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CN106046177B - P-5m-Fc融合蛋白及其表达基因、制备方法和应用 - Google Patents

P-5m-Fc融合蛋白及其表达基因、制备方法和应用 Download PDF

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CN106046177B CN201610695327.4A CN201610695327A CN106046177B CN 106046177 B CN106046177 B CN 106046177B CN 201610695327 A CN201610695327 A CN 201610695327A CN 106046177 B CN106046177 B CN 106046177B
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Abstract

本发明涉及一种P‑5m‑Fc融合蛋白及其表达基因、制备方法和应用，属于医药生物技术领域。该P‑5m‑Fc融合蛋白由功能单元与人免疫球蛋白IgG1的Fc部分连接构成，其中，所述功能单元由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列与连接子连接构成，所述连接子为由六个依次连接的甘氨酸构成的多肽，所述P‑5m‑Fc融合蛋白中至少具有一个所述功能单元，当所述P‑5m‑Fc融合蛋白中具有多个所述功能单元时，多个所述功能单元顺次连接后再与所述免疫球蛋白的Fc部分连接。该P‑5m‑Fc融合蛋白将P‑5m与人IgG1的Fc片段融合表达制成肽体，不仅可以提高P‑5m八肽的药效，还可显著延长药物的半衰期，获得很好的成药性。并通过实验研究证实了其具有显著的抗肿瘤转移的功能。

Description

P-5m-Fc融合蛋白及其表达基因、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，特别是涉及一种P-5m-Fc融合蛋白及其表达基因、制备方法和应用。
背景技术
目前的研究表明，肿瘤转移是肿瘤患者丧生的根本原因。P-5m八肽是来源于高分子激肽原第五结构域(D5)的一种具有八个氨基酸的多肽，这是目前发现的来源于D5的有效抗肿瘤转移的最短多肽。
有研究表明，P-5m八肽在细胞水平能够抑制小鼠黑色素瘤细胞的粘附和侵袭，并能抑制小鼠黑色素瘤肺转移，并且在人源HCCLM3肝癌细胞中具有抑制肿瘤细胞转移的效果。
但是P-5m八肽给药后，具有稳定性差、半衰期短的缺陷，目前仍难以在临床中应用。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种P-5m-Fc融合蛋白，能够延长P-5m八肽的稳定性和半衰期，增强其成药性。
一种P-5m-Fc融合蛋白，由功能单元与人免疫球蛋白IgG1的Fc部分连接构成，其中，所述功能单元由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列与连接子连接构成，所述连接子为由六个依次连接的甘氨酸构成的多肽，所述P-5m-Fc融合蛋白中至少具有一个所述功能单元，当所述P-5m-Fc融合蛋白中具有多个所述功能单元时，多个所述功能单元顺次连接后再与所述免疫球蛋白的Fc部分连接。
优选的，所述P-5m-Fc融合蛋白包括两个功能单元。
本发明还公开了一种编码上述的P-5m-Fc融合蛋白的表达基因，表达基因的序列为：
A)由功能单元的核苷酸序列及编码免疫球蛋白的Fc部分核苷酸序列组合构成；或者
B)与A)的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与A)的核苷酸序列不同的序列；或者
C)对上述A)或B)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
在其中一个实施例中，所述A)中，所述功能单元的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还公开了一种表达载体，为具有上述的P-5m-Fc融合蛋白的表达基因的表达载体。
优选的，所述表达载体为pET-28a(+)Fc质粒。
本发明还公开了一种上述的P-5m-Fc融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建如上所述的表达基因，并将上述表达基因插入至载体中，构建重组表达载体
(2)将上述重组表达载体转入宿主细胞中，通过筛选得到阳性表达载体；
(3)将上述阳性表达载体转入表达细胞中，对步骤(1)中的表达基因序列进行诱导表达，即得。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，通过下述方法构建重组表达载体：首先得到碱基序列组成为SEQ ID NO.2的基因片段，以BamH I和Nde I双酶切pET-28a(+)Fc质粒，回收酶切的载体片段，将上述SEQ ID NO.2的基因片段通过DNA连接酶插入至上述载体中，得到重组质粒，即为重组表达载体；
步骤(2)中，所述阳性表达载体通过以下方法得到：通过热激法将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含X-gal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，筛选得到阳性质粒，即为阳性表达载体；
步骤(3)中，所述诱导表达的具体方法为：将步骤(2)中得到的阳性质粒，通过热激法转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，培养；挑取单菌落接种至含氨苄青霉素LBG培养基中，培养，培养后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再诱导培养；得到P-5m-Fc融合蛋白。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，通过热激法将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含X-gal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，培养12-16h后，再挑取单菌落，接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，筛选得到阳性质粒；
步骤(3)中，将步骤(2)中得到的阳性质粒，通过热激法转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，培养12-16h；挑取单菌落接种至含50μg/ml氨苄青霉素的LBG培养基中，振摇培养至OD600达到0.4-0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.2-0.6mmol/L，诱导培养，离心培养物，取沉淀，加入磷酸盐缓冲液和上样缓冲液，煮沸后再次离心，得到P-5m-Fc融合蛋白。
在其中一个实施例中，还包括步骤(5)纯化：收集经过诱导表达菌体，并用磷酸盐缓冲液悬浮，进行超声破碎，离心，得到以包涵体表达的P-5m-Fc融合蛋白；将上述包涵体以裂解缓冲液重悬，再经过Triton X/100(聚乙二醇辛基苯基醚)，脱氧胆酸钠，尿素洗涤进行初步纯化，经初步纯化的包涵体用含有尿素和DTT(二硫苏糖醇)的Tris-HCl的缓冲溶液进行变性溶解，然后通过氧化还原剂复性或碱性条件下空气氧化复性，得到具有正确构象的活性P-5m-Fc融合蛋白。
通过上述方式，可将存在于包涵体中的错误折叠形式的蛋白质重新折叠为具有正确构象的活性P-5m-Fc融合蛋白。
在其中一个实施例中，所述步骤(5)纯化中：将上述包涵体以裂解缓冲液重悬，所述裂解缓冲液中包括50mmol/L pH8.0的Tris-HCl，l mmol/L的EDTA，100mmol/1L的NaCl，再经过体积百分数为2％的Triton X/100，质量百分比浓度为0.2％的脱氧胆酸钠，1mol/L尿素洗涤进行初步纯化；
经初步纯化的包涵体用pH8.0的含有8mmol/L尿素、20mmol/L DTT的25mmol/L的Tris-HCl缓冲液进行变性溶解；
再将上述P-5m-Fc融合蛋白以SP-sepharose阳离子层析柱进行纯化，然后通过氧化还原剂复性或碱性条件下空气氧化复性；
所述氧化还原剂复性的条件为：在纯化后的P-5m-Fc融合蛋白缓冲液中，加入DTT至终浓度10mmol/L，然后加入还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽至浓度分别为2mmol/L及0.2mmol/L，再用4mol/L尿素将P-5m-Fc融合蛋白稀释成0.5mg/ml，以浓度由4mol/L逐步降低至0mol/L的尿素缓冲溶液透析复性，该尿素溶液中含相同浓度的还原型和氧化型谷胱甘肽；
所述碱性条件下空气氧化复性的条件为：将纯化后的P-5m-Fc融合蛋白透析到尿素含量为8mol/L的pH10.0的25mmol/L Tris-HCl缓冲液中，加入DTT至终浓度10mmoI/L，暴露在空气中搅拌过夜，将P-5m-Fc融合蛋白稀释成0.5mg/ml，以浓度由4mol/L逐步降低至0mol/L的尿素缓冲溶液透析复性；
通过复性得到具有正确构象的活性P-5m-Fc融合蛋白。
以上述方式重新折叠蛋白，具有较好的复性效果，并且以SP-sepharose阳离子层析柱进行纯化，可进一步提高融合蛋白纯度。
本发明还公开了上述的P-5m-Fc融合蛋白在制备用于抑制肝癌细胞转移的药物中的应用。
特别是对HCCLM3细胞侵袭基质膜有较好的抑制作用，可用于抑制人源肝癌HCCLM3细胞的转移。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种P-5m-Fc融合蛋白，将P-5m与人IgG1的Fc片段融合表达制成肽体，不仅可以提高P-5m八肽的药效，还可显著延长药物的半衰期，获得很好的成药性。并通过实验研究证实了其具有显著的抗肿瘤转移的功能。
本发明的P-5m-Fc融合蛋白的制备方法，建立了P-5m-Fc融合蛋白的表达工艺，并对其中的工艺条件进行了优化。
并且，还对由以包涵体表达的P-5m-Fc融合蛋白的复性条件进行了优化筛选，得到了能够将存在于包涵体中的错误折叠形式的蛋白质重新折叠为具有正确构象的活性P-5m-Fc融合蛋白的最佳条件。
附图说明
图1为实施例1中pET-28a(+)P-5m-Fc质粒的双酶切鉴定图。
图中：1为pET-28a(+)P-5m-Fc质粒；2为酶切结果；M为DL2000DNA Marker。
图2为实施例2中pET-28a(+)-Fc和pET-28a(+)P-5m-Fc在未诱导情况下的表达。
图中：1和2为大肠杆菌中未诱导情况下pET-28a(+)-Fc的表达，3和4为大肠杆菌中未诱导情况下pET-28a(+)P-5m-Fc的表达，M为Protein Marker，箭头所指为P-5m-Fc融合蛋白电泳条带。
图3为实施例2中pET-28a(+)-Fc和pET-28a(+)P-5m-Fc在诱导情况下的表达。
图中：1为大肠杆菌中诱导情况下pET-28a(+)-Fc的表达，2和3为大肠杆菌中诱导情况下pET-28a(+)P-5m-Fc的表达，M为Protein Marker，箭头所指为P-5m-Fc融合蛋白电泳条带。
图4为实施例2中pET-28a(+)P-5m-Fc包涵体表达。
图中：1和2为菌液裂解后上清中pET-28a(+)P-5m-Fc表达蛋白；3为菌液裂解沉淀中pET-28a(+)表达蛋白；M为Protein Marker，箭头所指为P-5m-Fc融合蛋白电泳条带。
图5为实施例2中pET-28a(+)P-5m-Fc表达产物的初步纯化。
图中：1、2和3为菌液裂解后上清中pET-28a(+)P-5m-Fc表达蛋白；4和5为初步纯化后的pET-28a(+)P-5m-Fc蛋白；M为Protein Marker，箭头所指为P-5m-Fc融合蛋白电泳条带。
图6为实施例2中pET-28a(+)P-5m-Fc表达产物的纯化及Western-blotting结果。
图中：1为过柱纯化后的pET-28a(+)P-5m-Fc表达产物，2为pET-28a(+)P-5m-Fc的Western-blotting结果，3为pET-28a(+)-Fc的Western-blotting结果，M为ProteinMarker。
图7为实施例3中P-5m-Fc抑制HCCLM3细胞穿过transwell小室的侵袭能力放大400倍示意图。
图中：Control表示空白对照；P-5m-Fc 10μmol表示用终浓度为10μmol的P-5m-Fc处理后结果；P-5m-Fc 100μmol表示用终浓度为100μmol的P-5m-Fc处理后结果；P-5m-Fc100μmol+Ab表示用终浓度为100μmol的P-5m-Fc与P-5m多克隆抗体共同处理后结果；P-5m10μmol表示用终浓度为10μmol的P-5m处理后结果；P-5m 100μmol表示用终浓度为100μmol的P-5m处理后结果。
图8为实施例3中P-5m-Fc抑制HCCLM3细胞穿过transwell小室的侵袭能力对比。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
P-5m–Fc融合蛋白表达载体的构建
一、方法。
1、细菌质粒的提取与纯化
经分析，P-5m的氨基酸序列是GHGKHKNK，发明人通过大量的实验筛选后，利用大肠杆菌偏爱的密码子合成了P-5m肽基因正负链，5’端加ATG，3’端加6个甘氨酸密码子(下文中的GGT GGT GGT GGT GGT GGT部分)，并且为了增加效价，将P-5m肽基因和甘氨酸密码子进行重复两个循环，退火后，5’端、3’端分别产生Nde I识别位点(CAT ATG)和BamH I识别位点(GGA TCC)：正链5’-C CAT ATG GGC GAT GGC AAA GAT AAG AAC AAG GGT GGT GGT GGTGGT GGT GGC GAT GGC AAA GAT AAG AAC AAG GGA TCC GCG-3’(即SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列)；5’-CGC GGA TCC CTT GTT CTT ATC TTT GCC ATC GCC CAT ACC ACC ACC ACCACC ACC CTT GTT CTT ATC TTT GCC ATC GCC CAT ATG G-3’。
随后，按照Nde I和BamH I限制性内切酶试剂盒(厂家：Promaga，型号：R4024和R6801)公司提供的说明书进行酶切，以Nde I和BamH I双酶切pET-28a(+)Fc质粒(来源：参照下述文献制备得到：TPO模拟肽与人IgG1Fc片段的融合表达及其生物学特性研究。《生物工程学报》,2002,18(4):424-430；其中，所用含有全长Fc片段的质粒：pCDNA3.1-hIgG1 Fc购自北京普博斯货号：VIY0062hIgG1 Fc)。
酶切步骤中，先做单酶切消化，然后抽提、沉淀DNA后溶于TE，再做另一个酶切。按以下体系进行酶切反应：PCR回收产物10μL，10×H buffer 2μL/10×T buffer 3μL，两种核酸内切酶各lμL，最后用ddH2O加至20μL，37℃水浴酶切1.5h，65℃灭活15min。0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2、玻璃奶法快速胶内回收DNA
将上述质粒双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，1.2％琼脂糖凝胶电泳用于回收含P-5m和连接子的退火片段，0.8％琼脂糖凝胶电泳用于回收酶切的载体片段。
3、DNA片段的退火
利用大肠杆菌偏爱的密码子合成上述P-5m肽基因正负链，用灭菌水溶解配成0.1pmol/μL的浓度，取相同量的正负链寡核苷酸混合，加入退火缓冲液至1x(10mmol/LTris，pH7.5-8.0，50mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)，95℃热变性5min，然后使其缓慢冷却至室温。
4、DNA粘末端连接
以T4DNA连接酶连接上述P-5m和连接子肽的基因双链和同样酶切回收的质粒载体。
连接体系为：载体2μL，目的基因5μL，10×连接buffer1μL，T4DNA连接酶1μL，最后用ddH2O加至10μL。16℃连接12-16h。
5、大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
以无菌接种环蘸取冻存于-70℃的大肠杆菌菌种，划线接种于不含抗生素的LB琼脂平板，37℃培养16h左右。挑取一个单菌落，接种到3mL不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培过夜。次日将3mL菌液加入到预热至37℃的100mL不含抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇(250rpm)培养至OD600值约为0.4～0.6(约2.5～3h)。在无菌条件下将细菌培养液转移到两个无菌并以冰预冷的聚丙烯离心管中(以下操作均需无菌且在冰水浴中进行)，冰浴10min，使培养物冷却到0℃。4℃5000rpm离心10min，弃上清后，用10mL冰预冷的CaCl2溶液(75mM CaCl2，10mmol/L Tris-Cl pH6.5)溶液重悬沉淀，冰浴10min。4℃5000rpm离心10min，弃上清，以2mL用冰预冷的CaCl2保存液(75mM CaCl2，10mmol/L Tris-Cl pH6.5，15％(v/v)甘油)溶液重悬每管沉淀，用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管100μL，置-70℃超低温冰箱冻存备用。
6、转化
取上述步骤4得到的连接产物5μL用热激法转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。
具体方法为：连接产物5μL加入100μL感受态细胞，冰浴30min，42℃90s，冰浴3-5min，均匀涂布于含X-gal和IPTG和氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养12-16h；接菌培养:挑取单菌落，接种于5ml的LB(含50μg/ml氨苄青霉素)培养基，37℃200rpm振荡培养12h。
7、质粒小提
用质粒DNA小量快速制备试剂盒提取PCR法快速鉴定筛选得到的阳性质粒。用V-gene公司质粒小提试剂盒小提质粒。按如下操作进行：收集1mL过夜培养物，13000rpm离心30sec，加入150μL的溶液I，涡旋振荡悬浮细菌，再加入150μL的溶液II，上下颠倒几次，室温裂解细菌3～5min，加入400μL的溶液III，室温沉淀蛋白5min，然后13000rpm离心10min，小心吸取上清液到DNA–prep tube中，4000rpm离心1min，用500μL buffer W1洗涤一次，再用和500μL buffer W2洗涤两次，13000rpm离心1min，加入40～50μL的TE到柱子底部，室温放置1min，13000rpm离心1min，离心下来的液体即为质粒DNA溶液。
8、重组质粒的鉴定
得到的重组质粒送上海联合基因公司测序。
二、结果。
1、转化结果。
将连接得到的目的片段连接到pET-28a(+)Fc质粒中，挑取白色菌落小提质粒，进行双酶切，得到的DNA条带均与预期相符，如图1所示。
2、重组质粒测序结果
将得到的重组质粒送上海联合基因公司测序，结果表明，序列阅读框和方向正确，说明目的基因已经正确的插入表达质粒中。
实施例2
重组蛋白在宿主菌的表达及纯化
一、方法。
1、转化
用热激方法将阳性重组质粒p转化E.coli感受态BL21(DE3)，在LB抗性(含50μg/ml氨苄青霉素)琼脂平板上37℃培养12-16h。挑取单个菌株的重组质粒转化菌，接种10ml含50μg/ml氨苄青霉素的LBG培养基中，37℃振摇培养至OD600达到0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为为0.3mmol/L，200rpm继续培养3.5h。
2、诱导表达
取上述诱导产物1ml，5000rpm离心诱导细菌培养物，弃上清，沉淀加入100μL PBS混匀，加入2×SDS上样缓冲液100μL混匀，煮沸5min，8000rpm，4℃离心5min，取上清20μL进行SDS-PAGE电泳。
3、融合蛋白表达分析
诱导菌以6000rpm离心5min后，弃上请，应用1/10V的PBS悬浮，进行超声，功率为300W，超5sec，停10sec，共超声50次。经过超声后，以12000rpm离心10min，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE。
4、包涵体重组蛋白的洗涤、变性
(1)洗涤：将主要以包涵体形式存在的目的蛋白用裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，l mmol/L EDTA，100mmol/1L NaCl)重悬，经过2％Triton X/100(聚乙二醇辛基苯基醚)，0.2％脱氧胆酸钠，lmol/L尿素洗涤后，得到初步纯化。
(2)变性：初步纯化的包涵体用8mmol/L尿素(25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20mmol/L DTT)变性溶解6h。
5.SP-sepharose阳离子层析柱对目的蛋白进行纯化
(1)将SP-sepharose阳离子柱(1ml)柱连接到FPLC上，用10ml蒸馏水洗柱子。目的是冲洗柱中的20％乙醇。
(2)用5-10个柱积的起始缓冲溶液(25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.2％二巯基乙醇，8mol/L尿素)平衡柱子。流速为l ml/min。
(3)用注射器或蠕动泵上样，流速为1ml/min。收集穿过峰。
(4)用5-10个柱积的起始缓冲液洗涤至280nm吸收达基线水平。
(5)用10-25个柱积洗脱缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，pH8.0，8mol/L尿素，1mol/LNaCl)线性梯度洗脱，分管收集每个洗脱峰。
(6)洗脱缓冲液再洗脱10个柱积。
(7)12％SDS-PAGE电泳确定目的蛋白所在组分。
(8)透析：将含目的蛋白的组分对起始缓冲液透析48h，每8h更换透析液。
SDS-PAGE检测洗脱样品，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后照相。
6、纯化的目的蛋白含量测定
利用BCA蛋白定量试剂盒(厂家：Pierce，型号：23225)，依据说明书测定纯化的融合蛋白含量。
7、重组蛋白的复性
不同氧化条件下的稀释法复性
(1)氧化还原剂：
纯化后的蛋白缓冲液中，加入DTT至终浓度10mmol/L，作用1h，加入还原型：氧化型谷胱甘肽(2mmol/L：0.2mmol/L)作用lh。根据蛋白定量结果，用4mol/L尿素稀释成0.5mg/ml，以浓度逐步降低(4mol/L-2mol/L-0mol/L)的尿素溶液(含相同浓度还原型氧化型谷胱甘肽)透析复性。
(2)碱性条件下空气氧化复性：
纯化后的P-5m-Fc融合变性蛋白透析到碱性的8mol/L尿素缓冲液中(25mmol/LTris-HCl，pH10.0)，加入DTT至终浓度10mmoI/L，作用l小时，暴露在空气中搅拌过夜，根据蛋白定量结果，先稀释成0.5mg/ml，以浓度逐步降低(4mol/L-2mol/L-0mol/L)的尿素缓冲溶液(25mmol/L Tris-HCl，pH7.2)透析复性。
二、结果。
1、P-5m-Fc融合蛋白的表达
取测序正确的重组质粒，转化E.coli BL21(DE3)中，挑取单菌落，活化，然后37℃摇床培养至OD600约为0.6-0.8。加入IPTG至0.5mmol/L，诱导表达4h后，收菌，超声的方法破碎菌体，离心，获得上清与沉淀。取全菌体、超声上清和沉淀进行SDS-PAGE，结果如图2，图3，和图4所示，表明P-5m-Fc融合蛋白主要以包涵体形式表达，分子量约为34kD。
2、重组蛋白包涵体的洗涤、溶解
包涵体主要由重组蛋白和一些菌体杂质组成，其中包括RNA聚合酶，细菌膜蛋白，rRNA和质粒DNA等。
包涵体的形成一方面利于重组蛋白的分离纯化和蛋白质的稳定，但由于包涵体是蛋白质的错误折叠形式，往往没有活性，必须使其变性溶解并在适当条件下复性，重新折叠成具有正确构象的活性蛋白分子。一般来说，包涵体溶解之前要先用低浓度的变性剂和去污剂进行洗涤，以除去包涵体表面的杂蛋白。洗涤条件以除去尽可能多的杂蛋白而不溶解包涵体为最好。经过不同洗涤条件和浓度的摸索，最终确定了2％Triton X-100，0.2％脱氧胆酸钠，l mol/L尿素的系列洗涤条件，包涵体得到初步纯化，如图5所示。
3、SP-sepharose阳离子柱层析纯化
变性后的融合蛋白经阳离子柱层析进一步得到纯化，在pH8.0的情况下，融合蛋白与阳离子树脂结合，并被含有NaCI的缓冲液洗脱下来，如图6所示。
实施例3
P-5m–Fc融合蛋白的活性检测
一、Western-blotting试验
将经SDS-PAGE分析后的蛋白条带(Fc和P-5m-Fc融合蛋白)转移至PVDF膜上，以1％BSA在4℃条件下封闭过夜，0.05％PBST洗涤3次，每次10min，加入2000×稀释的阳性血清，37℃作用2h，以0.05％PBST洗涤3次，每次10min，加入25000×稀释的兔抗人IgG酶标抗体，以0.05％PBST洗涤3次，每次10min，加入PIERCE发光底物室温作用3min，于暗室曝光，显影后定影，结果如图6所示。
上述结果说明Fc与P-5m多克隆抗体不能结合，而P-5m-Fc与P-5m多克隆抗体能够特异结合。
二、间接ELISA试验
1、制备抗P-5m八肽的多克隆抗体
(1)抗原制备
抗原制备多肽的合成采用9-氟甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成多肽片段，利用高效液相法进行纯化，纯化后的样品再用HPLC分析，纯度>97％。多肽与载体蛋白-血蓝素联接。
(2)动物免疫
纯化后的多肽抗原液250μl与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后采用背部多点注射法免疫新西兰白兔。2周后取多肽抗原液加等体积弗氏不完全佐剂同法加强免疫，以后每两周免疫一次，全程共免疫5次，末次免疫后5-7d于耳缘静脉试血，间接ELISA方法检测血清达理想效价后颈动脉放血，收集兔血清。
(3)免疫兔血清采集及纯化
采用颈总动脉放血法收集兔血清。
盐析法初步纯化兔血清：
A、10mL血清与生理盐水等体积混合，边搅拌边逐滴加入饱和硫酸铵，使其终浓度为50％，4℃过夜，使蛋白充分沉淀。
B、3000rpm/min离心20min，弃上清。10mL生理盐水溶解沉淀，边搅拌边逐滴加入饱和硫酸铵，使其终浓度为33％，4℃沉淀3h以上。
C、3000rpm/min离心20min，弃上清。
D、所得沉淀以PBS溶解至5mL，装入透析袋，4℃以大于其20倍体积的PBS透析1～2d，其间更换PBS数次，直至萘氏试剂检测透析外液无黄色为止。
E、初步纯化的兔血清以C18反相色谱分离柱分离纯化后冷冻抽干。(亲和纯化抗体IgG冻干粉定量，1mg/支，-20℃保存)。
(4)间接ELISA方法测定血清效价
于注射免疫程序开始前和每次注射免疫后1周，从兔耳缘静脉取血1mL，离心取上清测定血清效价。
A、包被：将合成的多肽溶解于0.1mol/L的碳酸盐缓冲液中(pH 9.6)配成100μg/ml的抗原包被液，100μl包被酶标板，同时设立阴性对照(1：200稀释的正常兔血清)和空白对照(不加一抗)，各3复孔，100μL/孔，37℃包被3h；
B、洗涤：250μL/孔洗涤液，洗涤3次，每次5min；
C、封闭：200μL/孔封闭液，37℃封闭2h；
D、洗涤：250μL/孔洗涤液，洗涤3次，每次5min；
E、加一抗：加入1：200稀释的兔免疫血清，100μL/孔，37℃孵育1h；
F、洗涤：250μL/孔洗涤液，洗涤3次，每次5min；
G、加二抗：加入1:10 000羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h；
H、洗涤：250μL/孔洗涤液，洗涤5次，每次5min；
I、显色：加入OPD使用液，100μL/孔，避光显色10～20min；
J、终止反应：2mol/L硫酸，50μL/孔。
酶标仪测定A492值，以(被检标本值-空白值)/(阴性对照值-空白值)即P/N≥2.1为阳性。
2、P-5m八肽抗体的制备和效价
结果显示P-5m肽段具有良好的免疫原性，在接受第一次免疫后2周即第3周，体内抗体滴度开始上升，5次主动免疫结束后即第9周，兔抗血清与多肽抗原发生强阳性反应，对照组兔血清不与多肽发生免疫反应。家兔免疫后获得的血清进行倍比稀释，随着血清稀释度的增加，其反应孔OD值降低，以P/N≧2.1为阳性，间接ELISA测定效价均大于1:16 0000，表明获得高效价的多抗。
3、检测
将所纯化的P-5m–Fc融合蛋白均以10μg/mL包被酶标板，4℃条件下包被过夜，然后以0.05％PBST洗涤3次，每次3min，加入1％BSA于37℃封闭2h，以0.05％PBST洗涤3次，每次3min，加入50×稀释的阴、阳性血清，37℃作用1h，以0.05％PBST洗涤3次，每次3min，加入10000×稀释的兔抗人IgG酶标抗体，37℃作用0.5h，以0.05％PBST洗涤3次，每次3min，加入底物OPD，37℃作用15min，2mol/L H2SO4终止，应用ELx800酶标仪读取OD490值。
结果表明获得了高效价的P-5m多克隆抗体。
三、P-5m–Fc肽体抗肿瘤转移的功能研究
1、Fc对照蛋白的表达、纯化
为确定肽部分在发挥作用，同时表达了对照的Fc蛋白，将构建好的pET-28a-Fc融合表达质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达(图2,3)，收集菌体，超声破菌，离心收集包涵体部分，同融合蛋白一样进行洗涤和尿素溶液变性溶解，并纯化。
2、融合蛋白对HCCLM3细胞侵袭基质膜的抑制作用
(1)方法
A、将无基质胶的Transell小室包被基底膜：用无血清RPMI 1640培养基在冰上将Matrigel稀释至200μg/ml，在每个上室内加入100μl混合液体，放入CO2恒温培养箱内凝结30min后，吸走多余液体。
B、水化基底膜：向上、下室内分别加入500μl无血清RPMI 1640培养基，放入CO2恒温培养箱内水化30min。
C、制备细胞悬液：取对数生长期的HCCLM3细胞进行消化，弃去原有培养液，用含10mg/ml BSA的无血清培养基将细胞稀释至5×105cells/ml，并加入终浓度为0μM、10μM和100μM的P-5m。
D、接种细胞：将200μl不同组细胞悬液分别接种至transwell上室，下室加入500μl含10％FBS的RPMI 1640培养基，放入CO2恒温培养箱内培养24h。
E、固定：吸走上室液体，用棉签轻柔拭去膜上细胞和Matrigel胶，用冰冷的甲醇将膜下细胞固定10min，风干。
F、染色：室温下用0.1％结晶紫染色15min，用无菌水洗3次，晾干。
G、置于倒置显微镜下(400×)拍照，每孔计数5个视野的细胞数，比较各组细胞侵袭性差异。实验重复三次。
(2)结果
通过上述transwell侵袭实验，考察P-5m-Fc融合蛋白作用48h后对肝癌细胞迁移的抑制效果。
如图7-8所示，HCCLM3细胞的侵袭实验结果显示，10μM P-5m-Fc处理组穿膜细胞数比对照组少31.6％，100μM P-5m处理组穿膜细胞数比对照组少43.4％，差异有统计学意义(P≤0.05)；100μM的P-5m-Fc与P-5m多克隆抗体共同处理后穿膜细胞数比对照组少11.9％，差异无统计学意义。侵袭实验进一步明确了抗体封闭后P-5m对肿瘤细胞侵袭的影响，结果显示该抗体能够封闭P-5m-Fc对肿瘤细胞侵袭的抑制能力。
并且，从实验结果中还可以看出，10μM P-5m-Fc处理组穿膜细胞数比相同剂量P-5m处理组的穿膜细胞数少13.0％，且差异具有统计学意义(P≤0.05)；100μM P-5m-Fc处理组穿膜细胞数比相同剂量P-5m处理组的穿膜细胞数少12.3％，且差异具有统计学意义(P≤0.05)。
通过上述结果可以看出，表达纯化后的P-5m-Fc融合蛋白具有较好的抗肿瘤细胞侵袭的活性，其抗肿瘤细胞侵袭的效果优于P-5m八肽。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure IDA0001084806440000011

Claims (5)

1.一种P-5m-Fc融合蛋白，其特征在于，由功能单元与人免疫球蛋白IgG1的Fc部分连接构成，其中，所述功能单元由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列与连接子连接构成，所述连接子为由六个依次连接的甘氨酸构成的多肽，所述P-5m-Fc融合蛋白中至少具有一个所述功能单元，当所述P-5m-Fc融合蛋白中具有多个所述功能单元时，多个所述功能单元顺次连接后再与所述免疫球蛋白的Fc部分连接；
所述P-5m-Fc融合蛋白通过以下方法制备得到：
(1)构建表达基因，并将上述表达基因插入至载体中，构建重组表达载体；
所述表达基因的序列为：由如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的功能单元的核苷酸序列及编码免疫球蛋白的Fc部分核苷酸序列组合构成；
(2)将上述重组表达载体转入宿主细胞中，通过筛选得到阳性表达载体；
(3)将上述阳性表达载体转入表达细胞中，对步骤(1)中的表达基因序列进行诱导表达；
(4)纯化：收集经过诱导表达菌体，并用磷酸盐缓冲液悬浮，进行超声破碎，离心，得到以包涵体表达的P-5m-Fc融合蛋白；将上述包涵体以裂解缓冲液重悬，所述裂解缓冲液中包括50mmol/L pH8.0的Tris-HCl，l mmol/L的EDTA，100mmol/1L的NaCl，再经过体积百分数为2％的Triton X/100，质量百分比浓度为0.2％的脱氧胆酸钠，1mol/L尿素洗涤进行初步纯化；
经初步纯化的包涵体用pH8.0的含有8mmol/L尿素、20mmol/L DTT的25mmol/L的Tris-HCl缓冲液进行变性溶解；
再将上述P-5m-Fc融合蛋白以SP-sepharose阳离子层析柱进行纯化，然后通过氧化还原剂复性或碱性条件下空气氧化复性；
所述氧化还原剂复性的条件为：在纯化后的P-5m-Fc融合蛋白缓冲液中，加入DTT至终浓度10mmol/L，然后加入还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽至浓度分别为2mmol/L及0.2mmol/L，再用4mol/L尿素将P-5m-Fc融合蛋白稀释成0.5mg/ml，以浓度由4mol/L、2mol/L、0mol/L的尿素缓冲溶液透析复性，该尿素溶液中含相同浓度的还原型和氧化型谷胱甘肽；
所述碱性条件下空气氧化复性的条件为：将纯化后的P-5m-Fc融合蛋白透析到尿素含量为8mol/L的pH10.0的25mmol/L Tris-HCl缓冲液中，加入DTT至终浓度10mmoI/L，暴露在空气中搅拌过夜，将P-5m-Fc融合蛋白稀释成0.5mg/ml，以浓度由4mol/L、2mol/L、0mol/L的尿素缓冲溶液透析复性；
通过复性得到具有正确构象的活性P-5m-Fc融合蛋白。
2.一种权利要求1所述的P-5m-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建如权利要求1所述的表达基因，所述表达基因的序列为：由如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的功能单元的核苷酸序列及编码免疫球蛋白的Fc部分核苷酸序列组合构成；并将上述表达基因插入至载体中，构建重组表达载体
(2)将上述重组表达载体转入宿主细胞中，通过筛选得到阳性表达载体；
(3)将上述阳性表达载体转入表达细胞中，对步骤(1)中的表达基因序列进行诱导表达；
(4)纯化：收集经过诱导表达菌体，并用磷酸盐缓冲液悬浮，进行超声破碎，离心，得到以包涵体表达的P-5m-Fc融合蛋白；将上述包涵体以裂解缓冲液重悬，所述裂解缓冲液中包括50mmol/L pH8.0的Tris-HCl，l mmol/L的EDTA，100mmol/1L的NaCl，再经过体积百分数为2％的Triton X/100，质量百分比浓度为0.2％的脱氧胆酸钠，1mol/L尿素洗涤进行初步纯化；
经初步纯化的包涵体用pH8.0的含有8mmol/L尿素、20mmol/L DTT的25mmol/L的Tris-HCl缓冲液进行变性溶解；
再将上述P-5m-Fc融合蛋白以SP-sepharose阳离子层析柱进行纯化，然后通过氧化还原剂复性或碱性条件下空气氧化复性；
所述氧化还原剂复性的条件为：在纯化后的P-5m-Fc融合蛋白缓冲液中，加入DTT至终浓度10mmol/L，然后加入还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽至浓度分别为2mmol/L及0.2mmol/L，再用4mol/L尿素将P-5m-Fc融合蛋白稀释成0.5mg/ml，以浓度由4mol/L、2mol/L、0mol/L的尿素缓冲溶液透析复性，该尿素溶液中含相同浓度的还原型和氧化型谷胱甘肽；
所述碱性条件下空气氧化复性的条件为：将纯化后的P-5m-Fc融合蛋白透析到尿素含量为8mol/L的pH10.0的25mmol/L Tris-HCl缓冲液中，加入DTT至终浓度10mmoI/L，暴露在空气中搅拌过夜，将P-5m-Fc融合蛋白稀释成0.5mg/ml，以浓度由4mol/L、2mol/L、0mol/L的尿素缓冲溶液透析复性；
通过复性得到具有正确构象的活性P-5m-Fc融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的P-5m-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中，通过下述方法构建重组表达载体：首先得到碱基序列组成为SEQ ID NO.2的基因片段，以BamH I和Nde I双酶切pET-28a(+)Fc质粒，回收酶切的载体片段，将上述SEQID NO.2的基因片段通过DNA连接酶插入至上述载体中，得到重组质粒，即为重组表达载体；
步骤(2)中，所述阳性表达载体通过以下方法得到：通过热激法将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含X-gal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，筛选得到阳性质粒，即为阳性表达载体；
步骤(3)中，所述诱导表达的具体方法为：将步骤(2)中得到的阳性质粒，通过热激法转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，培养；挑取单菌落接种至含氨苄青霉素LBG培养基中，培养，培养后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再诱导培养；得到P-5m-Fc融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的P-5m-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，
步骤(2)中，通过热激法将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含X-gal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，培养12-16h后，再挑取单菌落，接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，筛选得到阳性质粒；
步骤(3)中，将步骤(2)中得到的阳性质粒，通过热激法转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，培养12-16h；挑取单菌落接种至含50μg/ml氨苄青霉素的LBG培养基中，振摇培养至OD600达到0.4-0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.2-0.6mmol/L，诱导培养，离心培养物，取沉淀，加入磷酸盐缓冲液和上样缓冲液，煮沸后再次离心，得到P-5m-Fc融合蛋白。
5.权利要求1所述的P-5m-Fc融合蛋白在制备用于抑制肝癌细胞转移的药物中的应用。
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