CN105814195A

CN105814195A - 层粘连蛋白应用于角膜内皮细胞培养

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Publication number: CN105814195A
Application number: CN201480065134.XA
Authority: CN
Inventors: 小泉范子; 奥村直毅; 木下茂; F·E·克鲁斯; U·施罗泽尔-施瑞哈特
Original assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd; Doshisha Co Ltd; Kyoto Prefectural PUC
Current assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd; Doshisha Co Ltd; Kyoto Prefectural PUC
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2016-07-27
Also published as: EP3074508A1; US20170002318A1; MX2016006915A; EP3074508B1; ES2763433T3; JP6470286B2; US11624053B2; RU2704984C1; JP2020188778A; BR112016011096A2; WO2015080297A1; CA2931280A1; RU2016125225A; JP2019054828A; JP2016539641A

Abstract

本发明提供了培养角膜内皮细胞的方法。更具体而言，本发明提供了用于培养角膜内皮细胞或使其生长的组合物，其包含至少一种由在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白及其片段组成的试剂。具体而言，本发明可包括层粘连蛋白511(α5β1γ1)和层粘连蛋白512(α5β2γ1)。本发明还提供了用于角膜内皮细胞的培养容器，其被本发明的组合物包被。此外，本发明提供了用于培养角膜内皮细胞的方法，包括使用本发明的组合物或容器以培养角膜内皮细胞的步骤。

Description

层粘连蛋白应用于角膜内皮细胞培养

技术领域

本发明涉及层粘连蛋白作为培养角膜内皮细胞培养物或使其生长的组分的用途。具体而言，本发明涉及用于角膜内皮细胞的培养或生长的包含层粘连蛋白的组合物、容器、培养方法等。

背景技术

出生时人角膜内皮细胞以约3000细胞/平方毫米的密度存在。但是，一旦损伤，人角膜内皮细胞不具有再生的能力。因此，角膜内皮细胞被认为难以培养。由于在移植技术中难以培养角膜内皮细胞或使其生长的现状，对角膜内皮的治疗或手术实际上是不可能的。在日本，角膜捐赠短缺，每年国内进行的角膜移植约有1700例，相比之下，约2600名患者在等待角膜移植。

[引用文献列表]

[专利文献]

[PTL1]日本公开No.2011-78370

[PTL2]WO2013/047763

[PTL3]WO2011/024070

[PTL4]WO2010/140464

[非专利文献]

[NPTL1]JournaloftheMedicalSocietyofTohoUniversityVol.56,No.1,Page.39(2009年1月1日)

[NPTL2]NipponGankaGakkaiZasshi[JournalofJapaneseOphthalmologicalSociety]Vol.105,extraedition.Page.196(2001年3月15日)

[NPTL3]JBiolChem.Sep13,2013.[在印刷前以电子文档公开]

[NPTL4]PLoSOne.2013；8(l):e53648.doi:10.1371/journal.pone.0053648.EpubJan7,2013

[NPTL5]CellAdhMigr.Jan-Feb2013；7(1):142-9.doi:10.4161/cam.22125.EpubOct17,2012

[NPTL6]JCellBiochem.Feb15,2007；100(3):545-56.

发明内容

[技术方案]

本申请的发明人已通过发现特定的层粘连蛋白可用于培养角膜内皮并使其生长而完成本发明。因此，本发明提供了以下代表性的项(item)：

(1)用于培养角膜内皮细胞或使其生长的组合物，其包含至少一种由在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白及其片段组成的试剂。

(2)项1的组合物，其中所述层粘连蛋白包含层粘连蛋白511(α5β1γ1)和层粘连蛋白512(α5β2γ1)。

(3)项1或2的组合物，其中所述片段具有角膜内皮细胞的细胞粘附能力。

(4)项1-3中任一项的组合物，其中所述试剂是层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或层粘连蛋白511-E8片段。

(5)项1-4中任一项的组合物，其中所述角膜内皮细胞来自人。

(6)用于培养角膜内皮细胞的培养基，其包含项1-5中任一项的组合物。

(7)用于角膜内皮细胞的培养容器，其包被有项1的组合物。

(8)用于培养角膜内皮细胞的方法，包括使用项1-5中任一项的组合物的步骤。

(9)用于培养角膜内皮细胞的方法，包括使用项6的培养基的步骤。

(10)用于培养角膜内皮细胞的方法，包括使用项7的容器的步骤。

应理解，可结合使用以上提及的特征。在阅读和理解以下提供的必要的对本发明的详述之后，本领域技术人员将理解本发明的其他实施方案和优势。

[发明的有益效果]

本发明提供了使得能够进行角膜内皮细胞(特别是人角膜内皮细胞)的培养、维持及生长的组分。

附图说明

[图1]图1是示出了人角膜内皮细胞中多种层粘连蛋白链的mRNA表达的图。该图从左侧开始示出了分子量标记物、层粘连蛋白α1链、α2链、α3链、α4链、α5链、β1链、β2链、β3链、β4链、γ1链、γ2链和γ3链。

[图2]图2示出了人角膜内皮细胞中多种整联蛋白(integrin)链的mRNA表达。上行从左侧开始示出了整联蛋白α1链、α2链、α3链、α4链、α5链、α6链、α7链、α8链、α9链、α10链、α11链、αE链、αV链和αL链。下行从左侧开始示出了整联蛋白αM链、αX链、αD链、αIIb链、β1链、β2链、β3链、β4链、β5链、β6链、β7链和β8链。

[图3A]图3A-图3C共同示出了通过流式细胞术对人角膜内皮细胞中多种整联蛋白链的表达分析。图3A示出了通过流式细胞术对人角膜内皮细胞中多种整联蛋白链的表达分析。上行从左侧开始示出了整联蛋白α1、α2和α3。下行左侧开始示出了整联蛋白α4、α5和α6。

[图3B]图3B也示出了通过流式细胞术对人角膜内皮细胞中多种整联蛋白链的表达分析。上行从左侧开始示出了整联蛋白αE、αV和αL。下行从左侧开始示出了整联蛋白αM、αX和αIIb(CD41a)。

[图3C]图3C也示出了通过流式细胞术对人角膜内皮细胞中多种整联蛋白链的表达分析。上行从左侧开始示出了整联蛋白αIIb(CD41a)、β1和β2。下行从左侧开始示出了整联蛋白β3、β4和β7。

[图4]图4是示出了层粘连蛋白511和层粘连蛋白521促使人角膜内皮细胞的细胞粘附的图像。上行从左侧开始示出了层粘连蛋白511、层粘连蛋白521和层粘连蛋白211。下行从左侧开始示出了无包被、FNC包被和明胶包被。比例尺为50μm。

[图5]图5是示出了层粘连蛋白511和层粘连蛋白521促进人角膜内皮细胞的细胞粘附的图表。Y轴表示细胞数目(％对照)。X轴从左侧开始表示无包被(对照)、层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白211、FNC包被、明胶包被和层粘连蛋白511-E8片段。

[图6]图6是示出了层粘连蛋白511-E8片段促进人角膜内皮细胞的细胞粘附的图表。Y轴表示细胞数目(％对照)。X轴从左侧开始表示无包被(对照)、层粘连蛋白511-E8片段的每种浓度(依次为：0.001μg/cm²、0.01μg/cm²、0.1μg/cm²、0.5μg/cm²、1.0μg/cm²和1.5μg/cm²)，以及FNC包被混合物。

[图7]图7是示出了层粘连蛋白511、层粘连蛋白521和层粘连蛋白511-E8片段促进人角膜内皮细胞的细胞粘附的图表。Y轴表示与对照相比的BrdU吸光度的相对值(％)。X轴从左侧开始表示无包被(对照)、层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白211、FNC包被混合物和层粘连蛋白511-E8片段(从左侧开始：0.5μg/cm²、1.0μg/cm²和1.5μg/cm²)

[图8]图8是培养第2天时的相差显微镜的图像，示出了层粘连蛋白511和层粘连蛋白521增强了培养人角膜内皮细胞的效率。左上图表示层粘连蛋白511，右上图表示层粘连蛋白521，左下图表示层粘连蛋白211，右下图表示无包被。比例尺(bar)表示100μm。

[图9]图9是培养第20天时的相差显微镜的图像，表明层粘连蛋白511和层粘连蛋白521使得能够以高细胞密度培养人角膜内皮细胞。左上图表示层粘连蛋白511，右上图表示层粘连蛋白521，左下图表示层粘连蛋白211，右下图表示无包被。比例尺表示100μm。

[图10]图10是示出了层粘连蛋白511和层粘连蛋白521使得能够以高细胞密度培养人角膜内皮细胞的图像。红色染料表示Na⁺/K⁺-ATP酶，蓝色染料表示DAPI。左上图表示层粘连蛋白511，右上图表示层粘连蛋白521，左下图表示层粘连蛋白211，右下图表示无包被。比例尺表示100μm。

[图11]图11是示出了层粘连蛋白511和层粘连蛋白521使得能够以高细胞密度培养人角膜内皮细胞的图像。绿色染料表示ZO-1，蓝色染料表示DAPI。左上图表示层粘连蛋白511，右上图表示层粘连蛋白521，左下图表示层粘连蛋白211，右下图表示无包被。比例尺表示100μm。

[图12]图12是表明甚至在其中培养基中添加了层粘连蛋白521和层粘连蛋白511-E8片段的培养物中人角膜内皮细胞的细胞粘附也得到促进的图表。Y轴表示细胞数目(％对照)。X轴从左侧开始表示无包被(对照)、层粘连蛋白521的每种浓度(依次为：1.0μg/cm²、2.0μg/cm²和4.0μg/cm²)、层粘连蛋白511-E8片段的每种浓度(依次为：1.0μg/cm²、2.0μg/cm²和4.0μg/cm²)，以及FNC包被混合物。

具体实施方式

本发明在下文中描述。除非另有明确说明，在本说明书通篇中，单数形式的表述应当被理解为包含所述概念的复数形式。因此，除非另有明确说明，单数形式的冠词(例如，英语中的“一”、“一个”、“所述”等)应当被理解为包含所述概念的复数形式。此外，除非另有明确说明，本文使用的术语应当被理解为是以本领域中常规使用的含义使用的。因此，除非另有定义，本文使用的所有具体的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如果出现矛盾，以本发明的说明书(包括定义)为准。

定义

本文使用的“角膜内皮细胞”是以本领域中常规使用的含义使用的。角膜是组成眼的薄层组织之一。角膜是透明的并且位于最接近于外部环境的部位。人的角膜被认为由五层组成，从外侧(身体表面)开始依次为角膜上皮、前弹性层、固有质(substantiapropia)、后弹性层(角膜内皮基底膜)和角膜内皮。具体地，除非另有说明，上皮和内皮以外的部分可一起被称为“角膜基质”并在本文中如此命名。本文使用的“HCEC”是人角膜内皮细胞的缩写。应理解，对于本发明中使用的角膜内皮细胞，可使用天然存在的细胞，以及分化自干细胞的细胞(即来自iPS的分化诱导细胞)等。

本文使用的“分离的”是指在正常环境中与细胞天然在一起的物质的量至少减少的状态，优选基本上没有这类物质的状态。因此，分离的细胞、组织等是指基本上没有天然环境中与所述细胞在一起的其他物质(例如，其他细胞、蛋白质或核酸)的细胞。

本文使用的“角膜内皮制剂”是指包含角膜内皮或角膜内皮细胞的任何制剂或药剂。因为可对用本发明的方法产生和培养的角膜内皮细胞进行制剂，使用通过本发明的方法培养和产生的角膜内皮细胞可制备角膜内皮制剂/试剂。

本文使用的“胞外基质”也被称为(ECM)，其是指存在于体细胞——不管所述细胞是上皮细胞或非上皮细胞——之间的物质。因为胞外基质通常是由细胞产生，胞外基质是生物材料。胞外结构域不但参与支持组织，还构成所有体细胞生存所需的内部环境。胞外基质通常是由结缔组织细胞产生。但是，一些胞外基质是由具有基底膜的细胞(例如上皮细胞或内皮细胞)自身分泌。胞外基质大致分成纤维组分和填充纤维组分之间间隙的基质。所述纤维组分包括胶原纤维和弹性纤维。所述基质的基本成分是葡糖胺聚糖(酸性粘多糖)，其大多数通过与非胶原蛋白结合而形成蛋白聚糖(酸性粘多糖-蛋白复合物)大分子。此外，基质包括基底膜中的层粘连蛋白、弹性纤维周围的微纤维、纤维、以及细胞表面的糖蛋白(例如纤维连接蛋白)。在特化的组织中，基础结构是相同的。例如，在透明软骨中，由成软骨细胞产生软骨基质，其包含特征性大量的蛋白聚糖；在骨中，由成骨细胞产生骨基质，在这里发生钙质沉着。在这方面，组成胞外基质的代表性物质包括但不限于胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白V、弹性蛋白、胶原蛋白VIII、玻璃体结合蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白，以及蛋白聚糖(例如，核心蛋白多糖、双糖链蛋白多糖、纤调蛋白聚糖、基膜聚糖(lumican)、透明质酸、聚集蛋白聚糖等)。本发明中可使用在细胞粘附中起作用的多种胞外基质。

本文使用的“层粘连蛋白”是组成胞外基质的基底膜的蛋白。层粘连蛋白促进多细胞性/组织构建及其维持、细胞粘附、细胞迁移和细胞生长，并且与癌细胞关系密切。层粘连蛋白被认为在胚细胞样转化(blastogenesis)的早期(2细胞期)表达。层粘连蛋白是由各一条α链、β链和γ链组成的异质三聚体。对于层粘连蛋白的命名，已知按照发现次序的命名法(层粘连蛋白-1,层粘连蛋白-2等)。但是，因为未考虑与亚基的对应关系，本文使用一种更新的命名法，在该方法中共同描述亚类α、β或γ(三位数编号，百位数表示为α，十位数表示为β，个位数表示为γ)的名称。在α1、β1和γ1的情况下，这样的层粘连蛋白被称为层粘连蛋白111。对于层粘连蛋白，已发现五种类型的α链、三种类型的β链和三种类型的γ链。因此，理论上的最大组合数为5×3×3＝45，可能存在45种层粘连蛋白分子。但是，已认为并非所有组合都是天然存在的。α链的每种亚基被称为LAMA1、LAMA2、LAMA3、LAMA4或LAMA5，β链的每种亚基被称为LAMB1、LAMB2或LAMB3，γ链的每种亚基被称为LAMC1、LAMC2或LAMC3。用于本发明中的层粘连蛋白可以是天然形式的蛋白或是其中一个或多个氨基酸残基被修饰而同时保持生物活性(特别是促进细胞粘附的活性)的修饰形式的蛋白。此外，本发明的层粘连蛋白的来源、其产生方法等不受限制，只要所述层粘连蛋白具有本文所述的特征。因此，本发明中所使用的层粘连蛋白可以是任何天然存在的蛋白、通过基因工程方法从重组DNA表达的蛋白，或化学合成的蛋白。用于本发明中的层粘连蛋白的来源不受特别限制，但是优选地来自人。当出于获得医学材料的目的来培养人细胞时，优选地但不限于使用来自人的层粘连蛋白，以避免使用来自其他动物的材料。

已知层粘连蛋白的结合分子。α1β1、α2β1、α2β2、α3β1、α6β1、α6β4、α7β1、α9β1、ανβ3、ανβ5、ανβ8是已知为层粘连蛋白受体的整联蛋白。

下表描述了代表性的层粘连蛋白及对其进行的解释。

本文使用的“α1链”(LAMA1)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMA1、LAMA、S-LAM-α等。对于人LAMA1，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_005559和NP_005550。使用登录号150320鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“α1链”或“LAMA1”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“α2链”(LAMA2)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMA2、LAMM等。对于人LAMA2，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_000426和NP_000417。使用登录号156225鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“α2链”或“LAMA2”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“α3链”(LAMA3)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMA3、BM600、E170、LAMNA、LOCS、lama3a等。对于人LAMA3，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_000227和NP_000218。使用登录号600805鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“α3链”或“LAMA3”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“α4链”(LAMA4)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMA4、LAMA3、LAMA4*-1、CMD1JJ等。对于人LAMA4，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_001105206和NP_001098676。使用登录号600133鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“α4链”或“LAMA4”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“α5链”(LAMA5)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMA5、KIAA1907等。对于人LAMA5，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_005560和NP_005551。使用登录号601033鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“α5链”或“LAMA5”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“β1链”(LAMB1)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMB1、CLM、LIS5等。对于人LAMB1，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_002291和NP_002282。使用登录号150240鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“β1链”或“LAMB1”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“β2链”(LAMB2)(层粘连蛋白S)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMB2、LAMS、NPHS5等。对于人LAMB2，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_002292和NP_002283。使用登录号150325鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“β2链”或“LAMB2”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“β3链”(LAMB3)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMB3、BM600-125KDA、LAM5、LAMNB1等。对于人LAMB3，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_000228和NP_000219。使用登录号150310鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“β3链”或“LAMB3”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“γ1链”(LAMC1)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMC1、LAMB2等。对于人LAMC1，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_002293和NP_002284。使用登录号150290鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“γ1链”或“LAMC1”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“γ2链”(LAMC2)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMC2、B2T、BM600、CSF、EBR2、EBR2A、LAMB2T、LAMNB2等。对于人LAMC2，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_005562和NP_005553。使用登录号150292鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“γ2链”或“LAMC2”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“γ3链”(LAMC3)是胞外基质中细胞粘附分子的层粘连蛋白的亚基，被称为LAMC3、OCCM等。对于人LAMC3，将所述基因和蛋白的序列分别登记为NCBI登记号NM_006059和NP_006050。使用登录号604349鉴定OMIM。当用于本文的目的时，应理解“γ3链”或“LAMC3”不仅意指具有以具体的序列号或登录号所述的氨基酸序列的蛋白(或编码所述蛋白的核酸)，还意指其功能活性衍生物、功能活性片段或同源物，或由在高或低严格条件下与编码蛋白的核酸杂交的核酸所编码的突变体。

本文使用的“在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白”是指在角膜内皮细胞中以正常状态表达或优选地在蛋白水平显著表达的层粘连蛋白基因类型。通过本文的分析确认α5、β1、β2和γ1表达(图2)。因此，确认了至少层粘连蛋白511和层粘连蛋白521在角膜内皮细胞中表达。Dev.Dyn.218,213-234,2000和J.Biol.Chem.277(15),12741-12748,2002详细描述了层粘连蛋白511。因此，这些文件中公开的内容以引用的方式纳入本文。对于层粘连蛋白511等，可使用可商购的蛋白。例如，层粘连蛋白511和层粘连蛋白521的重组蛋白是可商购的并可获自BioLaminaAB。

本文使用的基因、多核苷酸、多肽等的“表达”是指基因经历某种体内作用而成为另一种形式。优选地，所述术语是指基因、多核苷酸等经转录和翻译而成为多肽形式。但是，基因、多核苷酸等经转录产生mRNA可以是一种表达形式。仍然优选地，这样的多肽形式可以是接受翻译后加工的那些(在本文中被称为衍生物)。例如，可通过任何方法确定每种层粘连蛋白链的表达水平。具体地，可通过评估每种层粘连蛋白链的mRNA的量，每种层粘连蛋白链的蛋白的量，以及每种层粘连蛋白链的蛋白的生物活性来发现每种层粘连蛋白链的表达水平。可通过本文所述的方法来确定每种层粘连蛋白链的mRNA或蛋白的量。

本文使用的“功能等价物”是指具有与原来的主体相同的目标功能但是结构不同的任何物质。因此，应理解，当提及“由层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链或其功能等价物组成的组”或“由层粘连蛋白、每种层粘连蛋白链及其功能等价物组成的组”时，其中包含以下内容：具有一种或多种对眼细胞等的细胞粘附、分化调控和/或生长促进作用的能力的层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链本身，以及所述层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链的片段、突变体或变体(例如，氨基酸序列变体等)；以及在作用时能转变为层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链本身，或所述层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链的片段、突变体或变体的物质(包括，例如，编码层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链本身，或层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链的片段、突变体或变体的核酸，以及包含所述核酸的载体、细胞等)。“由层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链或其功能等价物组成的组”或“由层粘连蛋白、每种层粘连蛋白链及其功能等价物组成的组”的代表性实例包括至少一种选自层粘连蛋白及其片段的试剂。在本发明中，应理解，层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链的功能等价物与层粘连蛋白或每种层粘连蛋白链可以类似地使用，而不对其进行任何具体说明。

本文使用的“片段”是指相对于多肽或多核苷酸的全长(长度为n)具有1至n-1的序列长度的多肽或多核苷酸。可根据目的对片段的长度进行适当的改变。例如，对于多肽，其长度的下限包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50和更多个氨基酸。此外，由本文中未具体列出的整数代表的长度(例如，11等)也适合作为下限。此外，对于多核苷酸，其长度的下限包括5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100或更多个核苷酸。此外，由本文中未具体列出的整数代表的长度(例如，11等)也适合作为下限。应理解，在本文中，当作为活性(例如，生长促进或维持)因子发挥作用时，所述层粘连蛋白链的片段本身在本发明的范围内。根据本发明，本文使用的术语“活性”是指最广义的分子功能。活性通常包括但不意欲限于分子的生物功能、生物化学功能、物理功能或化学功能。活性包括，例如，酶活性，与另一分子相互作用的能力，激活、促进、稳定、抑制、遏制(suppress)或破坏另一分子的功能、稳定性的能力，以及在细胞中的特定位置定位的能力。适用时，所述术语涉及最广义的蛋白复合物的功能。当提及相关的基因或核酸或多肽时，本文使用的“生物功能”是指在活体生物中所述基因、核酸或多肽可具有的特定功能。“生物功能”包括但不限于产生特定的抗体、酶活性、给予抗性等。可通过“生物活性”发挥本文使用的生物功能。本文使用的“生物活性”是指在活体生物中因子(例如，多核苷酸和蛋白)可具有的活性，其中包含了发挥多种功能的活性(例如，促进转录的活性)。例如，也包含激活与另一分子相互作用的分子或使其失活的活性。当两个因子相互作用时，其生物活性可视为所述两个分子的结合和从中产生的生物学改变，例如，在两个分子结合的情况下(例如，当使用针对两个分子中任一个的抗体时，如果两个分子共沉淀则它们结合)。因此，测定方法包括观察所述共沉淀。例如，当因子是酶时，其生物活性包括其酶活性。在另一个实例中，当因子是配体时，包括与所述配体相匹配的受体的结合。可通过本领域中公知的技术来测量所述生物活性。因此，“活性”是指指示或显示所述结合(直接或间接地)或引发的反应(即，具有响应于一些暴露或刺激的可测量的效应)的多种可测量的指示剂。例如，“活性”包括与本发明的多肽或多核苷酸结合的化合物，在一些暴露或刺激后上游或下游受到影响的蛋白的量，或另一相似功能的量度。

本文使用的“功能活性的”是指根据与本发明的多肽、片段或衍生物相关的实施方案，具有蛋白的生物化学功能、调控功能或结构功能(例如生物活性)的多肽、片段或衍生物。

本文使用的层粘连蛋白的“片段”是指层粘连蛋白的任何片段。作为本发明中使用的试剂，应理解不仅可使用层粘连蛋白的全长，还可使用层粘连蛋白的片段，只要所述片段具有层粘连蛋白的全长的功能，特别是内皮细胞的细胞粘附能力。因此，本发明中使用的层粘连蛋白的片段通常具有层粘连蛋白的至少一个特征。具体而言，所述特征可包含内皮细胞的细胞粘附能力。

下文将描述本发明中在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白的序列。应理解，这些层粘连蛋白表示本发明优选的代表性实例，本发明不限于这些具体的层粘连蛋白亚型。

层粘连蛋白α5链的代表性核苷酸序列可以是：

(a)具有SEQIDNO:1所述的碱基序列或其片段序列的多核苷酸；

(b)编码由SEQIDNO:2所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽的多核苷酸；

(c)编码变体多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段中的一个或多个氨基酸具有选自SEQIDNO:2所述的氨基酸序列中置换、添加和缺失的突变，其中所述变体多肽具有生物活性；

(d)为SEQIDNO:1所述的碱基序列或其片段的等位基因或剪接突变体的多核苷酸；

(e)编码由SEQIDNO:2所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽的物种同源物的多核苷酸；

(f)在严格条件下与(a)-(e)之一的多核苷酸杂交并且编码具有生物活性的多肽的多核苷酸；或

(g)由与(a)-(e)之一的多核苷酸具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的碱基序列或其互补序列组成，并且编码具有生物活性的多肽的多核苷酸。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白α5链的活性。对于α5链，可参考DoiMetal.,J.Biol.Chem.277(15),12741-12748,2002和美国专利No.6,933,273。

层粘连蛋白α5链的氨基酸序列可以是：

(a)由SEQIDNO:2所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽；

(b)具有生物活性以及一个或多个具有突变的氨基酸的多肽，所述突变选自SEQIDNO:2所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失；

(c)由SEQIDNO:1所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体编码的多肽；

(d)为SEQIDNO:2所述的氨基酸序列的物种同源物的多肽；或

(e)具有与(a)至(d)之一的多肽有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白α5链的活性。对于α5链，可参考DoiMetal.,J.Biol.Chem.277(15),12741-12748,2002和美国专利No.6,933,273。

层粘连蛋白β1链的代表性核苷酸序列可以是：

(a)具有SEQIDNO:3所述的碱基序列或其片段序列的多核苷酸；

(b)编码由SEQIDNO:4所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽的多核苷酸；

(c)编码变体多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段中的一个或多个氨基酸具有选自SEQIDNO:4所述的氨基酸序列中置换、添加和缺失的突变，其中所述变体多肽具有生物活性；

(d)为SEQIDNO:3所述的碱基序列或其片段的等位基因或剪接突变体的多核苷酸；

(e)编码由SEQIDNO:4所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽的物种同源物的多核苷酸；

(g)由与(a)至(e)之一的多核苷酸有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的碱基序列或其互补序列组成，并且编码具有生物活性的多肽的多核苷酸。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白β1链的活性。对于β1链，可参考Pillarainenetal.,J.Biol.Chem.262(22),10454-10462,1987和美国专利No.6,933,273。

层粘连蛋白β1链的氨基酸序列可以是：

(a)由SEQIDNO:4所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽；

(b)具有生物活性以及一个或多个具有突变的氨基酸的多肽，所述突变选自SEQIDNO:4所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失；

(c)由SEQIDNO:3所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体编码的多肽；

(d)为SEQIDNO:4所述的氨基酸序列的物种同源物的多肽；或

(e)具有与(a)至(d)之一的多肽有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。对于β1链，可参考Pillarainenetal.,J.Biol.Chem.262(22),10454-10462,1987和美国专利No.6,933,273。

层粘连蛋白β2链的代表性核苷酸序列可以是：

(a)具有SEQIDNO:5所述的碱基序列或其片段序列的多核苷酸；

(b)编码由SEQIDNO:6所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽的多核苷酸；

(c)编码变体多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段中的一个或多个氨基酸具有选自SEQIDNO:6所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失的突变，其中所述变体多肽具有生物活性；

(d)为SEQIDNO:5所述的碱基序列或其片段的等位基因或剪接突变体的多核苷酸；

(e)编码由SEQIDNO:6所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽的物种同源物的多核苷酸；

(g)由与(a)至(e)之一的多核苷酸有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的碱基序列或其互补序列组成，并且编码具有生物活性的多肽的多核苷酸。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白β2链的活性。对于β2链，可参考WewerUMetal.,Genomics.Nov15,1994；24(2):243-52.,1987和美国专利No.6,933,273。

层粘连蛋白β2链的氨基酸序列可以是：

(a)由SEQIDNO:6所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽；

(b)具有生物活性以及一个或多个具有突变的氨基酸的多肽，所述突变选自SEQIDNO:6所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失；

(c)由SEQIDNO:5所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体编码的多肽；

(d)为SEQIDNO:6所述的氨基酸序列的物种同源物的多肽；或

(e)具有与(a)至(d)之一的多肽有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白β2链的活性。对于α5链，可参考WewerUMetal.,Genomics.Nov15,1994；24(2):243-52.,1987和美国专利No.6,933,273。

层粘连蛋白γ1链的代表性核苷酸序列可以是：

(a)具有SEQIDNO:7所述的碱基序列或其片段序列的多核苷酸；

(b)编码由SEQIDNO:8所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽的多核苷酸；

(c)编码变体多肽或其片段的多核苷酸，所述多肽或其片段中的一个或多个氨基酸具有选自SEQIDNO:8所述的氨基酸序列中的置换、天津爱和缺失的突变，其中所述变体多肽具有生物活性；

(d)为SEQIDNO:7所述的碱基序列或其片段的等位基因或剪接突变体的多核苷酸；

(e)编码由SEQIDNO:8所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽的物种同源物的多核苷酸；

(g)由与(a)至(e)之一的多核苷酸有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的碱基序列或其互补序列组成，并且编码具有生物活性的多肽的多核苷酸。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白γ1链的活性。对于γ1链，可参考Pillarainenetal.,J.Biol.Chem.263(14),6751-6758,1988和美国专利No.6,933,273。

层粘连蛋白γ1链的氨基酸序列可以是：

(a)由SEQIDNO:8所述的氨基酸序列或其片段组成的多肽；

(b)具有生物活性以及一个或多个具有突变的氨基酸的多肽，所述突变选自SEQIDNO:8所述的氨基酸序列中的置换、添加和缺失；

(c)由SEQIDNO:7所述的碱基序列的等位基因或剪接突变体编码的多肽；

(d)为SEQIDNO:8所述的氨基酸序列的物种同源物的多肽；或

(e)具有与(a)至(d)之一的多肽有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。在这方面，生物活性通常是指层粘连蛋白γ1链的活性。对于γ1链，可参考Pillarainenetal.,J.Biol.Chem.263(14),6751-6758,1988和美国专利No.6,933,273。

本文使用的“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”和“肽”具有相同的含义并可互换使用，它们是指任意长度的氨基酸序列的聚合物。该聚合物可以是直链或支链或环链。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸，或可以是改变的氨基酸。该术语也可包括组装成多条多肽链的复合物的那些。该术语也包括天然或人工改变的氨基酸聚合物。所述改变包括，例如，二硫键形成、糖基化、脂质化(lipidation)、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或改变(例如，与经标记的组分缀合)。该定义也包括，例如，包含一个或多个氨基酸类似物(例如，包含非天然氨基酸)的多肽，类肽化合物(例如，类肽)和其他本领域中公知的改变。对于本发明的蛋白(例如，层粘连蛋白的每种链)，将编码每种靶链基因的DNA整合至适合的载体，使用能够在各宿主中表达的表达载体，将所述适合的载体引入至真核细胞或原核细胞，使各链表达，从而获得所需的蛋白。可用于表达层粘连蛋白的宿主细胞包括但不特别限于，原核宿主细胞，例如大肠杆菌(Escherichia.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；以及真核宿主细胞，例如酵母、真菌、昆虫细胞、植物和植物细胞，以及哺乳动物细胞。使用转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、农杆菌(Agrobacterium)法、直接微注射等，可将所构建的用于表达靶层粘连蛋白链等的载体引入上述宿主细胞。使包含载体的细胞生长在适合的培养基中以产生用于本发明中的层粘连蛋白链，从细胞或培养基中纯化所述层粘连蛋白链，从而获得层粘连蛋白链等。使用分子筛色谱法、HPLC、离子交换色谱法、免疫亲和色谱法等进行纯化。

本文使用的“氨基酸”可以是天然的或非天然的，只要能实现本发明的目的。

本文使用的“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”具有相同含义并可互换使用，它们是指任何长度的核苷酸的聚合物。这些术语也包括“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”。所述“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”是指包含核苷酸衍生物或其中核苷酸之间的键(bonding)不同于正常键的寡核苷酸或多核苷酸，并且它们可互换使用。对于所述寡核苷酸，具体举例说明下述：2'-O-甲基-核糖核苷酸；一种寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的磷酸二酯键被转化为硫代磷酸酯键；一种寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的磷酸二酯键被转化为N3'-P5'氨基磷酸酯键；一种寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的核糖和磷酸二酯键被转化为肽核酸键；一种寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代；一种寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶取代；一种寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代；一种寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的胞嘧啶被吩噁嗪修饰的胞嘧啶取代；一种寡核苷酸衍生物，其中DNA中的核糖被2'-O-丙基核糖取代；一种寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的核糖被2'-甲氧基乙氧基核糖取代。除非另有说明，特定的核酸序列意欲包括与明确说明的序列相似的经保守性改变的变体(例如，简并密码子取代物)及其互补序列。特别地，可通过产生其中一个或多个经选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列而获得简并密码子取代物(Batzeretal.,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsukaetal.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolinietal.,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。本文使用的“核酸”可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。本文使用的“核苷酸”可以是天然或非天然的。

本文使用的“基因”是指定义遗传性状的试剂(agent)。通常，基因在染色体上以给定的次序排列。定义蛋白的一级结构的基因被称为结构基因，影响其表达的基因被称为调控基因。在本文中，“基因”可指“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”。

在本文中可通过公知的IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母密码子或单字母密码子来提及氨基酸。类似地，可通过通常认可的单字母密码子提及核苷酸。在本文中，使用默认参数和序列分析工具BLAST计算氨基酸序列和碱基序列的相似性、同一性和同源性。使用例如NCBI的BLAST2.2.26(2011年10月30日发布)进行同一性检索。本文使用的同一性值通常是指使用BLAST在默认条件下比对的值。但是，如果由于参数改变而获得更高的值，则将最高值定义为同一性的值。如果在多个区域评估同一性，则将所述区域的最高值定义为同一性的值。相似性是除同一性以外在计算中考虑相似氨基酸的数值。

本文使用的“在严格条件下杂交的核苷酸”是指通常用于本领域的公知的条件。应理解，对于本发明中使用的层粘连蛋白，也可使用与各具体公开的层粘连蛋白的核酸序列“在严格条件下杂交的多核苷酸”编码的那些蛋白。将选自本发明的多核苷酸的多核苷酸用作探针，使用菌落杂交技术、噬菌斑杂交技术或DNA杂交技术允许获得所述多核苷酸。具体而言，其意指通过如下获得的多核苷酸：在65℃、0.7至1.0MNaCl存在的条件下，使用固定有菌落或噬菌斑来源的DNA的滤器进行杂交，然后在65℃的条件下使用0.1至2倍浓度的SSC(柠檬酸钠盐水)溶液(其中1倍浓度的SSC溶液的组成为150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)冲洗所述滤器。根据实验文献(例如MolecularCloning第二版,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1-38,DNACloning1:CoreTechniques,APracticalApproach,SecondEdition,OxfordUniversityPress(1995))中所述的方法进行杂交。在此处，从在严格条件下杂交的序列中优选地排除仅包含A序列或T序列的序列。因此，用于本发明中的多肽(例如，转甲状腺素蛋白)也包括在严格条件下与编码本发明具体所述的多肽的核酸分子杂交的核酸分子编码的多肽。这些低严格条件包括在40℃下在包含35％甲酰胺、5×SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.02％PVP,0.02％BSA,100g/ml变性的鲑鱼精子DNA和10％(重量/体积)硫酸葡聚糖的缓冲液中进行杂交18至20小时；在55℃下在由2×SSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中冲洗1至5小时；在60℃下在由2×SSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中冲洗1.5小时。

对于本发明的功能等价物，可使用其氨基酸序列的一端或两端插入、置换或缺失、或添加一个或多个氨基酸的那些。在本文中，“在氨基酸序列的一端或两端插入、置换或缺失、或添加一个或多个氨基酸”意指通过公知的技术方法(例如定点诱变)或天然存在的突变对多个可天然存在的氨基酸进行置换等而产生的改变。

改变的氨基酸序列(例如，本发明中使用的层粘连蛋白的每种链)可以是这样的序列：例如，其一端或两端插入、置换、或缺失、或添加1至30，优选1至20，更优选1至9，仍然更优选1至5，特别优选1至2个氨基酸。所述改变的氨基酸序列可优选是这样的氨基酸序列：其在层粘连蛋白的每种链等的氨基酸序列中具有一个或多个(优选1或若干，或1、2、3或4个)保守性置换。在本文中，“保守性置换”意指用不同的化学上相似的氨基酸残基置换一个或多个氨基酸残基以使得蛋白质的功能基本上不会发生改变。例如，当给定的疏水残基被另一个疏水残基置换时，或当给定的极性残基被另一个具有相同电荷的极性残基置换时，可提及这类保守性置换。对于每个氨基酸而言，能够进行所述置换的功能上相似的氨基酸在本领域中是公知的。非极性(疏水)氨基酸的具体实例包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。极性(中性)氨基酸的具体实例包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。具有正电荷的(碱性)氨基酸的具体实例包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。此外，具有负电荷的(酸性)氨基酸的具体实例包括天冬氨酸、谷氨酸等。

本文使用的“试剂”在广义上可以是任何物质或任何其他元素(例如，能量如光、辐射、热和电)，只要所述物质可交换使用并且可实现预期的目的。所述物质包括但不限于，例如，蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸(包括，例如，DNA如基因组DNA和cDNA，RNA如mRNA)、多糖、寡糖、脂质、有机小分子(例如，激素、配体、信使分子、有机小分子、通过组合化学合成的分子、可用作药物的小分子(例如，小分子配体)等)及其复合物分子。特异性针对多核苷酸的试剂通常包括但不限于，具有与上述多核苷酸的序列有给定的序列同源性(例如，70％或更高的序列同一性)的互补性的多核苷酸，多肽如结合于启动子区的转录因子等。特异性针对多肽的试剂通常包括但不限于，特异性针对多肽的抗体，或其衍生物或其类似物(例如，单链抗体)，在所述多肽是受体或配体的情况下的特异性配体或受体，在所述多肽是酶的情况下的其底物(matrix)等。

本文使用的“培养”是指使受试细胞生长，在狭义上，其是指维持受试细胞的状况(否则状况将恶化)的状态(例如，细胞的数目不会显著减少的状态)。在狭义上，所述术语用于意指与培养的维持或维持相同的含义。

本文使用的“生长”是指其中细胞数目增加的状态。

本文使用的“生长能力”是指细胞生长的能力。除非本文具体说明，生长状态是指以稳定状态生长的可能性。“稳定状态”是指活体生物的正常情况，其中维持活体生物的稳态。本领域技术人员可容易地确定所述状态。例如，可通过细胞密度分析(其中细胞密度几乎恒定而没有改变，或识别出细胞生长标记物的表达等)确认所述状态。本文使用的“生长的促进”是指给定细胞的生长状态。如果起初靶细胞未在生长，则开始甚至少许的生长就相当于生长的促进。如果细胞已经在生长并且生长水平得到维持或提高(优选地提高)，则相当于生长的促进。

本文使用的“干细胞”是指同时具有分化为多种细胞系统(多系分化潜能)的能力和甚至在细胞分裂后维持多系分化潜能的能力(自我更新的能力)的细胞。干细胞包括胚胎干细胞、生殖细胞、iPS细胞、组织干细胞等。本发明所针对的角膜内皮细胞可以是从干细胞分化的细胞。使用本领域中公知的方法可实现从干细胞到角膜内皮细胞的分化。

本文使用的细胞的“正常的细胞功能”是指当提及特定的细胞(例如角膜内皮细胞)时细胞最初具有的功能。对于角膜内皮细胞，所述功能包括但不限于，ZO-1和Na⁺/K⁺-ATP酶，对角膜移植的适应性能力(MatsubaraM,TanishimaT:Wound-healingofthecornealendotheliuminthemonkey:amorphometricstudy,JpnJOphthalmol1982,26:264-273；MatsubaraM,TanishimaT:Wound-healingofcornealendotheliuminmonkey:anautoradiographicstudy,JpnJOphthalmol1983,27:444-450；VanHornDL,HyndiukRA:Endothelialwoundrepairinprimatecornea,ExpEyeRes1975,21:113-124和VanHornDL,SendeleDD,SeidemanS,BucoPJ:Regenerativecapabilityofthecornealendotheliuminrabbitandcat.InvestOphthalmolVisSci1977,16:597-613)等。

可通过免疫方法观察蛋白的表达或在mRNA水平(例如RT-PCR)上评估ZO-1和Na⁺/K⁺-ATP酶。对Na⁺/K⁺-ATP酶和ZO-1在与正常细胞相同的水平上的表达和/或功能的确认使得能够确认受试细胞是否具有正常功能。

对于对角膜移植的适应性能力，可使用实验动物(例如兔)通过机械刮除角膜内皮作为大泡性角膜病变模型，进行培养细胞的移植测试。但是，因为兔的角膜内皮细胞在体内生长，不能否认由于宿主角膜内皮细胞的生长而自然愈合的可能性(MatsubaraM,etal.,JpnJOphthalmol1982,26:264-273；MatsubaraM,etal.,JpnJOphthalmol1983,27:444-450；VanHornDL,etal.,ExpEyeRes1975,21:113-124和VanHornDL,etal.，InvestOphthalmolVisSci1977,16:597-613)。因此，为了评估更准确的移植适应性能力，优选评估对灵长类动物的移植物植入。当评估对人的移植适应性能力时，例如，在至少1个月，优选至少两个月，更优选至少3个月，仍然更优选至少6个月，还更优选至少12个月之后，在灵长类动物(例如食蟹猴)中评估适应性。对在灵长类动物(例如猴)中的移植适应性能力的确认对于应用于人尤为重要。

本文使用的“BrdU”是溴脱氧尿苷的缩写。因为在DNA合成中BrdU作为dTTP的类似物被掺入，可通过特异性针对被掺入到DNA中的BrdU的抗体来检测其中掺入BrdU的DNA(细胞核)。因此，BrdU被用作表示高生长能力/分化能力的指标(index)。

本文使用的“BrdU阳性”是指其中细胞标记物BrdU在靶细胞中表达的状态。

本文使用的“培养物”是指通过培养细胞(例如角膜内皮)而生成的那些物质。因此，“角膜内皮培养物”是指角膜内皮的培养物，所述术语通常是指以与体内存在状态不同的状态存在的那些物质。通过常规方法获得的角膜内皮培养物的问题在于，所述培养物的生长能力低并且易于被转化和丧失功能(PehGS,BeuermanRW,ColmanA,TanDT,MehtaJS(2011)Humancornealendothelialcellexpansionforcornealendotheliumtransplantation:anoverview.Transplantation91:811-819.,OkumuraN,KayE,NakaharaM,HamuroJ,KinoshitaS,etal.(2013)InhibitionofTGF-βsignalingenableshumancornealendothelialcellexpansioninvitroforuseinregenerativemedicine.PLoSOne8:e58000.)。因此，从培养物的角度而言，对于那些培养了特别长时间的培养物或传代培养的培养物，无法获得这样的细胞密度。特别地，角膜内皮细胞的密度在培养过程中容易降低。角膜内皮密度是健康程度的临床上最重要的指标之一。因此，从再生医学的观点而言，培养至高密度是重要的。此外，可预先增加内皮细胞的密度，然后进行体内给药，所述内皮细胞可以是极其重要的治疗剂。从这种意义上讲，重要的事实是，过去通过正常的培养方法会降低的细胞密度现在能够增加。人角膜内皮在体内的正常水平在约2500-3000/mm²范围内。本发明的有益之处在于，本发明提供了使培养物的细胞密度达到上述水平或超过所述水平的技术。

本文使用的“培养基”是指能够培养角膜内皮细胞或使其生长的任何培养基，所述培养基根据需要可以采取任何形式，例如液体培养基(培养基)、悬液培养基和固体培养基。用于所述角膜内皮细胞的培养基的组分包括，例如，DMEM(GIBCOBRL)、OptiMEM(LifeTechnologies)、血清(例如，胎牛血清(FBS)、人血清)、增殖因子/生长因子(例如，b-FGF)、抗生素物质(例如，青霉素、链霉素、庆大霉素)等。

本文使用的“(培养)容器”是指培养角膜内皮细胞的容器。所述培养容器的类型不受特别限制，可使用任何被灭菌以防止细菌污染以及具有适于培养细胞的任何材料和任何形状的容器。所述培养容器的实例包括但不限于，本领域中通常使用的培养皿、培养瓶(cultureflask)、培养Schales、培养板(例如，96孔、48孔、12孔、6孔和4孔)、培养瓶(culturebottle)。

(一般技术)

本文使用的分子生物学技术、生物化学技术、微生物方法是本领域中公知的和通常使用的，所述技术和方法记载于，例如，SambrookJ.etal.(1989).MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborandits3rdEd.(2001)；Ausubel,F.M.(1987).CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience；Ausubel,F.M.(1989).ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience；Innis,M.A.(1990).PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress；Ausubel,F.M.(1992).ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.Associates；Ausubel,F.M.(1995).ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.Associates；Innis,M.A.etal.(1995).PCRStrategies,AcademicPress；Ausubel,F.M.(1999).ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley,andannualupdates；Sninsky,J.J.etal.(1999).PCRApplications:ProtocolsforFunctionalGenomics,AcademicPress,Gait,M.J.(1985).OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IRLPress；Gait,M.J.(1990).OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IRLPress；Eckstein,F.(1991).OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,IRLPress；Adams,R.L.etal.(1992).TheBiochemistryoftheNucleicAcids,Chapman&Hall；Shabarova,Z.etal.(1994).AdvancedOrganicChemistryofNucleicAcids,Weinheim；Blackburn,G.M.etal.(1996).NucleicAcidsinChemistryandBiology,OxfordUniversityPress；Hermanson,G.T.(1996).BioconjugateTechniques,AcademicPress,andBessatsuJikkenIgaku"IdenshiDounyu&HatsugenKaisekiJikkenHou"YodoshaCo.,Ltd.,1997。关于角膜内皮细胞，NancyJoyce等人的报告{Joyce,2004#161}{Joyce,2003#7}是公知的；但是，如之前所述，成纤维细胞的转化是由于长期培养和传代培养。因此，现在仍在继续关于有效的培养方法的研究。其相关部分(其可以是完整的部分)以引用的方式纳入本文。

实施方式的描述

以下将描述优选的实施方案。但是，应理解，所述实施方案是本发明的实施例，本发明的范围并不限于所述优选的实施方案。此外，应理解，本领域技术人员在参考以下优选的实施方案的同时可在本发明的范围内容易地进行修改、改变等。此外，应理解，可组合任何实施方案。

(用于培养角膜内皮细胞或使其生长的组合物和培养容器)

一方面，本发明提供了用于培养角膜内皮细胞或使其生长的组合物，其包含至少一种由在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白及其片段组成的试剂。

尽管本发明的试剂(层粘连蛋白等)可被包含在培养基中以备使用，所述试剂可被包被(或可覆盖)于培养皿上以备使用。为了进行靶细胞的原代培养和/或传代培养，使用适合的培养基(例如，DMEM(达尔贝科改良伊格尔培养基)或OptiMEM)并在用于培养的培养皿中接种收集和分离到的细胞，用于进行原代培养和传代培养。在本发明中，甚至在添加到培养基中的血清量少于10％时也能获得良好的生长结果。此外，在本发明中，除了层粘连蛋白或除了层粘连蛋白的包被，可将细胞因子(例如成纤维细胞生长因子(FGF))作为添加剂添加到培养基中。本发明的试剂可用于实施例所述的分离细胞和从iPS或ES细胞诱导的内皮细胞。此外，应理解，所述试剂对诱导本身是有效的。

使用的层粘连蛋白在培养基溶液(例如，PBS)中的浓度包括，例如，约0.1μg至约500μg/ml。对于包被，可将每单位面积(例如，cm²)约0.75μg/cm²的量用于包被。对于处理培养容器的用途，不特别限制本发明的层粘连蛋白或其片段的量。当使用层粘连蛋白或其片段的溶液进行处理时，优选地以约0.01μg/ml或更多，优选地以约0.01至10μg/ml，仍然优选地以约0.01至约2μg/ml的量，可获得有利结果。约0.01至10μg/ml或约0.01至约2μg/ml的层粘连蛋白或其片段相当于固相中每单位培养容器面积上层粘连蛋白或其片段的量为约0.0015至1.5μg/cm²或约0.0015至0.3μg/cm²。

在一个优选的实施方案中，所述层粘连蛋白包括层粘连蛋白511和层粘连蛋白521。因此，在本实施方案中，本发明的试剂可以是层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或其片段。

可将任何片段用作本发明的层粘连蛋白511的片段或层粘连蛋白521的片段，只要所述片段可用于培养(在本文中可被称为“维持”或“维持培养物”，但是以与培养相同的含义使用)角膜内皮细胞或使其生长。所述片段包括但不限于层粘连蛋白511-E8片段和层粘连蛋白521片段(分别为序列编号9、10(核酸序列，氨基酸序列)和序列编号11、12(核酸序列，氨基酸序列))(参见TaniguchiY,IdoH,SanzenN,HayashiM,Sato-NishiuchiR,FutakiS,SekiguchiK.TheC-terminalregionoflamininbetachainsmodulatestheintegrinbindingaffinitiesoflaminins.JBiolChem.284:7820-7831,2009.AvailablefromNippi,Incorporated)。层粘连蛋白511-E8片段和层粘连蛋白521片段是通过弹性蛋白酶处理获得的片段，并且在异质三聚体的α链C末端区域包含卷曲螺旋结构域和3个LG结构域(LG1至LG3)的部分。E8片段被认为对应于异质三聚体分子的整联蛋白结合位点，在所述异质三聚体分子中层粘连蛋白的α链、β链和γ链经由卷曲螺旋结构域相互组装在一起。因此，可将层粘连蛋白全长中基本上保留了整联蛋白结合位点的那些作为优选的片段使用。应理解，可基于关于层粘连蛋白511-E8和层粘连蛋白521片段的信息通过适当的改变产生这样的片段。

在这方面，人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段(在本文中也被称为“人层粘连蛋白511-E8”)意指人层粘连蛋白α5β1γ1(在本文中也被称为“人层粘连蛋白511”)的片段，其对应于鼠层粘连蛋白α1β1γ1的E8片段(在本文中也被称为“鼠层粘连蛋白111-E8”)。层粘连蛋白的E8片段已被鉴定为通过用弹性蛋白酶消化鼠层粘连蛋白α1β1γ1(在下文中将其描述为“鼠层粘连蛋白111”)而获得的片段中具有强细胞粘附活性的片段(EdgarD.,TimplR.,ThoenenH.Theheparin-bindingdomainoflamininisresponsibleforitseffectsonneuriteoutgrowthandneuronalsurvival.EMBOJ.,3:1463-1468,1984.,GoodmanSL.,DeutzmannR.,vonderMarkK.Twodistinctcell-bindingdomainsinlaminincanindependentlypromotenonneuronalcelladhesionandspreading.J.CellBiol.,105:589-598,1987.)。对于人层粘连蛋白511和人层粘连蛋白332，用弹性蛋白酶消化之后推定存在对应于鼠层粘连蛋白111-E8的片段。用于本发明的人层粘连蛋白511-E8不需要为人层粘连蛋白511的弹性蛋白酶消化产物。用于本发明的人层粘连蛋白511-E8可以是与鼠层粘连蛋白111-E8有相似的细胞粘附活性、相似的结构和大约相同的分子量的人层粘连蛋白511的片段。制备人层粘连蛋白511-E8的方法并不受特别限制。例如，所述方法包括允许通过蛋白水解酶(例如弹性蛋白酶)消化全长的人层粘连蛋白511以片段化(fractionate)和纯化靶片段的方法，制备重组蛋白的方法等。从制备量、质量的均一性、制备成本等角度而言，优选制备重组蛋白。通过恰当地使用已知的基因重组技术可制备重组的人层粘连蛋白511-E8。制备重组的人层粘连蛋白511-E8的方法，例如，可通过如下方式制备重组的人层粘连蛋白511-E8：获得编码人层粘连蛋白511-E8的α链、β链和γ链中的每种链的蛋白的DNA，将每种所获得的DNA插入表达载体，通过共转染至适合的宿主细胞来表达所得的三种表达载体，以及通过已知的方法纯化三聚体蛋白(例如，参见HiroyukiIdo,etal,"Therequirementoftheglutamicacidresidueatthethirdpositionfromthecarboxylterminiofthelamininγchainsinintegrinbindingbylaminins"TheJournalofBiologicalChemistry,282,11144-11154,2007.)。可参考JP2011-78370中的具体制备方法。通过使用人层粘连蛋白521可制备类似的片段，其被称为“层粘连蛋白521-E8片段”。应理解，可通过与层粘连蛋白511-E8相似的方式来制备所述片段，这些片段保留了与层粘连蛋白511-E8相似的活性。

在一个优选的实施方案中，所述试剂是层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白511-E8片段或层粘连蛋白521-E8片段。

在一个优选的实施方案中，所述角膜内皮细胞来自人。

可通过移除供体角膜的天然角膜内皮从剥脱的角膜制备本发明所靶向的内皮细胞，而不损害后弹性层的完整性以及基质层的结构和功能(例如，WO2005/038015)。剥脱的角膜可用作人角膜内皮培养细胞。

在另一方面，本发明提供了用于角膜内皮细胞的培养容器，其被本发明的试剂或组合物包被。

通过参考本领域中已知的方法可进行用于培养角膜内皮细胞的用于层粘连蛋白等的经覆盖的容器或培养板的制备。可如下进行培养容器的制备(包被)：例如，在将用磷酸缓冲液稀释到20μg/ml的层粘连蛋白溶液添加到培养皿中之后，在37℃下(5％CO₂)孵育两小时，然后除去溶液并分别用磷酸缓冲液在培养基中冲洗两次以备使用。

因此，在另一方面，本发明涉及用于固相化(solid-phasing)(包被)细胞培养容器(所述容器用于培养角膜内皮细胞中的细胞)的组合物——所述包被使用包含至少一种选自在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白或其片段(例如，层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或其片段)的试剂的系统；或涉及用于固相化(包被)细胞培养容器的试剂。在一个实施方案中，本发明的组合物或试剂是包被组合物或包被试剂。在培养容器的表面上固相化层粘连蛋白的处理技术是本领域中已知的。因此，本领域技术人员可根据本发明的目的使用任何培养容器并对所述容器进行处理以将所述容器用于本发明的方法。

在另一方面，本发明还涉及包含上述组合物或试剂的试剂盒。本发明的试剂盒可还包含细胞培养基、细胞培养容器等。细胞培养容器可以是，例如，预包被的培养皿或预包被的培养板。或者，试剂盒的细胞培养容器可处于这样的状态：至少一种选自在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白或其片段(例如，层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或其片段)的试剂处于固相。本发明的细胞培养容器、组合物、试剂和试剂盒可用于在系统中培养哺乳动物细胞的方法，所述系统包含至少一种选自在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白或其片段(例如，层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或其片段)的因子。

(培养角膜内皮细胞的方法)

在另一方面，本发明提供了培养角膜内皮细胞的方法，所述方法使用本发明的组合物。即，本发明提供了培养角膜内皮细胞或使其生长的方法，包括使用本发明的试剂(层粘连蛋白、其片段等)培养角膜内皮细胞的步骤。用于本发明中的方法的试剂(层粘连蛋白、其片段等)被认为能够以本文所述的任何形式使用。此外，任何培养组分均可用于本发明的方法，只要所述组分可用于培养角膜内皮，并且能够举例说明具有本文所述的任何形式的培养组分。

在一个实施方案中，本发明中培养的角膜内皮细胞来自灵长类动物。在一个优选的实施方案中，本发明中培养的角膜内皮细胞来自人。

在一个优选的实施方案中，通过本发明的方法培养靶细胞是用于预防或治疗角膜内皮病症，尤其可用于产生用于移植的细胞、组织等。

培养角膜内皮细胞时的温度条件并不特别限制在使角膜内皮细胞生长的范围内。但是考虑到生长效率，例如，温度条件为约25℃至约45℃，或优选约30℃至约40℃，或仍然优选约37℃。在CO₂浓度为约5至10％的增湿环境下在常用的细胞培养箱中实施培养方法。

可以将可用于培养角膜内皮的任何组分用作可用于本发明的培养组分。此外，所述培养组分可以是常规出售和使用的培养基组分，或单独开发用于角膜内皮的组分。所述培养基组分的实例包括但不限于OptiMEM、DMEM、M199、MEM等(可获自IVITROGEN等)。

本发明的特征在于，通过在包含本发明的试剂(例如，特定的层粘连蛋白或其片段)的细胞培养系统中使用特定的多肽和/或肽，提高了细胞培养中多种特定的层粘连蛋白或其片段的活性。所述多肽选自非胞外基质蛋白的血液蛋白，其为血清、血清白蛋白、前白蛋白、免疫球蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、结合珠蛋白(Hp)、α2-巨球蛋白(α2-M)、α-甲胎蛋白(AFP)、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白(RBP)或脂连素(adiponectin)，以及明胶、肿瘤坏死因子(TNF)家族的蛋白和蛋白胨。在本发明的一个实施方案中，可用作额外组分的多肽和/或肽为，但不限于，血清白蛋白、肿瘤坏死因子(TNF)蛋白家族或蛋白胨，或者所述多肽和/或肽是免疫球蛋白或明胶。

在本发明中，可优选地使用血液蛋白，仍然优选地使用非胞外基质蛋白的血液蛋白，以及本发明的试剂(特定的层粘连蛋白或其片段)。所述血液蛋白优选地选自血清、血清白蛋白、前白蛋白、免疫球蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、结合珠蛋白(Hp)、α2-巨球蛋白(α2-M)、α-甲胎蛋白(AFP)、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白(RBP)或脂连素，其全部为非胞外基质蛋白的血液蛋白。“胞外基质”是填充胞外空间的物质。同时，胞外基质具有骨架作用(例如，动物的软骨或骨)、在细胞粘附中的支架作用(例如，基底膜或纤连蛋白)、在保留或提供细胞生长因子等中的作用(例如，结合于硫酸乙酰肝素的细胞生长因子FGF)等。许多被识别为存活的组成多细胞生物的单个细胞被包埋于胞外基质的床(bed)或巢(nest)中。脊椎动物(包括人)的胞外基质的主要组分为糖蛋白，例如胶原、蛋白聚糖、纤连蛋白和层粘连蛋白(部分地细胞粘附分子)。“胞外基质蛋白”意指组成所述胞外基质的蛋白。

本发明中的“非胞外基质蛋白的血液蛋白”意指参与细胞粘附等的非胞外基质蛋白的血液蛋白。它们全部为本领域技术人员能够适当地获得的已知蛋白。非胞外基质蛋白的血液蛋白优选但不限于人血清白蛋白(HSA/例如，可获自NacalaiTesque)、重组人血清白蛋白(rHSA/例如，可获自SIGMA-AlDRICH)或牛血清白蛋白(BSA/例如，可获自SIGMA-AlDRICH)。此外，“非胞外基质蛋白的血液蛋白”可以是免疫球蛋白。包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的免疫球蛋白是本领域技术人员公知的。例如，可使用人免疫球蛋白(IgG/例如，可获自OrientalYeastCol,Ltd.)但不限于此。

在本文中，“明胶”是指通过对胶原加热而提取的物质，其为结缔组织(例如，动物的皮肤、骨或肌腱(tendon))的主要成分。明胶的主要成分是蛋白质。

在本文中，可将肿瘤坏死因子(TNF)家族的蛋白作为额外的组分使用。“肿瘤坏死因子(TNF)”是一种类型的细胞因子。狭义上有三种类型的TNF，即TNF-α、TNF-β(淋巴毒素(LT)-α)和LT-β。“TNF家族的蛋白”包括至少19种类型的分子，例如，受体激活剂NFκB配体(RANKL)、Fas配体和CD40配体。优选地，可将受体激活剂NFκB配体(RANKL、sRANKL)可作为TNF家族的蛋白——其被用作本发明中使用的额外组分——的实例使用。

在本发明中，蛋白胨可作为额外的组分使用。“蛋白胨”是通过用蛋白水解酶溶解蛋白而获得的蛋白质。蛋白质是在体内被胃中的胃蛋白酶消化成蛋白胨，所得的蛋白胨被胰腺分泌的胰液和空肠分泌的肠液进一步消化为氨基酸。因为蛋白胨适合作为微生物的营养源，它经常被添加到培养基中。通过将蛋白质水解为氨基酸和低分子量的肽获得作为这类用于培养基的营养源的蛋白胨。通常使用从经过酶解作用(使用蛋白酶，例如从猪的胰腺提取的胰酶)的乳蛋白(乳酪蛋白)获得的蛋白胨。优选地使用来自植物的蛋白胨，但是不限于此。例如，蛋白胨是选自来自棉籽的蛋白胨、来自大豆的蛋白胨、来自小麦的蛋白胨和来自豌豆的蛋白胨。

(角膜内皮细胞和角膜内皮制剂)

本发明提供了通过本发明的方法培养和产生的角膜内皮细胞。可将本发明视为具有常规细胞中不存在的特征，该特征在于，甚至当进行正常的培养时以及进行传代培养时也可获得正常培养或生长的细胞。此外，最重要的特征在于，所述细胞具有功能正常的角膜内皮特征。因此，本发明提供的角膜内皮细胞可被作为制剂提供，这意指本发明提供了角膜内皮制剂。因此，本发明提供了制备角膜内皮制剂的方法，包括使用包含本发明的试剂或组合物的培养溶液或其上包被有本发明的试剂或组合物的培养容器来培养角膜内皮细胞的步骤。

在一方面，本发明的角膜内皮制剂包含基质材料(basematerial)，以及在所述基质材料上的角膜内皮细胞层。

用于本发明中的基质材料不受特别限制，只要它可支持所培养的角膜内皮细胞层，并且在移植后在体内维持其形状达给定的时间段，优选地至少3天。此外，用于本发明中的基质材料可以是在试管中培养角膜内皮细胞时发挥支架作用的那些材料，或者可以是在培养后仅具有支持角膜内皮细胞层的作用的那些材料。优选地，用于本发明中的基质材料为具有支架作用的那些材料，所述支架用于培养角膜内皮细胞并在培养完成后直接接受移植。

用于本发明中的基质材料包括，例如，来自天然产品的高聚物材料，例如胶原、明胶和纤维素；合成的大分子材料，例如聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯和聚(N-异丙基丙烯酰胺)；生物可降解的聚合物材料，例如聚乳酸和聚乙醇酸；羟基磷灰石、羊膜(amnion)等。

用于本发明中的基质材料的形状不受特别限制，只要它支持角膜内皮细胞层并且是适合于移植的形状。但是，所述形状优选地为片状。当本发明的制剂为片状时，可在移植时对其进行切割并制成与施用位置一致的大小。此外，也可将所述片状物紧紧卷起并插入到创口中。作为优选的具体实例，举例说明了圆形形状，其覆盖了受损伤的角膜上皮区域的约80％。此外，也优选地切开所述圆的周围部分以紧密附着于施用位置。

在一个优选的实施方案中，用于本发明的基质材料的实例是胶原。对于胶原，可优选地使用日本公开No.2004-24852中所述的胶原片层。例如，可根据日本公开No.2004-24852中所述的方法从羊膜制备所述胶原片层。

在下文中将描述角膜内皮细胞层的制备，其作为角膜内皮制剂的实例。

用于本发明中的角膜内皮细胞层优选地包括以下特征的至少一个。更优选地，用于本发明中的角膜内皮细胞层包括以下特征的两个或多个。仍然更优选地，用于本发明中的角膜内皮细胞层包括以下特征的全部。

(1)所述细胞层具有单层结构。这是活体生物的角膜内皮细胞层所包含的特征之一。

(2)细胞层中的细胞密度为约1000至约4000个细胞/mm²。具体而言，当成年人是受体时，所述细胞密度优选地为约2000至约3000个细胞/mm²。

(3)组成所述细胞层的细胞的平面形状基本上是六边形。这是活体生物中组成角膜内皮细胞层的细胞所包含的特征之一。本发明的制剂类似于活体生物的角膜内皮细胞层，其能够发挥与天然的角膜内皮细胞层相似的功能，也能够发挥体内生长能力。

(4)所述细胞在细胞层中规则排列。在活体生物的角膜内皮细胞层中，组成所述层的细胞规则排列。因此，认为将维持角膜内皮细胞的正常功能和高透明度，并适当地发挥角膜的润湿功能。因此，通过包括所述形态特征，预期本发明的制剂将发挥与活体生物中的角膜内皮细胞层的功能相似的功能。

本发明的制备方法包括使用本发明的试剂、组合物或容器来培养角膜内皮细胞的步骤，并且可通过例如以下方法来实施。

<1>在试管中收集和培养角膜内皮细胞

使用常规方法从受体自身或适合供体的角膜收集角膜内皮细胞。考虑到本发明的移植条件，可制备来自相同种族的角膜内皮细胞。例如，从角膜的薄壁组织剥脱角膜组织的后弹性层和内皮细胞层，将其转移至培养皿并用中性蛋白酶等处理。因此，角膜内皮细胞将从后弹性层脱落。可通过移液(pipetting)等使残留在后弹性层上的角膜内皮细胞脱落。移除后弹性层之后，在本发明的培养溶液中培养角膜内皮细胞。对于培养物或培养溶液，例如，可使用以下试剂：FBS(胎牛血清)(例如，BIOWEST，目录编号：S1820-500)、b-FGF(碱性成纤维细胞生长因子)(例如，INVITROGEN，目录编号：13256-029)，可适当地将抗生素物质(例如，青霉素和链霉素)添加到可商购的DMEM(达尔贝科改良伊格尔培养基)(例如，INVITROGEN，目录编号：12320等)中，然后添加本发明的培养标准化物(culturenormalizer)的组分。通过包被本发明的试剂以进行培养，促进角膜内皮细胞粘附到培养容器的表面，从而进行有利的生长。此外，当通过将层粘连蛋白添加到培养溶液中进行培养时，优选地使用培养皿，所述培养皿的表面包被有I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或牛角膜内皮细胞的胞外基质等。或者，可使用采用可商购的包被试剂(例如，FNC包被混合物(50ml(AES-0407)，ATHENA，目录编号：0407))处理的常规培养容器。培养角膜内皮细胞的温度条件不受特别限制，只要角膜内皮细胞生长。例如，温度在约25℃至约45℃的范围内，当考虑生长效率时，优选地为约30℃至约40℃，仍然优选约37℃。在常规细胞培养箱中，在增湿的约5至10％CO₂浓度的环境中进行所述培养方法。

<2>传代培养

在使接受培养的角膜内皮细胞生长之后，可进行传代培养。优选地，在近汇合或汇合时进行传代培养。可如下进行传代培养。首先，用胰蛋白酶-EDTA等处理细胞，从而使得从培养容器的表面移出细胞。然后收集细胞。将本发明的培养标准化物或培养基添加到所收集的细胞中以获得细胞悬液。优选地在收集细胞时或收集后进行离心处理。所述离心处理使得能够制备具有高细胞密度的细胞悬液。优选地细胞密度为约1-2×10⁶个细胞/ml。注意，所述离心处理的条件包括但不限于，例如，500rpm(30g)至1000rpm(70g)，离心1至10分钟。

将所述细胞悬液接种至与上述初始培养的容器类似的培养容器，因此对其进行培养。尽管传代培养的稀释率根据细胞的状态而改变，但是所述稀释率为约1:2至1:4，优选1:3。可在与上述初始培养的条件类似的培养条件下进行传代培养。孵育时间根据待使用的细胞的状态等而改变，但是例如为7至30天。可根据需要多次进行上述传代培养。当在本发明的试剂、组合物、培养基或容器中使用促进细胞粘附的试剂(例如，ROCK抑制剂等)时，可增强培养初期的细胞粘附，从而可缩短培养期。

<3>角膜内皮细胞层的制备

将所述细胞悬液接种到基质材料(例如，胶原片层)上以进行培养。在这一阶段，调整待接种的细胞数目，从而在最终制备的角膜内皮制剂中形成所需的细胞层的细胞密度。具体而言，接种所述细胞，从而使得形成细胞密度在约1000至约4000个细胞/mm²范围内的细胞层。在与上述初始培养条件类似的条件下进行所述培养。孵育时间根据待使用的细胞的状态而改变，但是，例如，3至30天。

通过如上所述进行培养，获得角膜内皮制剂，其中在试管中培养的角膜内皮细胞层是在基质材料上形成。

在本发明中，所述角膜内皮制剂可包含本发明的试剂或组合物，或包含它们中任一种的培养基，或者可将所述角膜内皮制剂维持在包含它们中任一种的容器中，以培养角膜内皮细胞或使其生长。所述角膜内皮制剂可包含本发明的试剂或组合物，或包含它们中任一种的培养基，或者可将所述角膜内皮制剂维持在包含它们中任一种的容器中，直至进行移植。本发明可包括角膜内皮制剂、本发明的试剂或组合物，或包含它们中任一种的培养基；或者，本发明提供了与包含它们中任一种的容器的组合。

可将通过本发明的制备方法获得的角膜内皮制剂作为移植物用于治疗需要移植角膜内皮的疾病，例如，大泡性角膜病变、角膜水肿、角膜白斑，特别是角膜营养不良，以及由于外部损伤或内部眼科手术导致的角膜内皮病症而引起的大泡性角膜病变。除了手术以外，所述大泡性角膜病变、角膜内皮病症等的原因还包括Fuchs角膜内皮营养不良、假鳞片样剥脱综合征、角膜内皮炎等。

给予本发明的角膜内皮制剂的受试者包括哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、奶牛、绵羊、猴等)，优选灵长类动物(例如，人)。

(角膜内皮疾病、疾患或病症的治疗和预防)

本发明提供了用于治疗或预防角膜内皮疾病、疾患或病症的药物，其包含通过培养角膜内皮细胞或使其生长的方法而产生的角膜内皮细胞，所述方法包括使用本发明的试剂、组合物或培养基或容器培养角膜内皮细胞的步骤。应理解，能够以本文所述的任何形式使用本发明的试剂、组合物或培养基或容器。例如，可考虑本文所述的内容，例如，(用于培养角膜内皮细胞或使其生长的组合物)、(用于培养角膜内皮细胞的方法)和(角膜内皮细胞和角膜内皮制剂)。此外，应理解，用作药物的角膜内皮细胞可采用本文使用的任何形式。例如，可考虑(角膜内皮细胞和角膜内皮制剂)中所述的内容。

在一个实施方案中，本发明的药物用于治疗和预防灵长类动物的角膜内皮的目的。优选地，所述治疗或预防的对象为人角膜内皮。

在一个实施方案中，本发明的药物中使用的角膜内皮细胞来自灵长类动物。优选地，本发明的药物中使用的角膜内皮细胞来自人。

在一个实施方案中，本发明的药物所针对的角膜内皮疾病、疾患或病症是大泡性角膜病变、角膜内皮炎、角膜水肿、角膜白斑等。

在一个实施方案中，本发明的药物以片状形式或作为悬液提供。

在一个实施方案中，本发明的药物还包括促进细胞粘附的试剂。促进细胞粘附的试剂对从角膜组织分离的角膜内皮细胞或分离并传代培养的角膜内皮细胞发挥促进粘附的作用。可将所述促进细胞粘附的试剂与作为药物提供的角膜内皮细胞一起或分开提供。在一个具体的实施方案中，本发明的药物中使用的促进细胞粘附的试剂包括Rho激酶抑制剂。Rho激酶抑制剂包括以下文献中公开的化合物：美国专利No.4678783、日本专利No.3421217、国际公开No.WO95/28387、国际公开No.WO99/2062、国际公开No.WO99/6140、国际公开No.WO02/076976、国际公开No.WO02/076977、国际公开No.WO2002/083175、国际公开No.WO02/100833、国际公开No.WO03/059913、国际公开No.WO03/062227、国际公开No.WO2004/009555、国际公开No.WO2004/022541、国际公开No.WO2004/108724、国际公开No.WO2005/003101、国际公开No.WO2005/039564、国际公开No.WO2005/034866、国际公开No.WO2005/037197、国际公开No.WO2005/037198、国际公开No.WO2005/035501、国际公开No.WO2005/035503、国际公开No.WO2005/035506、国际公开No.WO2005/080394、国际公开No.WO2005/103050、国际公开No.WO2006/057270和国际公开No.WO2007/026664。所述化合物可通过每篇所公开的参考文献中所述的方法制备并且包括，例如，1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪或其盐(例如，法舒地尔(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪))，以及(+)–反式-4-(1-氨乙基)-1-(4-吡啶基氨甲酰基)环己烷甲酰胺或其盐(例如，Y-27632((R)-(+)–反式-(4-吡啶基)-4-(1-氨乙基)-环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物))。

给予(移植)本发明的药物或方法的靶标包括哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、奶牛、绵羊、猴等)。但是，优选灵长类动物，特别优选人。对于灵长类动物，角膜内皮治疗尚未取得令人满意的结果。在这个意义上，本发明提供了开创性的治疗方法和药物。

在另一方面，本发明提供了用与治疗或预防角膜内皮疾病、疾患或病症的方法，包括使用通过以常规方式培养角膜内皮细胞的方法而产生的角膜内皮细胞的步骤，所述方法包括使用本发明的试剂、组合物、培养基或容器培养角膜内皮细胞的步骤。

本文中引用的所提及的参考文献，例如，科学出版物、专利和专利申请，以引用的方式全文纳入本文，所述引用方式与每篇参考文献的内容具体地记载于其中的方式相同。

如上所述，在提供优选的实施方案的同时对本发明进行描述以有助于理解。在下文中，将根据实施例对本发明进行描述。但是，提供以上说明和以下实施例的目的仅为举例说明，而非限制本发明。因此，本发明的范围仅通过权利要求来限定，而非通过本文具体记载的实施方案或实施例来限定。

[实施例]

在下文中将描述实施例，在实施例中对本发明的角膜内皮细胞进行常规培养。当适用时，遵守厚生劳动省(MinistryofHealth,LabourandWelfare)、文部科学省(MinistryofEducation,Culture,Sports,ScienceandTechnology)等针对处理生物样品等设置的标准，并且当适用时，根据《赫尔辛基宣言》或基于《赫尔辛基宣言》生成的伦理规定进行所述处理。对于用于研究的眼的捐献，从所有已故捐赠者的近亲属获得同意书。本研究获得SightLife^TM(美国华盛顿州，西雅图)眼库的伦理审查的许可。

(实验方法：研究级的人角膜组织)

分别从SightLife^TM眼库获得12个人供体角膜，在原代培养之前在4℃下将全部角膜保存在保藏培养基(Optisol；ChironVisionCorporation,Irvine,CA)中少于14天的时间。

(统计分析)

使用Student’st-检验的t-检验确定两个样品比较的平均值中的统计学上显著差异(P值)。使用Dunnett’s多重比较检验来分析多个样品组的比较中的统计学上显著差异。图表中所示的值代表平均值±SE。

(实施例1：层粘连蛋白链和整联蛋白链在角膜内皮细胞和后弹性层中的表达)

在本实施例中，观察到层粘连蛋白链在后弹性层——其为角膜内皮细胞的基底膜——中的表达。

(材料和方法)

使用PCR法进行层粘连蛋白链mRNA的表达。尽管未示出数据，但通过免疫染色确认了蛋白的表达。

用PBS稀释二级抗体，在室温下孵育所得溶液30分钟。将Alexa^TMFluor488标记的(缀合的)山羊抗兔IgG(目录编号：A11034；1:1500；MolecularProbe-Invitrogen)用作二级抗体。在振荡并用0.15％Triton/PBS冲洗两次及用PBS冲洗一次之后，使用碘化丙锭(目录编号：SP29004-41；PI；NacalaiTesque,Inc.Kyoto,Japan)进行核染色，并且通过用盖玻片覆盖来包埋所述二级抗体。使用共焦激光扫描显微镜(OlympusFluoview,Tokyo,Japan)观察荧光标记的二级抗体并拍照。

用于PCR法中的层粘连蛋白链的引物序列示于下表1中。用于PCR法中的整联蛋白链的引物序列示于下表2中。所述引物是从LifeTechnologiesJapanLtd.获得(目录编号：10336022)。

表1：PCR的寡核苷酸序列

表2：PCR的寡核苷酸序列

*PCR法：通过RT-PCR(半定量逆转录聚合酶链式反应)对每种层粘连蛋白链和整联蛋白链进行PCR法。引物购自寡核苷酸合成公司INVITROGEN，并且使用那些已进行脱盐处理的引物。RNEasyMini试剂盒(QIAGENGmbh，目录编号：74106)用于从细胞中提取总RNA。从购自西雅图眼库的用于研究的角膜剥脱包含角膜内皮细胞的后弹性层，并且从基底膜机械剥脱角膜内皮细胞以用于从所述角膜内皮细胞中提取RNA。使用ReverTraAce(ToyoboCo.,Ltd.(目录编号：TRT-101))对RNA进行逆转录反应(42℃，60分钟)，使用DNA聚合酶的TAKARATaqHotStart版本(TakaraBioInc.，目录编号：RR001A)，将GAPDH作为内标，扩增CD166和CD73。通过PCR设备(GeneAmp9700；AppliedBiosystems)和以下引物对扩增相同量的cDNA。在PCR反应中，使用表1、表2中所示的引物和以下所述的引物。

*GAPDH-F:GAGTCAACGGATTTGGTCGT(SEQIDNO:85)

*GAPDH-R:TTGATTTTGGAGGGATCTCG(SEQIDNO:86)

使用1.5％琼脂糖凝胶(NacalaiTesque，目录编号：01149-76)对经扩增的cDNA片段进行电泳，并通过溴化乙锭(NacalaiTesque，目录编号：14603-51)染色检测所述片段。

*流式细胞术：将经培养的人角膜内皮接种到包被有FNC包衣的培养皿并在37℃、5％CO₂的条件下培养约14天直至达到汇合状态。使用TrypLE^TMSelect剥脱细胞并收集细胞。然后，根据指导手册使用流式细胞仪(BDFACSCanto^TMII(BDBiosciences,FranklinLakes,NJ))对整联蛋白链的表面抗原进行分析，同时使用人细胞表面标记物筛选板(BDLyoplate^TM,BDBio-sciences,FranklinLakes,NJ)。

如下所述培养人角膜内皮细胞。从购自西雅图眼库的用于研究的角膜剥脱包含角膜内皮细胞的后弹性层，并且从基底膜机械剥脱角膜内皮细胞。使用胶原酶(ROCHE，目录编号：10103586001)从基底膜分离(通常在37℃下使用1mg/ml胶原酶A(RocheAppliedScience)处理2小时)和收集细胞之后，进行原代培养。对于培养基，使用其中针对3T3饲养细胞对以下进行条件化(conditioned)的培养基：Opti-MEMI-Reduced-SerumMedium，液态(INVITROGEN，目录编号：31985-070)+8％胎牛血清(FBS)(BIOWEST，目录编号：S1820-500)+200mg/mlCaCl₂·2H₂O(SIGMA，目录编号：C7902-500G)+0.08％硫酸软骨素(SIGMA，目录编号：C9819-5G)+20μg/ml抗坏血酸(SIGMA，目录编号：A4544-25G)+50μg/ml庆大霉素(INVITROGEN，目录编号：15710-064)+5ng/mlEGF(INVITROGEN，目录编号：PHG0311)。具体而言，在37℃下消化之后，将从单个角膜获得的HCEC重悬于培养基中并铺板在包被有FNCCoatingMix^TM的12孔板的一个孔中。根据公开的方案制备所述培养基，对所述方案增加部分改变。简言之，制备基本培养基，其包含OptiMEM-I(LifeTechnologies)、8％FBS、5ng/ml表皮生长因子(EGF)(Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MO)、1μΜSB431542(MerckMillipore)、20μg/ml抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、200mg/L氯化钙(Sigma-Aldrich)、0.08％硫酸软骨素(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.,Osaka)和50μg/ml庆大霉素。接下来，在培养灭活的3T3成纤维细胞之后收集条件化的培养基。如上文所述进行3T3成纤维细胞的灭活。简言之，使用4μg/ml丝裂霉素C(MMC)(KyowaHakkoKirinCo.,Ltd.,Tokyo)在37℃、5％CO₂下孵育汇合的3T3成纤维细胞2小时，然后用胰蛋白酶处理所得细胞，并以2×10⁴个细胞/cm²的密度将其铺板在塑料平板上。在37℃、5％CO₂的增湿空气中培养HCEC，每3天更换培养基。当HCEC在14-28天中达到汇合状态时，在无Ca²⁺和Mg²⁺的PBS中冲洗HCEC，在37℃下用0.05％胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶处理5分钟，然后以1:2的比例传代培养。

(结果)

当观察到层粘连蛋白链在后弹性层(角膜内皮细胞基底膜)中的表达时，层粘连蛋白α5链、层粘连蛋白β1链和层粘连蛋白γ1链的表达是显著的。另一方面，层粘连蛋白α1链、层粘连蛋白α2链和层粘连蛋白α3链的表达是不明显的(数据未示出)。

如图1所示，当观察到人角膜内皮细胞的层粘连蛋白链的mRNA表达时，层粘连蛋白α5链、层粘连蛋白β1链、层粘连蛋白β2链和层粘连蛋白γ1链的表达是显著的。另一方面，层粘连蛋白α1链、层粘连蛋白α2链、层粘连蛋白α3链、层粘连蛋白α4链、层粘连蛋白β3链、层粘连蛋白γ2链和层粘连蛋白γ3链的表达是不明显的。

如图2所示，识别出整联蛋白α1链、整联蛋白α2链、整联蛋白α3链、整联蛋白α6链、整联蛋白α10链、整联蛋白α11链、整联蛋白β1链、整联蛋白β5链、整联蛋白β8链和整联蛋白αV链的表达。也识别出整联蛋白β3链、整联蛋白β4链和整联蛋白β6链的少量表达。因此，以上内容表明，角膜内皮细胞表达α1β1、α2β1、α3β1、α6β1、α7β1和α6β4——已知它们是结合层粘连蛋白的整联蛋白——中的至少一种。

如图3(图3A、3B和3C)所示，整联蛋白α1链、整联蛋白α2链、整联蛋白α3链、整联蛋白α5链和整联蛋白β1链的表达被识别为作为表面抗原的表达。

(实施例2：促进人角膜内皮细胞的细胞粘附)

在本实施例中，包被有层粘连蛋白等的培养容器用于确认是否有助于人角膜内皮细胞的细胞粘附。

(材料和方法)

*层粘连蛋白511(LN511，VERITAS公司)

*层粘连蛋白521(LN521，VERITAS公司)

*层粘连蛋白511-E8片段(382-02413,Nippi.Inc.)

*FNCcoating(50ml(AES-0407)，ATHENA，目录编号：0407)

*明胶(G1890-500G,Sigma-AldrichCo.LLC.)

*容器(3526,CORNING)

(方法)*人角膜内皮细胞(HCEC，来源和培养方法)：如以上所述的实施例1进行HCEC培养。在无Ca²⁺和Mg²⁺的PBS中冲洗经培养的细胞，并在37℃下用0.05％胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶化5分钟，然后接种到包被有FNCCoating的12孔板中。根据公布的方案制备培养基，对所述方案增加部分改变。简言之，制备基础培养基，其包含OptiMEM-I(LifeTechnologies)、8％FBS、5ng/ml表皮生长因子(EGF)(Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MO)、10μMSB431542(MerckMillipore)、20μg/ml抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、200mg/L氯化钙(Sigma-Aldrich)、0.08％硫酸软骨素(WakoPureChemicalIndustries、Ltd.,Osaka)和50g/ml庆大霉素。然后，培养灭活的3T3成纤维细胞之后，回收条件化的培养基。如以上所述进行3T3成纤维细胞的灭活。简言之，在37℃、5％CO₂的条件下将汇合的3T3成纤维细胞与4μg/ml丝裂霉素C(MMC)(KyowaHakkoKirinCo.,Ltd.,Tokyo)一起孵育2小时，然后进行胰蛋白酶处理，并以2×10⁴个细胞/cm²的密度将其铺板在塑料平板上。在37℃、5％CO₂的增湿空气中培养HCEC，每3天更换培养基。

(方法)将HCEC接种到包被有层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白211、明胶、FNCCoating的96孔板的每个孔中，24小时后使用相差显微镜观察所形成的细胞。以5000个细胞/孔的接种密度接种到96孔培养板，在细胞接种后24小时使用发光细胞存活测定法(PromegaCorporation,Madison,WI,USA)检查粘附的细胞的数目。此外，评估包被有层粘连蛋白511-E8片段(0.001-1.5μg/cm²)的培养板的细胞粘附。此外，将各种浓度的层粘连蛋白521和层粘连蛋白511-E8片段添加到用于接种的培养基中，并以类似方式对24小时后的细胞数目进行评估。

(通过BrdU吸收测量细胞生长)

类似地，通过ELISA评估包被有各种基质的HCEC的BrdU吸收。以5000个细胞/孔的接种密度接种到96孔培养板，然后过夜培养。然后，将5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)添加到培养基中，然后过夜培养。除去培养基，添加固定液(Amersham细胞增殖biotrakELISA系统，版本2)以在室温下孵育30分钟。然后，除去固定液，添加封闭液(Amersham细胞增殖biotrakELISA系统，版本2)，然后在室温下孵育30分钟。接着除去封闭液，添加过氧化酶缀合的抗BrdU抗体，然后在室温下孵育90分钟。使用洗涤缓冲液冲洗平板三次，添加TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)基质(Amersham细胞增殖biotrakELISA系统，版本2)，然后孵育5至30分钟。使用1M硫酸终止反应，使用酶标仪(platereader)测量450nm处的吸光度。结果表示为5次测量的平均值±标准误差。

(结果)

如图4所示，在存在层粘连蛋白511和层粘连蛋白521的情况下，有利于角膜内皮细胞的粘附和延伸，而在其他条件下不利于生长。

如图5所示，与其他条件相比，在存在层粘连蛋白511和层粘连蛋白521的情况下，有利于角膜内皮细胞的细胞粘附。

如图6所示，与其他条件相比，在存在层粘连蛋白511-E8片段的情况下，有利于角膜内皮细胞的细胞生长。具体而言，在0.1至1.5μg/cm²的浓度下有利地促进了细胞粘附。

如图7所示，与其他条件相比，在存在层粘连蛋白511、层粘连蛋白521和层粘连蛋白511-E8片段的情况下，有利于角膜内皮细胞的细胞生长。

(实施例3：层粘连蛋白511和层粘连蛋白521在人角膜内皮细胞的细胞培养中的功能分析)

在本实施例中，进行层粘连蛋白511和层粘连蛋白521在人角膜内皮细胞的细胞培养中的功能分析。

(材料和方法)

*人角膜内皮细胞(HCEC，来源和培养方法)：如下进行HCEC的培养。简言之，从购自西雅图眼库的用于研究的角膜剥脱包含角膜内皮细胞的后弹性层；然后机械剥脱基底膜与角膜内皮细胞，然后使用胶原酶(ROCHE，目录编号：10103586001)从基底膜剥脱角膜内皮细胞(通常在37℃下使用1mg/ml胶原酶A(RocheAppliedScience)处理2小时)。回收后，进行原代培养。在原代培养中，铺板到包被有层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白211、FNCCoating的12孔板的1个孔中。对于培养基，使用与实施例1中的培养基相同的培养基。使用相差显微镜观察细胞一段时间。

*染色等细胞观察方法(组织学测试)：固定经培养的HCEC之后，使用ZO-1、Na+/K+-ATP酶作为功能相关的标记物，进行免疫染色，然后使用荧光显微镜进行观察。在室温(RT)下使用4％甲醛固定HCEC10分钟，然后用1％胎牛血清(BSA)孵育30分钟。对紧密连接相关蛋白ZO-1和泵功能相关蛋白Na⁺/K⁺-ATP酶进行免疫组织化学分析。以1:200稀释度使用每种一级抗体。对于二级抗体，使用1:2000稀释度的AlexaFluor^TM488标记的或AlexaFluor^TM594标记的山羊抗小鼠IgG(LifeTechnologies)。然后，使用DAPI(VectorLaboratories,Inc.,Burlingame,CA)对细胞核进行染色。然后，使用荧光显微镜(BZ-9000；Keyence,Osaka,Japan)观察载玻片。

*Na+/K+-ATP酶的抗体：使用MILLIPORE(MILLIPORE目录编号：05-369)制备的那些抗体。

*ZO-1的抗体：使用RabbitZYMEDLABORATORIES(ZYMEDLABORATORIES目录编号：61-7300)制备的那些抗体。

如图8所示，层粘连蛋白511和层粘连蛋白521被证明可使人角膜内皮细胞的细胞培养更有效。相差显微镜的照片示出原代培养2天后的细胞。

如图9所示，层粘连蛋白511和层粘连蛋白521被证明可允许具有高细胞密度的人角膜内皮细胞的细胞培养。相差显微镜的照片示出原代培养20天后的细胞。

如图10和11所示，层粘连蛋白511和层粘连蛋白521被证明可保持ZO-1和Na⁺/K⁺-ATP酶的活性，并且证明了使用本发明方法进行的培养允许在生长的同时维持正常功能。与层粘连蛋白211和未包被的对照相比，层粘连蛋白511和层粘连蛋白521中的细胞密度更高。

如图12所示，将各种浓度的层粘连蛋白521和层粘连蛋白511-E8片段添加到待接种的培养基中，因此促进了角膜内皮细胞的细胞粘附。

(实施例4：示例性制剂：用与制备角膜内皮片层的培养溶液)

在本实施例中，作为制剂的实例，如下所述制备包含本发明试剂的培养溶液，所述培养溶液用于制备角膜内皮片层。

使用常规方法制备以下所示的培养溶液。

层粘连蛋白511、层粘连蛋白521和/或其片段(0.75μg/cm²)

胎牛血清(FBS)10ml

青霉素-链霉素溶液1ml

碱性FGF200ng

DMEM适量

总量100ml

例如，可将BIOWEST(目录编号：S1820-500)或Invitrogen制备的那些用于FBS。对于青霉素-链霉素溶液，可使用NacalaiTesque制备的那些(包含青霉素5000μg/ml，链霉素5000μg/ml)。此外，例如，对于碱性FGF，可使用Invitrogen制备的那些(INVITROGEN，目录编号：13256-029)。对于SB431542，可使用TocrisCooksonLtd.制备的那些，对于SB203580，可使用商标CALBIOCHEM的那些。对于DMEM，可使用Invitrogen制备的那些。

(实施例5：示例性制剂：用于保存或扩增角膜的容器的组合物)

在本实施例中，作为制剂的实例，如下所述制备用于包被容器的溶液，其包含本发明的试剂。

通过常规方法制备以下所示的保存溶液。

层粘连蛋白511、层粘连蛋白521和/或其片段(0.75μg/cm²)

适合的缓冲液适量

总量100ml

可以与实施例4类似的方式获得每种成分。

如以上所述，通过使用本发明的优选实施方案来举例说明本发明。但是，应理解，本发明的范围应当仅根据权利要求来解释。此外，应理解，本文引用的任何专利、任何专利申请和任何文献以引用的方式纳入本文，所述引用方式与所述内容具体记载于其中的方式相同。本申请要求2013年11月27日提交的日本专利申请No.2013-244972的优先权，该专利申请以引用的方式全文纳入本文。

[工业应用]

本申请提供了用于促进角膜内皮细胞生长的培养组分和培养方法。本申请提供了在与角膜移植相关技术有关的工业(细胞培养工业、制药业等)中可用的技术。

(序列表独立文本)

SEQIDNO:1层粘连蛋白α5链核酸序列(NM_005560)

SEQIDNO:2层粘连蛋白α5链氨基酸序列(NP_005551)

SEQIDNO:3层粘连蛋白β1链核酸序列(NM_002291)

SEQIDNO:4层粘连蛋白β1链氨基酸序列(NP_002282)

SEQIDNO:5层粘连蛋白β2链核酸序列(NM_002292)

SEQIDNO:6层粘连蛋白β2链氨基酸序列(NP_002283)

SEQIDNO:7层粘连蛋白γ1链核酸序列(NM_002293)

SEQIDNO:8层粘连蛋白γ1链氨基酸序列(NP_002284)

SEQIDNO:9层粘连蛋白α1链正义引物序列:5'-GAGTCCGTCTCTCTGGACATAG-3'

SEQIDNO:10层粘连蛋白α1链反义引物序列:5'-CGTGGCATTCACAGGGTTGAC-3'

SEQIDNO:11层粘连蛋白α2链正义引物序列:5'-TGCTAGAATTTACCTCCGCTCG-3'

SEQIDNO:12层粘连蛋白α2链反义引物序列:5'-GATCAAGTGGACAAGCCCTG-3'

SEQIDNO:13层粘连蛋白α3链正义引物序列:5'-CTCCAAAGGCCCAACTCAAG-3'

SEQIDNO:14层粘连蛋白α3链反义引物序列:5'-CCATAACTGCCTCCTTAGTCTC-3'

SEQIDNO:15层粘连蛋白α4链正义引物序列:5'-CTTACGCAACACCACCGGATTC-3'

SEQIDNO:16层粘连蛋白α4链反义引物序列:5'-CCTTCTTCCAAGCATTCTCCG-3'

SEQIDNO:17层粘连蛋白α5链正义引物序列:5'-GAGGACTGAAGTGAAAACTCAA-3'

SEQIDNO:18层粘连蛋白α5链反义引物序列:5'-CCACTGAAGTTGTAAATGGTG-3'

SEQIDNO:19层粘连蛋白β1链正义引物序列:5'-GATGGTGAACTTGATGAAAAGT-3'

SEQIDNO:20层粘连蛋白β1链反义引物序列:5'-GGCTTATATCCTTTAGGAGTGA-3'

SEQIDNO:21层粘连蛋白β2链正义引物序列:5'-GATGATCGCATCCAAGGGAC-3'

SEQIDNO:22层粘连蛋白β2链反义引物序列:5'-GTCCAGAGTAGGGAGTCTCAG-3'

SEQIDNO:23层粘连蛋白β3链正义引物序列:5'-CCCAGATGGAGGAAGATGTC-3'

SEQIDNO:24层粘连蛋白β3链反义引物序列:5'-GTAGCTGAGTCTGTGGGCAG-3'

SEQIDNO:25层粘连蛋白β4链正义引物序列:5'-GGCAGGCTACTTTGGATTTC-3'

SEQIDNO:26层粘连蛋白β4链反义引物序列:5'-GCTTGAGGGATCATCTGGAC-3'

SEQIDNO:27层粘连蛋白γ1链正义引物序列:5'-GATGAGATGGTGACAGATCAAG-3'

SEQIDNO:28层粘连蛋白γ1链反义引物序列:5'-TTTCCAGTCTCTTCAATGGTAT-3'

SEQIDNO:29层粘连蛋白γ2链正义引物序列:5'-ATCGAAGGTTACTGCGGAATC-3'

SEQIDNO:30层粘连蛋白γ2链反义引物序列:5'-GTAGCCAGAAGCACAATCCTG-3'

SEQIDNO:31层粘连蛋白γ3链正义引物序列:5'-GGGATACAAGAGGGAGATGC-3'

SEQIDNO:32层粘连蛋白γ3链反义引物序列:5'-CATAGAAACCTGGCAAACAGC-3'

SEQIDNO:33整联蛋白α1链正义引物序列:5'-gaagaacctcctgaaacccttt-3'

SEQIDNO:34整联蛋白α1链反义引物序列:5'-tgatgtcatattggggaatgaa-3'

SEQIDNO:35整联蛋白α2链正义引物序列:5'-tgatgggacagaagtaacatgc-3'

SEQIDNO:36整联蛋白α2链反义引物序列:5'-tggaccaacatcttcaaaactg-3'

SEQIDNO:37整联蛋白α3链正义引物序列:5'-gctctgcctttggtttatctgt-3'

SEQIDNO:38整联蛋白α3链反义引物序列:5'-ttcccactagaaggtctgggta-3'

SEQIDNO:39整联蛋白α4链正义引物序列:5'-atattcagtcggagctggtcat-3'

SEQIDNO:40整联蛋白α4链反义引物序列:5'-gcatatttgtcacttccaacga-3'

SEQIDNO:41整联蛋白α5链正义引物序列:5'-tcctcagcaagaatctcaacaa-3'

SEQIDNO:42整联蛋白α5链反义引物序列:5'-gttgagtcccgtaactctggtc-3'

SEQIDNO:43整联蛋白α6链正义引物序列:5'-agcaaggcagatggaataatgt-3'

SEQIDNO:44整联蛋白α6链反义引物序列:5'-cagggtaggaatttcgatcaag-3'

SEQIDNO:45整联蛋白α7链正义引物序列:5'-caggtcaccttctacctcatcc-3'

SEQIDNO:46整联蛋白α7链反义引物序列:5'-accgtgacctcatacttgacct-3'

SEQIDNO:47整联蛋白α8链正义引物序列:5'-atggaaaatgtaaccaggatgg-3'

SEQIDNO:48整联蛋白α8链反义引物序列:5'-cagttatgaatgggcagaacaa-3'

SEQIDNO:49整联蛋白α9链正义引物序列:5'-cactttcagcccatcaatatca-3'

SEQIDNO:50整联蛋白α9链反义引物序列:5'-acagtgtgctgttaggcaagaa-3'

SEQIDNO:51整联蛋白α10链正义引物序列:5'-atcagtgtggttcagagggact-3'

SEQIDNO:52整联蛋白α10链反义引物序列:5'-gccctggctttgtagtattgtc-3'

SEQIDNO:53整联蛋白α11链正义引物序列:5'-ggacactgctgactacgtgaag-3'

SEQIDNO:54整联蛋白α11链反义引物序列:5'-gcgtgtgctctctatgatgaag-3'

SEQIDNO:55整联蛋白αE链正义引物序列:5'-tagcagtgaagaagctgacgag-3'

SEQIDNO:56整联蛋白αE链反义引物序列:5'-tctttcaggaagacgacagtga-3'

SEQIDNO:57整联蛋白αV链正义引物序列:5'-atctgtgaggtcgaaacaggat-3'

SEQIDNO:58整联蛋白αV链反义引物序列:5'-accttgccaataaaagctacca-3'

SEQIDNO:59整联蛋白αL链正义引物序列:5'-gaaccattgacaccagaagtga-3'

SEQIDNO:60整联蛋白αL链反义引物序列:5'-ttcttcaaaccccaactgtctt-3'

SEQIDNO:61整联蛋白αM链正义引物序列:5'-gatcggctaagagaaggacaga-3'

SEQIDNO:62整联蛋白αM链反义引物序列:5'-cattgccacaattcttctcaaa-3'

SEQIDNO:63整联蛋白αX链正义引物序列:5'-ccaacatctgcctttacattga-3'

SEQIDNO:64整联蛋白αX链反义引物序列:5'-cgtgaagtatctctgagcatcg-3'

SEQIDNO:65整联蛋白αD链正义引物序列:5'-ttaaccagatgaagggctttgt-3'

SEQIDNO:66整联蛋白αD链反义引物序列:5'-ggtctttgtacttctgcccatc-3'

SEQIDNO:67整联蛋白αIIb链正义引物序列:5'-gaaaagactgaggaggctgaga-3'

SEQIDNO:68整联蛋白αIIb链反义引物序列:5'-gagaaaatatccgcaactggag-3'

SEQIDNO:69整联蛋白β1链正义引物序列:5'-gctgaagactatcccattgacc-3'

SEQIDNO:70整联蛋白β1链反义引物序列:5'-atttccagatatgcgctgtttt-3'

SEQIDNO:71整联蛋白β2链正义引物序列:5'-tgatggacctctcctactccat-3'

SEQIDNO:72整联蛋白β2链反义引物序列:5'-gaaactggttggagttgttggt-3'

SEQIDNO:73整联蛋白β3链正义引物序列:5'-tgtttaccactgatgccaagac-3'

SEQIDNO:74整联蛋白β3链反义引物序列:5'-tcccataagcatcaacaatgag-3'

SEQIDNO:75整联蛋白β4链正义引物序列:5'-gcttcacacctatttccctgtc-3'

SEQIDNO:76整联蛋白β4链反义引物序列:5'-gaaggaaggtttcagatggatg-3'

SEQIDNO:77整联蛋白β5链正义引物序列:5'-gctggtgttcacaacagatgat-3'

SEQIDNO:78整联蛋白β5链反义引物序列:5'-atcccagactgacaactccact-3'

SEQIDNO:79整联蛋白β6链正义引物序列:5'-tgtgactgtggtgaatgtgtgt-3'

SEQIDNO:80整联蛋白β6链反义引物序列:5'-caccagctagtttgcacttgtc-3'

SEQIDNO:81整联蛋白β7链正义引物序列:5'-cacttcagacgacacattccat-3'

SEQIDNO:82整联蛋白β7链反义引物序列:5'-cccaactgcagacttaggaatc-3'

SEQIDNO:83整联蛋白β8链正义引物序列:5'-gcattatgtcgaccaaacttca-3'

SEQIDNO:84整联蛋白β8链反义引物序列:5'-atttcttcaggcttctcacgtc-3'

SEQIDNO:85GAPDH-F:GAGTCAACGGATTTGGTCGT

SEQIDNO:86GAPDH-R:TTGATTTTGGAGGGATCTCG

Claims

1.一种用于培养角膜内皮细胞或使其生长的组合物，其包含至少一种由在角膜内皮细胞中表达的层粘连蛋白及其片段组成的试剂。

2.权利要求1的组合物，其中所述层粘连蛋白包含层粘连蛋白511(α5β1γ1)和层粘连蛋白512(α5β2γ1)。

3.权利要求1的组合物，其中所述片段具有角膜内皮细胞的细胞粘附能力。

4.权利要求1的组合物，其中所述试剂是层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或层粘连蛋白511-E8片段。

5.权利要求1的组合物，其中所述角膜内皮细胞来自人。

6.一种用于培养角膜内皮细胞的培养基，其包含权利要求1的组合物。

7.一种用于角膜内皮细胞的培养容器，其被权利要求1的组合物包被。

8.一种用于培养角膜内皮细胞的方法，包括使用权利要求1的组合物的步骤。

9.一种用于培养角膜内皮细胞的方法，包括使用权利要求6的培养基的步骤。

10.一种用于培养角膜内皮细胞的方法，包括使用权利要求7的容器的步骤。