CN106046108A - 一种长孢被孢霉pfy发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺 - Google Patents
一种长孢被孢霉pfy发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，黄姜浆料用淀粉酶糖化后再接入长孢被孢霉PFY进行发酵，从发酵后的固体剩余物中提取油脂后，再用酸水解，从酸水解后的固体剩余物中提取薯蓣皂素。该方法与预发酵—酸水解法相比，消耗浓盐酸的量可减少80‑90%，皂素收率提高10%以上，另外得到两种副产品：糖浓度为6%‑10%的淀粉糖化液和产率为黄姜干重1.5%‑3%的微生物油脂。
Description
技术领域
本发明涉及一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺。首先通过淀粉酶酶解糖化，使黄姜淀粉转化为可溶于水的糖，然后将剩余固体物用长孢被孢霉PFY发酵，降解掉大部分的纤维素，再进行酸解，最后提取皂素，形成酶解/发酵——酸解联合法生产薯蓣皂素新工艺。
背景技术
皂素是合成肾上腺皮质激素类药物的主要原料，随着其在临床医学上的使用率的提升，皂素的需求量也随着增加。皂素一般从黄姜中提取得到，近年来黄姜种植业得到了很大的发展，并且成为部分农村和山区人民的主要经济来源，也逐步成了地区性的产业。但是皂素生产企业作为一类化工企业，其带来的污染也是非常严重的。黄姜主要种植地区和加工企业在湖北省长江流域沿线，企业的污水和废渣严重威胁着该地区丹江和汉江的生态环境。加之近年来“南水北调工程”的实施，为了保护水源的安全，很多环评和排污不达标的生产加工企业都陆续被迁离甚至停产。在国家新的改革发展形势下，污染问题已经上升为制约皂素企业进一步发展的主要原因之一，也是眼下必须攻克的难题。
目前众多科研工作者致力于薯蓣皂素的清洁生产工艺研究。大致的方向分为两种，一种是在传统的无机酸水解工艺基础上进行工艺改进，另一种是开发非无机酸水解的清洁工艺。非无机酸的清洁生产工艺，包括离子交换树脂催化法、离子液体催化法、生物转化法以及热分解处理法等。非无机酸水解清洁生产工艺艺几乎实现了零污染排放，这与传统无机酸有着本质的区别。但是非无机酸清洁生产工艺存在产率低、成本高等的问题。在国内的皂素产业一般仍然选择使用酸水解工艺，酸水解工艺开发最早，条件最成熟。
酸水解工艺一般包括直接酸水解工艺及改进后的预发酵-酸解联合法工艺。在酸解过程中，黄姜含有的淀粉和纤维素也会被水解转变为单糖、低聚糖等可溶于水的糖类以及高聚糖等，酸解液中含有较高浓度的而糖类物质。通过酸解作用，使得薯蓣皂苷连接的糖苷键断裂，释放出薯蓣皂素。再用相应的溶剂将薯蓣皂素从固体剩余物中萃取出来。通过后续的重结晶可得到高纯度的薯蓣皂素成品。
直接酸水解法制备薯蓣皂素的得率不理想，其主要原因是薯蓣皂苷通过糖苷键与细胞壁上的纤维素相连，酸解作用不足以有效的打断薯蓣皂素与糖残基之间的连接。另一个原因是是薯蓣皂苷存在于细胞内部，细胞壁上的组织比较坚韧，酸不足以穿透植物组织。更深层次的原因就是薯蓣皂素本身的分子结构歧链糖基在酸水解进行时产生了位阻，使得水解不完全，薯蓣皂素得率低。
四川省生物研究所薯蓣综合利用组在《植物学报》1975年第3期上发表的《预发酵提高薯蓣皂素产率及淀粉综合利用的研究》一文中最早对预发酵—酸水解法进行了介绍，最优化方案为发酵温度39-42 ℃，发酵时间48 h，酸解固液比1:5，所用硫酸浓度为0.5mol/L，薯蓣皂素得率平均值为2.67%。与直接酸水解法（酸浓度为1mol/L）相比，薯蓣皂素得率可提高23.4-39.8%。平均每批物料55.4kg，水解液体积平均为255L，生产1g薯蓣皂素的水解液为172mL。
长孢被孢霉PFY（Mortierella. elongata PFY）（CN 102618447A）为一株降解纤维素生产微生物油脂的真菌，由本实验室从土壤中筛选出并保藏，其种属由真菌的形态学和ITS全序列分析进行鉴定。姚日生等人利用长孢被孢霉PFY进行稻草秸秆的液态发酵，在秸秆浓度为20 g/L时，油脂产率为8.15 %。产生的微生物油脂中含有饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，组分含量分别为40%和56%。
发明内容
本发明的目的是提供一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，包括以下步骤：
（1）将新鲜黄姜搅拌清洗去除泥沙，粉碎成黄姜浆料a；
（2）加入淀粉酶进行酶解糖化，将糖化液离心，取出固体物b；
（3）把（2）中固体物b投入预混发酵培养基中，配置为成品发酵培养基，灭菌后接种长孢被孢霉PFY，培养，将发酵液离心，取出固体物c，干燥；
（4）用沸程30-60℃的石油醚从固体物c中提取油脂，在87-90℃下提取7.6-8h，提取后的剩余固体物记为d；
（5）将（4）中得到的固体物d进行酸解，然后离心分离，将分离后的固形物干燥、粉碎，记为e；
（6）用沸程60-90℃的石油醚从（5）中得到的粉碎固形物e中提取薯蓣皂素，在98-100℃下提取9.8-10h，得薯蓣皂素粗提物，将薯蓣皂素粗提物重结晶得薯蓣皂素纯品。
一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，所述步骤（2）中淀粉酶糖化前，黄姜浆料需加水调成固含量为15%-20%。
一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，所述的淀粉酶为耐高温α-淀粉酶，糖化时用盐酸调黄姜浆料至pH为6-7，在100 ℃下搅拌糖化2-6 h，酶用量为按照黄姜干重每g加入耐高温α-淀粉酶50-200单位（U）。
一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，所用的长孢被孢霉PFY为Mortierella. elongate CGMCC No.5070。
一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，所述步骤（3）中的预混发酵培养基的成分为：酵母粉3-8 g/L、硫酸铵1-4 g/L、七水硫酸镁0.3-0.7 g/L、磷酸二氢钾0.2-0.8 g/L，固体物b在成品培养基发酵中的含量为10-150 g/L。
一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，所述步骤（3）中培养的条件为温度30-35 ℃、培养基初始pH值4-7、发酵时间3-10 d、接种量1-10%。
一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，酸解所用酸为稀盐酸，氢离子浓度为0.5-4 mol/L，酸用量为固液比1:3-1:8，酸解温度100-130℃，常压或加压酸解，酸解时间为0.5-6 h。
本发明的优点是：
本发明首先通过淀粉酶酶解糖化，使黄姜淀粉转化为可溶于水的糖，再利用产微生物油脂的长孢被孢霉PFY（M. elongata PFY），降解掉黄姜中大部分的纤维素生产油脂，并联合酸解形成酶解/发酵——酸解联合法生产薯蓣皂素新工艺，大幅度降低了水解用酸量及洗涤用水量，并得到淀粉糖化液和微生物油脂两种副产品，提高了黄姜资源的综合利用率。
附图说明
图1为：酶解/发酵-酸解联合法生产薯蓣皂素新工艺制备的薯蓣皂素HPLC图谱；注：测试条件：高效液相色谱仪为日本岛津的LC-15C，检测波长210 nm，色谱柱Pursuit 5C18(150mm × 4.6 mm,5 μm)，流动相为甲醇-水（95 : 5），流速:1 mL·min-1，进样量10 μL。
图2为：微生物油脂的GC-MS图谱。注：检测方法：首先对提取物进行甲酯化，取样0.1g，加入2mL 0.5N的KOH-CH3OH，60℃水浴中皂化30min，然后加入1mL 14%的CH3OH-BF3，60℃水浴中振荡10min，加入1mL饱和的NaCl破乳，取上清液进行分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细地描述，但本发明的实施例方式不限于此：
实施例1
（1）将固含量为25%的新鲜黄姜搅拌清洗去除泥沙，粉碎成黄姜浆料（1）；
（2）黄姜浆料加水调成固含量为20%，加入耐高温α-淀粉酶进行酶解糖化，糖化时用盐酸调黄姜浆料至pH为6，在100 ℃下搅拌糖化5 h，酶用量为按照黄姜干重每g加入耐高温α-淀粉酶100单位，糖化完毕后，离心，固体剩余33%，取出固体物（2）；
（3）把固体物（2）配置成发酵培养基，培养基各成分为固体物（2）10 g/L、酵母粉5 g/L、硫酸铵3 g/L、七水硫酸镁0.5 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L；
（4）灭菌后接种长孢被孢霉PFY、接种量5%，摇瓶培养，培养基初始pH值5、于30 ℃下发酵时间5 d，将发酵液离心，取出固体物（3），干燥，固体剩余40%；
（5）提取油脂，得剩余固体物（4）；
（6）将固体物（4）进行酸解，酸解所用酸为2 mol/L稀盐酸，酸用量为固液比1:8，在100℃下热压酸解，酸解时间为4 h。离心分离酸解固体剩余物，干燥后粉碎，得固体物（5）；
（7）从固体剩余物（5）中提取薯蓣皂素，所用溶剂为沸程60-90℃石油醚、在100℃下提取10h；
（8）油脂得率为黄姜原料干重的2.56%，薯蓣皂素得率为黄姜原料干重的2.97%，每生产1g薯蓣皂素，水解液体积为35.4mL，消耗37%浓盐酸的量为5.9mL。
实施例2:
（1）将固含量为30%的新鲜黄姜搅拌清洗去除泥沙，粉碎成黄姜浆料（1）；
（2）黄姜浆料加水调成固含量为20%，加入耐高温α-淀粉酶进行酶解糖化，糖化时用盐酸调黄姜浆料至pH为6，在100 ℃下搅拌糖化4 h，酶用量为按照黄姜干重每g加入耐高温α-淀粉酶150单位，糖化完毕后，离心，取出固体物（2）固体剩余35%；
（3）把固体物（2）配置成发酵培养基，培养基各成分为固体物（2）80 g/L、酵母粉6 g/L、硫酸铵3 g/L、七水硫酸镁0.3 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L。
（4）灭菌后接种长孢被孢霉PFY，摇瓶培养，摇瓶培养的条件为温度34 ℃、培养基初始pH值4、发酵时间7 d、接种量5%，将发酵液离心，取出固体物（3），干燥，固体剩余57%；
（5）提取油脂，得剩余固体物（4）；
（6）将固体物（4）进行酸解，酸解所用酸为3 mol/L稀盐酸，酸用量为固液比1:6，在100℃下热压酸解，酸解时间为2 h。离心分离酸解固体剩余物，干燥后粉碎，得固体物（5）；
（7）从固体剩余物（5）中提取薯蓣皂素，所用溶剂为沸程60-90℃石油醚、在100℃下提取10h；
（8）油脂得率为黄姜原料干重的3.45%，薯蓣皂素得率为黄姜原料干重的2.85%，每生产1g薯蓣皂素，水解液体积为28mL，消耗37%浓盐酸的量为7.0mL。
实施例3：
（1）将固含量为20%的新鲜黄姜搅拌清洗去除泥沙，粉碎成黄姜浆料（1）；
（2）加入耐高温α-淀粉酶进行酶解糖化，糖化时用盐酸调黄姜浆料至pH为6，在100 ℃下搅拌糖化2 h，酶用量为按照黄姜干重每g加入耐高温α-淀粉酶80单位，糖化完毕后，离心，固体剩余36%，取出固体物（2）；
（3）把固体物（2）配置成发酵培养基，培养基各成分为固体物（2）110 g/L、酵母粉4 g/L、硫酸铵5 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、磷酸二氢钾0.2 g/L。
（4）灭菌后接种长孢被孢霉PFY、接种量5%，培养基初始pH值6、于30 ℃下发酵时间10 d、摇瓶转速0 r/min，将发酵液离心，取出固体物（3），干燥，固体剩余60%；
（5）提取油脂，得剩余固体物（4）；
（6）将固体物（4）进行酸解，酸解所用酸为1 mol/L稀硫酸，酸用量为固液比1:5，在100℃下热压酸解，酸解时间为6 h。离心分离酸解固体剩余物，干燥后粉碎，得固体物（5）；
（7）从固体剩余物（5）中提取薯蓣皂素，所用溶剂为沸程60-90℃石油醚、在100℃下提取10h；
（8）油脂得率为黄姜原料干重的1.56%，薯蓣皂素得率为黄姜原料干重的2.95%，每生产1g薯蓣皂素，水解液体积55.8mL，消耗98%浓硫酸的量为3.1mL。
实施例4:
（1）将固含量为25%的新鲜黄姜搅拌清洗去除泥沙，粉碎成黄姜浆料（1）；
（2）黄姜浆料加水调成固含量为15%，，加入耐高温α-淀粉酶进行酶解糖化，糖化时用盐酸调黄姜浆料至pH为6，在100 ℃下搅拌糖化2 h，酶用量为按照黄姜干重每g加入耐高温α-淀粉酶100单位，糖化完毕后，离心，固体剩余35%，取出固体物（2）；
（3）把固体物（2）配置成发酵培养基，培养基各成分为固体物（2）100 g/L、酵母粉5 g/L、硫酸铵3 g/L、七水硫酸镁0.5 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L。
（4）灭菌后接种长孢被孢霉PFY、接种量10%，培养基初始pH值5、30 ℃下发酵时间5d，将发酵液离心，取出固体物（3），干燥，固体剩余36%；
（5）提取油脂，得剩余固体物（4）；
（6）将固体物（4）进行酸解，酸解所用酸为2 mol/L稀盐酸，酸用量为固液比1:5，在110℃下热压酸解，酸解时间为4 h。离心分离酸解固体剩余物，干燥后粉碎，得固体物（5）；
（7）从固体剩余物（5）中提取薯蓣皂素，所用溶剂为沸程60-90℃石油醚、在100℃下提取10h；
（8）油脂得率为黄姜原料干重的3.02%，薯蓣皂素得率为黄姜原料干重的3.17%，每生产1g薯蓣皂素，水解液体积为19.8mL，消耗37%浓盐酸的量为3.3mL。
参考例
预发酵—酸水解工艺：将同一批的鲜黄姜搅拌清洗去除泥沙，粉碎成黄姜浆料按照黄姜干重：水=1:5的量加水搅拌均匀，在40 ℃下静置发酵48 h，加入盐酸调成2 mol/L的浓度，在120 ℃下加压酸解4 h。离心分离固体剩余物，干燥后研碎，用索氏提取器提取皂素，计算皂素得率。该法皂素得率为黄姜干重的2.57%，每生产1g薯蓣皂素，水解液体积为194.4mL，消耗37%的浓盐酸的量为32.4mL。
Claims (7)
1.一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将新鲜黄姜搅拌清洗去除泥沙，粉碎成黄姜浆料a；
（2）加入淀粉酶进行酶解糖化，将糖化液离心，取出固体物b；
（3）把（2）中固体物b投入预混发酵培养基中，配置为成品发酵培养基，灭菌后接种长孢被孢霉PFY，培养，将发酵液离心，取出固体物c，干燥；
（4）用沸程30-60℃的石油醚从固体物c中提取油脂，在87-90℃下提取7.6-8h，提取后的剩余固体物记为d；
（5）将（4）中得到的固体物d进行酸解，然后离心分离，将分离后的固形物干燥、粉碎，记为e；
（6）用沸程60-90℃的石油醚从（5）中得到的粉碎固形物e中提取薯蓣皂素，在98-100℃下提取9.8-10h，得薯蓣皂素粗提物，将薯蓣皂素粗提物重结晶得薯蓣皂素纯品。
2.根据权利要求1所述的一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，其特征在于：所述步骤（2）中淀粉酶糖化前，黄姜浆料需加水调成固含量为15%-20%。
3.根据权利要求1所述的一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，其特征在于：所述的淀粉酶为耐高温α-淀粉酶，糖化时用盐酸调黄姜浆料至pH为6-7，在100 ℃下搅拌糖化2-6 h，酶用量为按照黄姜干重每g加入耐高温α-淀粉酶50-200单位（U）。
4.根据权利要求1所述的一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，其特征在于：所用的长孢被孢霉PFY为Mortierella. elongate CGMCC No.5070。
5.根据权利要求1所述的一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，其特征在于：所述步骤（3）中的预混发酵培养基的成分为：酵母粉3-8 g/L、硫酸铵1-4 g/L、七水硫酸镁0.3-0.7 g/L、磷酸二氢钾0.2-0.8 g/L，固体物b在成品培养基发酵中的含量为10-150g/L。
6.根据权利要求1所述的一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，其特征在于：所述步骤（3）中培养的条件为温度30-35 ℃、培养基初始pH值4-7、发酵时间3-10 d、接种量1-10%。
7.根据权利要求1所述的一种长孢被孢霉PFY发酵黄姜提取薯蓣皂素的新工艺，其特征在于：酸解所用酸为稀盐酸，氢离子浓度为0.5-4 mol/L，酸用量为固液比1:3-1:8，酸解温度100-130℃，常压或加压酸解，酸解时间为0.5-6 h。
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