CN106754422B - 一种塔宾曲霉及其在制备黄姜皂素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种塔宾曲霉及其在制备黄姜皂素中的应用，塔宾曲霉HG‑57，其保藏号为CCTCC M2016389。取适量塔宾曲霉菌丝接种于PDA固体培养基上进行活化，待产孢后加水收集获得孢子悬液。将孢子悬液接入到种子培养基中放大得到种子液。将孢子悬液或放大后的种子液接入到黄姜水提液、黄姜醇提水溶液或黄姜水混液中，有氧发酵1～7天后得到发酵液；从发酵液中分离提取获得皂素产品。与在上述体系中直接加酸水解获得的皂素含量相比，分别提高了1.2～1.4倍、1.1～1.4倍、1.4～1.8倍。该菌株能有效转化黄姜皂苷为皂素，彻底替代传统工艺中的酸水解转化过程，且十分易于工程化放大，具有广阔的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域和生物技术领域，更具体地，涉及一种塔宾曲霉及其在制备黄姜皂素中的应用。
背景技术
薯蓣皂苷元又称皂素，是生产甾体激素类药物的重要原料。全球甾体激素类药物中60％以上是以薯蓣皂苷元为原料合成或半合成生产的。传统的生产薯蓣皂苷元的方法是使用强酸酸解，但这种方法由于污染大、能耗高且影响南水北调的水质安全。同时酸解的过程中存在皂苷转化不完全和容易产生副产物从而影响皂素产品的品质。目前的研究普遍认为酶解法和微生物转化法具有很好的应用前景，具有环境友好的特点，成为当前皂素绿色生产的热点。
目前，有研究者已发现层出镰孢WX12(CN 102703329 A)具备转化生产薯蓣皂苷元的功能，但其从种子液培养菌体再投入发酵液进行转化，转化过程中需要添加系列无机盐成分，所耗时间太长，薯蓣皂苷元得率低，且在制备黄姜皂苷过程中损失了含量可观的水溶性皂苷。还有一些研究者发现，米曲霉(CN 101012474 B)可将皂苷转化成薯蓣皂苷元，但存在中间产物多，转化率低的问题，很难实现产业化应用。另有研究者发现，泡盛曲霉(CN104232724 A)可转化黄姜皂苷生产薯蓣皂苷元，由于黄姜干粉中淀粉和纤维素对皂苷的束缚作用，专利公开菌株未能转化部分束缚的皂苷，导致皂苷元得率较低。有研究利用嗜酸乳酸杆菌(CN 103497987 B)转化黄姜皂苷生产薯蓣皂苷元，其中采用了淀粉、纤维素及薯蓣皂苷分离再通过纳滤截留薯蓣皂苷的方法，操作过程复杂，且其中未公开与直接酸水解获得皂素得率的比较，无法在不同产地黄姜品质差异较大的情况下正确评定该菌株的转化效率。现有专利报导微生物转化黄姜皂苷生产皂素过程中，工艺过程复杂，转化皂苷形式单一且转化效率低，皂素得率低，难以实现产业化应用。
专利CN 103242418 A公开了一种黄姜皂素的清洁生产工艺方法，利用了糖化、膜分离和超声萃取技术，获得了皂苷的膜浓缩液和有机溶剂的皂苷萃取浓缩液，可较全面的在工业化级别获取皂苷，但在将皂苷转化为皂素过程中依然采用的是酸水解催化皂苷水解为皂素，未能实现真正的绿色生产。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种塔宾曲霉及其在制备黄姜皂素中的应用，其目的在于高效转化各种存在形式的黄姜皂苷，因而可以与现有的皂素工业化生产方式对接，彻底替代传统工艺中通过酸水解转化皂苷为皂素的过程，并由此解决转化黄姜皂苷绿色生产黄姜皂素产业化过程中的技术瓶颈。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种塔宾曲霉，所述塔宾曲霉的分类命名为Aspergillus tubingensis HG-57，其于2016年7月11日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC M2016389，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的塔宾曲霉的应用，应用于发酵法制备黄姜皂素。
优选地，所述的塔宾曲霉的应用，包括如下步骤：
(1)将培养所述塔宾曲霉得到的孢子悬液接入黄姜皂苷原液中，有氧发酵1～7天后，得到发酵液；
(2)从所述发酵液中分离提取皂素，即为所述黄姜皂素。
优选地，所述孢子悬液的制备方法包括：取所述的塔宾曲霉接种于PDA 固体培养基上，在20～37℃培养2～7天进行活化，待长出孢子后，加入无菌水，混匀并收集得到孢子悬液。
优选地，所述制备方法还包括：将所述孢子悬液接入到种子培养基中放大得到种子液，所述种子培养基包括如下成分：2～15g/L葡萄糖，5～15g/L酵母粉，10～25g/L蛋白胨。
优选地，所述黄姜皂苷原液包括黄姜水提液、黄姜醇提水溶液以及黄姜水混液。
优选地，所述黄姜水提液的制备方法为：将黄姜鲜姜粉碎匀浆后的浆液或将黄姜干粉加水充分混匀后进行固液分离，取上清液即得到黄姜水提液。
优选地，所述黄姜醇提水溶液的制备方法为：向黄姜干粉中加入甲醇或乙醇，经充分提取后进行固液分离，得到黄姜醇提液，真空减压回收甲醇或乙醇，得到黄姜醇提浸膏，然后向黄姜醇提浸膏中加入无机盐水溶液即得到黄姜醇提水溶液。
优选地，所述无机盐水溶液包括如下组分：硝酸钾0.5～5g/L，硫酸镁0.5～2g/L，磷酸二氢钾0.2～1.5g/L，氯化钠0.2～1.5g/L，磷酸氢二钠0.2～1.5g/L。
优选地，所述黄姜水混液为直接将黄姜鲜姜粉碎匀浆后的浆液或黄姜干粉加水后的重悬液，所述黄姜鲜姜为含水量为50％～80％的未经脱水的黄姜。
总体而言，通过本发明的上述技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。
(1)本发明提供了一株塔宾曲霉HG-57，可应用于转化黄姜皂苷生产黄姜皂素；
(2)塔宾曲霉HG-57菌株能够高效转化各种存在形式的黄姜皂苷生产黄姜皂素，塔宾曲霉HG-57菌株转化黄姜水提液、黄姜醇提水溶液或黄姜水混液内的皂苷得到皂素的含量，与上述体系直接加酸水解获得皂素的含量相比，分别提高了1.2～1.4倍、1.1～1.4倍、1.4～1.8倍；
(3)塔宾曲霉HG-57菌株能有效地对接现有的黄姜皂素工业化生产中皂苷转化为皂素的生产工艺流程，彻底替代传统工艺中通过酸水解转化皂苷为皂素的过程，有望对现有皂素产业进行技术升级，实现绿色生产。
附图说明
图1是塔宾曲霉HG-57在转化黄姜水提液过程中的酶活曲线；
图2是塔宾曲霉HG-57培养第3天的菌落形态；
图3是塔宾曲霉HG-57培养第5天的菌落形态；
图4是塔宾曲霉HG-57依据ITS序列采用N-j法构建的系统进化树。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的一种塔宾曲霉HG-57，已送至中国典型培养物保藏中心保藏。保藏日期为2016年7月11日，保藏编号为CCTCC M 2016389，其拉丁文学名为Aspergillustubingensis，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
本发明提供了所述塔宾曲霉HG-57在发酵法转化黄姜皂苷制备黄姜皂素中的应用，能有效地转化黄姜水提液内的皂苷、黄姜醇提水溶液内的皂苷以及黄姜水混液内的皂苷生产黄姜皂素。
黄姜水提液中的皂苷以游离单体或微囊形式存在于水相中，应用于转化黄姜水提液中的皂苷时，按照如下步骤进行：
(1)制备黄姜水提液：取黄姜鲜姜适量，洗净去须后加水粉碎匀浆，浆液离心取上清液，也可以将黄姜干粉加水结合超声或微波等辅助手段处理后离心取上清液，所述上清液即为黄姜水提液；将所述黄姜水提液在121～126℃下处理20min进行高温湿热灭菌；
(2)制备塔宾曲霉孢子悬液：将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，20～37℃下培养2～7天，待长出孢子后，加入有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集塔宾曲霉的孢子悬液；将孢子悬液接入到种子培养基中，25～35℃下，150～220r/min培养18～36h后获得塔宾曲霉的种子液，其中种子培养基包括如下组分：2～15g葡萄糖，5～15g/L酵母粉，10～25g/L蛋白胨；
(3)转化皂苷生产皂素：将塔宾曲霉的孢子悬液，优选将塔宾曲霉的种子液接入到步骤(1)经高温湿热灭菌的黄姜水提液中，在25～35℃下，150～220r/min发酵培养1～7天后，得到发酵液；
(4)分离提取皂素：将得到的发酵液固液分离后获得的皂素酶解物60～90℃烘干，加入甲醇超声萃取10～40min，萃取次数为1～2次，其中甲醇体积为发酵液原始体积的1～2倍，常规方法浓缩、结晶精制获得皂素产品；优选采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。
应用于转化黄姜醇提水溶液中的皂苷时，按照如下步骤进行：
(1)制备黄姜醇提水溶液：使用甲醇或乙醇萃取黄姜中的皂苷，回收甲醇或乙醇后，皂苷存在于醇提浸膏内，加适量无机盐水溶液制成黄姜醇提水溶液。所述无机盐水溶液包括如下组分，硝酸钾0.5～5g/L，硫酸镁0.5～2g/L，磷酸二氢钾0.2～1.5g/L，氯化钠0.2～1.5g/L，磷酸氢二钠0.2～1.5g/L，加水溶解。将所述黄姜醇提水溶液在121～126℃下处理20min进行高温湿热灭菌；
(2)制备塔宾曲霉孢子悬液：将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，20～37℃下培养2～7天，待长出孢子后，加入有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集塔宾曲霉的孢子悬液；将孢子悬液接入到种子培养基中，25～35℃下，150～220r/min培养18～36h后获得塔宾曲霉的种子液，其中种子培养基包括如下组分：2～15g/L葡萄糖，5～15g/L酵母粉，10～25g/L蛋白胨；
(3)转化皂苷生产皂素：将塔宾曲霉的孢子悬液，优选将塔宾曲霉的种子液接入到步骤(1)经高温湿热灭菌的黄姜醇提水溶液中，在25～35℃下，150～220r/min发酵培养1～7天后，得到发酵液；
(4)分离提取皂素：将得到的发酵液固液分离后获得的皂素酶解物60～90℃烘干，加入甲醇超声萃取10～40min，萃取次数为1～2次，其中甲醇体积为发酵液原始体积的1～2倍，常规方法浓缩、结晶精制获得皂素产品；优选采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。
应用于转化黄姜水混液中的皂苷时，按照如下步骤进行：
(1)制备黄姜水混液：将黄姜鲜姜粉碎匀浆后的浆液或黄姜干粉加水后的重悬液即为黄姜水混液，将所述黄姜水混液在121～126℃下处理20min进行高温湿热灭菌；
(2)制备塔宾曲霉孢子悬液：将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，20～37℃下培养2～7天，待长出孢子后，加入有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集塔宾曲霉的孢子悬液；将孢子悬液接入到种子培养基中，25～35℃下，150～220r/min培养18～36h后获得塔宾曲霉的种子液，其中种子培养基包括如下组分：2～15g/L葡萄糖，5～15g/L酵母粉，10～25g/L蛋白胨；
(3)转化皂苷生产皂素：将塔宾曲霉的孢子悬液，优选将塔宾曲霉的种子液接入到步骤(1)经高温湿热灭菌的黄姜水混液中，在25～35℃下，150～220r/min发酵培养1～7天后，得到发酵液；
(4)分离提取皂素：将得到的发酵液固液分离后获得的皂素酶解物60～90℃烘干，加入甲醇超声萃取10～40min，萃取次数为1～2次，其中甲醇体积为发酵液原始体积的1～2倍，常规方法浓缩、结晶精制获得皂素产品；优选采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。
黄姜皂素的定量测定方法：高效液相色谱法，色谱条件为：C18反相柱(syncronisC18 250×4.6mm)，检测波长204nm，流动相为纯甲醇，流速1ml/min，进样量10μL。
图1为塔宾曲霉HG-57在转化黄姜水提液过程中的酶活曲线，可以看出塔宾曲霉HG-57在转化黄姜水提液过程中的β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶的酶活性，这四种与皂苷水解相关的酶在全过程中都有不同程度的波动，酶活性均保持在一个较高的水平。正因为菌株丰富的糖苷酶酶系相互协同配合，才保证了菌株对皂苷的高效转化。同时水溶性的皂苷极易被菌株水解转化。
β-葡萄糖苷酶虽然酶活性相对于另外三种酶较低，但在菌株转化皂苷的过程中有非常大的波动，说明该酶在处理过程中随着底物的不断变化而不断变化，是转化过程中一个必需的酶，且该酶只需要很低的酶活性水平就能满足菌株对底物的作用。
图2和图3为塔宾曲霉HG-57分别培养3天和5天时的菌落形态。本发明塔宾曲霉HG-57的生物学形态描述为：在PDA固体培养基上生长迅速，28℃培养3天，直径12～15mm，7天后达到25～30mm，质地绒毛状，菌丝初生时为白色，渐变为棕、黑色，无渗出液，反面黄褐色。
图4为塔宾曲霉HG-57依据ITS序列采用N-j法构建的系统进化树。菌株塔宾曲霉HG-57依据其ITS rDNA序列，采用Neighbour-joining法构建的系统进化树，跟菌株塔宾曲霉FJBJ11在系统进化树上聚为同一簇群。
以下为实施例：
实施例1
实施例1为酸催化水解转化黄姜水提液中的皂苷制备皂素的对比实施例。
取黄姜干粉500g，加水使得黄姜干重：水＝1：5，混匀后超声处理40min，后8000r/min离心10min，取上清液获得黄姜水提液。将黄姜水提液进行酸催化水解，水解条件为：体系酸浓度1mol/L，反应温度100℃，水解时间5h；得到的水解物进行过滤，得到的滤饼采用自来水或碱水洗涤至中性，再进行干燥得到皂素水解物。得到的皂素水解物采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素1.24g/每100g黄姜干姜。
实施例2
实施例2为采用本发明的塔宾曲霉发酵法转化黄姜水提液中的皂苷制备皂素的实施例。
取黄姜干粉1000g，加水使得黄姜干重：水＝1：5，混匀后超声处理40min，后8000r/min离心10min，将获得的上清液于121℃下湿热处理20min，获得黄姜水提液。
将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，28℃下培养3天，待长出孢子后，加入带有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集塔宾曲霉的孢子悬液。
将塔宾曲霉的孢子悬液接入到黄姜水提液中，29℃下，210r/min发酵培养2天后，得到发酵液，将得到的发酵液经8000r/min离心10min后获得的皂素酶解物60～90℃烘干，加入甲醇超声萃取40min，萃取次数为2次，其中甲醇体积为发酵液原始体积的2倍，常规方法浓缩、结晶精制获得皂素产品。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素1.65g/每100g黄姜干姜。
实施例3
实施例3为酸催化水解转化黄姜醇提水溶液中的皂苷制备皂素的对比实施例。
取黄姜干粉2000g，使用75％乙醇萃取黄姜中的皂苷，回收乙醇后，皂苷存在于醇提浸膏内，加水即为黄姜醇提水溶液，将黄姜醇提水溶液进行酸催化水解，水解条件为：体系酸浓度1mol/L，反应温度100℃，水解时间5h；得到的水解物进行过滤，得到的滤饼采用自来水或碱水洗涤至中性，再进行干燥得到皂素水解物。得到的皂素水解物采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素2.14g/每100g黄姜干姜。
实施例4
实施例4为采用本发明的塔宾曲霉发酵法转化黄姜醇提水溶液中的皂苷制备皂素的第一实施例。
取黄姜干粉1800g，使用75％乙醇萃取黄姜中的皂苷，回收乙醇后，皂苷存在于醇提浸膏内，加入无机盐水溶液(硝酸钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钠0.2g/L，磷酸氢二钠0.2g/L)，加水溶解，自然pH值)后在123℃下处理20min进行高温湿热灭菌。。
将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，25℃下静置培养2天，待长出孢子后，加入有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集孢子悬液。将孢子悬液接入到种子培养基(10g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，15g/L蛋白胨)中，25℃下，150r/min培养18h后获得塔宾曲霉的种子液。
将塔宾曲霉的种子液接入到黄姜醇提水溶液中，25℃下，150r/min发酵培养1天后，得到发酵液，8000r/min离心12min获得沉淀物。采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素3.36g/每100g黄姜干姜。
实施例5
实施例5为采用本发明的塔宾曲霉发酵法转化黄姜醇提水溶液中的皂苷制备皂素的第二实施例。
取黄姜干粉1200g，使用75％乙醇萃取黄姜中的皂苷，回收乙醇后，皂苷存在于醇提浸膏内，加入无机盐水溶液(硝酸钾5g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钠1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L)，加水溶解，然后在123℃下处理20min进行高温湿热灭菌。
将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，35℃下静置培养7天，待长出孢子后，加入有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集孢子悬液。将孢子悬液接入到种子培养基(2g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨)中，35℃下，220r/min培养36h后获得塔宾曲霉的种子液。
将塔宾曲霉的种子液接入到黄姜醇提水溶液中，35℃下，220r/min发酵培养7天后，得到发酵液，8000r/min离心12min获得沉淀物。采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素2.354g/每100g黄姜干姜。
实施例6
实施例6为酸催化水解转化黄姜水混液中的皂苷制备皂素的对比实施例。
取黄姜鲜姜5000g，洗净去须后加水粉碎匀浆，使得黄姜干重：水＝1：7，即为黄姜水混液。将黄姜水混液进行酸催化水解，水解条件为：体系酸浓度1mol/L，反应温度100℃，水解时间5h；得到的水解物进行过滤，得到的滤饼采用自来水或碱水洗涤至中性，再进行干燥得到皂素水解物。得到的皂素水解物采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素2.4g/每100g黄姜干姜。
实施例7
实施例7为采用本发明的塔宾曲霉发酵法转化黄姜水混液中的皂苷制备皂素的实施例。
取黄姜鲜姜3000g，洗净去须后加水粉碎匀浆，使得黄姜干重：水＝1：7，在123℃下处理20min进行高温湿热灭菌后即为黄姜水混液。
将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，30℃下静置培养6天，待长出孢子后，加入有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集孢子悬液。将孢子悬液接入到种子培养基(15g/L葡萄糖，15g/L酵母粉，25g/L蛋白胨)中，29℃下，200r/min培养28h后获得塔宾曲霉的种子液。
将塔宾曲霉的种子液接入到黄姜水混液中，31℃下，200r/min发酵培养7天后，得到发酵液，8000r/min离心12min获得沉淀物。采用120号汽油提取沉淀物，提取物干燥后，得到皂素。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素4.32g/每100g黄姜干姜。
实施例8
实施例8为采用本发明的塔宾曲霉发酵法转化工业化规模黄姜水提液中的皂苷制备皂素的实施例。
取黄姜鲜姜若干(干重2000kg)，加水粉碎匀浆使得黄姜干重：水＝1：5，混匀后经过板框过滤压榨，将获得的清液于121℃下湿热处理20min，获得黄姜水提液。
将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，28℃下培养3天，待长出孢子后，加入带有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集塔宾曲霉的孢子悬液。
将塔宾曲霉的孢子悬液接种于种子培养基(5g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，12g/L蛋白胨)中，30℃，200r/min培养24h后获得一级种子液，后经过二级放大获得二级种子液，将放大后的种子液接入到黄姜水提液中，28℃下，210r/min，通气量0.5vvm下发酵培养2天后，得到发酵液，将得到的发酵液经板框过滤压榨后获得的皂素酶解物在60～90℃下烘干，加入甲醇超声萃取40min，萃取次数为2次，其中甲醇体积为发酵液原始体积的2倍，常规方法浓缩、结晶精制获得皂素产品。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素1.62g/每100g黄姜干姜。
实施例9
实施例9为采用本发明的塔宾曲霉发酵法转化工业化规模黄姜醇提水溶液中的皂苷制备皂素的实施例。
取黄姜干粉1680kg，使用75％乙醇萃取黄姜中的皂苷，回收乙醇后，皂苷存在于醇提浸膏内，加入无机盐水溶液(硝酸钾4g/L，硫酸镁1.2g/L，磷酸二氢钾1.3g/L，氯化钠1.5g/L，磷酸氢二钠1.3g/L)，加水溶解，然后在123℃下处理20min进行高温湿热灭菌。
将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，35℃下静置培养7天，待长出孢子后，加入有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集孢子悬液。将孢子悬液接入到种子培养基(5g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨)中，35℃下，220r/min培养36h后获得塔宾曲霉的一级种子液，后经过二级放大获得二级种子液。将放大后的种子液接入到黄姜醇提水溶液中，35℃下，220r/min，通气量0.35vvm下发酵培养7天后，得到发酵液，板框过滤压榨获得皂素酶解物。采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素2.2g/每100g黄姜干姜。
实施例10
实施例10为采用本发明的塔宾曲霉发酵法转化工业化规模黄姜水混液中的皂苷制备皂素的实施例。
取黄姜鲜姜若干(干重2120kg)，加水粉碎匀浆，使得黄姜干重：水＝1：7，在123℃下处理20min进行高温湿热灭菌后即为黄姜水混液。
将塔宾曲霉HG-57从斜面上转接到PDA固体培养基上，30℃下静置培养6天，待长出孢子后，加入有玻璃珠的无菌水，震荡2min，获得并收集孢子悬液。将孢子悬液接入到种子培养基(15g/L葡萄糖，15g/L酵母粉，25g/L蛋白胨)中，29℃下，200r/min培养28h后获得塔宾曲霉的种子液，后经过二级放大获得二级种子液。将放大后的种子液接入到黄姜水混液中，31℃下，200r/min，通气量0.6vvm下发酵培养7天后，得到发酵液，板框过滤压榨获得皂素酶解物。采用120号汽油提取，提取物干燥后，得到皂素。所得的皂素使用高效液相色谱法进行定量分析其中含有皂素4.15g/每100g黄姜干姜。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种塔宾曲霉HG-57，其特征在于，所述塔宾曲霉的分类命名为Aspergillustubingensis，其于2016年7月11日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC M 2016389。
2.一种如权利要求1所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于，应用于发酵法制备黄姜皂素。
3.如权利要求2所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将培养所述塔宾曲霉得到的孢子悬液接入黄姜皂苷原液中，有氧发酵1～7天后，得到发酵液；
(2)从所述发酵液中分离提取皂素，即为所述黄姜皂素。
4.如权利要求3所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于，所述孢子悬液的制备方法包括：取如权利要求1所述的塔宾曲霉接种于PDA固体培养基上，在20～37℃培养2～7天进行活化，待长出孢子后，加入无菌水，混匀并收集得到孢子悬液。
5.如权利要求4所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于，所述制备方法还包括：将所述孢子悬液接入到种子培养基中放大得到种子液，所述种子培养基包括如下成分：2～15g/L葡萄糖，5～15g/L酵母粉，10～25g/L蛋白胨。
6.如权利要求3所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于，所述黄姜皂苷原液包括黄姜水提液、黄姜醇提水溶液以及黄姜水混液。
7.如权利要求6所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于，所述黄姜水提液的制备方法为：将黄姜鲜姜粉碎匀浆后的浆液或将黄姜干粉加水混匀后进行固液分离，取上清液即得到黄姜水提液。
8.如权利要求6所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于，所述黄姜醇提水溶液的制备方法为：向黄姜干粉中加入甲醇或乙醇，经提取后进行固液分离，得到黄姜醇提液，真空减压回收甲醇或乙醇，得到黄姜醇提浸膏，然后向黄姜醇提浸膏中加入无机盐水溶液即得到黄姜醇提水溶液。
9.如权利要求8所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于，所述无机盐水溶液包括如下组分：硝酸钾0.5～5g/L，硫酸镁0.5～2g/L，磷酸二氢钾0.2～1.5g/L，氯化钠0.2～1.5g/L，磷酸氢二钠0.2～1.5g/L。
10.如权利要求6所述的塔宾曲霉的应用，其特征在于，所述黄姜水混液为将黄姜鲜姜粉碎匀浆后得到的浆液或黄姜干粉加水后得到的重悬液。
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| CN105925490A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-09-07 | 云南农业大学 | 塔宾曲霉及其液态发酵生产茶褐素的方法 |
| CN106167765A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-11-30 | 云南农业大学 | 一种塔宾曲霉及其液态发酵生产茶褐素的方法 |
-
2017
- 2017-01-12 CN CN201710021690.2A patent/CN106754422B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103205365A (zh) * | 2013-03-27 | 2013-07-17 | 沈阳药科大学 | 塔宾曲霉及其在制备人参皂苷Rh4及其苷元中的应用 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A novel b-glucosidase from Aspergillus fumigates releases diosgenin from spirostanosides of Dioscorea zingiberensis C. H. Wright (DZW);Jing Lei等;《World J Microbiol Biotechnol》;20111119;第28卷;第1309-1314页 * |
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| 薯蓣皂苷水解酶的发酵及粗酶的性质研究;赵玉婷等;《食品科学》;20071231;第28卷(第8期);第269-272页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106754422A (zh) | 2017-05-31 |
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