CN105940013A

CN105940013A - 用于治疗血友病的方法和组合物

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Publication number: CN105940013A
Application number: CN201480072482.XA
Authority: CN
Inventors: J·C·米勒; D·帕斯乔恩; E·J·瑞巴
Original assignee: Sangamo Biosciences Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: US10407476B2; US20150159172A1; AU2020277091A1; IL245785A0; US20210188926A1; WO2015089046A1; DK3080274T3; IL245778B; AU2014363991B2; JP6642943B2; WO2015089077A3; EP3757116A1; CA2931637C; US10968261B2; HK1225754A1; EP3080274B1; US11634463B2; AU2014363991A1; HUE051628T2; AU2014364051A1

Abstract

本文公开用于将编码涉及凝血的蛋白质的转基因序列插入细胞的基因组中以治疗包括血友病的病状的方法和组合物。在一个方面，本文描述非天然存在的锌指蛋白(ZFP)，该锌指蛋白结合至基因组中所关注区域(例如白蛋白基因)中的靶位点，其中ZFP包含一个或多个工程化的锌指结合结构域。在某些实施方案中，锌指结构域识别白蛋白基因中的靶位点。在一些实施方案中，锌指蛋白质包含称为并且排序为F1至F5或F1至F6的五个或六个锌指结构域，如表1的单行中示出。

Description

用于治疗血友病的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年12月9日提交的美国临时申请号61/913,838和2014年2月24日提交的美国临时申请号61/943,884的权益，其公开内容全部以引用方式并入本文。

在联邦科研资助下进行的本发明权利的声明

不适用。

技术领域

本公开是涉及基因修饰和血友病治疗领域。

背景

血友病诸如甲型血友病和乙型血友病，是凝血系统的遗传病症，其特征是出血至关节和软组织中，和过量出血至经历外伤或经历手术的任何位点。甲型血友病在临床上与乙型血友病难分辨，但是因子VIII(FVIII或F8)在甲型血友病中缺乏或不存在，而因子IX(FIX或F.IX)在患有乙型血友病的患者中缺乏或不存在。因子VIII基因编码血浆糖蛋白，所述血浆糖蛋白以其非活性形式与冯威勒布兰德氏因子相关联地进行循环。在表面损伤后，内在凝血级联启始并且因子VIII从复合物中释放并且变得活化。活化形式与因子IX一起操作来激活因子X变成活化Xa，最后导致纤维蛋白原变化至纤维蛋白和凝结诱导。参见，Levinson等人(1990)Genomics7(1):1-11。40-50％的甲型血友病患者患有涉及因子VIII内含子22的染色体倒位(也称为IVS22)。倒位的原因是因子VIII基因的内含子22中的9.6kb序列与位于因子VIII基因远侧约300kb处的两个密切相关反向序列中的一个之间的染色体内重组事件，导致相对于外显子23至26的外显子1至22倒位。参见，Textbook of Hemophilia,Lee等人(编)2005,BlackwellPublishing。其他甲型血友病患者在因子VIII中具有缺陷，包括活性位点突变，和无义和错义突变。就其本身来说，因子IX(F.IX或FIX)编码涉及凝血系统的丝氨酸蛋白水解酶中的一个，并且已经证明恢复野生型因子IX蛋白质的正常循环水平的甚至3％可预防自发出血。额外血友病与其他凝血因子的异常表达相关联。举例来说，因子VII缺陷是在300,000至500,000人中的约1个人中发生的常染色体隐性性状并且与患者体内的不适当因子VII水平相关联。类似地，因子X缺陷也是在每500,000至1百万人中的1个人中发生的常染色体隐性性状，并且由FX基因的遗传变体导致。因子X缺陷可在患者群体中具有不同程度的严重性。

乙型血友病的当前治疗依赖于长期、重复静脉内输注纯化重组因子IX并且受许多缺点影响。这包括需要重复静脉内输注，与抑制剂形成相关联，并且是预防性而非治愈性的。

已经描述患有甲型或乙型血友病的患者的基因疗法，其涉及引入质粒和编码功能因子VIII或因子IX蛋白质的其他载体(例如，AAV)。参见例如美国专利号6,936,243；7,238,346和6,200,560；Shi等人(2007)J Thromb Haemost.(2):352-61；Lee等人(2004)Pharm.Res.7:1229-1232；Graham等人(2008)Genet Vaccines Ther.3:6-9；Manno等人(2003)Blood 101(8):2963-72；Manno等人(2006)Nature Medicine 12(3):342-7；Nathwani等人(2011)Molecular Therapy 19(5):876-85；Nathwani等人(2011)；N Engl J Med.365(25):2357-65。然而，在这些方案中，形成抑制性抗-因子VIII或IX(抗-F8或抗-F.IX)抗体和针对递送媒介物的抗体仍然是血友病的基于因子VIII和因子IX替换的疗法的主要并发症。参见例如Scott&Lozier(2012)Br J Haematol.156(3):295-302。

已经描述基因组DNA的靶向裂解的各种方法和组合物。这些靶向裂解事件可用于例如诱导靶向诱变、诱导细胞DNA序列的靶向缺失，和促进预定染色体基因座处的靶向重组。参见，例如，美国专利号8,623,618；8,034,598；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和美国申请号14/278,903，其公开内容出于所有目的以引用方式全部并入。这些方法经常涉及使用工程化裂解系统来诱导双链断裂(DSB)或靶DNA序列中的切口以使得通过产生误差的过程诸如非同源末端连接(NHEJ)来修复断裂或使用修复模板的修复(同源性引导修复或HDR)可产生基因的剔除或插入所关注的序列(靶向整合)。此技术也可用于经由使用供体寡核苷酸来在基因组序列中引入位点特异性变化，包括引入基因组区域的特异性缺失，或特异性点突变或局部改变(也称为基因校正)。裂解可经由使用特异性核酸酶诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录活化剂样效应核酸酶(TALEN)来发生，或使用具有工程化crRNA/tracr RNA(‘单一引导RNA’)的CRISPR/Cas系统来引导特异性裂解。此外，开发基于Argonaute系统(例如，来自嗜热栖热菌，被称为‘TtAgo’，参见Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258-261)的靶向核酸酶，所述系统还可具有用于基因组编辑和基因疗法的潜力。

如与典型整合方法相比，此核酸酶介导的靶向转基因插入方法提供改进转基因表达、增加安全和表达持久性的希望，因为它允许精确转基因定位以将基因沉默或活化相邻致癌基因的风险减少到最低限度。

转基因可靶向整合至其同源基因座中，例如，将野生型转基因插入内源性基因座以校正突变基因。或者，转基因可插入非同源基因座例如“安全港”基因座中。已经描述一些安全港基因座，包括CCR5、HPRT、AAVS1、Rosa和白蛋白。参见，例如，美国专利号7,951,925和8,110,379；美国公布号20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和美国申请号14/278,903。举例来说，美国专利公布号20110027235涉及将功能性蛋白质靶向整合至分离干细胞中并且美国公布号20120128635描述治疗乙型血友病的方法。也参见Li等人(2011)Nature 475(7355):217-221和Anguela等人(2013)Blood122:3283-3287。

然而，仍然需要治疗血友病的额外组合物和方法。

概述

本文公开用于靶向整合编码蛋白质，诸如功能凝血因子蛋白质(例如，因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI)的序列的方法和组合物。功能因子VIII(“F8”)和/或因子IX(“F.IX”或“FIX”)蛋白质的表达可导致例如治疗和/或预防甲型血友病(因子VIII)和/或乙型血友病(因子IX)，而功能因子VII或因子X的表达可治疗或预防与因子VII和/或因子X缺陷相关联的血友病。核酸酶，例如工程化大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TALE-核酸酶(TALEN，包括TALE效应结构域与来自限制性内切酶和/或大范围核酸酶的核酸酶结构域的融合(诸如兆TALE和紧凑TALEN))、Ttago系统和/或CRISPR/Cas核酸酶系统用于在基因所插入的细胞中使‘安全港’基因座(例如CCR5、AAVS1、HPRT、Rosa或白蛋白)处的DNA裂解。供体转基因的靶向插入可经由同源性引导修复(HDR)或非同源性修复机制(例如，NHEJ供体捕获)。核酸酶可诱导靶DNA中的双链(DSB)或单链断裂(切口)。在一些实施方案中，使用两个切口酶通过引入两个切口来产生DSB。在一些情况下，切口酶是ZFN，而在其他情况下，切口酶是TALEN或CRISPR/Cas切口酶。在一些实施方案中，方法和组合物涉及结合至细胞中的白蛋白基因的至少一种蛋白质。

在一方面，本文描述的是非天然存在的锌指蛋白(ZFP)，该锌指蛋白结合至基因组中所关注的区域(例如白蛋白基因)中的靶位点，其中ZFP包含一个或多个工程化的锌指结合结构域。在一个实施方案中，ZFP是裂解所关注靶基因组区域的锌指核酸酶(ZFN)，其中ZFN包含一个或多个工程化的锌指结合结构域和核酸酶裂解结构域或裂解半结构域。裂解结构域和裂解半结构域可以例如从各种限制性内切核酸酶和/或归巢内切核酸酶中获得。在一个实施方案中，裂解半结构域从IIS型限制性内切核酸酶(例如，Fok I)中得到。在某些实施方案中，锌指结构域识别白蛋白基因中的靶位点，例如具有如在表1的单行中所示来排序的识别螺旋结构域的锌指蛋白。在一些实施方案中，锌指蛋白质包括称为并且排序为F1至F5或F1至F6的五个或六个锌指结构域，如表1的单行中示出。

在另一方面，本文描述转录活化剂样效应(TALE)蛋白质，其结合至基因组中的所关注的区域(例如，白蛋白基因)中的靶位点，其中TALE包含一个或多个工程化TALE结合结构域。在一个实施方案中，TALE是裂解所关注靶基因组区域的核酸酶(TALEN)，其中TALEN包含一个或多个工程化的TALE DNA结合结构域和核酸酶裂解结构域或裂解半结构域。裂解结构域和裂解半结构域可以例如从各种限制性内切核酸酶和/或归巢内切核酸酶(大范围核酸酶)中获得。在一个实施方案中，裂解半结构域从IIS型限制性内切核酸酶(例如，Fok I)中得到。在其他实施方案中，裂解结构域从大范围核酸酶得到，所述大范围核酸酶结构域还可展现DNA结合功能。

在另一方面，本文描述结合至基因组中的所关注的区域(例如，白蛋白基因)中的靶位点的CRISPR/Cas系统，其中CRISPR/Cas系统包括一种或多种工程化单一引导RNA或功能等效物，以及Cas9核酸酶。

如本文描述的核酸酶(例如，ZFN、CRISPR/Cas系统、Ttago和/或TALEN)可结合至且/或裂解在基因内或在基因附近的编码或非编码区域中的所关注的区域，例如像，前导序列、尾随序列或内含子，或在编码区域上游或下游的非转录区域。在某些实施方案中，核酸酶(例如，ZFN)结合至且/或裂解白蛋白基因。

在另一方面，本文描述编码一种或多种核酸酶(例如，本文描述的ZFN、CRISPR/Cas系统、Ttago和/或TALEN)或其他蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是例如mRNA。在一些方面，mRNA可化学修饰(参见例如Kormann等人(2011)Nature Biotechnology29(2):154-157)。在其他方面，mRNA可包含ARCA帽(参见美国专利7,074,596和8,153,773)。在其他实施方案中，mRNA可包含未修饰和修饰核苷酸的混合物(参见美国专利公布2012-0195936)。

在另一方面，本文描述的是表达载体(例如ZFN、CRISPR/Cas系统、Ttago和/或TALEN表达载体)，其包含有效地连接至启动子的编码如本文描述的一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质包括核酸酶(例如，ZFN、CRISPR/Cas系统、Ttago和/或TALEN)。在一个实施方案中，表达载体是病毒载体。在一方面，病毒载体展现组织特异性趋向性。

在另一方面，本文描述宿主细胞，其包含一种或多种表达载体，包括核酸酶(例如，ZFN、CRISPR/Cas系统、Ttago和/或TALEN)表达载体。

在另一方面，提供包含如本文描述的表达载体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可包含一种以上表达载体。在一些实施方案中，药物组合物包含包含第一多核苷酸的第一表达载体，和包含第二多核苷酸的第二表达载体。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸是不同的。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸是大致上相同的。药物组合物可进一步包含供体序列(例如，因子IX供体序列)。在一些实施方案中，供体序列与表达载体相关联。

在一方面，本发明方法和组合物包括遗传修饰细胞，所述细胞包括表达在血友病中异常表达的功能形式蛋白质(因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI蛋白质)的转基因，其中转基因整合至细胞基因组的内源性安全港基因(例如，白蛋白基因)中。在某些实施方案中，转基因使用至少一种核酸酶以位点特异性(靶向)方式来整合。在某些实施方案中，核酸酶(例如，ZFN、TALEN、Ttago和/或CRISPR/Cas系统)对于安全港基因(例如CCR5、HPRT、AAVS1、Rosa或白蛋白具有特异性。参见例如美国专利号7,951,925和8,110,379；美国公布号20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和美国申请号14/278,903)。在一些实施方案中，安全港是白蛋白基因。

在另一方面，本文描述在体外和/或体内遗传修饰细胞以产生因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI的方法，所述方法包括使用一种或多种核酸酶(例如，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas)来裂解细胞中的内源性安全港基因以使得编码因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI的转基因整合至安全港基因座中并且在细胞中表达。在某些实施方案中，安全港基因是aCCR5、HPRT、AAVS1、Rosa或白蛋白基因。在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞为灵长类动物细胞。在某些实施方案中，细胞是人细胞。在一组实施方案中，提供裂解细胞(例如，肝细胞)中的白蛋白基因的方法，包括将本文公开的一种或多种表达载体在使得表达一种或多种蛋白质并且裂解白蛋白基因的条件下引入细胞中。白蛋白基因可例如通过将供体序列整合至所裂解的白蛋白基因中来修饰。

在某些实施方案中，所述方法包括遗传修饰细胞以产生因子IX，所述方法包括向细胞施用表1示出的锌指核酸酶(ZFN)(或编码这些ZFN的多核苷酸)和编码因子IX蛋白质的供体。ZFN和供体可以任何组合存在于相同或不同载体上，例如在各自携带一种组分的3个独立AAV载体上；在携带两种组分的一个载体和携带第3种组分的独立载体上；或在携带所有3种组分的一个载体上。

在另一方面，本文提供用于提供在哺乳动物，或灵长类动物，诸如人灵长类动物，诸如患有甲型血友病的人患者中缺少或缺陷的功能性蛋白质(例如，因子VIII)的方法，例如用于治疗甲型血友病。在一些情况下，功能蛋白质是循环血浆蛋白质。在一些情况下，功能蛋白质是非循环血浆蛋白质。在一些情况下，功能蛋白质可为肝脏特定的。在另一方面，本文提供用于提供在哺乳动物，或灵长类动物，诸如人灵长类动物，诸如患有乙型血友病的人患者中缺少或缺陷的功能性蛋白质(例如，因子IX)的方法，例如用于治疗乙型血友病。在另一方面，本文提供用于向哺乳动物，或灵长类动物，诸如人灵长类动物，诸如人患者提供功能性蛋白质(例如因子VII)以治疗与因子VII缺陷相关联的血友病的方法。在另一方面，本文提供用于提供功能性蛋白质(例如因子X)以治疗与因子X缺陷相关联的血友病的方法。在另一方面，本文提供用于提供治疗与因子XI缺陷相关联的血友病的功能蛋白质(例如因子XI)的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使用核酸酶以将编码功能性因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI蛋白质的序列整合至有需要的受试者的细胞中。在其他实施方案中，所述方法包括将遗传修饰细胞(表达在患有血友病的受试者中异常表达的功能形式蛋白质)施用至受试者。因此，分离的细胞可引入受试者中(离体细胞疗法)或细胞可在它是受试者的一部分(在体内)时加以修饰。还提供使用本文描述的供体和/或核酸酶用于治疗血友病(例如，用因子VIII供体治疗甲型血友病，用因子IX供体治疗乙型血友病，用因子VII治疗因子VII缺陷，用因子X治疗因子X缺陷和/或用因子XI治疗因子XI缺陷)，例如，在制备用于治疗血友病的药物中。在某些实施方案中，因子VIII蛋白质包括B-结构域缺失。在某些实施方案中，因子VIII-和/或因子IX-编码序列使用病毒载体、非病毒载体(例如，质粒)和/或其组合来递送。

在所描述的任何组合物和方法中，核酸酶和/或转基因可在AAV载体上携带，包括但不限于AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9和AAVrh10或假型AAV诸如AAV2/8、AAV8.2、AAV2/5和AAV2/6等。在一些实施方案中，AAV载体是AAV2/6载体。在某些实施方案中，核酸酶和转基因供体使用相同AAV载体类型来递送。在其他实施方案中，核酸酶和转基因供体使用不同AAV载体类型来递送。核酸酶和转基因可使用一个或多个载体来递送，例如，一个载体携带转基因和核酸酶；两个载体，其中一个携带核酸酶(例如，例如具有2A肽的ZFN对的左和右ZFN)并且一个携带转基因；或三个载体，其中一个载体携带核酸酶对的一个核酸酶(例如，左ZFN)，单独载体携带核酸酶对中的另一个核酸酶(例如，右ZFN)并且第三个单独载体携带转基因。参见图2。在使用两个或更多个载体的实施方案中，载体可以相同浓度或以不同比率来使用，例如，转基因供体载体可用比核酸酶载体高2倍、3倍、4倍、5倍或更高的浓度来施用。举例来说，第一核酸酶、不同于第一核酸酶的第二核酸酶和转基因载体可以约1:1:1、约1:1:2、约1:1:3、约1:1:4、约1:1:5、约1:1:6、约1:1:7、约1:1:8、约1:1:9、约1:1:10、约1:1:11、约1:1:12、约1:1:13、约1:1:14、约1:1:15、约1:1:16、约1:1:17、约1:1:18、约1:1:19或在一些情况下约1:1:20的比率递送。在示例性实施方案中，第一核酸酶、不同于第一核酸酶的第二核酸酶和转基因载体以约1:1:8的比率递送。在某些实施方案中，核酸酶和/或转基因供体经由静脉内(例如，门静脉内)施用来递送至完整动物的肝脏。

在本文描述的任何组合物和方法中，由转基因编码的蛋白质可包括因子VIII蛋白质、或修饰因子VIII蛋白质，例如B-域缺失因子VIII(BDD-F8)或其片段。在其他实施方案中，由转基因编码的蛋白质包括因子IX蛋白质。在其他实施方案中，由转基因编码的蛋白质包括因子VII蛋白质。在其他实施方案中，由转基因编码的蛋白质包括因子X蛋白质。在本文描述的任何组合物或方法中，转基因还包括转录调控因子，而在其他组合物或方法中，它不包括转录调控因子并且转录通过内源性调控因子来调控。在另一方面，本发明方法包括用于治疗性治疗有需要的受试者的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含工程化干细胞，其包括安全港特异性核酸酶，和编码因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI蛋白质或其功能片段和/或截断形式的转基因供体。在其他实施方案中，所述组合物包含工程化干细胞，其已经修饰并且表达编码因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI蛋白质或其功能片段和/或截断形式的转基因供体。

在本文描述的任何组合物或方法中，细胞可为真核细胞。合适细胞的非限制实例包括真核细胞或细胞系诸如分泌细胞(例如，肝脏细胞、粘膜细胞、唾液腺细胞、垂体细胞等)、血细胞(红细胞)、先驱红细胞、肝细胞、肌肉细胞、干细胞(例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝干细胞、造血干细胞(例如CD34+))或内皮细胞(例如血管、肾小球和管状内皮细胞)。因此，靶细胞可为灵长类动物细胞，例如人细胞，或靶细胞可为哺乳动物细胞(包括兽医动物)，例如尤其非人灵长类动物和以下目的哺乳动物：啮齿目(小鼠、大鼠、仓鼠)、兔形目(兔)、食肉目(猫、犬)和偶蹄目(奶牛、猪、绵羊、山羊、马)。在一些方面，靶细胞包括组织(例如肝脏)。在一些方面，靶细胞是干细胞(例如，胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝干细胞等)或通过本文描述的任何方法的非人类动物胚胎，然后植入胚胎以使得活动物出生。然后将动物培育至性成熟并且允许产生后代，其中至少一些后代包括基因组修饰。细胞也可包括胚胎细胞，例如小鼠、大鼠、兔或其他哺乳动物细胞胚胎。细胞可来自任何生物体，例如人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、猫、犬或其他哺乳动物细胞。细胞可分离或可为生物体(例如，受试者)的一部分。

在本文所述的任何方法和组合物中，转基因可整合至内源性安全港基因中以使得一些、全部或无内源性基因表达，例如具有整合转基因的融合蛋白。在一些实施方案中，内源性安全港基因是白蛋白基因并且内源性序列是白蛋白序列。内源性可存在于外源性蛋白质的氨基(N)-末端部分和/或外源性蛋白质的羧基(C)-末端部分上。白蛋白序列可包括全长野生型或突变型白蛋白序列或，替代地，可包括部分白蛋白氨基酸序列。在某些实施方案中，白蛋白序列(全长或部分)用于增加与其融合且/或充当载体的转基因所表达的多肽的血清半衰期。在其他实施方案中，转基因包含白蛋白序列并且靶向插入基因组内的另一个安全港。此外，转基因可包括驱动其表达的外源性启动子(例如，组成型或可诱导启动子)或其表达可由内源性控制序列(例如，内源性白蛋白启动子)驱动。在一些实施方案中，供体包括额外修饰，包括但不限于密码子优化、添加糖基化位点、截断形式等。

在一些实施方案中，提供包括锌指蛋白质和野生型或工程化裂解结构域或裂解半结构域的融合蛋白质。

在一些实施方案中，提供药物组合物，其包含：(i)包含编码锌指核酸酶的多核苷酸的AAV载体，所述锌指核酸酶包含FokI裂解结构域和包含排序为F1至F5的5个锌指结构域的锌指蛋白质，其中每个锌指结构域包含识别螺旋区域并且其中锌指蛋白质的识别螺旋区域在表1的第一行中示出(SEQ ID NO:4-8)(例如，SEQ ID NO.15)；(ii)包含编码锌指核酸酶的多核苷酸的AAV载体，所述锌指核酸酶包含FokI裂解结构域和包含排序为F1至F6的6个锌指结构域的锌指蛋白质，其中每个锌指结构域包含识别螺旋区域并且其中锌指蛋白质的识别螺旋区域在表1的第二行中示出(SEQ ID NO:9-14)(例如，SEQ IDNO.16)；和(iii)包含编码因子IX蛋白质(例如，SEQ ID NO.17)的供体的AAV载体。

在一些实施方案中，(i)、(ii)和(iii)以约1:1:1、约1:1:2、约1:1:3、约1:1:4、约1:1:5、约1:1:6、约1:1:7、约1:1:8、约1:1:9、约1:1:10、约1:1:11、约1:1:12、约1:1:13、约1:1:14、约1:1:15、约1:1:16、约1:1:17、约1:1:18、约1:1:19或约1:1:20的比率提供。

在一些实施方案中，提供药物组合物，其包含：包含与SEQ ID NO.15具有80％、90％、95％、99％、99.5％或99.8％或更大同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的第一多核苷酸，包含与SEQ IDNO.16具有80％、90％、95％、99％、99.5％或99.8％或更大同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的第二多核苷酸和任选地，包含与SEQ ID NO.17具有80％、90％、95％、99％、99.5％或99.8％或更大同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的供体序列。

在一些实施方案中，提供药物组合物，其包含以下或由以下组成：包含如SEQ ID NO.15中的序列的第一多核苷酸或有所述核苷酸组成，包含如SEQ ID NO.16中的序列或由所述序列组成的第二多核苷酸，和任选地，包含SEQ ID NO.17中的序列或由所述序列组成的供体序列。

在本文描述的任何组合物或方法中，裂解可经由使用特异性核酸酶诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录活化剂样效应核酸酶(TALEN)来发生，或使用具有工程化crRNA/tracr RNA(‘单一引导RNA’)的Ttago或CRISPR/Cas系统来引导特异性裂解。在一些实施方案中，使用两个切口酶通过引入两个切口来产生DSB。在一些情况下，切口酶是ZFN，而在其他情况下，切口酶是TALEN或CRISPR/Cas系统。靶向整合可经由同源性引导修复机制(HDR)且/或经由非同源性修复机制(例如，NHEJ供体捕获)来发生。如本文描述的核酸酶可结合至且/或裂解在基因内或在基因附近的编码或非编码区域中的所关注的区域，例如像，前导序列、尾随序列或内含子，或在编码区域上游或下游的非转录区域内。在某些实施方案中，核酸酶裂解在结合位点(例如，表1所示结合位点)处或附近的靶序列。裂解可导致例如经由插入、缺失或其组合来修饰基因。在某些实施方案中，修饰在核酸酶结合和/或裂解位点处或附近，例如，裂解位点上游或下游1-300个(或在其间的任何值)碱基对内，更优选地结合和/或裂解位点任一侧的1-100个碱基对(或在其间的任何值)内，甚至更优选地结合和/或裂解位点任一侧的1至50个碱基对(或在其间的任何值)内。

所描述的方法和组合物可用于治疗或预防有需要的受试者的血友病。在一些实施方案中，提供治疗患有乙型血友病的患者的方法，包括向患者施用本文描述的任何表达载体或药物组合物，其中表达载体或药物组合物介导编码功能因子IX蛋白质的转基因靶向整合至内源性白蛋白基因中。在一些实施方案中，组合物包含载体并且用于靶向肝脏细胞。在其他实施方案中，组合物包含工程化干细胞并且作为骨髓移植物来给予患者。在一些情况下，患者在移植之前部分或完全免疫清除。在其他情况下，在内源性基因的核酸酶介导的修饰(例如，将FIX转基因靶向整合至白蛋白基因座中)之前、期间和/或之后，患者用一种或多种免疫抑制剂治疗。

在其他方面，本文描述治疗和/或预防乙型血友病的方法，其使用包括如表1示出的工程化锌指核酸酶(ZFN)的系统(“SB-FIX”系统)以在体内位点特异性并入人因子9(hF9)转基因的校正拷贝至受试者自身肝细胞的基因组中。hF9转基因的整合靶向白蛋白基因座的内含子1，导致因子IX在血液中的稳定、高水平、肝脏特异性表达和分泌。SB-FIX含有作为一系列连续静脉内剂量来施用的三个个别重组腺病毒相关病毒血清型2/6(rAAV2/6)载体：编码SBS42906的第一载体(表1的SB-42906)，编码SBS43043的第二载体(SB-43043)，和提供编码无启动子hF9转基因的DNA修复模板的第三载体(SB-F9供体，也称为“SB-FIX供体”)。递送所有三个载体导致：1)通过一对工程化序列特异性ZFN(SBS42906和SBS43043)在白蛋白基因座的内含子1的预先界定位点处的特异性和选择性裂解和2)由DNA修复模板编码的hF9转基因稳定整合至ZFN诱导的DNA断裂位点处。将hF9转基因安置于基因组中，和在高度表达内源性白蛋白基因座的控制下在受试者终生提供因子IX的持久、肝脏特异性表达。

此外，本文描述的任何方法可进一步包括额外步骤，包括部分肝切除术或用增强转导且/或诱导肝细胞经历细胞周期的辅助剂治疗。辅助剂的实例包括γ辐照、UV辐照、氚化核苷酸诸如胸苷、顺铂、依托泊苷、羟基脲、阿非迪霉素、泼尼松龙、四氯化碳和/或腺病毒。

本文所述方法可以在体外、离体或体内实施。在某些实施方案中，将组合物引入活的完整哺乳动物中。在递送时，哺乳动物可在任何发育阶段，例如，胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、幼年或成年。另外，靶向细胞可为健康或患病细胞。在某些实施方案中，将组合物中的一种或多种静脉内递送(例如，经由门静脉内到达肝脏，例如尾静脉注射)、动脉内、腹膜内、肌肉内、进入肝实质(例如，经由注射)、进入肝动脉(例如，经由注射)，和/或经由胆道系统(例如，经由注射)。

在一个具体方面，本文所述的方法和组合物包括治疗性组合物，其包含(i)编码FVIII的供体转基因(ii)核酸酶(例如，ZFN、TALEN、Ttago或CRISPR/Cas系统)，其靶向相应地除了FVIII以外的内源性基因的基因座，例如，靶向哺乳动物，或灵长类动物或人，诸如血友病患者的内源性白蛋白基因。在某些实施方案中，治疗性组合物包含在分开的独立载体诸如分开AAV载体中的不同量的FVIII供体转基因和白蛋白基因特异性核酸酶，其可一起施用(例如，混合成单一溶液或同时施用)或替代地可个别地施用(例如，在单独溶液中以相应施用之间的实质性延迟，例如，10分钟或更长、30分钟或更长、1小时或更长、2小时或更长、3小时或更长或更长时间来施用)。)。在某些实施方案中，施用治疗性组合物以将FVIII供体转基因整合至非FVIII基因座中并且随后表达所整合的FVIII以在哺乳动物，或灵长类动物或人，或血友病患者的血浆中获得治疗水平的FVIII。在某些实施方案中，治疗水平的FVIII可包括，例如，大于2％、大于4％、大于5％、大于6％、大于8％、大于10％、大于12％、大于15％、大于20％、大于25％或更大临床可接受正常血浆浓度的FVIII。替代地或另外地，治疗水平的FVIII可包括在将FVIII供体转基因和白蛋白基因核酸酶施用至此个体之前在个别哺乳动物、或灵长类动物或人、或血友病患者中测量的例如大于2％、大于4％、大于5％、大于6％、大于8％、大于10％、大于12％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％或更大血浆浓度的功能性FVIII。

在另一个具体方面，本文所述的方法和组合物包括治疗性组合物，其包含(i)编码FIX的供体转基因(ii)核酸酶((例如，ZFN、TALEN、Ttago或CRISPR/Cas系统)，其靶向相应地除了FIX以外的内源性基因的基因座，例如，靶向哺乳动物，或灵长类动物或人，诸如血友病患者的内源性白蛋白基因。在某些实施方案中，治疗性组合物包含在分开的独立载体诸如分离AAV载体中的不同量的FIX供体转基因和白蛋白基因特异性核酸酶，其可一起施用(例如，混合成单一溶液或同时施用)或替代地可个别地施用(例如，在单独溶液中以相应施用之间的实质性延迟，例如，10分钟或更长、30分钟或更长、1小时或更长、2小时或更长、3小时或更长或更长时间来施用)。在某些实施方案中，施用治疗性组合物以将FIX供体转基因整合至非FIX基因座中并且随后表达所整合的FIX以在哺乳动物，或灵长类动物或人，或血友病患者的血浆中获得治疗水平的FIX。在某些实施方案中，治疗水平的FIX可包括，例如，大于2％、大于4％、大于5％、大于6％、大于8％、大于10％、大于12％、大于15％、大于20％、大于25％或更大临床可接受正常血浆浓度的FIX。替代地或另外地，治疗水平的FIX可包括在将FIX供体转基因和白蛋白基因核酸酶施用至此个体之前在个别哺乳动物、或灵长类动物或人、或血友病患者中测量的例如大于2％、大于4％、大于5％、大于6％、大于8％、大于10％、大于12％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％或更大血浆浓度的功能性FIX。

为了将组合物靶向至具体类型细胞，例如，血小板、成纤维细胞、肝细胞等，施用的组合物中的一种或多种可与特异性结合至细胞表面受体的归巢剂相关联。举例来说，载体可偶联至配体(例如，半乳糖)，某些肝系统细胞具有针对所述配体的受体。偶联可为共价的，例如，交联剂诸如戊二醛，或非共价的，例如，抗生物素化配体结合至生物素化载体。另一种形式的共价偶联通过将用于制备载体原料的AAV辅助质粒工程化来提供以使得所编码的外壳蛋白中的一种或多种是原生AAV外壳蛋白和肽或蛋白质配体的混合物，从而使配体暴露于病毒颗粒的表面上。

还提供试剂盒，其包括本发明的组合物(例如，表达载体、遗传修饰细胞、ZFP、CRISPR/Cas系统和/或TALEN和任选地转基因供体)。试剂盒可以包括编码核酸酶的核酸(例如包含在适合表达载体中RNA分子或核酸酶编码基因)、供体分子、适合的宿主细胞系、用于实施本发明方法的说明书等。

这些和其他方面鉴于总体公开内容易于为本领域技术人员显而易知。

附图简述

图1是展示示例性核酸酶和供体的示意图。示出三个载体：用于两个核酸酶(SB-42906，左ZFN/ZFN 1和SB-43043，右ZFN/ZFN2)以及SB-F9供体(底部图)的AAV2/6载体。

图2是展示ZFN SBS42906和SBS43043结合至在白蛋白基因座处的其DNA靶序列(在SEQ ID NO:1示出的白蛋白序列内加框)的示意图。

图3是描绘核酸酶介导的同源性和非同源性引导靶向整合的示意图。

图4是描绘通过NHEJ或HDR来靶向整合hF9供体的示意图。不论靶向整合发生的机制为何(左侧的NHEJ和右侧的HDR)，由供体编码的剪接受体序列允许hF9转基因(外显子2-8)适当mRNA剪接至来自内源性白蛋白启动子的外显子1并且表达。

图5A和5B示出白蛋白基因座处的mRNA转录物。图5A是白蛋白基因座处的替代mRNA转录物的示意图。野生型白蛋白基因座(hALB外显子1-8)处的转录产生2.3kb的转录物，而在SB-FIX供体整合之后，表达融合转录物hALB(外显子1)-hFIX(外显子2-8)(1.7kb)。描绘RT-PCR的引物结合位点。图5B示出仅用SB-FIX供体或用hALBZFN和SB-FIX供体转导的HepG2亚克隆的分析。顶部图示出在分泌48小时之后通过hFIX特异性ELISA确定的亚克隆的hFIX分泌。中间图示出在所有亚克隆中SB-hFIX供体整合至人血白蛋白中的模式(HDR或NHEJ)。底部图示出使用对于野生型人血白蛋白转录物或hALB-hFIX融合转录物具有特异性的引物从HepG2亚克隆进行RT-PCR。

图6A至6C示出hALB ZFN和如本文描述的示例性因子IX供体的序列。图6A示出ZFN 42906的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)(示出ZFP和裂解结构域序列)。图6B示出ZFN 43043的氨基酸序列(SEQ IDNO:16)(示出ZFP和裂解结构域序列)。ZFP的识别螺旋区域加下划线并且FokI裂解结构域以斜体字示出(ZFN 42906中的“ELD”FokI结构域和ZFN 43043中的“KKR”FokI结构域)。图6C(SEQ ID NO:17)示出示例性因子IX供体的核苷酸序列。左(碱基对271-550)和右(碱基对2121-2220)同源性臂以大写字母示出并且加下划线。剪接受体序列(碱基对557-584)加下划线。密码子优化因子IX-编码序列以大写字母示出(碱基对585-1882)并且多聚腺苷酸化信号以粗体示出(碱基对1890-2114)。

详述

本文公开用于修饰细胞以产生一种或多种蛋白质的组合物和方法，所述蛋白质的表达或基因序列在修饰之前是异常。在一些实施方案中，蛋白质与血友病相关联。细胞可通过将编码一种或多种功能蛋白质的转基因靶向插入细胞的安全港基因(例如，白蛋白)来修饰。在一些实施方案中，转基因插入内源性白蛋白基因中。转基因可编码涉及血友病的任何蛋白质或肽，例如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI和/或其功能片段。还公开使用如本文描述的细胞和/或通过如本文描述来修饰细胞(离体或体内)来治疗血友病的方法。进一步描述用于修饰细胞的包含编码核酸酶的核酸和供体分子的组合物，和在体内或离体修饰细胞的方法。另外，描述包含通过本发明方法和组合物修饰的细胞的组合物。

本文描述的基因组修饰的细胞通常经由核酸酶介导(ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas)靶向整合来修饰以插入编码治疗性蛋白质(例如，因子VII、因子VIII(F8)、因子IX、因子X和/或因子XI)的序列，其中与血友病疾病相关联的其基因发生改变或处于异常状态下的蛋白质进入受试者的一种或多种细胞的基因组(在体内或离体)，以使得细胞在体内产生蛋白质。在某些实施方案中，所述方法进一步包括诱导受试者的细胞，尤其肝脏细胞增殖(进入细胞周期)，例如通过部分肝切除术和/或通过施用诱导肝细胞经历细胞周期的一种或多种化合物。受试者包括但不限于人，非人灵长类动物，兽医动物诸如猫、犬、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、奶牛、猪、马、山羊等。

总则

除非另外指示，否则这些方法的实施以及本文公开的组合物的制备和用途将使用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA以及本领域技术内的相关领域中的传统技术。这些技术在文献中得以充分说明。参见例如Sambrook等人MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989和2001第三版；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新；丛书METHODS INENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,第三版,Academic Press,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,第304卷,“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编),Academic Press,San Diego,1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第119卷,“ChromatinProtocols”(P.B.Becker,编)Humana Press,Totowa,1999。

定义

术语“核酸”、“多核苷酸”以及“寡核苷酸”可交换使用，并且指的是呈直链或环状构象，以及呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公开的目的，这些术语不应被解释为相对于聚合物的长度为限制性的。所述术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫代磷酸主链)中被修饰的核苷酸。通常，具体核苷酸的类似物具有相同的碱基成对特异性；即A的类似物将会与T碱基成对。

术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”可交换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于其中一种或多种氨基酸是对应的天然存在氨基酸的化学类似物或修饰衍生物的氨基酸聚合物。

术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或99.8％相同，那么聚合物分子被认为彼此“同源”。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或99.8％类似，那么聚合物分子被认为彼此“同源”。

术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。计算两个核酸序列的同一性百分比例如可通过出于最优比较目的来比对两个序列来进行(例如，为了最优比对，间隙可引入第一和第二核酸序列中的一个或两个并且不相同序列可出于比较目的而忽略)。在某些实施方案中，出于比较目的来比对的序列的长度是参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、99％、99.5％、99.8％或大致上100％。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同核苷酸占据时，那么在此位置的分子是相同的。两个序列之间的同一性百分比随着由序列共享的相同位置的数目而变化，考虑到为了最优比对两个序列而需要引入的间隙的数目，和每个间隙的长度。两个序列之间的序列的比较和同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。举例来说，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用迈耶斯和米勒算法(CABIOS,1989,4:11-17)来确定，所述算法并入ALIGN程序(版本2.0)中，所述ALIGN程序使用PAM 120权重残值表、12的间隙长度罚分和4的间隙罚分。两个核苷酸序列之间的同一性百分比可替代地使用GCG软件包中的GAP程序来确定，所述GCG软件包使用NWSgapdna.CMP矩阵。各种其他序列比对程序可利用并且可用于确定序列同一性例如像Clustal。

“结合”指的是大分子之间(例如，蛋白质与核酸之间)序列特异、非共价相互作用。不是所有的结合相互作用的组分都需要序列特异(例如，与DNA主链中磷酸盐残基接触)，只要相互作用总体上是序列特异即可。这种相互作用通常特征在于10^-6M^-1或更低的分解常数(K_d)。“亲和力”指的是结合的强度：增加的结合亲和力与较低K_d有关。

“结合蛋白”是能够非共价结合另一分子的蛋白质。结合蛋白可以结合至例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。就蛋白质结合蛋白来说，它可以结合至其自身(以形成同源二聚体、同源三聚体等)和/或它可以结合至不同蛋白质的一个或多个分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。举例来说，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合以及蛋白质结合活性。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是通过一个或多个锌指以序列特异的方式结合DNA的蛋白质，或较大蛋白质内的一个结构域，所述一个或多个锌指是结合结构域内的氨基酸序列区，该序列区的结构通过锌离子配位作用来稳定。术语锌指DNA结合蛋白经常缩写为锌指蛋白或ZFP。

“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域涉及TALE结合至其同源靶DNA序列。单一“重复单元”(也称为“重复序列”)通常是33-35氨基酸长度并且展现至少一些与天然存在TALE蛋白质内的其他TALE重复序列的序列同源性。参见例如美国专利号8,586,526。

锌指和TALE结合结构域可“工程化”以结合至预定核苷酸序列，例如经由天然存在锌指或TALE蛋白质的识别螺旋区域的工程化(改变一个或多个氨基酸)。因此，工程化DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白质。用于将DNA结合蛋白工程化的方法的非限制性实例是设计和选择。经设计的DNA结合蛋白是自然界中不存在的蛋白质，该蛋白质的设计/组成主要是合理标准的结果。用于设计的合理标准包括取代规则以及用于处理数据库信息的计算机算法的应用，该数据库存储了现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息。参见例如美国专利6,140,081；6,453,242；6,534,261；和8,586,526也参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。

“选择的”锌指蛋白或TALE是没有在自然界中发现的蛋白质，该蛋白质的制造主要是经验过程的结果，如噬菌体展示、相互捕获或杂种选择。参见例如US 5,789,538；US 5,925,523；US 6,007,988；US 6,013,453；US 6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO 01/88197和WO 02/099084。

“TtAgo”是被认为涉及基因沉默的原核Argonaute蛋白质。TtAgo来源于细菌嗜热栖热菌。参见例如Swarts等人,同前,G.Sheng等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,652)。“TtAgo系统”是所需要的所有组分，包括，例如，用于由TtAgo酶裂解的引导DNA。

“重组”是指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程，包括但不限于通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组的供体捕获。对本公开内容来说，“同源重组(HR)”指的是这种交换的特定形式，该交换发生在例如经由同源导向修复机理所进行的细胞中双链断裂修复期间。这个过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子以成为“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)的修复模板，并且这个过程被不同地称为“无交叉基因转变”或“短序列基因转变”，因为它导致基因信息从供体向靶传递。不希望被任何具体理论束缚，这种传递可以涉及在断裂的靶和供体之间形成的异源双链体DNA的错配校正，和/或“取决于合成的链退火”，在该退火中供体用来重新合成将成为靶一部分的基因信息，和/或相关的过程。这种特定的HR经常导致靶分子序列的变化，这样使得供体多核苷酸的部分或所有序列并入靶多核苷酸中。

在本公开的方法中，如本文所描述的一种或多种靶向核酸酶可在预先确定的位点中，在靶序列(例如，细胞染色质)中产生双链断裂，并且与断裂区中的核苷酸序列具有同源性的“供体”多核苷酸可以引入细胞中。已经展示了存在双链断裂可促进供体序列的整合。供体序列可以物理整合或，可替代地，供体多核苷酸被用作用于经由同源组合来修复断裂的模板，这将导致引入供体中的全部或部分核酸序列至细胞染色质中。因此，可以改变细胞染色质中的第一序列，并且在某些实施方案中，可以转变成存在于供体多核苷酸中的序列。因此，使用术语“替换”或“更换”可以理解为表示用另一核苷酸序列来替换一个核苷酸序列，(即，在信息意义上替换序列)，并且不必然需要用另一多核苷酸来物理或化学地替换一个多核苷酸。

在本文描述的任何方法中，额外的锌指蛋白或TALEN对可以用于细胞内额外靶位点的额外双链裂解。

在用于靶向重组和/或替换和/或改变细胞染色质中所关注区域序列方法的实施方案中，染色体序列通过用外源“供体”核苷酸序列同源重组来改变。如果存在与断裂区同源的序列，那么可通过细胞染色质中的双链断裂的存在来刺激这种同源重组。

在本文描述的任何方法中，第一核苷酸序列(“供体序列”)可以包含与所关注区域中基因组序列同源但不同的序列，因此将刺激同源重组以在所关注区域插入不相同序列。因此，在某些实施方案中，与所关注区域序列同源的供体序列部分展现了与所替换的基因组序列约80％至99％之间(或任何在其间的整数)的序列同一性。在其他实施方案中，供体和基因组序列之间的同源性高于99％，例如如果具有超过100个邻接碱基对的供体与基因组序列之间只有1个核苷酸不同。在某些情况下，供体序列的非同源部分可以包含不存在于所关注区域中的序列，这样使得新的序列引入所关注区域中。在这些情况下，非同源序列通常侧接具有50至1,000个碱基对(或在其间的任何整数值)或任何大于1,000个碱基对数目的序列，这些序列与所关注区域中的序列同源或相同。在其他实施方案中，供体序列与第一序列是非同源的，并且供体序列通过非同源重组机理插入基因组中。

本文描述的任何方法可以通过靶向整合中断所关注基因表达的供体序列来用于细胞中一种或多种靶序列的部分或完全失活。也提供了具有部分或完全失活基因的细胞系。

此外，如本文所描述的靶向整合方法也可以用来整合一种或多种外源序列。外源核酸序列可以包括，例如一种或多种基因或cDNA分子，或任何类型编码或非编码的序列，以及一种或多种控制成分(例如，启动子)。另外，外源核酸序列可能产生一种或多种RNA分子(例如，小发夹结构的RNA(shRNA)、抑制性RNA(RNAi)、微型RNA(miRNA)等)。

“裂解”指的是DNA分子共价主链的断裂。可通过各种各样的方法来开始裂解，所述方法包括但不限于磷酸二酯键的酶水解或化学水解。单链裂解和双链裂解均是可能的，并且双链裂解可由于两个相异单链裂解事件而发生。DNA裂解可导致平端或交错端产生。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA裂解。

“裂解半结构域”是与第二多肽(相同的或不同的)偶联的多肽序列，从而形成具有裂解活性(优选地双链裂解活性)的复合物。术语“第一和第二裂解半结构域”；“+和-裂解半结构域”以及“右和左裂解半结构域”可交换使用，指的是二聚化的裂解半结构域对。

“工程化裂解半结构域”是已经修饰以便与另一裂解半结构域(例如，另一工程化裂解半结构域)形成专性异源二聚体的裂解半结构域。还参见美国专利号7,914,796；8,034,598；和8,623,618；以引用方式全部并入本文。

术语“序列”指的是任何长度的核苷酸序列，该核苷酸序列可以是DNA或RNA；可以是直链的、环状的或支链的，以及可以是单链或双链的。术语“供体序列”指的是插入基因组的核苷酸序列。供体序列可以是任何长度，例如2与10,000个核苷酸之间的长度(或任何在其间或其上的整数值)，优选地约100与1,000个核苷酸之间的长度(或任何在其间的整数值)，更优选地约200与500个核苷酸之间的长度。

“染色质”是包括细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包括核酸(主要为DNA)以及蛋白质，该蛋白质包括组蛋白和非组蛋白的染色体蛋白。大多数真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中核小体核心包括近似150个与八聚物相关的DNA碱基对，该八聚物包括组蛋白H2A、H2B、H3以及H4的每两个；并且接头DNA(取决于有机体具有可变长度)在核小体核心之间伸展。组蛋白H1分子一般与接头DNA相关。就本公开内容来说，术语“染色质”意指包含所有类型的细胞核蛋白，不论是原核的还是真核的。细胞染色质包括染色体染色质和游离基因染色质。

“染色体”是包括细胞所有或部分基因组的染色质复合物。细胞基因组的特征通常在于它的核型，该核型是包括细胞基因组的所有染色体集合。细胞的基因组可以包括一种或多种染色体。

“游离基因”是复制的核酸、核蛋白复合物或其他包含核酸的结构，该核酸不是细胞染色体核型的一部分。游离基因的实例包括质粒和某些病毒基因组。

“靶位点”或“靶序列”是定义结合分子所结合(只要存在足以结合的条件)核酸的一部分的核酸序列。

“外源”分子是通常不存在于细胞中，但可以通过一种或多种基因的、生物化学的或其他方法来引入细胞中的分子。“通常存在于细胞中”是相对于细胞的具体发育阶段和环境条件而测定。因此，例如，仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子相对于成年肌肉细胞是外源分子。类似地，通过热激诱导的分子相对于非热激的细胞是外源分子。外源分子可以包括，例如功能失常的内源分子的功能形式或功能正常的内源分子的功能失常形式。

其中，外源分子可以是小分子，如通过组合化学过程而产生的小分子，或大分子如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、任何上述分子的修饰衍生物或任何包含上述分子的一种或多种的复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链的；可以是直链、支链或环状的；并且可以是任何长度。核酸包括能够形成双链体以及三链体的那些核酸。参见例如美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质包括，但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化的DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰基转移酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶以及解旋酶。

外源分子可以是与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。举例来说，外源核酸可以包括感染的病毒基因组、引入细胞中的质粒或游离基因、或通常不存在于细胞中的染色体。用于将外源分子引入细胞的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于脂质介导的传递(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注入、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的传递以及病毒载体介导的传递。外源性分子也可为与内源性分子相同类型的分子，但是来源于与产生细胞的物种不同的物种。举例来说，人核酸序列可引入最初来源于小鼠或仓鼠的细胞系。

相反，“内源”分子是在具体环境条件下，在具体发育阶段通常存在于具体细胞中的分子。举例来说，内源核酸可以包括染色体、线粒体、叶绿体或其他细胞器的基因组、或天然存在的游离核酸。额外的内源分子可以包括蛋白质，例如转录因子和酶。

“融合”分子是其中两个或更多个亚单位分子得以连接优选地共价连接的分子。亚单位分子可以是相同化学类型的分子，或可以是不同化学类型的分子。第一种类型融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，ZFP或TALE DNA结合结构域与一个或多个活化结构域之间融合)以及融合核酸(例如，编码上文中描述的融合蛋白的核酸)。第二种类型融合分子的实例包括但不限于形成三链体核酸与多肽之间融合以及小沟结合剂与核酸之间融合。

细胞中融合蛋白的表达可以由融合蛋白向细胞递送或通过编码融合蛋白的多核苷酸向细胞递送而引起，其中转录多核苷酸，并且翻译转录物以产生融合蛋白。分子间剪接、多肽裂解以及多肽连接反应也可以在细胞中的蛋白质表达中涉及到。用于向细胞递送多核苷酸和多肽的方法在本公开内容别处提出。

“基因”对本公开内容来说包括编码基因产物(参见下文)的DNA区，以及调控基因产物产生的所有DNA区，无论这些调控序列是否与编码和/或转录序列邻近。因此，基因包括，但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质结合位点以及基因座控制区。

“基因表达”指的是将包含在基因中的信息转变成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物也包括通过如加帽、聚腺苷酸化、甲基化以及编辑的方法来修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、遍在蛋白化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化以及糖基化来修饰的蛋白质。

基因表达“调节”指的是基因活性变化。表达调节可以包括但不限于基因活化和基因阻抑。基因编辑(例如，裂解、变化、失活、随机突变)可以用来调节表达。基因失活指的是与不包括相较于如本文所描述的ZFP的细胞，基因表达的任何减少。因此，基因失活可能是部分的或完全的。

“所关注区”是任何细胞染色质区，如，例如基因或基因内部或基因附近的非编码序列，其中结合外源分子是可取的。结合可以是为了靶向DNA裂解和/或靶向重组的目的。所关注区可以存在于例如染色体、游离基因、细胞器基因组(例如，线粒体、叶绿体)或感染病毒基因组中。所关注区可以在基因编码区内，在转录的非编码区内，如例如前导序列、尾随序列或内含子，或在编码区上游或下游内的非转录区内。所关注区可以小至单个核苷酸对，或高达2,000个核苷酸对长度，或任何整数值的核苷酸对。

“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞(例如，T-细胞)。

术语“有效连接”或“有效地连接”(或“可操作连接”)关于并列两种或更多种组分(如序列成分)可交换使用，其中组分经布置，这样既使得组分功能正常又使得组分的至少一种可以介导对于其他组分的至少一种所施加的功能。作为说明，如果响应于一种或多种转录调控因子存在或缺失，转录调控序列控制编码序列转录水平，那么转录调控序列如启动子可有效连接至编码序列。转录调控序列一般以顺式与编码序列有效连接，但无需直接邻近编码序列。举例来说，增强子是有效连接至编码序列的转录调控序列，虽然它们不是邻接的。

相对于融合多肽，术语“有效地连接”可以指的是如下事实：每个组分在与其他组分的连接状态下进行与其在未这样连接的情况下所进行的功能相同的功能。举例来说，相对于ZFP DNA结合结构域融合至活化结构域的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFP DNA结合结构域能够结合它的靶位点和/或它的结合位点，同时活化结构域能够上调基因表达，那么ZFP DNA结合结构域和活化结构域是有效连接的。相对于ZFP DNA结合结构域融合至裂解结构域的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFP DNA结合结构域能够结合它的靶位点和/或它的结合位点，同时裂解结构域能够在靶位点附近裂解DNA，那么ZFPDNA结合结构域和裂解结构域是有效连接的。

蛋白质、多肽或核酸的“功能片段”是序列不同于全长蛋白质、多肽或核酸，但仍保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段可以拥有比对应天然分子更多、更少或相同数量的残基，和/或可以包含一种或多种氨基酸或核酸取代物。用于测定核酸功能(例如，编码功能，可杂交另一核酸的能力)的方法在本领域是众所周知的。类似地，确定蛋白质功能的方法是熟知的。举例来说，多肽的DNA结合功能可以例如通过过滤结合、电泳迁移位移或免疫沉淀实验来测定。DNA裂解可以通过凝胶电泳来分析。参见Ausubel等人，同上文。蛋白质可与另一蛋白质相互作用的能力可以通过例如共免疫沉淀、双杂交实验或基因和生物化学两者的互补作用来测定。参见例如Fields等人(1989)Nature340:245-246；美国专利号5,585,245和PCT WO 98/44350。

“载体”能够将基因序列传递至靶细胞。典型地，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够引导所关注基因的表达并且可将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，此术语包括克隆，和表达媒介物，以及整合载体。

“安全港”基因座是基因组内的基因座，其中基因可插入而对于宿主细胞没有任何有害效应。最有利的是所插入基因序列的表达不受来自相邻基因的任何通读表达干扰的安全港基因座。由核酸酶靶向的安全港基因座的非限制实例包括CCR5、CCR5、HPRT、AAVS1、Rosa和白蛋白。参见例如美国专利号7,951,925和8,110,379；美国公布号20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和美国临时申请号61/823,689)

核酸酶

本文描述包含核酸酶的组合物，所述核酸酶例如适用于将编码功能性凝血因子(例如因子VIII和/或因子IX)蛋白质的序列整合于来自患有甲型或乙型血友病的受试者或在所述受试者体内的细胞的基因组中的核酸酶。在某些实施方案中，核酸酶是天然存在的。在其他实施方案中，核酸酶非天然存在的，即，在DNA-结合结构域和/或裂解结构域中工程化。举例来说，可改变天然存在核酸酶的DNA-结合结构域以结合至选定靶位点(例如，已经工程化以结合至不同于同源结合位点的大范围核酸酶)。在其他实施方案中，核酸酶包含异源DNA-结合和裂解结构域(例如，锌指核酸酶；TAL-效应结构域DNA结合蛋白；具有异源裂解结构域的大范围核酸酶DNA-结合结构域)和/或使用工程化单一引导RNA的CRISPR/Cas系统)。

A.DNA-结合结构域

任何DNA-结合结构域可用于本文公开的组合物和方法中，包括但不限于锌指DNA-结合结构域、TALE DNA结合结构域、CRISPR/Cas核酸酶的DNA-结合部分，或来自大范围核酸酶的DNA-结合结构域。

在某些实施方案中，核酸酶是天然存在或工程化(非天然存在的)大范围核酸酶(归巢内切核酸酶)。示例性归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。它们的识别序列是已知的。还参见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等人(1997)Nucleic AcidsRes.25:3379-3388；Dujon等人(1989)Gene 82:115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)TrendsGenet.12:224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和the New England Biolabscatalogue。工程化大范围核酸酶描述于例如美国专利公布号20070117128中。归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA-结合结构域可在核酸酶的总体情况下改变(即，使得核酸酶包括同源裂解结构域)或可融合至异源裂解结构域。来自大范围核酸酶的DNA-结合结构域还可展现核酸酶活性(例如，cTALEN)。

在其他实施方案中，DNA-结合结构域包括天然存在或工程化(非天然存在的)TAL效应DNA结合结构域。参见例如美国专利号8,586,526，以引用的方式整体并入本文。黄单孢菌属的植物病原菌已知在重要农作物中导致许多疾病。黄单孢菌属的致病性取决于保守类型III分泌(T3S)系统，其将超过25种不同效应蛋白质注入植物细胞中。在这些注入蛋白质之中的是转录活化剂样(TAL)效应物，其模拟植物转录活化剂并且操纵植物转录组(参见Kay等人(2007)Science318:648-651)。这些蛋白质含有DNA结合结构域和转录活化结构域。最好表征的TAL-效应物中的一种是来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变型的AvrBs3(参见Bonas等人(1989)Mol Gen Genet 218:127-136和WO2010079430)。TAL-效应物含有串联重复序列的集中结构域，每个重复序列含有大约34个氨基酸，所述重复序列对于这些蛋白质的DNA结合特异性是关键性的。另外，其含有核定位序列和酸性转录活化结构域(关于综述，参见Schornack S,等人(2006)J PlantPhysiol 163(3):256-272)。另外，在植物病原细菌青枯菌中，已经发现称做brg11和hpx17的两种基因，所述基因与青枯菌生物变型1菌株GMI1000和生物变型4菌株RS1000中的黄单孢菌的AvrBs3家族同源(参见Heuer等人(2007)Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384)。这些基因在核苷酸序列上彼此98.9％相同但是不同之处在于在hpx17的重复结构域中缺失1,575个碱基对。然而，两种基因产物与黄单孢菌属的AvrBs3家族蛋白质具有小于40％序列同一性。参见例如美国专利号8,586,526，以引用的方式整体并入本文。

这些TAL效应物的特异性取决于在串联重复序列中发现的序列。重复序列包含大约102个碱基对并且重复序列通常彼此91-100％同源(Bonas等人，同前)。重复序列的多态性通常位于位置12和13并且在位置12和13处的高变双残基(重复可变双残基或RVD区域)的同一性与TAL-效应物的靶序列中的邻接核苷酸的同一性之间似乎存在一一对应的关系(参见Moscou和Bogdanove,(2009)Science 326:1501和Boch等人(2009)Science 326:1509-1512)。实验上，已经确定这些TAL-效应物的DNA识别的天然代码以使得位置12和13处的HD序列(重复可变双残基或RVD)导致a结合至胞嘧啶(C)，NG结合至T，NI结合至A、C、G或T，NN结合至A或G，和ING结合至T。这些DNA结合重复序列已经以新的组合和多个重复序列来组装成蛋白质，制得人工转录因子，所述因子能够与新的序列相互作用并且活化植物细胞中的非内源性报道基因的表达(Boch等人，同前)。工程化TAL蛋白质已经连接至FokI裂解半结构域以产生TAL效应结构域核酸酶融合(TALEN)，包括具有非典型RVD的TALEN。参见，例如美国专利号8,586,526。

在一些实施方案中，TALEN包含内切核酸酶(例如，FokI)裂解结构域或裂解半结构域。在其他实施方案中，TALE-核酸酶是兆TAL。这些兆TAL核酸酶是包含TALE DNA结合结构域和大范围核酸酶裂解结构域的融合蛋白。大范围核酸酶裂解结构域作为单体来起作用并且不需要二聚化以获得活性。(参见Boissel等人(2013)Nucl Acid Res:1-13,doi:10.1093/nar/gkt1224)。

在更进一步实施方案中，核酸酶包括紧凑TALEN。这些核酸酶是将TALE DNA结合结构域连接至TevI核酸酶结构域的单链融合蛋白。融合蛋白可充当由TALE区域定位的切口酶，或可产生双链断裂，取决于TALE DNA结合结构域相对于TevI核酸酶结构域安置的位置(参见Beurdeley等人(2013)Nat Comm:1-8DOI:10.1038/ncomms2782)。另外，核酸酶结构域还可展现DNA-结合功能。任何TALEN可与具有一个或多个兆TALE的额外TALEN(例如，一种或多种TALEN(cTALEN或FokI-TALEN)组合使用。

在某些实施方案中，DNA结合结构域包括锌指蛋白。优选地，锌指蛋白是非天然存在的，因为它经过工程化以结合至选定靶位点。参见例如Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)NatureBiotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公布号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，以引用方式全部并入本文。

与天然存在的锌指蛋白相比，工程化的锌指结合结构域可具有新的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包括，例如使用包括三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，在其中每个三联体或四联体核苷酸序列与锌指的一个或多个氨基酸序列相关，该锌指结合具体的三联体或四联体序列。参见，例如共有的美国专利6,453,242和6,534,261，该专利以引用的方式全部并入本文。

包括噬菌体展示和双杂交系统的示例性选择方法公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759以及6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO00/27878；WO 01/88197以及GB 2,338,237中。另外，已经在例如共有的WO 02/077227中描述了用于锌指结合结构域的结合特异性增强。

另外，如这些和其他参考文献中所公开，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何合适接头序列，包括例如5个或更多个氨基酸长度的接头来连接在一起。关于6个或更多个氨基酸长度的示例性接头序列，还参见美国专利号6,479,626；6,903,185；和7,153,949。本文描述的蛋白质可以包括单独蛋白质锌指之间适合接头的任何组合。

靶位点的选择；ZFP和设计并构建融合蛋白(和编码所述蛋白质的多核苷酸)的方法为本领域技术人员已知并且详细描述于美国专利号6,140,081；5,789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496中。

B.裂解结构域

任何合适裂解结构域可有效地连接至DNA-结合结构域以形成核酸酶，诸如锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas核酸酶系统。参见例如美国专利号7,951,925；8,110,379和8,586,526；美国公布号20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和美国临时申请号61/823,689。

如以上提及，裂解结构域可与DNA-结合结构域异源，例如锌指DNA-结合结构域和裂解结构域来自核酸酶或TALEN DNA-结合结构域和裂解结构域，或大范围核酸酶DNA-结合结构域和裂解结构域来自不同核酸酶。异源裂解结构域可从任何内切核酸酶或外切核酸酶获得。可以从其中得到裂解结构域的示例性的内切核酸酶包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见例如2002-2003Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA；和Belfort等人(1997)Nucleic AcidsRes.25:3379-3388。裂解DNA的其他酶是己知的(例如S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰腺DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO核酸内切酶；还参见Linn等人(编)Nucleases,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1993)。这些酶(或其功能片段)的一种或多种可以用作裂解结构域和裂解半结构域的来源。

类似地，裂解半结构域可以从任何核酸酶或其部分中得到，如上所阐述，该裂解半结构域或其部分需要用于裂解活性的二聚作用。通常地，如果融合蛋白包含裂解半结构域，那么裂解需要两个融合蛋白。可替代地，可以使用单个包含两个裂解半结构域的蛋白质。两个裂解半结构域可以从相同内切核酸酶(或其功能片段)中得到，或每个裂解半结构域可以从不同内切核酸酶(或其功能片段)中得到。另外，两个融合蛋白的靶位点是优选地相对于彼此布置的，这样使得两个融合蛋白与它们各自的靶位点的结合将裂解半结构域放置于使得裂解半结构域例如通过二聚作用来形成功能裂解结构域的彼此空间定位中。因此，在某些实施方案中，靶位点的近侧通过5至8个核苷酸或通过15至18个核苷酸来分开。然而任何数目的核苷酸或核苷酸对可以介于两个靶位点之间(例如，从2至50个核苷酸对或更多)。通常地，裂解的位点位于靶位点之间。

限制核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中且能够以序列特异性方式结合DNA(在识别位点处)，且在结合位点处或附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型)在远离识别位点的位点处裂解DNA且具有可分开的结合结构域和裂解结构域。例如，IIS型酶FokI在距其于一条链上的识别位点9个核苷酸处，并且在距其于另一条链上的识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链裂解。参见例如美国专利5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的裂解结构域(或裂解半结构域)以及一个或多个锌指结合结构域，该锌指结合结构域可能是或可能不是工程化的。

裂解域与结合结构域分离的示例性IIS型限制酶是Fok I。这个具体的酶以二聚体的形式起作用。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。因此，对本公开内容来说，认为用于公开融合蛋白中的Fok I酶部分是裂解半结构域。因此，对于使用锌指FokI融合体来靶向双链裂解和/或靶向取代细胞序列，可以使用两个融合蛋白(每个该融合蛋白包含Fok I裂解半结构域)来重新构成催化活性的裂解结构域。可替代地，也可以使用包含锌指结合结构域和两个Fok I裂解半结构域的单个多肽分子。在本公开内容别处提供了使用锌指Fok I融合体来靶向裂解和靶向序列变化的参数。

裂解结构域或裂解半结构域可以是蛋白质的任何部分，该蛋白质保留裂解活性或保留多聚(例如，二聚)以形成功能裂解结构域的能力。

示例性的IIS型限制性酶描述于国际公布WO 07/014275中，该公布以引用的方式全部并入本文。额外的限制性酶也包含独立的结合和裂解结构域，并且这些酶是本公开内容涵盖的。参见例如Roberts等人(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。

在某些实施方案中，裂解结构域包括最大限度地减少或防止同源二聚化的一种或多种工程化裂解半结构域(也称为二聚化结构域突变体)，如例如美国专利公布号20050064474；20060188987；20070305346和20080131962所描述，其公开内容以引用方式全部并入本文中。在Fok I的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537以及538处的氨基酸残基全部是用于影响Fok I裂解半结构域二聚的靶。

形成专性异源二聚体的Fok I的示例性工程化裂解半结构域包括如下对，在该对中第一种裂解半结构域包括在Fok I的位置490和538处的氨基酸残基的突变，并且第二种裂解半结构域包括在氨基酸残基486和499处的突变。

因此，在一个实施方案中，490处的突变用Lys(K)替换Glu(E)；在538处的突变用Lys(K)替换Iso(I)；486处的突变用Glu(E)替换Gln(Q)；并且位置499处的突变用Lys(K)替换Iso(I)。更确切地说，本文描述的工程化裂解半结构域通过在一个裂解半结构域中位置490(E→K)和538(I→K)突变以产生指定的“E490K：I538K”工程化裂解半结构域，以及通过在另一裂解半结构域中位置486(Q→E)和499(I→L)突变以产生指定的“Q486E：I499L”工程化裂解半结构域来制备。本文描述的工程化裂解半结构域是专性异源二聚突变体，在该突变体中异常裂解被减至最低或消除。参见例如美国专利号7,914,796和8,034,598，其公开内容出于所有目的以引用方式全部并入。在某些实施方案中，工程化裂解半结构域包含在位置486、499以及496(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如在位置486处用Glu(E)残基替换野生型Gln(Q)残基、在位置499处用Leu(L)残基替换野生型Iso(I)残基以及在位置496处用Asp(D)或Glu(E)残基(也分别称为“ELD”和“ELE”结构域)替换野生型Asn(N)残基的突变。在其他实施方案中，工程化裂解半结构域包含在位置490、538以及537(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如在位置490处用Lys(K)残基替换野生型Glu(E)残基、在位置538处用Lys(K)残基替换野生型Iso(I)残基以及在位置537处用Lys(K)残基或Arg(R)残基(也分别称为“KKK”和“KKR”结构域)替换野生型His(H)残基的突变。在其他实施方案中，工程化裂解半结构域包含在位置490和537(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如在位置490处用Lys(K)残基替换野生型Glu(E)残基以及在位置537处用Lys(K)或Arg(R)残基(也分别称为“KIK”和“KIR”结构域)替换野生型His(H)残基的突变。(参见美国专利第8,623,618号)。在其他实施方案中，工程化裂解半结构域包含“Sharkey”和/或“Sharkey’”突变(参见Guo等人(2010)J.Mol.Biol.400(1):96-107)。

本文描述的工程化裂解半结构域可以使用任何适合的方法来制备，例如通过如美国专利号7,888,121；7,914,796；8,034,598和8,623,618中所描述的野生型裂解半结构域(Fok I)位点导向突变发生来制备。

或者，核酸酶可在体内在使用所谓“分裂酶”技术核酸靶位点处组装(参见，例如美国专利公布号20090068164)。这类分裂酶的组分可表达于分开表达构建体中，或可在一个开放解读码组中连接，其中个别组分例如通过自裂解2A肽或IRES序列来分开。组分可为个别锌指结合结构域或大范围核酸酶核酸结合结构域的结构域。

核酸酶可在使用之前针对活性来筛选，例如在基于酵母的染色体系统中，如WO2009/042163和20090068164所描述。核酸酶表达构建体可使用在本领域中已知的方法容易地设计。参见例如美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；和国际公布WO 07/014275。核酸酶的表达可在组成型启动子或可诱导启动子的控制下，例如在蜜三糖和/或半乳糖存在下活化(去抑制)并且在葡萄糖存在下被抑制的半乳糖激酶启动子。

在某些实施方案中，核酸酶包括CRISPR/Cas系统。编码系统的RNA组分的CRISPR(集群规则间隔短旋转对称重复序列)基因座，和编码蛋白质的cas(CRISPR相关联)基因座(Jansen等人2002.Mol.Microbiol.43:1565-1575；Makarova等人2002.Nucleic Acids Res.30:482-496；Makarova等人2006.Biol.Direct 1:7；Haft等人2005.PLoSComput.Biol.1:e60)构成CRISPR/Cas核酸酶系统的基因序列。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR-相关联(Cas)基因的组合以及能够设计CRISPR-介导核酸裂解的特异性的非编码RNA成分。

II型CRISPR是最好表征的系统之一并且在四个相继步骤中进行靶向DNA双链断裂。首先，两个非编码RNA，前crRNA阵列和tracrRNA，从CRISPR基因座转录。其次，tracrRNA杂交至前-crRNA的重复序列区域并且介导将前-crRNA处理至含有个别间隔序列的成熟crRNA。第三，经由crRNA上的间隔序列与靶DNA上的原型间隔序列相邻基序(PAM)附近的原型间隔序列之间的Watson-Crick碱基配对，成熟crRNA:tracrRNA复合物将Cas9引导至靶DNA，这是靶识别的附加要求。最后，Cas9介导靶DNA的裂解以产生原型间隔序列内的双链断裂。CRISPR/Cas系统的活动包括三个步骤：(i)将外来DNA序列插入CRISPR阵列以阻止将来攻击，这是称为‘适应’的过程，(ii)表达相关蛋白质，以及表达并处理阵列，随后(iii)RNA-介导干扰外来核酸。因此，在细菌细胞中，多个所谓‘Cas’蛋白质涉及CRISPR/Cas系统的天然功能并且在诸如插入外来DNA等的功能中发挥作用。

在某些实施方案中，Cas蛋白质可为天然存在Cas蛋白质的“功能衍生物”。原生序列多肽的“功能衍生物”是具有与原生序列多肽相同定性生物特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于原生序列的片段和原生序列多肽和其片段的衍生物，只要其具有与相应原生序列多肽相同的生物活性。在本文中涵盖的生物活性是功能衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、其共价修饰和融合。Cas多肽或其片段的合适衍生物包括但不限于Cas蛋白质或其片段的突变体、融合、共价修饰。Cas蛋白质，包括Cas蛋白质或其片段，以及Cas蛋白质或其片段的衍生物，可从细胞获得或化学合成或通过这两种程序的组合获得。细胞可为天然产生Cas蛋白质的细胞，或天然产生Cas蛋白质并且遗传工程化以在较高表达水平下产生内源性Cas蛋白质或从外源引入核酸产生Cas蛋白质的细胞，所述核酸编码与内源性Cas相同或不同的Cas。在一些情况下，细胞不天然产生Cas蛋白质并且遗传工程化以产生Cas蛋白质。

靶向安全港和其他基因的示例性CRISPR/Cas核酸酶系统公开于例如美国临时申请号61/823,689中。

因此，核酸酶包含DNA-结合结构域，其特异性结合至需要插入供体(转基因)的任何基因中的靶位点。

靶位点

如以上详细描述，DNA-结合结构域可工程化以结合至任何选定序列，例如在安全港基因座诸如白蛋白中。工程化的DNA-结合结构域与天然存在的DNA-结合结构域相比，可以具有新的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包括，例如使用包括三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，在其中每个三联体或四联体核苷酸序列与锌指的一个或多个氨基酸序列相关，该锌指结合具体的三联体或四联体序列。参见，例如共有的美国专利6,453,242和6,534,261，该专利以引用的方式全部并入本文。也可进行TAL-效应结构域的合理设计。参见，例如美国专利号8,586,526。

可适用于DNA-结合结构域的包括噬菌体展示和双杂交系统的示例性选择方法公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759以及6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197以及GB2,338,237中。另外，已经在例如共有的WO 02/077227中描述了用于锌指结合结构域的结合特异性增强。

靶位点的选择；核酸酶和设计并构建融合蛋白(和编码所述蛋白质的多核苷酸)的方法为本领域技术人员已知并且详细描述于美国专利申请公布号20050064474和20060188987中，所述公布以引用方式全部并入本文中。

另外，如这些和其他参考文献中所公开，DNA结合结构域(例如多指锌指蛋白)可使用任何合适接头序列，包括例如5个或更多个氨基酸长度的接头来连接在一起。关于6个或更多个氨基酸长度的示例性接头序列，参见例如美国专利号6,479,626；6,903,185；和7,153,949。本文描述的蛋白质可以包括蛋白质的单独DNA结合结构域之间适合接头的任何组合。还参见美国专利号8,586,526。

为了经由靶向插入编码功能因子VIII和/或因子IX蛋白质的序列来治疗血友病，受试者的基因组中的任何所需插入位点用核酸酶裂解，所述核酸酶刺激携带因子VIII和/或因子IX编码序列的供体多核苷酸的靶向插入。核酸酶的DNA-结合结构域可靶向基因组中的任何所需位点。在某些实施方案中，核酸酶的DNA-结合结构域靶向内源性安全港基因座，例如内源性白蛋白基因座。

在某些实施方案中，如图6A和6B示出的一对二聚化锌指核酸酶用于裂解白蛋白基因以促进靶向整合因子IX供体。ZFN包含具有表1示出的识别螺旋区域的DNA-结合结构域和工程化FokI裂解结构域以使得ZFN形成专性异源二聚体(例如，所述对的一个成员包含“ELD”FokI结构域并且所述对的另一个成员包含“KKR”FokI结构域。

还提供与本文描述ZFN具有同源性或同一性的ZFN，包括但不限于具有至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％序列同源性或同一性的ZFN序列。此外，应了解通常对于识别螺旋区域外部的残基确定同源性，包括但不限于FokI结构域、接头结构域、锌指骨架残基(例如，识别螺旋区域外部的任何残基)。因为可使用任何锌指骨架(环境)和/或裂解结构域，所以可存在识别螺旋区域锌指残基外部的同源性的显著变化。

供体序列

为了治疗血友病，供体序列(还称为“外源性序列”或“供体”或“转基因”)包含编码功能凝血因子蛋白质的序列或其一部分，以便在整合供体之后产生编码并表达功能凝血因子蛋白质的序列。凝血因子蛋白质转基因的非限制实例包括因子VIII和/或因子IX，包括这些蛋白质的功能片段。在某些实施方案中，因子VIII蛋白质的B-结构域缺失。参见例如Chuah等人(2003)101(5):1734-1743。在其他实施方案中，转基因包含编码功能因子IX蛋白质的序列，或其一部分，以便在整合供体之后产生编码并表达功能因子IX蛋白质的序列。

供体分子可插入内源性基因中以使得所有、一些或没有内源性基因得以表达。举例来说，包含如本文描述的功能凝血因子蛋白质(例如，因子VIII和/或因子IX)序列的转基因可插入内源性白蛋白基因座以使得一些或没有内源性白蛋白与转基因一起表达。

供体(转基因)序列可在表达融合蛋白(例如，核酸酶)之前、同时或之后引入细胞。供体多核苷酸可含有与基因组序列的足够同源性(连续或不连续区域)以支持在它与和它带有同源性的基因组序列之间的同源重组(或同源介导修复)或，替代地，供体序列可经由非HDR机制(例如，NHEJ供体捕获)来整合，在此情况下供体多核苷酸(例如，载体)不需要含有与细胞染色质中的所关注区域同源的序列。参见例如美国专利号7,888,121和7,972,843和美国专利公布号20110281361；20100047805和20110207221。

供体多核苷酸可为DNA或RNA、单链、双链或部分单链和部分双链并且可以线性或环状(例如，小环)形式引入细胞。参见例如美国专利公布号20100047805、20110281361、20110207221。如果以线性形式引入，那么供体序列的末端可通过为本领域技术人员已知的方法来保护(例如，避免核酸外切降解)。举例来说，一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3’末端且/或自身互补寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见例如Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:4959-4963；Nehls等人(1996)Science 272:886-889。用于保护外源多核苷酸免受降解的另外方法包括但不限于添加末端氨基和使用修饰的核苷酸间键联，例如像硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。可将多核苷酸引入到细胞中作为载体分子的一部分，所述载体分子具有额外序列例如像复制起点、启动子和编码抗生素耐药性的基因。此外，供体多核苷酸可以裸核酸形式，以与试剂诸如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸形式引入，或可通过病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒)来递送。

在一些实施方案中，供体可插入以使得其表达通过整合位点处的内源性启动子(例如，在供体整合至患者的白蛋白基因座中时的内源性白蛋白启动子)来驱动。在此等情况下，转基因可缺少驱动其表达的控制元件(例如，启动子和/或增强子)(例如，还被称为“无启动子构建体”)。但是，显然在其他情况下供体可包含在整合后驱动功能性蛋白质表达的启动子和/或增强子，例如组成型启动子或可诱导或组织特异性(例如，肝脏或血小板特异性)启动子。供体序列可特异性整合至任何选定靶位点。

当白蛋白序列(内源性或转基因的一部分)与转基因一起表达时，白蛋白序列可为全长序列(野生型或突变型)或部分序列。优选地白蛋白序列是功能性的。这些全长或部分白蛋白序列的功能的非限制实例包括增加由转基因(例如，治疗性基因)表达的多肽的血清半衰期且/或充当载体。

此外，虽然并非为表达所必需的，外源性序列还可包括转录或翻译调控序列，例如，启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽和/或多聚腺苷酸化信号的序列。

任何供体序列可包括以下修饰中的一个或多个：密码子优化(例如，人密码子)和/或添加一个或多个糖基化位点。参见例如McIntosh等人(2013)Blood(17):3335-44。

递送

核酸酶、编码这些核酸酶的多核苷酸、供体多核苷酸和包含本文所述蛋白质和/或多核苷酸的组合物可在体内或离体以任何合适手段递送。

如本文描述的递送核酸酶的方法描述于例如美国专利号8,586,526；6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824中，其公开内容以引用的方式全部并入本文。如本文描述的核酸酶和/或供体构建体还可使用含有编码锌指蛋白、TALEN蛋白质和/或CRISPR/Cas系统中的一个或多个的序列的载体来递送。可以使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体以及腺相关病毒载体等。还参见美国专利号6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824，所述专利以引用的方式全部并入本文。此外，显然任何这些载体可包含所需要的序列中的一个或多个。因此，在将一种或多种核酸酶和供体构建体引入细胞中时，可在相同载体或不同载体上携带核酸酶和/或供体多核苷酸。当使用多个载体时，每个载体可以包含编码一个或多个核酸酶和/或供体构建体的序列。在某些实施方案中，一个载体用于携带转基因和核酸酶。在其他实施方案中，使用两个载体(相同或不同载体类型)，其中一个载体携带核酸酶(例如，例如具有2A肽的ZFN对的左和右ZFN)并且一个载体携带转基因。在更进一步实施方案中，使用三个载体，其中第一个载体携带核酸酶对的一个核酸酶(例如，左ZFN)，第二个载体携带核酸酶对中的另一个核酸酶(例如，右ZFN)并且第三个载体携带转基因。参见图2。

供体和/或核酸酶可以任何合适浓度使用。在某些实施方案中，供体和分开核酸酶载体以相同浓度使用。在其他实施方案中，供体和分开核酸酶载体以不同浓度使用，例如，一个载体比另一个载体多2、3、4、5、10、15、20或更大倍(例如，供体载体比核酸酶载体更多。举例来说，一种核酸酶载体(或多种核酸酶载体)和供体载体可以约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19或在一些情况下约1:20的比率来使用。在一些实施方案中，第一核酸酶载体、不同于第一核酸酶载体的第二核酸酶载体和供体载体可以约1:1:1、约1:1:2、约1:1:3、约1:1:4、约1:1:5、约1:1:6、约1:1:7、约1:1:8、约1:1:9、约1:1:10、约1:1:11、约1:1:12、约1:1:13、约1:1:14、约1:1:15、约1:1:16、约1:1:17、约1:1:18、约1:1:19或在一些情况下约1:1:20的比率来使用。在示例性实施方案中，第一核酸酶载体、不同于第一核酸酶的第二核酸酶载体，和供体载体以约1:1:8的比率使用。当AAV载体用于递送时，例如，包括供体和/或核酸酶的病毒载体可在约1x 10⁸与约1x 10¹⁵载体基因组/kg/剂量之间(例如，细胞或动物)。

常规基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码核酸酶和供体构建体的核酸引入细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸核酸和与如脂质体或泊洛沙姆的递送媒介物复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，在递送至细胞中之后，其具有游离基因或整合的基因组。关于体内递送工程化DNA-结合蛋白和包含这些结合蛋白的融合蛋白的综述，参见例如，Rebar(2004)Expert Opinion Invest.Drugs 13(7):829-839；Rossi等人(2007)Nature Biotech.25(12):1444-1454以及一般基因递送参考文献诸如Anderson,Science 256:808-813(1992)；Nabel&Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani&Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993)；Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature 357:455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995)；Kremer&Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995)；Haddada等人,于Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler和(编辑)(1995)中；和Yu等人,Gene Therapy 1:13-26(1994)。

核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂转染、微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸偶联物、裸DNA、人工病毒颗粒以及DNA的试剂增强吸收。使用例如Sonitron2000系统(Rich-Mar)的超声穿孔也可以用于核酸递送。

额外示例性的核酸递送系统包括由AmaxaBiosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)、BTX MolecularDelivery Systems(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics Inc(参见例如U.S.6,008,336)提供的那些。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386；4,946,787；和4,897,355中)并且脂转染试剂有市售(例如Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适用于多核苷酸有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些。

制备脂质:核酸复合物，包括靶向脂质体诸如免疫脂质复合物，为本领域技术人员熟知(参见，例如，Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等人Cancer Gene Ther.2:291-297(1995)；Behr等人,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等人,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等人,Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等人,Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。

额外的递送方法包括使用将待递送的核酸封装至EnGeneIC递送媒介物(EDV)中。这些EDV使用双特异性抗体特异性地向靶组织递送，其中该抗体的一个臂具有对于靶组织的特异性，并且另一个臂具有对于EDV的特异性。抗体将EDV带至靶细胞表面，然后通过胞吞作用将EDV带入细胞中。当在细胞中时，将释放内含物(参见MacDiarmid等人(2009)Nature Biotechnology 27(7):643)。

使用基于RNA或DNA病毒的系统递送核酸利用用于使病毒靶向体内特定细胞以及使病毒有效载荷迁移至核中的高度进展的方法。病毒载体可直接向患者施用(体内)或它们可用于体外处理细胞，且接着向患者施用修饰的细胞(离体)。用于递送核酸酶和/或供体的常规基于病毒的系统包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关、痘苗和单纯性疱疹病毒载体用于基因转移。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法使整合在宿主基因组中成为可能，从而常导致插入的转基因的长期表达。另外，已在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

逆转录病毒的趋向性可通过并入外来包膜蛋白质、扩增靶细胞的潜在靶群体来改变。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒效价的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体包含封装能力高达6-10kb外来序列的顺式作用长末端重复序列。最小顺式作用LTR就足以用于载体的复制和封装，其接着用于将治疗基因整合至靶细胞中以提供持久的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)的载体及其组合(参见，例如Buchscher等人,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等人,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfelt等人,Virol.176:58-59(1990)；Wilson等人,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等人,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。

在瞬时表达优选的应用中，可使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率且不需要细胞分裂。用所述载体已获得高效价和表达水平。此载体可在相对简单系统中大量产生。腺病毒相关病毒(“AAV”)载体还用于向细胞转导靶核酸，例如，体外产生核酸和肽，和体内和离体基因治疗程序(参见，例如，West等人,Virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)。构建重组AAV载体描述于许多公布中，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984)；和Samulski等人,J.Virol.63:03822-3828(1989)。

至少六种病毒载体方法当前可用于临床试验中的基因转移，其利用涉及通过插入辅助细胞系的基因来补充缺陷载体以产生转导剂的方法。

pLASN和MFG-S是已被用于临床试验中的逆转录病毒载体的实例(Dunbar等人,Blood 85:3048-305(1995)；Kohn等人,Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等人,PNAS 94:22 12133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因治疗试验中的第一种治疗性载体。(Blaese等人,Science 270:475-480(1995))。已经观察到MFG-S包装载体的50％或更大的转导效率。(Ellem等人,Immunol Immunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等人,Hum.Gene Ther.1:111-2(1997)。

重组腺相关病毒载体(rAAV)是基于缺陷性和非病原性细小病毒腺相关2型病毒的有前途的替代性基因递送系统。所有载体都源于仅保留侧接转基因表达盒的AAV 145bp碱基对倒置末端重复序列的质粒。归因于整合至转导的细胞的基因组中的高效基因转移和稳定转基因递送是此载体系统的关键特征。(Wagner等人,Lancet 351:91171702-3(1998),Kearns等人,Gene Ther.9:748-55(1996))。其他AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9和AAVrh10或假型AAV诸如AAV2/8、AAV8.2、AAV2/5和AAV2/6和任何新AAV血清型也可根据本发明来使用。

复制缺陷重组腺病毒载体(Ad)可以高效价产生并且容易感染许多不同细胞类型。大多数腺病毒载体被工程化以使转基因替代AdE1a、E1b和E3基因；随后使复制缺陷性载体在反式提供缺失的基因功能的人293细胞中增殖。Ad载体可在体内转导多种类型的组织，包括非分裂性分化细胞，如见于肝、肾和肌肉组织中的细胞。常规Ad载体具有大携带能力。在临床试验中使用Ad载体的实例涉及通过肌肉内注射来抗肿瘤免疫接种的多核苷酸疗法(Sterman等人,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。在临床试验中使用腺病毒载体来转移基因的额外实例包括Rosenecker等人,Infection 24:1 5-10(1996)；Sterman等人,Hum.Gene Ther.9:7 1083-1089(1998)；Welsh等人,Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)；Alvarez等人,Hum.Gene Ther.5:597-613(1997)；Topf等人,Gene Ther.5:507-513(1998)；Sterman等人,Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)。

封装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这类细胞包括293细胞，其封装腺病毒，和ψ2细胞或PA317细胞，其封装逆转录病毒。用于基因疗法的病毒载体通常由生产细胞系产生，所述细胞系将核酸载体封装至病毒颗粒中。载体通常含有封装并随后整合至宿主中所需要的减少病毒序列(如果可适用)，其他病毒序列由编码待表达的蛋白质的表达盒替换。缺失的病毒功能由封装细胞系以反式提供。举例来说，用于基因疗法的AAV载体通常只具有来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，所述序列为封装并整合至宿主基因组中所需要。病毒DNA封装于细胞系中，其含有编码其他AAV基因，即rep和cap的辅助质粒，但是缺少ITR序列。细胞系还用作为辅助病毒的腺病毒感染。辅助病毒促进复制AAV载体和从辅助质粒表达AAV基因。由于缺少ITR序列，辅助质粒未大量地封装。以腺病毒的污染可通过例如热处理来减少，与AAV相比，腺病毒对于热处理更敏感。

在许多基因治疗应用中，需要基因治疗载体以针对具体组织类型的高度特异性来递送。因此，病毒载体通常被修饰来通过在病毒外表面上以与病毒外壳蛋白的融合蛋白形式表达配体来对给定细胞类型具有特异性。选择配体以对已知存在于目标细胞类型上的受体具有亲和力。举例来说，Han等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:9747-9751(1995)，报道Moloney鼠白血病病毒可修饰以表达融合至gp70的人调蛋白，并且重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。此原理可扩展至其他病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体并且病毒表达包含细胞表面受体的配体的融合蛋白。举例来说，丝状噬菌体可工程化以展示具有实际上任何选定细胞受体的特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。虽然以上描述主要适用于病毒载体，但是相同原则可施加于非病毒载体。这类载体可工程化以含有有利于由特异性靶细胞吸收的特异性吸收序列。

基因疗法载体可通常通过如下所述的全身性施用(例如静脉内、腹膜内、肌肉内、真皮下或颅内输注)或局部施用向个别患者施用来体内递送。或者，载体可离体递送至细胞，如自个别患者外植的细胞(例如淋巴细胞、骨髓吸出物和组织生检体)或万能供血者造血干细胞中，随后通常在选择已并入载体的细胞之后将细胞再植入受试者中。

含有核酸酶和/或供体构建体的载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)也可直接施用至生物体以便在体内转导细胞。或者，可施用裸DNA。施用是通过通常用于引入分子以最与血液或组织细胞终接触的任何途径，包括但不限于注射、输注、局部施加和电穿孔。施用这类核酸的适合方法是可用的且为本领域技术人员所熟知，且尽管一种以上途径可用于施用特定组合物，但特定途径可常提供比另一途径更直接且更有效的反应。

本文描述的适合于引入多核苷酸(例如核酸酶编码和/或因子VII、因子VIII、因子FIX、因子X和/或因子XI编码)的载体包括非整合慢病毒载体(IDLV)。参见例如Ory等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11382-11388；Dull等人(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zuffery等人(1998)J.Virol.72:9873-9880；Follenzi等人(2000)Nature Genetics25:217-222美国专利公布号2009/054985。

药学上可接受的载体部分地通过所施用的具体组合物以及通过用来施用组合物的具体方法来确定。因此，如下所述，存在可用的药物组合物的广泛多种的适合制剂(例如参见Remington’sPharmaceutical Sciences,第17版,1989)。

显然核酸酶编码序列和供体构建体可使用相同或不同系统来递送。举例来说，核酸酶和供体可由相同载体(例如，AAV)携带。或者，供体多核苷酸可由质粒携带，而一种或多种核酸酶可由不同载体(例如，AAV载体)携带。此外，不同载体可通过相同或不同途径来施用(肌肉内注射、尾静脉注射、其他静脉内注射、腹膜内施用和/或肌肉内注射。载体可同时或任何相继顺序来递送。

因此，在某些实施方案中，本公开包括经由核酸酶介导的因子VIII编码序列的整合来在体内或离体治疗甲型血友病。本公开还包括经由因子IX编码序列的核酸酶介导整合来在体内或离体治疗乙型血友病。类似地，本公开包括分别经由因子VII、因子X或因子XI编码序列的核酸酶介导整合来治疗因子VII缺陷、因子X或因子XI缺陷相关血友病。组合物以有效获得血清、肝脏或靶细胞中的治疗性因子VII、因子VIII、因子IX或因子X多肽的所需浓度的量来施用至人患者。施用可通过多核苷酸递送至所需靶细胞的任何手段。举例来说，涵盖体内和离体方法。静脉内注射至门静脉是优选施用方法。其他体内施用模式包括例如直接注入肝叶或胆管和在肝脏远端的静脉内注射，包括经由肝动脉，直接注入肝实质，经由肝动脉注射，和/或经由胆道系统的逆行注射。离体施用模式包括切除肝细胞或其他肝脏细胞的体外转导，随后将转导、切除肝细胞输注回到人患者的门脉管、肝实质或胆道系统，参见例如，Grossman等人(1994)NatureGenetics,6:335-341。其他施用模式包括编码因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和/或因子XI的转基因的离体核酸酶介导插入患者或同种异体干细胞中的安全港位置。修饰之后，处理细胞然后重新输注至患者体内以治疗血友病。

治疗血友病在本文中仅作为举例来论述，并且应了解其他病状可使用本文公开的方法和组合物来治疗。在一些情况下，方法和组合物可用于治疗血栓性病症。待施用的核酸酶和因子VII、因子VIII、因子IX、因子X或因子XI供体的有效量将在不同患者之间并且根据所关注的治疗性多肽而变化。因此，有效量最好由施用组合物的医师确定并且适当剂量可由本领域普通技术人员容易地确定。允许足够时间来整合并表达(通常例如4-15天)之后，治疗性多肽的血清或其他组织水平的分析和与施用之前的初始水平比较确定是否施用量太低、在正确范围内或太高。在一些实施方案中，可向患者施用单一剂量。在一些实施方案中，可向患者施用多个剂量。在一些实施方案中，可进行本文公开的组合物与其他治疗剂的共同施用。

初始和随后施用的合适方案也可变，但是如果有必要，典型地在初始施用之后进行后续施用。随后施用可以可变时间间隔来施用，所述时间间隔在每天一次至每年一次至每隔几年一次范围内。本领域技术人员应认识到可建议适当免疫抑制技术以便通过递送载体的免疫抑制来避免转导的抑制或阻滞，参见例如，Vilquin等人(1995)HumanGene Ther.6:1391-1401。

离体和体内施用的制剂包括液体或乳化液体中的悬浮液。活性成分经常与药学上可接受并与活性成分相容的赋形剂混合。合适赋形剂包括例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等和其组合。另外，组合物可含有少量辅助物质，诸如，润湿或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂或增强药物组合物的有效性的其他试剂。

以下实施例涉及其中核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)的本公开的示例性实施方案。应了解这只是为了示例并且可使用其他核酸酶，例如具有工程化DNA-结合结构域的寻靶内切核酸酶(大范围核酸酶)和/或天然发生工程化寻靶内切核酸酶(大范围核酸酶)DNA-结合结构域与异源裂解结构域的融合、TALEN和/或包括工程化单一引导RNA的CRISPR/Cas系统。

实施例

实施例1：核酸酶和供体结构

为了靶向人血白蛋白基因座，两个个别ZFN，SBS42906(5-指蛋白质)和SBS43043(6-指蛋白质)被设计成分别以高亲和力和特异性来结合相邻15个碱基对和18个碱基对靶位点。ZFN展示于下表1中。

靶序列中的大写字母表示结合核苷酸并且小写字母表示未结合核苷酸。

表1：白蛋白特异性ZFN

两个ZFN以特定空间定向来结合至DNA上的组合33个碱基对识别序列的严格要求提供了催化在白蛋白基因座中的单一预定位点形成双链断裂(DSB)必不可少的功能特异性。此架构的示意图在图2中示出。两个ZFN各自靶向位于DNA的相反链上的白蛋白基因内含子区域特定序列(核苷酸447–485，相对于转录起始位点)。

FokI核酸酶裂解结构域连接至每个ZFP的羧基末端。参见例如美国专利号7,888,121和8,623,618。实施高度特定功能的Fok1结构域的额外特征是将裂解仅限制于异源二聚体结合事件。这经由使用已经工程化以仅充当异源二聚体的变体Fok1结构域(例如，“ELD/KKR”)来实现。参见例如美国专利号8,623,618。这些专性异源二聚体FokI结构域防止潜在同型二聚体位点处的脱靶裂解，由此进一步增强ZFN特异性。

供体载体构建如下。编码靶向白蛋白内含子1基因座和hF9转基因的ZFN的rAAV2/6载体在图1中示出。对于两个ZFN编码AAV2/6载体，SB-42906和SB-43043(分别表达左和右ZFN)，ZFN表达在肝脏特异性增强子和启动子的控制下，包含人ApoE增强子和人α1-抗-胰蛋白酶(hAAT)启动子(Miao等人.(2000)Mol.Ther.1(6):522-532)。ApoE/hAAT启动子在作为预定靶组织的肝细胞中具有高度活性，但是在其他细胞和组织类型中无活性以防止在非靶组织中ZFN表达和活性。

含有hF9转基因的rAAV2/6供体载体(SB-F9供体)是编码包括外显子2-8的部分hF9cDNA的无启动子构建体。存在F9外显子2剪接受体位点(SA)以允许hF9转基因(外显子2-8)有效剪接至来自白蛋白基因座的成熟mRNA中，不论机制整合为何(NHEJ或HDR；参见例如图3和4)。任选地侧接hF9转基因的是与白蛋白内含子1基因座的裂解位点同源的序列。左同源性臂(LA)含有白蛋白内含子1裂解位点上游的相同序列的280个核苷酸，并且右同源性臂(RA)含有裂解位点下游的相同序列的100个核苷酸。同源性臂用于经由同源介导修复来帮助促进hF9转基因靶向整合于白蛋白内含子1基因座处。选择同源性臂的大小以避免白蛋白基因座中的可抑制靶向整合或转基因表达的重复序列和剪接元件。聚腺苷酸序列从牛生长激素基因得到。使用杆状病毒(Sf9)表达系统，将rAAV载体用衣壳血清型AAV2/6来封装。

实施例2：人原代肝细胞中的核酸酶修饰

涂布之后一天，人原代肝细胞用一种或两种ZFN表达rAAV2/6病毒在0.3E5-9.0E5载体基因组(vg)/细胞的MOI下转导。细胞在第7天收获并且制备基因组DNA和蛋白质以通过miSEQ来进行插入和缺失百分比(插入和/或缺失)分析和使用针对FokI结构域的抗体通过蛋白质印迹来进行ZFN表达分析。

本文描述的ZFN(SBS42906(5-指；左ZFN)和SBS43043(6-指；右ZFN))展示高水平修饰(例如，10-30％之间的插入和缺失)。

另外，人肝癌细胞系(HepG2)用于评估白蛋白基因座处的特异性核酸酶介导整合和整合模式(NHEJ或HDR)。用人血白蛋白ZFN和FIX供体转导的HepG2细胞展示高于背景的较强hFIX分泌(～75ng/ml)，并且通过miSEQ来分析白蛋白特异性基因修饰展示～74％插入和缺失。亚克隆用于基因分型以确定白蛋白基因座处的特定整合和通过NHEJ或HDR的整合模式(图3)。亚克隆还展示较强hFIX分泌(高达350ng/ml)。总体上，在使用通过HDR或NHEJ的单等位基因供体整合的亚克隆之间没有差异。

这些结果展示hFIX可从白蛋白基因座稳定表达，与FIX供体整合模式无关。

在FIX供体稳定整合于白蛋白基因座处之后，hALB-hFIX融合蛋白质mRNA从白蛋白启动子转录。虽然未改变的野生型白蛋白基因的表达产生2.3kb转录物，但是hALB-hFIX融合mRNA较短，为1.7kb(图5A)，与通过NHEJ或HDR的整合模式无关。

我们通过产生具有通过NHEJ或HDR的稳定整合FIX供体的肝癌细胞系HepG2的稳定亚克隆来证明此结论。在用SB-42906、SB-43043和FIX供体转导HepG2细胞之后，我们通过整合特异性基因分型来识别多个亚克隆，这些亚克隆展示通过NHEJ或HDR的FIX供体整合并且展示可通过hFIX ELISA检测出的高(150-350ng/ml)分泌水平的hFIX蛋白质(图5B)。在总mRNA分离和反转录至cDNA之后，我们通过PCR和测序来分析这些亚克隆的转录物。在未修饰对照细胞中，我们只可检测到具有侧接外显子1-8的引物的预期野生型白蛋白转录物(2.3kb)，但是未检测到具有结合至FIX供体的引物的转录物。

在具有整合至白蛋白基因座中的FIX供体并且分泌FIX的三个HepG2亚克隆中，我们检测野生型人血白蛋白转录物和具有结合至白蛋白5’UTR和FIX供体3’UTR的引物的预期hALB-hFIX融合转录物(1.7kb)。这些RT-PCR产物的亚克隆和测序证实它是预期hAlb-hFIX融合mRNA。这暗示在所有三个亚克隆中，FIX供体通过NHEJ或HDR整合于一个白蛋白等位基因中，导致表达功能hALB-hFIX转录物和进一步分泌hFIX蛋白质。其他等位基因的MiSeq分析展示这些亚克隆在白蛋白内含子1中带有10或40个核苷酸(nt)缺失或1个nt插入。尽管这些插入和缺失，细胞如预期产生约一半量的野生型白蛋白转录物和蛋白质作为未修饰对照细胞，证明白蛋白外显子1中的较小插入和缺失对于白蛋白表达没有重大影响。由于在这些亚克隆中未检测到具有结合至白蛋白mRNA的外显子8的引物的其他转录物，我们得出的结论是在hFIX供体整合之后，mRNA剪接只在白蛋白外显子1的剪接供体位点与hF9供体的剪接受体部位之间发生。

总之，我们对于HepG2亚克隆中的核酸酶修饰白蛋白基因座的转录概况的详细分析证明只表达所需hALB-hFIX融合蛋白质mRNA。

成功的靶向整合需要所有三个AAV载体转导同一肝细胞(参见例如，美国临时申请号61/943,865)。我们发现靶向整合的效率取决于ZFN:供体的比率。因此，rAAV编码ZFN载体以1:1比率来配制，并且rAAV编码ZFN:ZFN:hF9供体DNA比率是1:1:8。

实施例3：在人体外脱靶SELEX引导的毒性评估

使用生物信息学方法来识别ZFN作用的潜在脱靶效应，针对如本文描述的ZFN的预定DNA结合位点的最佳拟合匹配来搜索基因组。为了获得每个ZFN的共有偏好结合位点，使用被称为SELEX(通过实验富集的配体的系统性演进)基于亲和力的靶位点选择程序。

简单地说，SELEX实验通过将ZFN的ZFP部分与随机DNA序列池一起孵育，经由亲和色谱来捕获ZFP蛋白质和任何结合DNA序列，然后PCR扩增所结合DNA片段来进行。将这些DNA片段克隆并且测序和比对以确定共有结合偏好。

表1的两个ZFN的15个碱基对和18个碱基对结合位点的每个位置的这些实验得到偏好然后用于针对人基因组中的最相似位点来指导全基因组生物信息学搜索。然后将潜在裂解位点的所得列表排序以优先考虑具有与SELEX得到共有序列的最高相似性的那些位点。识别人基因组中的前40个位点。在这些40个位点中，18个属于标注基因，但是这些位点中只有1个出现于外显子(蛋白质编码)序列内。预计内含子序列处的低水平修饰不影响基因表达或功能。

随后，为了确定是否这些位点由本文描述的核酸酶裂解，人原代肝细胞和人肝癌细胞系HepG2用高剂量(3e5vg/细胞)的SB-42906和SB-43043(均封装为AAV2/6)或作为对照的表达GFP的AAV2/6载体来转导。基因组DNA在转染后7-9天分离，并且将中靶(hALB内含子1基因座)和前40个预测脱靶位点基因座PCR从100ng的基因组DNA扩增(～15,000二倍体基因组)。然后，每个基因座处的修饰水平通过Illumina miSEQ上的成对末端深度测序来确定。成对序列经由开放资源软体包SeqPrep(由Dr.John St.John开发，例如参见Klevegring等人(2014)PLOS One doi:e104417doi.10,1371journal.pone 0104417)来合并。

每个序列针对在所有碱基上≥15的质量评分来过滤，然后映射至人基因组(hg19组件)。映射至不正确基因座的序列从进一步分析中排除。内德勒曼-文施(Needleman,S.B,m and Wunsch,C.D.(1970)J.MolBiol 48(3):443-53)比对在靶扩增子基因组区域与所获得的IlluminaMiseq读取之间进行以映射插入和缺失。比对序列中的插入缺失事件如Gabriel等人(2011)Nature Biotechnology.29(9):816-23所描述来界定，除了长度中的插入和缺失1碱基对也被视为真实插入和缺失以避免少算实际事件以外。

应用描述分析之后，中靶修饰在人原代肝细胞中测量为16.2％插入和缺失并且在HepG2细胞中测量为30.0％插入和缺失。在任一细胞类型中，在任何潜在前40个脱靶位点处，未检测到显著插入和缺失。

这些结果强调ZFN试剂SBS42906和SBS43043在中靶水平(分别为16和30％)下在人原代肝细胞和肝癌细胞中的极好特异性。

实施例4：在体内靶向整合

将如本文描述的核酸酶(和/或编码核酸酶的多核苷酸)和供体和/或包含核酸酶和/或供体的药物组合物施用至人受试者以使得校正FIX转基因整合至受试者的基因组中(例如，在受试者的自身内源性白蛋白基因座的控制下)，由此导致因子IX的肝脏特异性合成。具体地说，根据当前治疗准则接受预防FIX替换疗法(>100剂量)而不产生针对FIX的抑制剂并且对于重组FIX没有过敏症的患有严重乙型血友病(>6出血/年，在未治疗时)的至少18岁龄的男性受试者根据表2示出的以下排程之一给予如本文描述的核酸酶和FIX供体：

表2

*所使用的ZFN1:ZFN2:cDNA供体比率：1:1:8

ZFN1:ZFN2:cDNA供体比率

“SB-FIX”含有作为静脉内剂量施用的三个组分，即三个个别重组腺病毒相关病毒(rAAV)血清型2/6(rAAV2/6)载体：编码SBS42906(称为左ZFN并且在本文中被称为ZFN1)的第一载体(SB-42906)，编码SBS43043(称为右ZFN并且在本文中被称为ZFN2)的第二载体(SB-43043)，和编码DNA修复模板的第三载体(hF9基因供体)，所述模板编码无启动子hF9转基因。

SB-FIX的3个组分(2个核酸酶和供体)例如在一或多个药物组合物中，经由静脉内输注(例如，门静脉)依序和/或同时施用。

任选地受试者(在施用SB-FIX之前、期间和/或之后)用免疫抑制剂诸如糖皮质激素处理以例如减少或消除免疫响应(例如，中和抗体(NAB)响应或对于AAV的免疫响应)。具体地说，患上肝转氨酶增加的受试者给予60mg泼尼龙随后在4-6周内逐渐减少的短暂免疫抑制方案。

受试者针对以下来评估：对于AAV2/6的免疫响应；对于FIX的免疫响应；存在AAV2/6载体DNA；通过血液、唾液、尿液、粪便和精液的PCR来评估白蛋白基因座基因修饰(SB-FIX的修饰位点)的存在；FIX水平从基线的变化；aPTT从基线的变化；使用因子IX替换疗法从基线的任何变化；出血发作频率和/或严重性从基线的任何变化；和肝功能(包括，例如，AST、ALT、胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白水平)。

SB-FIX施用恢复功能性FIX的肝产生。在>1％的正常水平下，用FIX浓缩物预防性治疗的需要减少或消除并且在>5％正常水平下，除了最严重创伤以外的出血大致上减少。因此，FIX cDNA的AAV介导基因转移至肝脏细胞中提供FIX在乙型血友病受试者中的长期产生。

所有本文提到的专利、专利申请以及专利公布特此以引用的方式全部并入。

虽然为了清楚理解，比较详细地用说明和实施例的方式提供了公开内容，但本领域技术人员明显可以实施不背离本公开内容精神或范围的各种改变和改进。因此，前面的描述和实施例不应理解为具有限制性。

Claims

1.一种锌指蛋白，其包含称为并且排序为F1至F5或F1至F6的五个或六个锌指结构域，如在表1的单行中示出。

2.一种融合蛋白，其包含如权利要求1所述的锌指蛋白和野生型或工程化裂解结构域或裂解半结构域。

3.一种多核苷酸，其编码一种或多种如权利要求1或权利要求2所述的蛋白质。

4.一种表达载体，其包含如权利要求3所述的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的表达载体，其中所述载体是AAV载体。

6.如权利要求5所述的表达载体，其中所述AAV载体是AAV2/6载体。

7.一种药物组合物，其包含如权利要求4至6中任一项所述的表达载体。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其包含如权利要求4至6中任一项所述的第一表达载体，所述第一表达载体包含第一多核苷酸，和如权利要求4至6中任一项所述的第二表达载体，所述第二表达载体包含第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是不同的。

9.如权利要求7所述的药物组合物，其包含

(i)包含编码锌指核酸酶的多核苷酸的AAV载体，所述锌指核酸酶包含FokI裂解结构域和包含排序为F1至F5的5个锌指结构域的锌指蛋白质，其中每个锌指结构域包含识别螺旋区域并且其中所述锌指蛋白质的所述识别螺旋区域在表1的第一行中示出(SEQ IDNO:4-8)；

(ii)包含编码锌指核酸酶的多核苷酸的AAV载体，所述锌指核酸酶包含FokI裂解结构域和包含排序为F1至F6的6个锌指结构域的锌指蛋白质，其中每个锌指结构域包含识别螺旋区域并且其中所述锌指蛋白质的所述识别螺旋区域在表1的第二行中示出(SEQ IDNO:9-14)；和

(iii)包含编码因子IX蛋白质的供体的AAV载体。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述第一多核苷酸包含如SEQ ID NO.15的序列或由如SEQ ID NO.15的序列组成并且所述第二多核苷酸包含如SEQ ID NO.16的序列或由如SEQ ID NO.16的序列组成。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其进一步包含供体序列。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述供体序列与表达载体缔合。

13.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述供体序列包含如SEQ ID NO.17的序列或由如SEQ ID NO.17的序列组成。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述表达载体是AAV载体。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述AAV载体是AAV2/6载体。

16.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中至少一种蛋白质结合至细胞中的白蛋白基因。

17.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。

18.一种裂解细胞中的白蛋白基因的方法，所述方法包括：

在使得所述一或多种蛋白质得以表达并且所述白蛋白基因得以裂解的条件下，将一或多种如权利要求4至6中任一项所述的表达载体引入所述细胞中。

19.如权利要求18所述的方法，其进一步包括将供体序列整合至所述裂解的白蛋白基因中。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述供体序列使用AAV载体来引入。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2/6载体。

22.如权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述供体序列编码因子IX(F.IX)蛋白质。

23.如权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。

24.一种治疗患有乙型血友病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求4至6中任一项所述的表达载体或如权利要求7所述的药物组合物，所述表达载体或药物组合物介导编码功能因子IX蛋白质的转基因靶向整合至内源性白蛋白基因中。

25.如权利要求24所述的方法，其中将系统施用至所述患者，所述系统包括：

(iii)包括编码因子IX蛋白质的供体的AAV载体。

26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中静脉内施用所述表达载体或药物组合物和转基因。

27.一种试剂盒，其包括如权利要求4至6中任一项所述的表达载体。

28.如权利要求8或10-17所述的药物组合物，其中所述第一核酸酶、不同于所述第一核酸酶的所述第二核酸酶和所述转基因供体以约1:1:1、约1:1:2、约1:1:3、约1:1:4、约1:1:5、约1:1:6、约1:1:7、约1:1:8、约1:1:9、约1:1:10、约1:1:11、约1:1:12、约1:1:13、约1:1:14、约1:1:15、约1:1:16、约1:1:17、约1:1:18、约1:1:19或约1:1:20的比率提供。

29.如权利要求9所述的药物组合物，其中(i)、(ii)和(iii)以约1:1:1、约1:1:2、约1:1:3、约1:1:4、约1:1:5、约1:1:6、约1:1:7、约1:1:8、约1:1:9、约1:1:10、约1:1:11、约1:1:12、约1:1:13、约1:1:14、约1:1:15、约1:1:16、约1:1:17、约1:1:18、约1:1:19或约1:1:20的比率提供。