CN109628518B - 一种生产和提取l-谷氨酰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物发酵技术领域，公开了一种生产和提取L‑谷氨酰胺的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）陶瓷膜过滤，步骤3）脱色，步骤4）精滤，步骤5）色谱提取，步骤6）浓缩结晶。本发明方法发酵产率高，工艺简单、高效环保、生产成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵行业中的L-谷氨酰胺生产领域，具体提供一种生产和提取L-谷氨酰胺的方法。
背景技术
L-谷氨酰胺（L-Glutamine，L-Gln）是由L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化的一种氨基酸，化学名2,5-二氨基-5-氧代戊酸，是构成蛋白质的基本氨基酸之一。L-谷氨酰胺是一种白色斜方晶系晶体或结晶性粉末，无臭无毒，有微甜香味，难溶于甲醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。
L-谷氨酰胺是20种合成蛋白质的基本氨基酸之一，约占人体游离氨基酸的60%，在生物体代谢中起举足轻重的作用。近年来医学发现表明，L-谷氨酰胺缺乏将引发多种疾病，其在生命活动中起着重要作用，广泛应用于医药、保健、细胞培养和饲料行业。
目前，生产L-谷氨酰胺的方法主要包括化学合成法、酶促合成法以及生物发酵法，其中，化学合成法使用了大量的化学试剂，容易造成环境污染，而且产品质量不高；酶促合成法成本较高，无法推广使用；生物发酵法是生产L-谷氨酰胺的主要方法，已经有较多的研究对生物发酵法进行了改进，包括诱变菌株、优化培养基和培养条件等，申请人之前的专利技术“一种发酵法生产L-谷氨酰胺的方法”对发酵法进行了优化，采用两种菌株协同发酵的方式，提高了发酵产量，但是存在菌株培养和操作参数复杂，产量不稳定等缺陷。
目前，国内提取L-谷氨酰胺的传统方法为离子交换法，这种方法存在设备结构复杂，自动化程度低，生产效率以及产品质量低等缺点。另外，现有的常规提取工艺所产出的L-谷氨酰胺成品很难达到某些客户的要求，为了提高产品质量，可以采用顺序式模拟移动床色谱技术替代离子交换工艺，重新调整后道提取工艺路线，以期提高产品质量，提高市场竞争力。
发明内容
为解决上述L-谷氨酰胺生产和提取存在的问题，本发明提供了一种生产和提取L-谷氨酰胺的方法，该方法发酵产率高，工艺简单、高效环保、生产成本低。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种生产和提取L-谷氨酰胺的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）陶瓷膜过滤，步骤3）脱色，步骤4）精滤，步骤5）色谱提取，步骤6）浓缩结晶。
进一步地，所述步骤1）发酵，包括如下工艺：将谷氨酸棒杆菌以6-10％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵时间为48h；发酵时间分为两个阶段，第一阶段为24h，发酵温度为32-35℃，通气量为0.4vvm，通过流加盐酸或氨水控制pH在5.0；第二阶段为24h，发酵温度为32℃，通气量为0.5vvm，第二阶段开始时，往发酵罐中添加调节液，添加量占发酵液体积的1-2%，往发酵罐中流加葡萄糖溶液，控制发酵罐中葡萄糖浓度不低于0.8%，通过流加氨水控制pH在7.0-7.2；第二阶段完成后，收集L-谷氨酰胺发酵液。
进一步地，所述发酵罐培养基的组分为（质量百分比）：葡萄糖10%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸亚铁0.01%、七水硫酸镁0.01%、一水硫酸锰0.005%。
进一步地，所述调节液的组分为：脯氨酸50g/L，精氨酸50g/L，肌醇10g/L。
进一步地，所述步骤2）陶瓷膜过滤，包括如下工艺：通过陶瓷膜过滤，收集陶瓷膜清液。
进一步地，所述步骤3）脱色，包括如下工艺：将步骤2）的陶瓷膜清液打入脱色罐进行脱色，脱色剂为活性炭，脱色完成后，过滤得到脱色清液。
进一步地，所述步骤4）精滤：将步骤3）脱色清液接入精滤机进行精滤，温度控制35-40℃，压力控制0.1-0.2MPa，得到精滤清液。
进一步地，所述步骤5）色谱提取，包括如下步骤：将步骤4）的精滤清液接入色谱室进行提取，控制提取工艺参数：色谱室流量3-5m3/h，温度35-40℃，压差0.8-1.0MPa，得到L-谷氨酰胺提取液。
进一步地，所述步骤6）浓缩结晶，包括如下步骤：将L-谷氨酰胺提取液通过浓缩结晶、离心烘干得到L-谷氨酰胺成品。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：
本发明发酵工艺中，添加了发酵调节液，其中，适量的肌醇可以强化CO2 固定反应, 削弱乙醛酸循环, 保证三羧酸循环不被中断和源源不断供给α-酮戊二酸，通过还原氨基化反应，大量积累谷氨酸，提高发酵转化率；而谷氨酸可以代谢生成谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸，通过发酵中后期添加脯氨酸和精氨酸，能够对相应的脯氨酸和精氨酸途径产生反馈抑制作用，从而使得更多的流向谷氨酰胺途径。发酵第一阶段，通过调节发酵液的pH偏酸性，有利于谷氨酸的合成，而且使得细胞通透性变差，谷氨酸不会流出到细胞外，有利于积累谷氨酸，发酵第二阶段，通过流加氨水调节发酵液的pH至中性或偏弱碱性，有利于细胞内谷氨酸合成谷氨酰胺，而且细胞通透性改善，从而提高谷氨酰胺的产量。
本发明采用“顺序式模拟移动床色谱”技术提取L-谷氨酰胺，与传统的离子交换法相比，酸碱消耗与水耗大大降低，整个生产过程节能环保，减少了环境的污染。本发明采用料液闪蒸技术对L-谷氨酰胺料液进行处理，极大的提高了L-谷氨酰胺产品的收率，产品质量也大幅上升。本发明L-谷氨酰胺料液经陶瓷膜、脱色膜、精滤机等工序并经过过滤、压滤、反冲洗等环节，极大的去除了大分子杂质。本发明采用特定树脂对L-谷氨酰胺料液进行提取，极大的去除了盐分和其它氨基酸，产品纯度与收率大幅上升。
实施例1
一种生产和提取L-谷氨酰胺的方法，其包括如下步骤：
步骤1）将谷氨酸棒杆菌ATCC13761种子液（浓度为1×109cfu/ml）以10％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵时间为48h；发酵时间分为两个阶段，第一阶段为24h，发酵温度为32℃，通气量为0.4vvm，控制pH在5.0；第二阶段为24h，发酵温度为32℃，通气量为0.5vvm，第二阶段开始时，往发酵罐中一次性添加调节液，添加量占发酵液体积的1.5%，往发酵罐中流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液，控制发酵罐中葡萄糖浓度不低于0.8%，通过流加氨水控制pH在7.0；第二阶段完成后，收集发酵液；
所述发酵罐培养基的组分为（质量百分比）：葡萄糖10%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸亚铁0.01%、七水硫酸镁0.01%、一水硫酸锰0.005%。
所述调节液的组分为：脯氨酸50g/L，精氨酸50g/L，肌醇10g/L。
步骤2）陶瓷膜分离工序在常温下从发酵工序接收发酵完毕的L-谷氨酰胺发酵液，将料液接入储料罐中保存。激活陶瓷膜1*与2*模组，控制输料频率38HZ，生产频率40HZ，排渣频率30HZ，过滤温度37℃，压力1.5Mpa，通过料液在膜管内高速流动，在压力驱动下含小分子组分的清液沿与之垂直方向向外渗透，制得陶瓷膜清液，含大分子组分的浓缩液被膜截留。
步骤3）将步骤2）的陶瓷膜清液打入脱色罐，接料至脱色罐25%时打开搅拌装置，完成自循环，每罐加入40kg活性炭对陶瓷膜清液进行脱色处理，得到脱色清液。
步骤4）将步骤3）脱色清液接入精滤机，依次通过过滤、压滤、反冲洗三个环节。在此过程中，温度控制37℃，压力控制0.15MPa，得到精滤清液。
步骤5）将步骤4）的精滤清液接入氨基酸料液分离室，其中氨基酸料液分离室包括完全过滤和脱气装置以及基于顺序式模拟移动床色谱技术的L-谷氨酰胺色谱分离系统。完全过滤和脱气装置：包括换热器、过滤器、闪蒸罐，洗提水罐，水闪蒸罐，脱气后料罐，脱气后水罐，残夜罐，提取液罐。L-谷氨酰胺色谱分离系统：包括6个色谱室，分别为k1，k2，k3，k4，k5，k6以及色谱自动化控制系统。
步骤6）进料准备环节，蒸汽进入换热器出蒸汽冷凝水与过滤蒸汽。
步骤7）将步骤6）的过滤蒸汽接入闪蒸罐，接入脱气后料罐，得到闪蒸蒸汽。
步骤8）将洗提水罐的洗提水通过换热器与过滤器以及水闪蒸罐后接入脱气后水罐，得到闪蒸水。
步骤9）将步骤4）精滤清液、步骤7）闪蒸蒸汽、步骤8）闪蒸水标准接入过滤室中过滤，得到过滤清液。
步骤10）通过控制色谱室流量3m3/h，温度37℃，压差在1.0MPa以内，将过滤清液打入色谱室k2中，通过树脂对L-谷氨酰胺进行提取，打开色谱室k6出料口，通过色谱自动化控制系统过滤清液通过循环依此次入色谱室k1，k3，k4，k5，k6。在色谱室k6中得到提取液，分离出有机酸以及其它盐杂质组分。
步骤11）将提取液通过浓缩结晶、离心烘干得到L-谷氨酰胺成品。
经测定L-谷氨酰胺指标：L-谷氨酰胺收率为85.7%；
L-谷氨酰胺含量：99.3% 比旋度[α]：+6.6
pH值：4.50 硫酸盐：<0.03%
干燥失重：<0.3% 灰分：<0.3%
重金属（以pb计）：<15mg/kg 氯化物：<0.05%
实施例2
一种生产和提取L-谷氨酰胺的方法，其包括如下步骤：
步骤1）将谷氨酸棒杆菌ATCC13761种子液（浓度为2×109cfu/ml）以7％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵时间为48h；发酵时间分为两个阶段，第一阶段为24h，发酵温度为32℃，通气量为0.4vvm，控制pH在5.0；第二阶段为24h，发酵温度为32℃，通气量为0.5vvm，第二阶段开始时，往发酵罐中一次性添加调节液，添加量占发酵液体积的2%，往发酵罐中流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液，控制发酵罐中葡萄糖浓度不低于0.8%，通过流加氨水控制pH在7.0；第二阶段完成后，收集发酵液；
所述发酵罐培养基的组分为（质量百分比）：葡萄糖10%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸亚铁0.01%、七水硫酸镁0.01%、一水硫酸锰0.005%。
所述调节液的组分为：脯氨酸50g/L，精氨酸50g/L，肌醇10g/L。
步骤2）陶瓷膜分离工序在常温下从发酵工序接收发酵完毕的L-谷氨酰胺发酵液，将料液接入储料罐中保存。激活陶瓷膜1*与2*模组，控制输料频率38HZ，生产频率40HZ，排渣频率30HZ，过滤温度38℃，压力2.0Mpa，通过料液在膜管内高速流动，在压力驱动下含小分子组分的清液沿与之垂直方向向外渗透，制得陶瓷膜清液，含大分子组分的浓缩液被膜截留。
步骤3）将步骤2）的陶瓷膜清液打入脱色罐，接料至脱色罐25%时打开搅拌装置，完成自循环，每罐加入40kg活性炭对陶瓷膜清液进行脱色处理，得到脱色清液。
步骤4）将步骤3）脱色清液接入精滤机，依次通过过滤、压滤、反冲洗三个环节。在此过程中，温度控制38℃，压力控制0.2MPa，得到精滤清液。
步骤5）将步骤4）的精滤清液接入氨基酸料液分离室，其中氨基酸料液分离室包括完全过滤和脱气装置以及基于顺序式模拟移动床色谱技术的L-谷氨酰胺色谱分离系统。完全过滤和脱气装置：包括换热器、过滤器、闪蒸罐，洗提水罐，水闪蒸罐，脱气后料罐，脱气后水罐，残夜罐，提取液罐。L-谷氨酰胺色谱分离系统：包括6个色谱室，分别为k1，k2，k3，k4，k5，k6以及色谱自动化控制系统。
步骤6）进料准备环节，蒸汽进入换热器出蒸汽冷凝水与过滤蒸汽。
步骤7）将步骤6）的过滤蒸汽接入闪蒸罐，接入脱气后料罐，得到闪蒸蒸汽。
步骤8）将洗提水罐的洗提水通过换热器与过滤器以及水闪蒸罐后接入脱气后水罐，得到闪蒸水。
步骤9）将步骤4）精滤清液、步骤7）闪蒸蒸汽、步骤8）闪蒸水标准接入过滤室中过滤，得到过滤清液。
步骤10）通过控制色谱室流量5m3/h，温度38℃，压差在1.0MPa以内，将步骤9）的过滤清液打入色谱室k2中，通过树脂对L-谷氨酰胺进行提取，打开色谱室k6出料口，通过色谱自动化控制系统过滤清液通过循环依此次入色谱室k1，k3，k4，k5，k6。在色谱室k6中得到提取液，分离出有机酸以及其它盐杂质组分。
步骤11）将提取液通过浓缩结晶、离心烘干得到L-谷氨酰胺成品。
经测定L-谷氨酰胺指标：L-谷氨酰胺收率为85.5%；
L-谷氨酰胺含量：99.4% 比旋度[α]：+6.8
pH值：4.60 硫酸盐：<0.03%
干燥失重：<0.3% 灰分：<0.3%
重金属（以pb计）：<15mg/kg 氯化物：<0.05%。
实施例3
各发酵因素对发酵液中L-谷氨酰胺产量的影响。
1、调节液组分对L-谷氨酰胺产量的影响，发酵方式参照实施例1，具体结果见表1：
调节液的组分为：脯氨酸50g/L，精氨酸50g/L，肌醇10g/L
表1
| 组别 | 发酵时间h | L-谷氨酰胺产量g/100ml |
| 脯氨酸+精氨酸+肌醇 | 48 | 9.34 |
| 脯氨酸+精氨酸 | 48 | 8.56 |
| 精氨酸+肌醇 | 48 | 8.17 |
| 脯氨酸+肌醇 | 48 | 8.34 |
| 不添加调节剂 | 48 | 7.82 |
结论：如表1所示，与不添加调节剂的组别进行比较，其他组的L-谷氨酰胺产量均有所提高，其中，脯氨酸+精氨酸+肌醇组的L-谷氨酰胺产量最高，提高了15.5个百分点；原因分析，适量的肌醇可以强化CO2 固定反应, 削弱乙醛酸循环, 保证三羧酸循环不被中断和源源不断供给α-酮戊二酸，通过还原氨基化反应，大量积累谷氨酸，提高发酵转化率；而谷氨酸可以代谢生成谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸，通过发酵中后期添加脯氨酸和精氨酸，能够对脯氨酸和精氨酸途径产生反馈抑制作用，从而使得更多的流向谷氨酰胺途径。
2、pH的改变对发酵液中L-谷氨酰胺产量的影响。
发酵第一阶段，通过流加稀盐酸或氨水调节发酵液的pH偏酸性，有利于谷氨酸的合成，而且使得细胞通透性变差，谷氨酸不会流出到细胞外，有利于积累谷氨酸，发酵第二阶段，通过流加氨水调节发酵液的pH至中性或偏弱碱性，有利于细胞内谷氨酸合成谷氨酰胺，而且细胞通透性改善，从而提高谷氨酰胺的产量。具体数据见表2：
表2
| 组别 | 谷氨酸产量g/100ml | L-谷氨酰胺产量g/100ml |
| 整个发酵过程pH为5 | 0.69 | 8.56 |
| 第1阶段pH为5，第2阶段为7 | 0.21 | 9.34 |
| 整个发酵过程pH为7 | 0.17 | 7.86 |
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种生产和提取L-谷氨酰胺的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）陶瓷膜过滤，步骤3）脱色，步骤4）精滤，步骤5）色谱提取，步骤6）浓缩结晶，其特征在于，所述步骤1）发酵，包括如下工艺：将谷氨酸棒杆菌以6-10％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵时间为48h；发酵时间分为两个阶段，第一阶段为24h，发酵温度为32-35℃，通气量为0.4vvm，控制pH在5.0；第二阶段为24h，发酵温度为32℃，通气量为0.5vvm，第二阶段开始时，往发酵罐中一次性添加调节液，添加量占发酵液体积的1-2%，同时往发酵罐中流加葡萄糖溶液，控制发酵罐中葡萄糖浓度不低于0.8%，并且通过流加氨水控制pH在7.0-7.2；第二阶段完成后，收集L-谷氨酰胺发酵液；所述调节液的组分为：脯氨酸50g/L，精氨酸50g/L，肌醇10g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵罐培养基的组分按照质量百分比为：葡萄糖10%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸亚铁0.01%、七水硫酸镁0.01%、一水硫酸锰0.005%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）陶瓷膜过滤，包括如下工艺：通过陶瓷膜过滤，收集陶瓷膜清液。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步骤3）脱色，包括如下工艺：将步骤1）的陶瓷膜清液打入脱色罐进行脱色，脱色剂为活性炭，脱色完成后，过滤得到脱色清液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤4）精滤：将步骤3）的脱色清液接入精滤机进行精滤，温度控制35-40℃，压力控制0.1-0.2MPa，得到精滤清液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤5）色谱提取，包括如下步骤：将步骤4）的精滤清液接入色谱室进行提取，控制提取工艺参数：色谱室流量3-5m3/h，温度35-40℃，压差0.8-1.0MPa，得到L-谷氨酰胺提取液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤6）浓缩结晶，包括如下步骤：将L-谷氨酰胺提取液通过浓缩结晶、离心烘干得到L-谷氨酰胺成品。
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