CN103360497A

CN103360497A - 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103360497A
Application number: CN2013103062594A
Authority: CN
Inventors: 曹荣月; 宦晓军; 张鹏; 常娜; 杨梦琪
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-07-22
Filing date: 2013-07-22
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明属于基因工程制备活性肽领域，公开一种抗肿瘤融合蛋白疫苗VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽及其制备方法和应用。利用本实验室的融合表达制备技术平台，构建在大肠杆菌细胞内融合表达VEGF121-M2-X10-hCG-CTP37肽的工程菌。通过离子交换层析法分离获得目的蛋白。通过体外Western blotting鉴定检测融合蛋白疫苗的正确表达及所含两种抗原表位的免疫原性；体内动物实验预期本疫苗能够显著性抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖，并诱发特异性的抗肿瘤免疫反应，对于抗肿瘤治疗具有很好的临床应用前景。

Description

一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程制备活性肽领域，公开一种抗肿瘤融合蛋白疫苗VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽及肽的融合表达工程菌的构建、DEAE52离子交换层析制备VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽的方法及体外Western blotting鉴定融合蛋白疫苗的正确表达及所含两种抗原表位的免疫原性。

背景技术

生物治疗是一个广泛的概念，涉及一切应用生物大分子进行治疗的方法，种类十分繁多.如果从操作模式上来分非细胞治疗和细胞治疗。生物治疗是继手术、放疗和化疗后发展的第四类癌症治疗方法，系利用和激发机体的免疫反应来对抗、抑制和杀灭癌细胞。生物治疗的主要优点有：运用正常人赖以生存而肿瘤患者表达较低的生物细胞因子调动机体自身的免疫力量达到抗肿瘤作用，与放疗和化疗相比，副作用很小；通过主动免疫能够激发全身性的抗肿瘤效应，作用范围更加广泛，特别适用于多发病灶或有广泛转移的恶性肿瘤；采用分子靶向药物进行治疗，目标明确，对肿瘤细胞以外的正常细胞无影响，对不宜进行手术的中晚期肿瘤患者，能够明显遏制肿瘤的进展，延长患者生命。

肿瘤多肽疫苗即属于一种重要的非细胞生物治疗模式，因制作工序简单、费用低廉、化学性质稳定、无致癌性等优点而成为肿瘤免疫治疗的新方法。理想的多肽疫苗免疫原性强，能激活抗原特异性CTL和HTL反应，有效杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒害作用。但是普通的多肽抗原因其表位单一、分子量小易降解等原因而致免疫原性弱，只能激发低水平的CTL反应，不能获得理想的抗肿瘤效果，故在多肽疫苗设计过程中需重点解决提高免疫原性的问题。

分子靶向治疗针对肿瘤异常的信号通路，具有高选择性、低毒性和高治疗指数，可长期用药，从而有可能使恶性肿瘤转化为“慢性病”。目前，已有十余种分子靶向药物被批准用于实体瘤治疗，另有数十种处于临床研究中。分子靶向药物已经成为抗肿瘤新药研发的主要方向。但是，单一靶点的小分子类药物治疗范围窄，且易产生免疫逃逸和耐药性。大多数实体肿瘤都是多靶点、多环节的调控过程，阻断一个受体或靶位不一定能阻断所有细胞信号转导。多靶点药物简化了治疗程序，代表了肿瘤靶向治疗药物新的发展方向。

血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的血管新生因子，是促进血管生长作用最强的关键因子之一，是诱导血管生成的主要调节因素。而血管的生成是肿瘤快速生长和恶变转移所必须的条件。目前共发现有五种哺乳动物VEGF配体和三种VEGF酪氨酸激酶受体，一些共受体还可间接的调节VEGF的生物学效应。VEGF在正常组织和肿瘤组织中的表达有显著差异，在肿瘤的发生发展中具有重要作用，为肿瘤的治疗提供了新的作用靶点。

人绒毛膜促性腺激素(hCG)在肿瘤细胞表面的异位表达是肿瘤细胞的特征性标志之一，正常情况下成人组织细胞的胚胎基因处于静息状态，不表达或仅表达极其微量的hCG，当细胞发生恶性转化时，静息的胚胎基因被激活而表达。但良性肿瘤细胞一般不表达异位hCG，分化程度越低的肿瘤表达越高，恶性程度也越高；而且对肿瘤生长、和逃避免疫系统攻击起重要作用。hCG并不诱发肿瘤的发生，但肿瘤一旦形成就会表达异位hCG，模拟胚胎发育模式促进自身生长。hCGβ亚基C末端37个氨基酸(βhCG-CTP37)部位浓集了ehCGβ所含6条糖链中的4条(在C末端上第121，127，132，138丝氨酸上连有四条O-糖链)，可能与肿瘤的转移、免疫耐受等特性的关系更密切；而且存在βhCG的特异性表位，可诱导特异性的免疫应答避免交叉反应的发生。所以针对βhCG-CTP37关键抗原的免疫应答(包括抗体和效应细胞)可能对ehCG+肿瘤更具有抗瘤效应。

由于VEGF和hCG均为自体蛋白，极易产生免疫耐受，免疫原性较低，故可通过串联重复表位的方法增强二者的免疫原性。M是热休克蛋白Hsp70上407-426之间的肽段，M2则是两段M的串联重复连接，M2可作为分子内佐剂，增强多肽疫苗的免疫原性，且不依赖Hsp70而发挥作用。X是hCGβ亚基上109-118之间的肽段，通过基于同尾酶技术的基因片段重复技术，构建出十段重复的X10，用于增强βhCG-CTP37的免疫原性。

本融合蛋白即为多靶点抗肿瘤多肽疫苗，针对不同的抗原表位，诱发特异性免疫反应，并依赖于M2和X10的帮助，产生高滴度的抗VEGF抗体和抗βhCG抗体，两种抗体分别作用于不同的抗肿瘤靶点，达到抑制肿瘤血管生成和特异性抑制肿瘤细胞增殖的作用。

发明内容

公开一种抗肿瘤双功能融合蛋白疫苗VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽制备方法和应用。

本发明的一个目的是提供相应的编码序列，载体和宿主菌。

本发明的另一个目的是通过VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽作为疫苗刺激机体，打破免疫耐受，同时产生针对VEGF和βhCG特异性肽段的抗体，通过抗原特异性的抗肿瘤免疫和抗肿瘤血管生成两方面抑制肿瘤的生长。

在本发明的另一方面，提供了一种VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽，它是利用DPTGG柔性肽将两种抗肿瘤疫苗上的抗原表位连接制备新型双功能融合蛋白疫苗。

在本发明的第二方面，提供了一种VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求4，5所述的质粒载体及其工程菌。

(b)从培养物中分离出SEQ NO：1所示氨基酸序列的VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽。

(c)纯化出VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽。

在一优选例中，本发明的方法中，所述的步骤(b)包括：

通过溶菌，硫酸铵分级沉淀，离子交换层析等方法分离出VEGF121-M2-DPTGG和X10-βhCG-CTP37组成的融合蛋白。

附图说明

图1重组质粒构建原理示意图。Linker代表连接肽DPTGG，D代表Asp，P代表Pro，T代表Thr，G代表Gly。

图2PCR获得X10-βhCG-CTP37基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

M为DNA Marker，Lane1：PCR产物。

图3PCR获得VEGF-M2-DPTGG基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

M为DNA Marker，Lane1：PCR产物。

图4融合蛋白的基因正向测序图。

图5融合蛋白的基因反向测序图。

图612％SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白结果，即重组菌的诱导曲线。

M为Protein Marker，Lane1：诱导前的全菌蛋白样品，Lane2-9：诱导后1-8小时每个小时的全菌蛋白样品

图712％SDS-PAGE电泳检测超声裂解菌体结果。

M为Protein Marker，Lane1：诱导前全菌蛋白，Lane2：诱导后6h全菌蛋白，Lane3：超声裂解后上清，Lane4：超声裂解后沉淀

图812％SDS-PAGE电泳检测硫酸铵分级沉淀目的蛋白结果。

M为Protein Marker，Lane1：菌体裂解上清，Lane2：10％-15％饱和度时蛋白沉淀，Lane3：15％-20％饱和度时蛋白沉淀，Lane4：20％-25％饱和度时蛋白沉淀，Lane5：25％-30％饱和度时蛋白沉淀，Lane6：30％-35％饱和度时蛋白沉淀Lane7：35％-40％饱和度时蛋白沉淀。

图912％SDS-PAGE电泳检测DEAE52阴离子交换层析对目的蛋白纯化结果。

M为Protein Marker，Lane1：上样前蛋白溶液样品，Lane2-9：蛋白洗脱峰每8mL取样样品。

图1012％SDS-PAGE电泳检测融合蛋白冻干粉复溶结果。

M为Protein Marker，Lane1：诱导前全菌蛋白，Lane2：诱导后6h全菌蛋白，Lane3：冻干粉复溶样品。

图11Western bloting检测融合蛋白中βhCG抗原结果。

M为蛋白预染Marker，Lane1：纯化后的融合蛋白。

图12Western bloting检测融合蛋白中VEGF抗原结果。

M为蛋白预染Marker，Lane1：纯化后的融合蛋白。

具体实施方式

以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。

本说明书中所提到的材料：

(1)宿主菌和质粒

宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工程菌种，基因工程研究相关的实验室一般都有保存。pET-28a载体为本实验室构建并保存。

(2)酶和试剂

分子克隆工具酶为Fermentas公司产品；质粒抽提试剂盒、PCR胶回收试剂盒为上海生工生物科技有限公司产品；DAB显色试剂盒为北京鼎国昌盛生物技术有限公司产品。

(3)培养基

LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。

本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A LaboratoryManual2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。

(4)抗体

兔抗人βhCG单克隆抗体为北京博奥森生物技术有限公司产品，兔抗人VEGF单抗为上海生工生物工程股份有限公司产品，羊抗兔IgG二抗为武汉博士德生物工程有限公司产品。

实施例1VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37基因的克隆

本实验利用PCR技术，利用合成的4条引物V1、V2、C1、C2，分别从模板质粒上获得目的基因的片段，再将两个目的片段逐个插入到pET-28a表达载体中，从而获得融合蛋白序列。四条引物序列如下：

V1：5′-CATGCCATGGACATCATCGACGACT-3′含保护碱基及Nco I酶切位点

V2：5′-GGAATTCGCCACCAGTCGGATCCTTGTTGTGAGCGGCAATCT-3′含保护碱基及EcoR I酶切位点

C1：5′-CGGCGACATGGGTGGCATGGAATTC-3′含保护碱基及EcoR I酶切位点

C2：5′-GGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTA-3′含保护碱基及HindIII酶切位点

引物由捷瑞测序公司合成。PCR反应在eppendorf PCR扩增仪上进行。C1和C2按1∶1比例混合，于94℃，30s；60℃，45s；72℃，1min；共35个循环。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见图3)，条带位置与预期的522bp一致。

PCR产物经切胶回收获得的目的基因片段和pET-28a载体质粒分别经EcoRI和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用T₄ DNA连接酶4℃连接，转化至E.coli BL21感受态细胞后涂布到含50mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落，酶切方法初筛阳性克隆，将阳性克隆送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确。

再将V1和V2按1∶1比例混合，于94℃，30s，58℃，45s；72℃，1min；共35个循环。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见图3)，条带位置与预期的538bp一致。

PCR产物经切胶回收获得的目的基因片段和第一步构建的载体质粒分别经EcoR I和Nco I双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用T₄DNA连接酶4℃连接，其他步骤同第一步克隆，将阳性克隆送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确(参见图4)，至此融合蛋白基因构建完成。

实施例2VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽基因在大肠杆菌中的表达及培养重组表达菌以1％接种量在液体LB培养基中37℃振荡过夜，再1％转接摇瓶大批培养，培养3h后加入终浓度为7mM乳糖诱导表达，诱导6h后收集菌体，留样进行SDS-PAGE分析(参见附图4)。融合蛋白在诱导后6h达到稳定的最大表达量，通过Bandscan软件分析融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的35％，并在胞内以可溶性形式表达。

实施例3融合蛋白的初步分离纯化

挑选高表达量菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养；过夜培养液转接入LB培养基，37℃扩大培养，选取最优发酵条件获得发酵菌体。8000r/min离心15min，上清及沉淀均留样。pH8.0，50mM的Tris·HCl漂洗2次菌体沉淀；向收集的菌体中加入配制好的菌体裂解液(10mL/g菌体)，放置于37℃摇床恒温剧烈振荡2小时后进行超声裂解操作，以充分裂解菌体；裂解至溶液不粘滞时取出裂解液，12000r/min离心15min，收集上清及沉淀均留样标记。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白主要存在于菌体裂解上清中，故可判断融合蛋白为胞内可溶性表达。

取裂解上清于冰浴中边搅拌边加入研细的硫酸铵粉末至相应饱和度，4℃静置1小时后12000r/min离心20min，每一级饱和度各取上清和沉淀制备样品，进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示目的蛋白主要在硫酸铵溶液15％至25％饱和度时集中沉淀，虽然在更高饱和度时也有目的蛋白析出，但含量较少，可忽略。取上述沉淀复溶于离子交换缓冲液(25mM Tris·HCl，pH8.0)中，于4℃透析过夜，再于4℃，12000r/min，离心20min，弃沉淀，上清用DEAE-52阴离子交换柱进行进一步分离纯化。

实施例4DEAE-52阴离子交换层析

本实施例采用的是DEAE-纤维素DE52是弱酸型阴离子交换剂，将DEAE-52用HCl和NaOH分别处理后用蒸馏水将其洗至中性，再将DEAE-52装入层析柱中，层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接核酸蛋白检测仪，利用离子交换缓冲液(pH8.0，25mM Tris·HCl)进行层析柱的平衡，平衡完毕后以1mL/min的速度进行蛋白溶液的上样操作，上样后重复平衡操作，再用NaCl(0-500mM)进行梯度洗脱，收集洗脱峰，并每8ml留样，进行SDS-PAGE电泳分析。

实施例5脱盐冻干

收集蛋白纯度较高的洗脱液，4℃对其用蒸馏水透析过夜，将透析后的洗脱液平铺于玻璃平皿中，平放入-20℃冰箱中预先冷冻至固体，再迅速转移至冻干机中零下40℃冻干12小时，刮取蛋白干粉冷冻保存。

实施例6融合蛋白疫苗的Western blotting鉴定

融合蛋白疫苗中βhCG抗原片段的体外Western blotting鉴定方法如下：将蛋白干粉复溶后制备样品进行SDS-PAGE电泳，至溴酚蓝刚跑出胶板停止电泳，剥胶，切胶至合适大小，根据胶的大小裁剪硝酸纤维素(NC)膜，针对40kDa左右的蛋白，稳流110mA转膜3h，蛋白质转移至NC膜上后，用5％的脱脂牛奶封闭液或5％BSA37℃封闭1h。将NC膜取出后置于杂交袋中，于膜正面加入稀释后的一抗(兔抗人βhCG单克隆抗体)，排气泡，封口，37℃孵育2h，将膜取出，TBST(pH7.6，100mM Tris·HCl，0.9％NaCl，0.1％tween-20)洗三次，每次10min。再用稀释后的二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)同上孵育1h，TBST洗三次，每次10min，再经水洗10min后，取出NC膜进行DAB显色观察结果。

融合蛋白疫苗中VEGF抗原片段的体外Western blotting鉴定方法同上，所不同的是一抗为兔抗人VEGF单克隆抗体。其他试剂及操作事项均与上述方法中的一致。

除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。

Claims

1.一种抗肿瘤融合蛋白疫苗VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37的氨基酸序列为：Met Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Gln Asn His His Glu Val Val Lys PheMet Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe GlnGlu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg CysGly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile ThrMet Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe LeuGln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Tyr IleLys Ala Asn Ser Lys Phe Ser Ser Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln Gly GluArg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Ser Ser Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln GlyGlu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Asp Pro Thr Gly Gly Glu Phe Ala Arg Thr CysAsp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ala ArgThr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln AspSer Ala Arg Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg PheGln Asp Ser Ala Arg Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Thr Cys Asp Asp ProArg Phe Gln Asp Ser Ala Arg Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe GIn Asp Ser Thr CysAsp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ala Ser Ala Asp Pro Thr Gly Gly Thr Cys Asp AspPro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro SerArgLeu Pro Gly Pro SerAsp Thr Pro Ile Leu Pro Gln(SEQ ID NO：1)。

2.根据权利要求1所述的VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37，其特征在于，它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤双功能融合蛋白疫苗VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37，其特征在于：该多肽的理论分子量为37657.05Da，实际分子量约为42kDa，其N端为VEGF突变体1(VEGF121首尾1-8和115-121两段氨基酸序列用破伤风毒素Th表位替换)及M2(HSP70(407-426)肽段的两段串联重复序列)，C端为X10(βhCG(109-118)的十段串联重复序列)及βhCG的C末端的37个氨基酸(βhCG-CTP37)，N端和C端之间利用DPTGG柔性肽连接。

4.一种载体，其特征在于：它含权利要求2所述的核苷酸序列及权利要求3所述的重组方法：先将X10-βhCGCTP37基因插入本实验室保存的pET-28a载体上，筛选克隆，再将VEGF突变体1基因插入此克隆上，构成新的融合蛋白基因。该融合蛋白基因位于pET-28a载体T7启动子的下游。这个重组的融合表达质粒称pET-28a-VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37。

5.一种基因工程菌，其特征在于：含有权利要求4所述的载体。

6.包括权利要求4所述的VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽的重组方法，其特征在于：包含两种抗肿瘤疫苗的抗原表位及分子内佐剂M2和X10，同时具有两种不同的抗肿瘤机制和功能。

7.一种VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：

(I)在适合的表达条件下，培养权利要求5所述的宿主菌。

(II)通过溶菌，超声破碎，硫酸铵分级沉淀，初步分离重组后的融合蛋白；该融合蛋白具有权利要求1所示的VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37的氨基酸序列。

(III)通过DEAE-52离子交换层析分离出VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37，该融合蛋白纯度可达SDS-PAGE电泳纯。

8.根据权利要求1所述的重组多肽的活性，其特征在于：所述的VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37在体外进行蛋白质免疫印迹实验(Western blotting)，可分别与VEGF单抗和βhCG单抗产生阳性反应，表明该融合蛋白同时具有VEGF和βhCG两种抗原表位，且表位间互不干扰，具备正确的空间构象。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的步骤(III)中的VEGF121-M2-X10-βhCG-CTP37肽进入体内后，刺激机体产生针对VEGF和βhCG-CTP37抗原表位的两种特异性抗体，通过抑制肿瘤血管生成和特异性的抑制肿瘤细胞的生长达到预防和治疗肿瘤的目的。