CN105964146A - 一种从酶解液中分离核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种从酶解液中分离核苷酸的方法，其具体过程为：在温室下，将酶解液的pH调节至6～8之间，然后将溶液泵入电渗析装置的淡化室中，并将一定量的纯水泵入浓缩室中，充分循环后，将该装置的阴极和阳极分别与直流电源的负极和正极相连接，设定膜堆两端的电压降为45V或者恒定电流0.5A，启动电渗析装置。在电渗析过程中用氢氧化钠维持淡化室溶液的pH>6.0，当淡化室溶液的电导率<0.1ms/cm时停止电渗析。浓缩室中得到纯度较高的核苷酸溶液，其在430纳米下的透光率约为70‑90％，比原料液提高了5倍以上，总收率大于95％。淡化室中残留的总核苷酸<2％。
Description
技术领域
本发明属于电渗析在生物化工领域中的应用，具体涉及一种电渗析提纯核苷酸的方法。
背景技术
电渗析是在电场作用下，离子选择性地透过离子交换膜，同时实现分离和浓缩的膜分离技术，因其具有操作简单，不污染环境等特点，已在海水淡化、废水处理、食品以及医药等方面得到广泛的应用。
目前电渗析技术因环境优势已经越来越受到重视，已被广泛用于发酵液中有机酸的脱盐和分离过程中。如Chuanhui Huang等人(Journal of Membrane Science 288(2007)1–12)对电渗析法在有机酸生产方面做出了综述；程桂石等(化工学报，2005(11),Vol56,No 11；2200-2203)研究了电渗析法回收厨房垃圾发酵液中乳酸过程中pH的影响；Moon-Sung Kang等人(Journal of Membrane Science 222(2003)149–161)对大分子有机酸在电渗析中的分离特性进行了详细的研究；Vu Hong Thang等人(Journal of MembraneScience 249(2005)173–182)对电渗析分离乳酸的工艺进行了详细的阐述优化；孟洪等人(膜科学与技术,2003(2),Vol 23,No 1,7-11)阐述了电渗析过程中的浓差极化和水解机理，为工艺优化和防治膜污染奠定基础。
核苷酸是核糖核酸及脱氧核糖核酸的基本组成单位，是体内合成核酸的前身物。核苷酸随着核酸分布于生物体内各器官、组织、细胞的核及胞质中，并作为核酸的组成成分参与生物的遗传、发育、生长等基本生命活动。七十年代以来，随着分子生物学和制药工业的发展，核苷酸及其衍生物的研究和开发成为热点，并逐渐形成了继氨基酸之后的又一重要产业。
核苷酸产品的用途十分广阔，在食品行业中作为功能性食品添加剂，尤其是在婴幼儿奶粉中的使用效果非常明显，它的加入使奶粉更接近于母乳，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生；在医药领域，核苷酸作为医药中间体是许多核苷酸类衍生物的生产原料，在医药、人体和动物保健等方面也有着良好的应用效果和巨大的应用市场，其相关产品的全球销售额高达上百亿美元
目前核苷酸的生产方法主要包括化学合成法和酶解法。其中酶解法由于无有机溶剂和有毒化学试剂的残留，而得到了广泛的应用。酶解法是以酵母中提取的核糖核酸(RNA)为原料，利用核酸酶P1对其进行酶解，得到含4四种单核苷酸的混合溶液，再对其进行分离、精制，最后得到四种单核苷酸产品。
由于酶解液中存在大量的蛋白质、多糖、色素和未完全酶解的寡聚核苷酸等杂质，传统分离工艺流程长，导致产品的收率低，产品质量不稳定。其中对核苷酸酶解液进行脱色一般采用活性炭脱色的方法，但活性炭对核苷酸的吸附作用力强，导致产品回收率降低，且活性炭难于回收，易造成二次污染，使用成本较高。因此需要开发新的分离工艺来分离酶解液中核苷酸，以提高核苷酸的收率和纯度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种收率高、无污染的分离核苷酸的方法。
一种从酶解液中分离核苷酸的方法，包括如下步骤：
(1)调节核苷酸酶解液的pH为6.0～9.0；
(2)利用电渗析装置浓缩得到四种核苷酸，工作电压为10～60V，运行温度为25℃，控制淡化室的pH大于6.0；
(3)当淡化室的电导率下降至100μs/cm以下时，电渗析结束。
其中，所述的核苷酸酶解液按照如下方法制备：
(1a)酶解液的获得：将RNA粉末按55g/L溶于水中，调节pH为5.5，加入核酸酶P1，在70℃下反应1h；
(2a)向步骤(1a)的酶解液中加入15g/L的活性炭，70℃继续酶解1h，在65℃条件加入壳聚糖絮凝剂，静置20min，离心，收集上清液。
步骤(2a)中，酶解液与壳聚糖絮凝剂的比例为9:1，所述壳聚糖絮凝剂中壳聚糖的浓度为10～12g/L，壳聚糖絮凝剂的pH为4.6～4.8。
其中，电渗析结束之后，采用0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液，对电渗析膜堆进行倒极电渗析清洗0.5～1h，再用水对膜堆进行冲洗，使得浓缩室和淡化室流出溶液的pH值为6.5～7.5。
其中，所述的电渗析装置包括：组装框架、阳极电极室、阴极电极室、钛涂钌电极和电渗析膜堆，所述的阳极电极室和阴极电极室分别位于组装框的两侧，所述钛涂钌电极设置在阳极电极室和阴极电极室内，所述的电渗析膜堆由交替排列的阳离子交换膜、阴离子交换膜、隔网组成，阳极电极室和阴极电极室分别与直流电源的正极和负极相连。
其中，所述的阳离子交换膜为CJMC-2磺酸型电渗析阳离子交换膜，阴离子交换膜为CJMA-2季铵型电渗析阴离子交换膜。
其中，所述的电渗析膜堆的单元数为10对。
有益效果：
本发明是采用电渗析技术取代传统从酶解液中提取核苷酸的技术，解决了传统工艺中存在的步骤多，能耗大等问题，实现核苷酸的清洁生产，核苷酸回收率达到90％以上，整个分离系统实现基本零排放，是一项绿色分离技术，具有显著的工业应用价值和环境效益。
附图说明
图1电渗析装置的结构示意图。
图2电渗析装置的结构示意图。
图3电渗析过程示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明用于核苷酸酶解液提纯的电渗析器包括：电渗析膜堆单元，pH计，电导率仪，直流电源；
电渗析膜堆单元包括：电渗析膜堆，流量计，输液泵，组装框架，管道；电渗析膜堆包括：若干交替排列的离子交换膜、隔板、电极板、夹紧装置，从而构成电渗析膜堆的浓缩室，淡化室和电极室；以及浓缩水罐，淡化水罐，电极水罐。
以下实施例中采用的阳离子交换膜为CJMC-2磺酸型电渗析阳离子交换膜，阴离子交换膜为CJMA-2季铵型电渗析阴离子交换膜。
实施例1：
1、酶解液配制方法：配制1L 5.5％的RNA溶液，RNA粉末55g，溶于蒸馏水(70℃)中，边加边搅拌，同时滴加5mol/L氢氧化钠，调pH＝5.5，然后升温至70℃；加入预热15min的核酸酶P1酶液，加入量为6％(60mL)，反应3h 50min，所述核酸酶P1已经在申请号为201410818210.1的中国专利中详细公开；
2、酶解液的预处理：加入0.15％(1.5g)的活性炭，继续酶解50min；然后降温至65℃，加入体积为10％(即100ml)，浓度为1％(即1g溶于100ml水中)的壳聚糖絮凝剂(配制方法为壳聚糖加入水中，然后加乙酸调pH至4.7左右)，静置20min，取样测透光度T430，应高于60％；降温至45℃后进行离心(8000rpm 10min)；然后测透光T430。
实施例2：
采用本发明的电渗析方法从核苷酸酶解液中提取核苷酸。在室温25℃下，选择恒压模式45V，循环间歇式操作，膜堆单元数为10对，膜面积为0.02m2。各室的条件如下：浓缩室为500ml模拟酶解液，pH为6，循环流量为20L/h；淡化室为300ml去离子水，循环流量为20L/h；电极室为0.3mol/L的硫酸钠溶液，循环流量为20L/h。
核苷酸模拟酶解液：核苷酸模拟酶解液中的4种核苷酸的总浓度为30g/L，但无其他杂质。电渗析处理时间120min后，浓室的体积增加16.6％，浓度提升10％，核苷酸的回收率达到97.6％，膜堆以及管道中残留量在2％以下，整个过程的电流效率为40％，pH由7变化至9.58。
核苷酸酶解液：核苷酸酶解液中的4种核苷酸总浓度约为30g/L，还包含色素、无机盐、蛋白质等杂质。使用电渗析处理120分钟后，浓室体积增加17.5％，浓度提升6％，核苷酸回收率为94.37％。膜堆及管道中残留量在2％以下，整个过程的电流效率为40％。浓缩室中溶液的pH由7升高至9.67，在430nm处测得透光率为79.6％，透光率提升330％。
实施例3：
采用本发明中恒流模式从核苷酸酶解液中提取核苷酸。在室温条件下，选择恒流模式I＝0.5A，循环间歇式操作，膜堆单元数为10对。各室的条件如下：浓缩室为500ml模拟酶解液，pH为6，循环流量为30L/h；淡化室为300ml去离子水，循环流量为30L/h；电极室为0.3mol/L的硫酸钠溶液，循环流量为30L/h。
模拟核苷酸酶解液：模拟核苷酸酶解液中4种核苷酸的总浓度为30g/L，但无其他杂质。电渗析处理时间90min后，浓室体积增加20％，浓度提升34.5％，核苷酸回收率达到96.6％，膜堆以及管道中残留量在2％以下，整个过程的电流效率为45％。
核苷酸酶解液：核苷酸酶解液中4种核苷酸总浓度约为30g/L，主要杂质为色素、无机盐、蛋白质等物质。电渗析处理的时间为90分钟，浓室体积增加17％，浓度提升32％，核苷酸回收率达到92.7％，膜堆及管道中残留量在2％以下，整个过程的电流效率为43％，pH由7变为9.56，在430nm处测得透光率为69.6％，透光提升328％。
实施例4：
采用本发明中的恒压模式，多膜堆串联连续提取酶解液中的核苷酸。在室温下(25℃)，选择恒压模式，三个膜堆的电压分别为60V、45V，30V，膜堆单元数均为10对，各室条件如下：淡室待处理的酶解液体积为5000mL，流量为0.5L/h。采用连续操作模式，即淡化室中的液体依次流经3个膜堆。从第三个膜堆流出的酶解液中核核苷酸的总浓度<1g/L，电导率<0.2ms/cm，可直接排出，不用再回流到淡化室的储罐中。浓室为3000mL纯水，流量为5L/h，进行循环操作；电极室溶液为0.3mol/L的硫酸钠，流量为6L/h。电渗析处理9h后，浓室体积增加20％，核苷酸回收率达到90.24％，膜堆以及管道中残留量小于2％，整个过程电流效率为23％，在430nm处测得透光率为70.2％。
实施例5：
采用本发明中的恒流模式大批量从核苷酸酶解液中提取核苷酸。在室温条件下，选择恒流模式I＝0.5A，循环间歇式操作，膜堆单元数为10对。各室的条件如下：浓缩室为500ml模拟酶解液，pH为6，循环流量为1.8L/h；淡化室为300ml去离子水，循环流量为1.8L/h；电极室为0.3mol/L的硫酸钠溶液，循环流量为2.0L/h。连续进样5次，总产率为96％，在430nm处测得的透光率均在70％以上。
在电渗析过程结束后，采用倒极清洗的方式：浓缩室和淡化室均为500ml一定浓度的碳酸氢钠，将外接电源反接在膜堆上，选择恒压模式，起始电压为10V，循环20min后再以纯水冲洗。后续料液处理产率均能维持在90％以上，表明膜性能恢复良好。
Claims (7)
1.一种从酶解液中分离核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)调节核苷酸酶解液的pH为6.0～9.0；
(2)利用电渗析装置浓缩得到四种核苷酸，工作电压为10～60V，运行温度为25℃，控制淡化室的pH大于6.0；
(3)当淡化室的电导率下降至100μs/cm以下时，电渗析结束。
2.根据权利要求1所述的从酶解液中分离核苷酸的方法，其特征在于，所述的核苷酸酶解液按照如下方法制备：
(1a)酶解液的获得：将RNA粉末按55g/L溶于水中，调节pH为5.5，加入核酸酶P1，在70℃下反应1h；
(2a)向步骤(1a)的酶解液中加入15g/L的活性炭，70℃继续酶解1h，在65℃条件加入壳聚糖絮凝剂，静置20min，离心，收集上清液。
3.根据权利要求2所述的从酶解液中分离核苷酸的方法，其特征在于，步骤(2a)中，酶解液与壳聚糖絮凝剂的比例为9:1，所述壳聚糖絮凝剂中壳聚糖的浓度为10～12g/L，壳聚糖絮凝剂的pH为4.6～4.8。
4.根据权利要求1所述的从酶解液中分离核苷酸的方法，其特征在于，电渗析结束之后，采用0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液，对电渗析膜堆进行倒极电渗析清洗0.5～1h，再用水对膜堆进行冲洗，使得浓缩室和淡化室流出溶液的pH值为6.5～7.5。
5.根据权利要求1所述的从酶解液中分离核苷酸的方法，其特征在于，所述的电渗析装置包括：组装框架、阳极电极室、阴极电极室、钛涂钌电极和电渗析膜堆，所述的阳极电极室和阴极电极室分别位于组装框的两侧，所述钛涂钌电极设置在阳极电极室和阴极电极室内，所述的电渗析膜堆由交替排列的阳离子交换膜、阴离子交换膜、隔网组成，阳极电极室和阴极电极室分别与直流电源的正极和负极相连。
6.根据权利要求5所述的从酶解液中分离核苷酸的方法，其特征在于，所述的阳离子交换膜为CJMC-2磺酸型电渗析阳离子交换膜，阴离子交换膜为CJMA-2季铵型电渗析阴离子交换膜。
7.根据权利要求4所述的从酶解液中分离核苷酸的方法，其特征在于，所述的电渗析膜堆的单元数为10对。
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