于静脉内施用的示例性频率是历经连续治疗过程，在每周与每季度之间，但更大或更小频率的给药也是可能的。对于皮下施用，示例性给药频率是每日至每月，但更大或更小频率的给药也是可能的。
施用的剂量的数目取决于病症是急性的抑或是慢性的，以及病症对治疗的响应。对于急性病症或慢性病症的急性恶化，1次与10次之间的剂量常常是足够的。有时，单次推注剂量(任选以分开形式)足以用于急性病症或慢性病症的急性恶化。对于急性病症或急性恶化的复发，可重复治疗。对于慢性病症，可在定期间隔下，例如每周、每两周、每月、每季度、每六个月，持续至少1、5或10年或患者终生施用抗体。
用本文公开的抗体或其它拮抗剂治疗可与有效针对所治疗病症的其它治疗组合。组合治疗剂可被配制以达成分开施用。用于治疗多发性硬化症的额外治疗剂包括以下中的一个或多个：特立氟胺(teriflunomide)、干扰素β-1a、干扰素β-1b、乙酸格拉默(glatiramer acetate)、芬戈莫德(fingolimod)和米托蒽醌(mitoxantrone)或皮质类固醇(corticosteroid)，诸如泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)或地塞米松(dexamethasone)。
用于癌症的额外治疗剂包括烷化剂，诸如卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；抗代谢剂，诸如氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、甲氨蝶呤(methotrexate)和羟基脲(hydroxyurea)；天然产物，包括植物生物碱和抗生素，诸如博莱霉素(bleomycin)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、依托泊苷(etoposide)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和泰素(Taxol)(太平洋紫杉醇(paclitaxel))或相关化合物，诸如拓扑异构酶1抑制剂伊立替康(irinotecan)；替莫唑胺(temozolomide)和卡莫司汀(carmustine)；和酪氨酸激酶的抑制剂，诸如(苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、(索拉非尼(sorafenib))和(埃罗替尼(erlotinib))或(吉非替尼(gefitinib))；血管生成的抑制剂；和单克隆抗体，包括针对HER2抗原的针对VEGF的或针对表皮生长因子(EGF)受体的抗体，诸如(西妥昔单抗(cetuximab))和(帕尼单抗(panitumumab))。
用于治疗帕金森氏病的额外药剂包括左旋多巴(levodopa)、苯扎赛德(benzaseride)、卡比多巴(carbidopa)、多巴胺(dopamine)激动剂、非麦角多巴胺激动剂、儿茶酚-O-甲基(“COMT”)抑制剂(例如像恩他卡朋(entacopone)或托卡朋(tolcopone))、单胺氧化酶(“MAO”)抑制剂(例如像雷沙吉兰(rasagaline)、金刚烷胺(amantadine))或抗胆碱能剂。
V.制剂
用于胃肠外施用的药物组合物优选是无菌的和大致上等张的，并且在GMP条件下制造。药物组合物可以单位剂型(即供单次施用的剂量)提供。可使用一种或多种生理上和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂配制药物组合物。制剂取决于所选施用途径。对于注射，抗体可被配制成优选于生理上可相容的缓冲液，诸如汉克氏溶液(Hank’ssolution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水或乙酸盐缓冲液(以减轻在注射部位处的不适)中的水溶液。溶液可含有配制剂，诸如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体可呈用于在使用之前，用适合媒介物(例如无菌无热原水)复原的冻干形式。
本发明提供制剂，其包含本文所述的抗体或其它拮抗剂、缓冲剂、一种或多种糖和/或多元醇和表面活性剂，并且具有约5.5至约7的范围内的pH。可制备用于以液体形式或以冻干形式储存的制剂。当以冻干形式储存时，制剂可用液体(例如无菌水)复原以获得本文所述的浓度和性质。当冻干组合物被称为可通过添加水来复原以产生具有指定组分浓度和pH的制剂时，这意味着冻干制剂可仅通过添加水(即不供给额外量的组分或添加酸或碱以改变pH)来被如此复原。如果冻干制剂被复原成与制剂冻干前相同的体积，那么冻干前液体制剂的浓度和性质也可根据下述那些浓度和性质。如果体积不同，那么制剂的浓度应按比例调整。举例来说，如果复原体积是冻干前体积的一半，那么冻干前制剂中组分的浓度应为复原制剂中浓度的一半。
任选地，将抗体再混悬于如下所述的制剂中，暂时冷冻以用于冻干前储存，冻干，并且用水复原成与冻干前相同的浓度。这种制剂应优选使抗体在整个冷冻、冻干、储存和复原期间稳定，以及适于胃肠外施用。在示例性工作流程中，将纯化抗体在约40mg/mL下再混悬于制剂中，并且在-40℃下冷冻储存在袋中。在室温下使袋解冻3小时，并且汇合内含物。将制剂经0.2微米无菌过滤器无菌过滤。小瓶用5.4mL制剂填充并冻干。将冻干小瓶储存在2-8℃下。通过添加无菌水(例如视制剂而定，近似5.0至5.4mL无菌水)来复原冻干小瓶。接着添加5mL复原产品至含有20-100mL生理盐水、乳酸林格氏溶液或5％右旋糖溶液等的IV袋的孔口中以用于向患者中静脉内输注。
一些制剂包括填充剂，其可或可不与糖/多元醇组分相同。通常，制剂是无菌的，例如如通过使用0.2μm或0.22μm过滤器进行无菌过滤所实现。如以下在冷冻和解冻时所进一步界定，由于片段化和/或聚集的水平较低至不可检测，制剂也通常是稳定的。在复原冻干饼块之后，其它制剂在约40℃下稳定至少3个月。在一些制剂中，小于约5％的抗体在制剂中以聚集体形式存在。
在一些制剂中，抗体以约5mg/mL至约100mg/mL范围内的浓度存在。在一些制剂中，抗体以约5mg/mL至约50mg/mL范围内的浓度存在。在一些制剂中，抗体以约25mg/mL至约50mg/mL范围内的浓度存在。举例来说，抗体可以约35-45mg/mL或约40mg/mL的浓度存在。抗体可以约50mg/小瓶至约500mg/小瓶或更多的无菌液体剂型存在。抗体可以约40mg/小瓶至约500mg/小瓶的冻干剂型存在。举例来说，抗体可以约250-350mg/小瓶或约200mg/小瓶的无菌液体或冻干剂型存在。
制剂可包含任何本文所述的抗体。在一些制剂中，配制的抗体是包含以下的抗体：(i)成熟重链可变区，其包含SEQ ID NO:161的三个Kabat CDR，例外之处是位置32(Kabat编号)可为N、S或Q，并且位置33(Kabat编号)可为G或A，其中所述成熟重链可变区与SEQ IDNO:161至少90％同一，和(ii)成熟轻链可变区，其包含SEQ ID NO:123的三个Kabat CDR，并且与SEQ ID NO:123至少90％同一。在所述制剂中，成熟重链可变区的位置1(Kabat编号)可被E占据。在一些制剂中，成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:161，并且成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123。举例来说，在一些制剂中，成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:161，并且成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:123。
在其它制剂中，配制的抗体是本文所述的分离的抗MCAM抗体。这种制剂中，分离的抗MCAM抗体在包括氨基酸残基141的表位处结合人MCAM(SEQ ID NO:11)。
缓冲剂在公开的制剂中用于实现适于抗体的pH，所述缓冲剂例如像组氨酸、丁二酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。一些制剂具有约5.5至约7的范围内的pH，例如pH 5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。一些制剂具有约5.5至约6.5之间的pH。一些制剂具有约6.0的pH，并且其它制剂具有约6.5的pH。在一些制剂中，组氨酸缓冲剂以约10mM至约30mM范围内的浓度，例如以约15-25mM或约20mM的浓度存在。
适于制剂的糖和/或多元醇包括海藻糖和蔗糖或其组合。糖/多元醇充当填充剂、冻干保护剂和/或张力调整剂。举例来说，一些制剂包括以约200mM至约260mM范围内的浓度存在的海藻糖，或以约200mM至约260mM范围内的浓度存在的蔗糖。一些制剂包括以约220mM的浓度存在的海藻糖。其它制剂包括以约220mM的浓度存在的蔗糖。一些所述制剂的特征在于重量摩尔渗透浓度在约250-400、300-400、或300-350mOsm/kg的范围内，例如像287或295mOsm/kg。
制剂可含有表面活性剂以降低抗体聚集和吸附于表面。适合表面活性剂包括以约0.005重量％至约0.05重量％范围内的浓度存在的聚山梨醇酯20。聚山梨醇酯20防止否则将发生在抗体的制剂中的聚集或浊度显著增加。聚山梨醇酯20可以约0.01％至约0.05％范围内的浓度存在。举例来说，浓度可为0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％或0.05％。或者，在一些制剂中，聚山梨醇酯20以约0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L或0.5g/L范围内的浓度存在。一些制剂包括在0.2g/L的浓度下的聚山梨醇酯20。
示例性制剂(液体，冻干前或在冻干之后复原)的特征在于pH在约5.5至约7的范围内，并且包括：(a)在约10mg/mL至约50mg/mL范围内的浓度下的本文所述的抗体；(b)以约10mM至约30mM范围内的浓度存在的组氨酸缓冲剂；(c)一种或多种选自以约200mM至约260mM范围内的浓度存在的海藻糖和以约200mM至约260mM范围内的浓度存在的蔗糖的糖和多元醇(“糖/多元醇”)；和(d)以约0.005重量％至约0.05重量％范围内的浓度存在的聚山梨醇酯20。在一个实例中，制剂可包括：(a)任何本文所述的抗体；(b)在约20mM的浓度下的组氨酸缓冲剂；(c)在约220mM的浓度下的蔗糖；(d)在约0.02％的浓度下的聚山梨醇酯20；和约6.0的pH。在另一实例中，制剂可包括：(a)任何本文所述的抗体；(b)在约20mM的浓度下的组氨酸缓冲剂；(c)在约220mM的浓度下的海藻糖；(d)在约0.02％的浓度下的聚山梨醇酯20；和约6.5的pH。
一些冻干制剂包括：(a)本文所述的抗体；(b)组氨酸缓冲剂；(c)海藻糖或蔗糖；和(d)聚山梨醇酯20。冻干制剂可包括约200mg抗体。一些冻干制剂能够用无菌水复原。一些冻干制剂包括100-300或150-250mg抗体、10至20或14至16mg组氨酸、300至450或350至400mg蔗糖、和0.5至1.5mg或0.75至1.25mg聚山梨醇酯20。其它冻干制剂包括100至300或150至250mg抗体、10至20或14至16mg组氨酸、360至500或400至450mg海藻糖脱水物、和0.5至1.5mg或0.75至1.25mg聚山梨醇酯20。
示例性冻干制剂包括200mg抗体、15.5mg组氨酸、376mg蔗糖和1mg聚山梨醇酯20。另一示例性冻干制剂包括200mg抗体、15.5mg组氨酸、416mg海藻糖二水合物和1mg聚山梨醇酯20。一些所述制剂可被复原成约5mL的体积。其它冻干制剂与这个段落中公开的任何冻干制剂以相同比例包括相同组分，但数量不同(例如400mg抗体、31mg组氨酸、752mg蔗糖和2mg聚山梨醇酯20)。
冻干制剂可被复原成抗体浓度是约30-50或35-45mg/mL，例如复原成约40mg/mL；(b)组氨酸缓冲剂以约10-30或15-25mM，例如约20mM的浓度存在；(c)蔗糖或海藻糖以约160-330或200-260mM，例如约220mM的浓度存在；(d)聚山梨醇酯20以约0.1-0.3或0.15至0.25g/L，例如约0.2g/L的浓度存在；和(e)约5.5-6.5，例如约6.0(如果蔗糖存在)或6.5(如果海藻糖存在)的pH。
液体或复原冻干制剂优选是大致上等张的，从而暗示重量摩尔渗透浓度是约250-350mOsm/kg水。一些制剂具有270-300mOsm/kg的重量摩尔渗透浓度。一些制剂具有约287或约295mOsm/kg的重量摩尔渗透浓度。液体或复原的冻干制剂也可为高张的(>350mOsm/kg水)或低张的(<250mOsm/kg水)。
可在无不同于在本文中被描述为组分的那些的药物赋形剂、载体等下制备任何所述制剂。这种制剂可被描述为由叙述的组分组成，或如果存在不影响制剂的性质的无关紧要量的其它组分，那么可被描述为基本上由叙述的组分组成。制剂优选在由FDA核准或可由FDA核准用于制备向人施用的药物的优良制造规范(GMP)下制备。
本发明涵盖在38℃-42℃下持续至少约30天、至少约3个月或更久具有稳定性(例如如通过高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)所评估)的抗体制剂。所述制剂也可在20℃-24℃下持续至少约1年具有稳定性，和/或在2℃-4℃下持续至少约3年具有稳定性。评估冻干制剂以冻干状态储存的稳定性。如果在在这些指定时间和温度组合中的一个或多个下孵育之后，制剂满足对较低至不可检测片段化和/或较低至不可检测聚集的以下定义，那么它被视为是稳定的。更特定来说，公开的制剂展现较低至不可检测水平的抗体聚集和/或片段化，或片段化及/或聚集超过初始水平较低或不可检测增加(例如小于约5％聚集)。具有较低至不可检测水平的片段化的制剂含有的总蛋白质中至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％例如呈单峰形式，如通过疏水相互作用色谱法所测定，或根据还原毛细管凝胶电泳(rCGE)，呈双峰形式(单个对应于抗体重链和抗体轻链中的各个)，其代表非降解抗体，并且不含有各自占有总蛋白质超过5％、超过4％、超过3％、超过2％、超过1％或超过0.5％的其它单峰。以蛋白质重量计，具有较低至不可检测水平的聚集的制剂含有不超过约15％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％或不超过约0.5％聚集，如通过高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)所测量。举例来说，在一些制剂中，小于约5％的抗体以聚集体形式存在。稳定制剂也显示少许或不显示生物活性损失，例如具有的可通过ELISA和/或额外功能性测定测量的结合亲和力是初始可测量值的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
VI.试剂盒
本发明进一步提供包括本文公开的MCAM抗体或其它拮抗剂和相关材料，诸如使用说明书(例如包装插页)的试剂盒(例如容器)。使用说明书可例如含有用于施用MCAM拮抗剂以及任选一种或多种额外药剂的说明书。含MCAM拮抗剂的容器可为单位剂量容器、大包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量容器。
包装插页是指惯常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或涉及使用所述治疗产品的警告的信息。
试剂盒也可包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它也可包括从商业和使用者立场来看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
以上或以下引用的所有专利申请、网站、其它出版物、登记号等都出于所有目的以引用的方式整体并入本文，所述引用的程度就好像明确地和个别地指示各个别条目以引用的方式如此并入一样。如果在不同时间有序列的不同版本与登记号相关联，那么意指的是在本申请的有效申请日期时与所述登记号相关联的版本。有效申请日期意指实际申请日期或涉及所述登记号的优先权申请的申请日期(如果可适用)的早先日期。同样，如果在不同时间有出版物、网站等的不同版本被公布，那么除非另外指示，否则意指的是在申请的有效申请日期时最新近公布的版本。除非另外明确指示，否则本发明的任何特征、步骤、要素、实施方案或方面都可与任何其它特征、步骤、要素、实施方案或方面组合使用。尽管本发明已出于明晰和理解的目的通过说明和举例的方式相当详细地加以描述，但将明显的是某些变化和修改可在随附权利要求的范围内加以实施。
实施例
材料和方法
抗体产生/表征
为产生能够结合鼠类MCAM的抗体，通过使鼠类MCAM的细胞外结构域融合于人IgG来产生MCAM-Fc，并且使用标准技术在CHO细胞中产生。用含100μg MCAM-Fc蛋白的CFA(1:1体积)免疫Lou/M大鼠。在两周间隔下用含MCAM-Fc蛋白的不完全弗氏佐剂(IFA)(1:1体积)使大鼠加强免疫两次。使用标准方案从免疫的大鼠产生杂交瘤，并且通过Clonepix来选择克隆。用全长鼠类MCAM基因转染CHO细胞，并且使用新霉素和标准技术针对稳定表达加以选择。使用标准技术用羧基荧光素丁二酰亚胺酯(CFSE)荧光标记亲本CHO细胞(MCAM阴性)，并且在1:1比率下与未标记的MCAM转染CHO细胞混合。使杂交瘤上清液与这个细胞混合物一起孵育30分钟，并且通过流式细胞计量术用荧光标记的抗大鼠二级抗体(Jackson Immuno)检测潜在MCAM特异性抗体的结合。
使针对MCAM特异性抗体被筛选为阳性的杂交瘤的上清液与荧光标记的小鼠MCAM-Fc蛋白(5μg/mL)一起预孵育30分钟，随后添加至层粘连蛋白α4表达性细胞系WM2664中，并且通过流式细胞计量术来测定对MCAM-Fc蛋白与细胞系的结合的中和。
为产生能够结合人MCAM的大鼠抗体，通过使人MCAM的细胞外结构域融合于人IgG来产生hMCAM-Fc，并且使用标准技术在CHO细胞中产生。用含250μg hMCAM-Fc蛋白的CFA(1:1体积)免疫Lou/M大鼠。在两周间隔下用含hMCAM-Fc蛋白的不完全弗氏佐剂(IFA)(1:1体积)使大鼠加强免疫两次。使用标准方案从免疫的大鼠产生杂交瘤，并且通过Clonepix来选择克隆。用全长人MCAM基因转染CHO细胞，并且使用新霉素和标准技术针对稳定表达加以选择。使用标准技术用羧基荧光素丁二酰亚胺酯(CFSE)荧光标记亲本CHO细胞(MCAM阴性)，并且在1:1比率下与未标记的人MCAM转染CHO细胞混合。使杂交瘤上清液与这个细胞混合物一起孵育30分钟，并且通过流式细胞计量术用荧光标记的抗大鼠二级抗体(Jackson Immuno)检测潜在人MCAM特异性抗体的结合。
为产生能够结合人MCAM的小鼠抗体，通过使人MCAM的细胞外结构域融合于人IgG来产生hMCAM-Fc，并且使用标准技术在CHO细胞中产生。用含50μg hMCAM-Fc蛋白的CFA(1:1体积)免疫Balb/c小鼠。在两周间隔下用含hMCAM-Fc蛋白的不完全弗氏佐剂(IFA)(1:1体积)使小鼠加强免疫两次。使用标准方案从免疫的小鼠产生杂交瘤，并且通过Clonepix来选择克隆。用全长人MCAM基因转染CHO细胞，并且使用新霉素和标准技术针对稳定表达加以选择。使用标准技术用羧基荧光素丁二酰亚胺酯(CFSE)荧光标记亲本CHO细胞(MCAM阴性)，并且在1:1比率下与未标记的人MCAM转染CHO细胞混合。使杂交瘤上清液与这个细胞混合物一起孵育30分钟，并且通过流式细胞计量术用荧光标记的抗小鼠二级抗体(Jackson Immuno)检测潜在人MCAM特异性抗体的结合。
使针对人MCAM特异性抗体被筛选为阳性的杂交瘤的上清液与荧光标记的hMCAM-Fc蛋白(5μg/mL)一起预孵育30分钟，随后添加至层粘连蛋白α4表达性细胞系WM2664中，并且通过流式细胞计量术来测定对hMCAM-Fc蛋白与细胞系的结合的中和。
核酸和蛋白质操作
为确定CDR，使用RNAquous-4PCR试剂盒(Ambion)从杂交瘤细胞分离总RNA，并且用于cDNA合成。使用根据Marathon cDNA扩增(Clontech)修改的方法合成第一链和第二链cDNA，其中cDNA衔接头连接于获得的dscDNA的5'末端。基于重链与轻链两者的特异性抗体同种型恒定区序列设计反向特异性引物，并且连同衔接头引物一起用于使用Pfu UltraDNA聚合酶(Stratagene)进行的对VL片段与VH片段两者的PCR扩增中。将扩增的PCR产物克隆至pCR-Blunt-TOPO(Invitrogen)中，并且测定核苷酸序列。针对VL序列和VH序列内的同一性百分比来比较鉴定的克隆的序列。
为测定上清液中IL-17浓度，使用商业试剂盒(R&D Systems)进行ELISA。
实施例1.抗MCAM单克隆抗体的产生
如以上材料和方法中所述产生针对人MCAM蛋白的小鼠和大鼠单克隆抗体。通过评估单克隆抗体结合用人MCAM转染的细胞的能力来确认单克隆抗体与人MCAM之间的特异性结合。为此，用羧基荧光素丁二酰亚胺酯(CFSE)标记未转染细胞，并且与未标记的人MCAM转染细胞混合。因此，未转染细胞可被区分。
使用这些技术，分离823个独立小鼠融合物克隆，并且显示表达能够结合人MCAM的抗体。另外，分离152个独立大鼠融合物克隆，并且显示表达能够结合人MCAM的抗体。
接着，抗人MCAM单克隆抗体用于测试它们阻断人MCAM与它的配体结合的能力。使人MCAM-Fc蛋白(5μg/mL)与同种型对照抗体或10μg/mL测试单克隆抗体一起于PBS中预孵育30分钟。添加混合物至健康脊髓组织切片中，并且随后如以上材料和方法中所述通过荧光显微术来表征。此外，使亲本CHO细胞(CHOK1)或用人MCAM基因转染的CHO细胞与CHO培养基(DMEM)、重组层粘连蛋白411(10μg/ml)或重组层粘连蛋白511(即层粘连蛋白10(α5β1γ1))(10μg/ml)一起在37℃下预孵育45分钟。洗涤细胞，并且通过流式细胞计量术用全层粘连蛋白抗体检测层粘连蛋白411而非层粘连蛋白511与MCAM的特异性结合。在层粘连蛋白孵育之前，人MCAM转染的CHO细胞与抗MCAM抗体(在20μg/ml下)一起预孵育使人MCAM与层粘连蛋白411的结合消除。
使用这个技术，显示上述823个独立小鼠融合物克隆中的87个以及152个独立大鼠融合物克隆中的26个表达能够阻断人MCAM蛋白与它的配体(层粘连蛋白的α-4链)之间的相互作用的抗体。
实施例2.对抗MCAM单克隆抗体的进一步表征
如下进一步表征在以上实施例1中被描述为能够(i)结合人MCAM，以及(ii)阻断人MCAM与层粘连蛋白的α-4链之间的相互作用的87个独立小鼠融合物克隆和26个独立大鼠融合物克隆。首先，如下测定对单克隆抗体阻断人MCAM与层粘连蛋白的α-4链结合的能力的IC50定量。使表达人MCAM的CHO细胞与抗人MCAM抗体(在各种浓度下)一起在4摄氏度下孵育30分钟。接着洗除未结合抗体，并且使细胞与20ug/ml的重组人层粘连蛋白411一起在37摄氏度下孵育45分钟。接着洗除未结合层粘连蛋白，并且用荧光标记的抗层粘连蛋白抗体检测结合于细胞表面的层粘连蛋白。在洗涤之后，通过流式细胞计量术来检测结合于表面的层粘连蛋白的量，并且基于平均荧光强度计算IC50。
使用上述测定，6个独立抗人MCAM单克隆抗体克隆被鉴定为结合人MCAM，并且具有最大的阻断在细胞表面上表达的人MCAM与它的结合配体人层粘连蛋白411之间的相互作用的能力。这六个抗MCAM单克隆抗体克隆在本文中被称为(i)小鼠抗人MCAM单克隆克隆1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1和1749.1.3，以及(ii)大鼠抗人MCAM单克隆抗体克隆2120.4.19和2107.4.10。这些抗体的重链和轻链以及它们的高变区的氨基酸和核酸序列以SEQ ID NO:29-92提供。更具体来说，在以上测定中，单克隆抗体克隆1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1、1749.1.3、2120.4.19和2107.4.10的IC50分别被确定为0.469ug/ml、0.431ug/ml、0.307ug/ml、0.545ug/ml、0.888ug/ml和0.290ug/ml。此外，被进行以确定各单克隆抗体的特异性结合亲和力的实验证明各自能够以高亲和力结合人MCAM蛋白(数据未显示)。因此，这些特异性单克隆抗体各自都极其能够结合人MCAM，并且抑制细胞表达的人MCAM与它的α-4层粘连蛋白结合配体的相互作用。相反，两个对照抗体，即非特异性人IgG1抗体和先前描述的被称为ABX-MA1的完全人抗MCAM抗体(例如参见Mills等,Cancer Res.62:5106(2002)以及美国专利号6,924,360、7,067,131和7,090,844)均不能阻断人MCAM与它的层粘连蛋白411对应物之间的结合相互作用。因此，以上鉴定的6个特异性单克隆抗体具有(i)以高亲和力结合活细胞的表面上的人MCAM，并且(ii)阻断细胞表达的人MCAM与包含α-4层粘连蛋白多肽链的层粘连蛋白的相互作用的新型能力。
实施例3.对抗MCAM单克隆抗体的结构域结合分析
ForteBio分析用于确定人MCAM蛋白上由单克隆抗体克隆1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1、1749.1.3、2120.4.19和2107.4.10识别和结合的抗原表位的位置。使用以下方案：ForteBio抗人IgG Fc生物传感器用于将包括全长MCAMhFc蛋白的各种MCAMhFc结构域固定于生物传感器表面上。将这些传感器浸渍于MCAM特异性1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1、1749.1.3、2120.4.19或2107.4.10抗体中以检测与这些结构域或全长蛋白质的结合。在将这些样品装载至黑色96孔板中之后，如下使Octet Red程序化：60秒用于基线#1；180秒用于装载各种结构域；60秒用于基线#2；180秒用于抗体与结构域缔合；以及240秒用于抗体从结构域解离。
使用的试剂和供给物：
1.MCAMhFc，最终浓度在5ug/ml下
2.抗体克隆1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1、1749.1.3、2120.4.19和2107.4.10克隆，在5ug/ml下
3.用于动力学实验的ForteBio抗人IgG Fc捕集(AHC)生物传感器，目录号18-5060
4.来自Greiner Bio-one的块状96孔板，目录号655209
5.ForteBio Octet Red机器
6.新鲜组织培养基(含20％FCS的DMEM)用作稀释缓冲液
来自这些分析的结果如下：
单克隆抗体克隆1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1和1749.1.3全都显示结合见于人MCAM蛋白的结构域3上的抗原表位，所述结构域3由人MCAM蛋白的氨基酸244-321(SEQ IDNO:24)明确界定。抗体不能结合人MCAM结构域1(即氨基酸19-129，SEQ ID NO:22)、结构域2(即氨基酸139-242，SEQ ID NO:23)或结构域1和2的组合(即氨基酸19-242)。因此，单克隆抗体克隆1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1和1749.1.3确定位于人MCAM蛋白的结构域3内的新型抗原表位。
单克隆抗体克隆2120.4.19和2107.4.10各自显示结合由人MCAM结构域1(即氨基酸19-129，SEQ ID NO:22)和结构域2(即氨基酸139-242，SEQ ID NO:23)的组合界定的抗原表位。这两个单克隆抗体均不单独结合人MCAM结构域1。因此，单克隆抗体克隆2120.4.19和2107.4.10确定新型抗原表位，所述表位通过存在人MCAM蛋白结构域1与2两者而确定。
与以上不同，先前描述的完全人抗MCAM抗体ABX-MA1结合与上述那些不同的抗原表位，即仅在人MCAM结构域1内被完全界定和涵盖的抗原表位。
鉴于这些结果，因为单克隆抗体克隆1174.1.3、1414.1.2、1415.1.1、1749.1.3、2120.4.19和2107.4.10各自能够(i)结合人MCAM，并且(ii)阻断人MCAM与含有α-4层粘连蛋白的蛋白质之间的相互作用，而ABX-MA1抗体仅能够结合人MCAM，而不阻断人MCAM与含有α-4层粘连蛋白的蛋白质之间的相互作用，所以这些结果证明人MCAM结构域2、人MCAM结构域3及其组合在与α-4层粘连蛋白链的结合相互作用方面起作用。鉴于此，明显的是结合人MCAM结构域2、人MCAM结构域3和/或其组合的抗体将适用作能够阻断人MCAM与α-4层粘连蛋白之间的相互作用的药剂，并且由此适用于抑制本文所述的由那个相互作用所致的各种后果。相反，结合仅由人MCAM结构域1界定的抗原表位的抗体(诸如本文所述的ABX-MA1抗体)不适用于阻断MCAM/α-4层粘连蛋白相互作用和它的各种下游生物学后果。
实施例4.鸟枪诱变表位定位
使用鸟枪诱变和高通量细胞表达技术来鉴定用于抗MCAM抗体结合的各种目标氨基酸残基，所述技术使得能够在真核细胞内表达和分析突变靶标蛋白质的大型文库。使人MCAM蛋白中的每个残基个别地突变成丙氨酸或其它指定残基以测定功能变化。在标准哺乳动物细胞系内表达蛋白质。
表1显示用于产生鸟枪诱变文库的试剂和方法的概述。
表1
亲本质粒 hsMCAM-V5/HIS6(登记号NP 006491)
最终文库大小 528个突变克隆加上17个额外定点突变体
突变策略 丙氨酸扫描诱变
细胞类型 BHK-S
表位标签 C末端V5/HIS6
全长人MCAM被成功密码子优化，合成，并且亚克隆至哺乳动物高表达载体中。接着验证这个亲本构建体的序列，并且通过免疫检测方法验证哺乳动物细胞表达。
成功针对高通量鸟枪诱变形式来优化通过免疫荧光对2120.4.19抗体和小鼠血清与MCAM结合的检测。以384孔形式，用单一稀释度的二级抗体测试连续稀释的各初级抗体。测试抗体对表达人MCAM的293T和BHK细胞的检测。选择最优测定条件以筛选完全突变文库。
产生MCAM突变文库并验证序列，所述文库由545个克隆(528/536丙氨酸突变体和17/17定点突变体)组成，各自携带单一丙氨酸残基取代(丙氨酸残基被取代成丝氨酸)或指定残基。残基35、66、161、261、342、380、414和435未在文库中表现。通过免疫检测与小鼠血清的结合来一式三份筛选突变文库。这验证各突变克隆的细胞表面表达。
进行多轮优化以确定适于定位的条件。评估以下变量：多种层粘连蛋白浓度和抗层粘连蛋白二级抗体浓度、用以降低非特异性结合的各种阻断缓冲液、多种细胞类型、和多种洗涤步骤。
通过免疫检测与2120.4.19抗体的结合来一式三份筛选突变文库。定量各变异体的反应性以鉴定展现结合损失的点突变体。
定量各突变克隆的单克隆抗体和血清反应性以鉴定展现结合损失，而不影响表面表达的点突变体。通过将各突变克隆的单克隆抗体结合概况与血清结合概况进行比较来鉴定各抗体的关键残基。
以384孔形式，用野生型(WT)MCAM或单独载体转染BHK细胞，随后进行免疫检测。测试连续稀释的各抗体(以4μg/ml开始)针对WT或单独载体的免疫反应性(表2)。各点代表四个重复实验的平均值。
表2
确定2120.4.19和小鼠血清的用于免疫检测和表位定位的最优筛选条件。使用这些条件，各抗体显示稳健信号、高信号与背景值和重复实验之间的低可变性。这些数据指示这些条件适于成功高通量表位定位。使用2120.4.19的最终筛选浓度0.25μg/mL和小鼠血清的1:800稀释度。来自Jackson ImmunoResearch的二级抗体在1:400下用于2120.4.19和血清检测。表3显示针对高通量免疫检测加以优化的实验参数。
表3
一式三份测定突变文库的表面表达(小鼠血清结合)和单克隆抗体结合。将各原始数据点进行背景扣除，并且相对于野生型MCAM反应性值加以标准化。结果显示于图1中。将关于2120.4.19的平均单克隆抗体结合值相对于它的平均表面表达值绘图(图1，灰色菱形)。<30％单克隆抗体反应性和>50％小鼠血清结合的阈值应用于鉴定就单克隆抗体结合而言呈阴性，但就表面表达而言呈阳性的克隆(图1，黑色菱形)。
通过相较于各克隆的总体表面表达(平均血清反应性)评估它的平均单克隆抗体反应性来鉴定对于2120.4.19关键的残基(表4)。抗体结合中涉及的残基被鉴定为就单克隆抗体结合而言呈阴性(<30％WT)，但就表面表达而言呈阳性(>50％WT)的那些。显示各关键残基的平均反应性(和标准偏差)。
表4
通过鸟枪诱变定位鉴定的关键氨基酸暗示2120.4.19抗体的结合位点。数据指示2120.4.19结合构象复合表位，同时主要结合第二Ig结构域。
关键残基似乎主要取决于由第二和/或第三Ig结构域的二硫键促使的结构稳定化。对2120.4.19的结合由包括第二Ig结构域的二硫键化半胱氨酸161和223中的一个或两个的一簇关键残基支持。
实施例5.关于抗体和层粘连蛋白结合的确认性MCAM表位定位
为鉴定人MCAM上的2120.4.19结合位点，通过使用Schrodinger Maestro将人MCAMIg1和Ig2的同源性模型建立在人BCAM Ig1和Ig2上(图2A)。设计并产生基于结构信息和鸟枪诱变信息的20点突变体。在哺乳动物细胞上显示这些突变体，并且FACS用于测试2120.4.19和层粘连蛋白α-4与MCAM突变体的结合。三个MCAM单一突变体I141A、D216A和Y318A显示完全损失层粘连蛋白α-4结合性。I141A显示完全损失2120.4.19结合性，并且P145V显示显著损失2120.4.19结合性。
为进一步确认数据，产生分别表达I141A、P145V、D216A和Y318A的稳定细胞系。如上所述用纯化蛋白质进行ForteBio测定。对照ABX-MA1抗体结合于野生型MCAM和MCAM突变体。2120.4.19不显示显著结合MCAM I141A突变体。此外，2120.4.19显示与MCAM P145V和D216A突变体的结合分别极大降低。此外，2120.4.19与MCAM突变体P145V的结合显示快速K解离。
实施例6.人源化抗MCAM 2120抗体的产生
根据以下方案产生各种人源化抗MCAM抗体。首先，使用JN Biosciences的专有算法构建可变区的三维分子模型。其次，使用分子模型鉴定对形成CDR结构重要或为与抗原结合所必需的框架氨基酸残基。并行地，选择分别与VH和VL氨基酸序列具有高同源性的cDNA源性人VH和VL氨基酸序列。最后，将对CDR结构或抗原结合重要的CDR序列以及框架氨基酸残基从VH和VL移植至对应所选人框架序列中。
图3描绘各种2120重链和轻链序列的比对。残基编号是根据Kabat编号。视抗体的形式而定来鉴定向CDR形成和抗原结合中涉及的框架(FR)氨基酸残基的不同突变。
2120抗体的示例性突变描绘于图3A(CDR-H1(S30T)中、CDR-H1与CDR-H2之间(I37V和L48I)、以及CDR-H2与CDR-H3之间(K71R)的加框残基影响CDR接触；并且S30T、I37V、L48I和K71R与CDR-H2之后的另一突变(T68S)组合影响CDR接触)；和图3B(CDR-L1与CDR-L2之间(L46V和Y49F)以及CDR-L2与CDR-L3之间(V58I)的加框残基影响CDR接触；CDR-L1与CDR-L2之间的加框残基(L46V和Y49F)影响CDR接触；并且L46V、Y49F和V58I突变与CDR-L1之前的另一突变(T22N)组合影响抗体/抗原相互作用)中。
设计各链的若干形式(标准性相对于攻击性或保守性)。对于含有N-脱酰胺基序(NG)的那些抗体，将向天冬酰胺或甘氨酸的突变引入标准形式中。合成具有异源性信号序列的各种人源化V区，并且克隆至含有人CK(VL)或人IgG1(VH)的表达载体中。
根据制造商方案，用FreeStyleTM MAX转染试剂(Invitrogen)将重链和轻链质粒共转染至293F细胞中。用蛋白A PhyTip柱(Phynexus)纯化表达的抗体，并且通过OD280来定量。
根据以下方案，在竞争性ELISA中，将人源化抗体的表观亲和力与亲本啮齿动物或嵌合抗体进行比较。
用重组hMCAM-His涂布ELISA板，并且用酪蛋白缓冲液阻断以防止非特异性结合。在存在或不存在3x递增浓度的未标记竞争剂(人源化抗体、啮齿动物抗体或嵌合抗体)下，在亚饱和浓度下添加生物素化啮齿动物或嵌合抗体。在洗涤以移除未结合抗体之后，添加抗生蛋白链菌素HRP以允许检测生物素化抗体。用TMB底物使ELISA显色，并且测量OD450。使用GraphPad Prism5软件确定未标记竞争剂的IC50。
表5概述人源化序列的设计。
表5
表5
2120 供体框架 突变
VH1 AF062133 IGHV2-26*01 S30T*,I37V,L48I和K71R
VH2 AF062133 IGHV2-26*01 VH1突变+T68S
VH3 AF062133 IGHV2-26*01 VH1突变+N32S
VH4 AF062133 IGHV2-26*01 VH1突变+N32Q
VH5 AF062133 IGHV2-26*01 VH1突变+G33A
VL1 X84343 IGKV1-39*01 L46V、Y49F和V58I
VL2 X84343 IGKV1-39*01 L46V,Y49F
VL3 X84343 IGKV1-39*01 VL1+T22N
根据制造商方案，用FreeStyleTM MAX转染试剂(Invitrogen)将重链和轻链质粒共转染至293F细胞中。用蛋白A PhyTip柱(Phynexus)纯化表达的抗体，并且通过OD280来定量。
根据以下方案，在竞争性ELISA中，将人源化抗体的表观亲和力与亲本啮齿动物或嵌合抗体进行比较：
用重组hMCAM-His涂布ELISA板，并且用酪蛋白缓冲液阻断以防止非特异性结合。在存在或不存在3x递增浓度的未标记竞争剂(人源化抗体、啮齿动物抗体或嵌合抗体)下，在亚饱和浓度下添加生物素化啮齿动物或嵌合抗体。在洗涤以移除未结合抗体之后，添加抗生蛋白链菌素HRP以允许检测生物素化抗体。用TMB底物使ELISA显色，并且测量OD450。使用GraphPad Prism5软件确定未标记竞争剂的IC50。
使用ForteBio Octet Red测量亲和力。抗人Fc传感器用于捕集人源化抗体，并且若干浓度的hMCAMHis分析物用于使用1:1拟合模型确定亲和力。
根据以下方案在层粘连蛋白/FACS测定中测量抗体的效价：在存在或不存在不同浓度的人源化、啮齿动物或嵌合抗体下添加重组层粘连蛋白411(Biolaminate)至hMCAM表达性CHO细胞中。在孵育30-45分钟之后，洗涤细胞，并且添加缀合于AF650的抗层粘连蛋白(NovusBio)以检测结合的层粘连蛋白。在流式细胞仪上操作细胞以测量层粘连蛋白结合信号。
表6提供用于转染的构建体。
表6
构建体 描述
h2120_VH1 标准性
h2120_VH2 保守性
h2120_VH3 标准性+N-S
h2120_VH4 标准性+N-Q
h2120_VH5 标准性+G-A
h2120_VL1 标准性
h2120_VL2 攻击性
h2120_VL3 保守性
表7描述特定转染实验。
表7
表8显示人源化抗体相较于啮齿动物亲本的如通过ForteBio和竞争性ELISA测量的相对亲和力以及第一轮转染的表达水平。
表8
表8
表9显示相较于啮齿动物亲本的通过ForteBio、竞争性ELISA和功能性阻断数据(层粘连蛋白/FACS测定)测量的亲和力以及来自第二轮转染的表达水平。
表9
总之，数据证明各种2120人源化抗体在亲和力方面具有>5倍降低，如通过ForteBio所测量，并且大多数在表观亲和力和效价方面具有>2-3倍降低，如通过竞争性ELISA和层粘连蛋白阻断测定所测量，例外之处是VH5VL3(G-A N-脱酰胺突变VH/保守性VL)，其在亲和力和效价方面具有<2倍降低。
将某些候选抗体再表达，并且测试它们的亲和力(通过ForteBio)和它们的IC50。结果提供于下表10中。
表10
实施例7.对人源化2120抗体的修饰
利用以上描述以及根据Liu等JBC.286:11211-7,2011的DNA操作方法，构建2120.4.19抗体成熟重链可变区的大鼠和人源化形式的变体。构建2120.4.19、h2120VH1、h2120VH2、h2120VH3、h2120VH4和h2120VH5的在位置H1(Kabat编号)处具有谷氨酰胺向谷氨酸取代的变体(图4A)。这些变体被称为2120.4.19.Q1E、h2120VH1.Q1E、h2120VH2.Q1E、h2120VH3.Q1E、h2120VH4.Q1E和h2120VH5.Q1E，并且以SEQ ID NO:156-161显示。由SEQ IDNO:157-161标识的人源化形式描绘于图4A中的比对中。可使用修饰的可变重链构建各种大鼠和人源化抗体，包括：h2120VH1.Q1E+h2120VL1；h2120VH1.Q1E+h2120VL2；h2120VH1.Q1E+h2120VL3；h2120VH2.Q1E+h2120VL1；h2120VH2.Q1E+h2120VL2；h2120VH2.Q1E+h2120VL3；h2120VH3.Q1E+h2120VL1；h2120VH3.Q1E+h2120VL2；h2120VH3.Q1E+h2120VL3；h2120VH4.Q1E+h2120VL1；h2120VH4.Q1E+h2120VL2；h2120VH4.Q1E+h2120VL3；h2120VH5.Q1E+h2120VL1；h2120VH5.Q1E+h2120VL2；和h2120VH5.Q1E+h2120VL3。

Claims (77)

1.一种抗体，其包含：
(a)成熟重链可变区，其包含SEQ ID NO:161的三个Kabat CDR，例外之处是位置32(Kabat编号)可为N、S或Q，并且位置33(Kabat编号)可为G或A，并且其中位置1(Kabat编号)被E占据；和
(b)成熟轻链可变区，其包含SEQ ID NO:123的三个Kabat CDR。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少90％同一，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少90％同一。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少95％同一，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少95％同一。
4.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少98％同一，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少95％同一。
5.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少99％同一，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少95％同一。
6.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:161，并且其中所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少95％同一。
7.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与SEQID NO:161至少95％同一，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少98％同一。
8.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少95％同一，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少99％同一。
9.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少95％同一，并且所述成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ IDNO:123。
10.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少98％同一，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少98％同一。
11.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少99％同一，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少99％同一。
12.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:161，并且其中所述成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123。
13.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:161，并且其中所述成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:123。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗体，其是人源化抗体。
15.一种分离的抗MCAM抗体，其在包括氨基酸残基141的表位处结合人MCAM(SEQ IDNO:11)。
16.如权利要求15所述的分离的抗MCAM抗体，其中所述表位包含氨基酸残基145。
17.如权利要求15或16所述的分离的抗MCAM抗体，其中所述表位包含人MCAM的至少五个连续氨基酸残基，所述连续氨基酸残基包括氨基酸残基141。
18.如权利要求15至17中任一项所述的分离的抗MCAM抗体，其中所述抗体不是单克隆抗体2120.4.19或包含大致上来自单克隆抗体2120.4.19的CDR的抗体。
19.如权利要求15至18中任一项所述的分离的抗MCAM抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
20.如权利要求15至19中任一项所述的分离的抗MCAM抗体，其中所述抗体是嵌合、人源化、镶饰或人抗体。
21.如权利要求1至20、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体，其是抗原结合片段。
22.一种药物组合物，其包含如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体。
23.一种药物制剂，其包含：
(a)抗体，其包含：
(i)成熟重链可变区，其包含SEQ ID NO:161的三个Kabat CDR，例外之处是位置32(Kabat编号)可为N、S或Q，并且位置33(Kabat编号)可为G或A；和
(ii)成熟轻链可变区，其包含SEQ ID NO:123的三个Kabat CDR；
(b)以约10mM至约30mM范围内的浓度存在的组氨酸缓冲剂；
(c)一种或多种选自以下的糖和多元醇(“糖/多元醇”)：
(i)以约200mM至约260mM范围内的浓度存在的蔗糖；和
(ii)以约200mM至约260mM范围内的浓度存在的海藻糖；以及
(d)以约0.005重量％至约0.05重量％范围内的浓度存在的聚山梨醇酯20；
其中所述药物制剂的特征在于pH在约5.5至约7的范围内。
24.如权利要求23所述的药物制剂，其中所述成熟重链可变区与SEQ ID NO:161至少90％同一，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO:123至少90％同一。
25.如权利要求23或24所述的药物制剂，其中所述成熟重链可变区的位置1(Kabat编号)被E占据。
26.如权利要求23至25中任一项所述的药物制剂，其中所述成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160或SEQ ID NO:161，并且其中所述成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122或SEQ IDNO:123。
27.如权利要求23至26中任一项所述的药物制剂，其中所述成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:161，并且所述成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:123。
28.一种药物制剂，其包含：
(a)如权利要求15至21中任一项所述的分离的抗MCAM抗体；
(b)以约10mM至约30mM范围内的浓度存在的组氨酸缓冲剂；
(c)一种或多种选自以下的糖和多元醇(“糖/多元醇”)：
(i)以约200mM至约260mM范围内的浓度存在的蔗糖；和
(ii)以约200mM至约260mM范围内的浓度存在的海藻糖；以及
(d)以约0.005重量％至约0.05重量％范围内的浓度存在的聚山梨醇酯20；
其中所述药物制剂的特征在于pH在约5.5至约7的范围内。
29.如权利要求28所述的药物制剂，其中所述分离的抗MCAM抗体在包括氨基酸残基141的表位处结合人MCAM(SEQ ID NO:11)。
30.如权利要求23至29、76或77中任一项所述的药物制剂，其中所述抗体或所述分离的抗MCAM抗体以约40mg/mL的浓度存在。
31.如权利要求23至30、76或77中任一项所述的药物制剂，其中所述组氨酸缓冲剂以约20mM的浓度存在。
32.如权利要求23至31、76或77中任一项所述的药物制剂，其中所述糖/多元醇是以约220mM的浓度存在的蔗糖。
33.如权利要求32所述的药物制剂，其中所述pH是约6.0。
34.如权利要求33所述的药物制剂，其特征在于重量摩尔渗透浓度是约295mOsm/kg。
35.如权利要求23至31、76或77中任一项所述的药物制剂，其中所述糖/多元醇是以约220mM的浓度存在的海藻糖。
36.如权利要求35所述的药物制剂，其中所述pH是约6.5。
37.如权利要求36所述的药物制剂，其特征在于重量摩尔渗透浓度是约287mOsm/kg。
38.如权利要求23至37、76或77中任一项所述的药物制剂，其中小于约5％的所述抗体或所述分离的抗MCAM抗体在所述制剂中以聚集体形式存在。
39.如权利要求23至38、76或77中任一项所述的药物制剂，其进一步包含填充剂。
40.如权利要求23至39、76或77中任一项所述的药物制剂，其是无菌的。
41.如权利要求23至40、76或77中任一项所述的药物制剂，其在冷冻和解冻时是稳定的。
42.如权利要求23至41、76或77中任一项所述的药物制剂，其中在38-42℃下储存至少30天之后和/或在38-42℃下储存至少3个月之后，根据疏水相互作用色谱法，至少65％的蛋白质显现为单峰。
43.如权利要求23至41、76或77中任一项所述的药物制剂，在38-42℃下储存至少30天之后和/或在38-42℃下储存至少3个月之后，根据高效尺寸排阻色谱法，具有不超过5重量％的聚集蛋白质。
44.一种冻干制剂，其包含：
(a)如权利要求15至21、23至27、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体；
(b)组氨酸缓冲剂；
(c)蔗糖或海藻糖；和
(d)聚山梨醇酯20。
45.如权利要求44所述的冻干制剂，其在添加水时复原成具有约5.5至约6.5之间的pH的制剂。
46.如权利要求44或权利要求45所述的冻干制剂，其包含约10mg至约40mg所述抗体或所述分离的抗MCAM抗体。
47.如权利要求44至46中任一项所述的冻干制剂，其中所述制剂在复原时包含以约20mM的量存在的组氨酸缓冲剂。
48.如权利要求44至47中任一项所述的冻干制剂，其中所述制剂在复原时包含以约220mM的量存在的蔗糖。
49.如权利要求48所述的冻干制剂，其中所述制剂在复原时具有约6.0的pH。
50.如权利要求44至47中任一项所述的冻干制剂，其中所述制剂在复原时包含以约220mM的量存在的海藻糖。
51.如权利要求50所述的冻干制剂，其中所述制剂在复原时具有约6.5的pH。
52.如权利要求44至51中任一项所述的冻干制剂，其中所述聚山梨醇酯20以约0.01重量％至约0.05重量％范围内的量存在。
53.如权利要求44所述的冻干制剂，其可通过添加水至包含以下的水溶液中来复原：
(a)以约40mg/mL的浓度存在的所述抗体或所述分离的抗MCAM抗体；
(b)以约20mM的浓度存在的组氨酸缓冲剂；
(c)以约220mM的浓度存在的蔗糖；
(d)以约0.02％的浓度存在的聚山梨醇酯20；和
(e)约6.0的pH。
54.如权利要求53所述的冻干制剂，其包含：
(a)200mg所述抗体或所述分离的抗MCAM抗体；
(b)15.5mg组氨酸
(c)376mg蔗糖；
(d)1mg聚山梨醇酯20；和
(e)约6.0的pH。
55.如权利要求44所述的冻干制剂，其可通过添加水至包含以下的水溶液中来复原：
(a)以约40mg/mL的浓度存在的所述抗体或所述分离的抗MCAM抗体；
(b)以约20mM的浓度存在的组氨酸缓冲剂；
(c)以约220mM的浓度存在的海藻糖；
(d)以约0.02％的浓度存在的聚山梨醇酯20；和
(e)约6.5的pH。
56.如权利要求55所述的冻干制剂，其包含：
(a)200mg所述抗体或所述分离的抗MCAM抗体；
(b)15.5mg组氨酸
(c)416mg海藻糖二水合物；
(d)1mg聚山梨醇酯20；和
(e)约6.5的pH。
57.如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物受试者的炎性病症的药剂，所述炎性病症的特征在于MCAM表达性细胞浸润至体内炎症部位中。
58.如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物受试者的中枢神经系统(CNS)炎性病症的药剂，所述中枢神经系统炎性病症的特征在于MCAM表达性细胞浸润至CNS中。
59.如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物受试者的多发性硬化症的药剂。
60.如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物受试者的牛皮癣的药剂。
61.如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物受试者的实体肿瘤诸如黑素瘤的药剂。
62.如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物受试者的类肉瘤病的药剂。
63.如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物受试者的牛皮癣性关节炎的药剂。
64.如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物受试者的帕金森氏病的药剂。
65.如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体的用途，其用于制造用以治疗哺乳动物受试者的过敏性接触性皮炎的药剂。
66.一种用于治疗特征在于MCAM表达性细胞浸润至炎症部位中的炎性病症的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用有效量的如权利要求1至21、74或75中任一项所述的抗体或分离的抗MCAM抗体。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述MCAM表达性细胞是TH17细胞。
68.如权利要求57至67中任一项所述的方法或用途，其中所述哺乳动物受试者是人。
69.一种包含用于结合抗MCAM单克隆抗体的表位的分离的肽，其中所述肽包含人MCAM(SEQ ID NO:11)的5-50个连续氨基酸残基，所述连续氨基酸残基包括氨基酸残基141。
70.如权利要求69所述的分离的肽，其中使所述肽连接于载体多肽。
71.如权利要求69或权利要求70所述的分离的肽，其中使所述肽与佐剂组合。
72.一种产生抑制人MCAM结合层粘连蛋白α-4链的抗体的方法，其包括：
(a)用如由权利要求66至68中任一项所定义的肽免疫受试者；
(b)从所述受试者分离B细胞，其中所述B细胞分泌抗体；以及
(c)筛选所述抗体以鉴定抑制人MCAM结合层粘连蛋白α-4链的抗体。
73.如权利要求72所述的方法，其进一步包括：
(d)使所述B细胞与培养物中的永生化细胞融合以形成单克隆抗体产生性杂交瘤细胞；
(e)培养所述杂交瘤细胞；以及，
(f)从培养物分离单克隆抗体。
74.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:161，并且所述成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:123，并且其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:171的重链恒定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:168的轻链恒定区。
75.如权利要求1所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:161，并且所述成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:123，并且其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:172的重链恒定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:168的轻链恒定区。
76.如权利要求23至27中任一项所述的药物制剂，其中所述成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:161，并且所述成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:123，并且其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:171的重链恒定区和具有氨基酸序列SEQ IDNO:168的轻链恒定区。
77.如权利要求23至27中任一项所述的药物制剂，其中所述成熟重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:161，并且所述成熟轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:123，并且其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:172的重链恒定区和具有氨基酸序列SEQ IDNO:168的轻链恒定区。
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