CN1057908C

CN1057908C - 透明质酸和透明质酸类防止动脉再狭窄的用途

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Publication number: CN1057908C
Application number: CN93119844A
Authority: CN
Inventors: R·E·福尔克; S·S·阿斯库莱; E·A·特利
Original assignee: Hyal Pharmaceutical Corp
Current assignee: Hyal Pharmaceutical Corp
Priority date: 1992-09-25
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 2000-11-01
Anticipated expiration: 2013-09-24
Also published as: DE69303931D1; EP0661981A1; GR3021171T3; NO951122L; MX9305887A; CN1092654A; ZA937068B; SK36895A3; BR9307221A; ATE141054T1; JPH08506797A; CA2079205C; TW271401B; ES2091031T3; HU9500857D0; JP3742955B2; AU670117B2; PL308201A1; IL107087A0; CZ66295A3

Abstract

预防动物管壁损伤低管壁狭窄，给该动物施用治疗有效量、无毒量的透明质酸和/或其盐和/或同等物，类似物、衍生物、复合物、酯，透明质酸片段，和亚单位来防止该管壁狭窄。

Description

透明质酸和透明质酸类防止动脉再狭窄的用途

本发明涉及管壁损伤后，动物管壁狭窄(狭窄)的预防。在一个实施方案中，本发明涉及在球形血管成形术后动物再狭窄的预防。

球形血管成形术是一种被广泛接受的扩张冠状动脉阻塞的方法。在20世纪60年代早期，实验中可导入球形导管，而在70年代末期首次将其用于临床。从那时起，它就在单和多枝冠状动脉疾病的治疗中起主要的治疗作用(Baumgartner，H.R.，1963，Z.Ges.Exp.Med.137：227)。然而，在一些成功地用球形血管成形术进行了治疗的患者中会发生动脉再狭窄。而这次动脉内经(ID)的狭窄是由球形血管成形术造成的损伤面积内的内皮细胞生长(增殖)引起的。因此，再阻塞不是由胆甾醇堵塞而是由于在动脉内壁上内皮细胞堆集减小了动脉内经(ID)导致梗塞引起的。在人体中，再狭窄损伤包括几乎全部的，即使血管平滑肌细胞也不除外(Glazier，J.J.，Williams，m.G.，Madden，S.and Rickards，A.F.，1990，J.Roy.Coll.Phys.Lors，24：292)。它们在动脉腔内的积累是细胞迁移和增殖的结果。这两种情况几乎肯定归因于在可能被在原组织损伤位点早期积累的巨噬细胞释放的若干不同的细胞激活素的协同相互作用。而这种管壁同径(ID)的狭窄或细胞增殖并不限于冠状动脉。也可能在例如外周血管系统发生手术后再狭窄。

在现有技术中，已提出了若干建议以防止再狭窄。

美国专利5,087,244(Wolinsky等人)声称教导了在其一端有一个无弹力球的导管的应用，其中，该球具微小的多个小孔并含有浓缩肝素溶液，在血管成形术后，通过接触动脉面的小孔而释放浓缩肝素溶液以防止再狭窄。

美国专利5,116,864(Hathaway等人)宣称教导了血管再通后，通过系统施用能被光活化的补骨脂素以得到能抑制平滑肌细胞生长的血清补骨脂素水平，从而防止外周或心血管系统再狭窄的方法。

美国专利5,092,841(Spears，J.R.)宣称教导了通过在壁和血管成形术导管间投放生物保护性物质以便在血管成形术导管排斥期间，将该生物保护性物质导入并渗入动脉壁的组和血管中，从而治疗血管成形术期间动脉壁的损伤。

EP.356275-A(Petiton等人)宣称教导了在抑制手术后再狭窄中，新的邻酰基化氨基葡糖聚糖衍生物的用途。

Berk，B.C.等人(J.Am.Coll.Cardiol，dated 1991Vol 17#6 Supplement B，pp111B-117B)讨论了冠状动脉血管成形术后肝素知糖皮质激素防止再狭窄的药理学作用。

WO9209561(Itoh等人)宣称教导了经皮经腔的冠状动脉血管成形术后新的ACAT抑制酰胺衍生物在治疗再狭窄方面的用途。

WO9208472(Scarborough等人)宣称教导了从蛇毒中得到的血小板抗粘着性肽对于防止血管成形术后再狭窄的用途。

WO9207852(Bovy等人)宣称教导了某些双苯基烷基黄嘌呤衍生物防止血管成形术后再狭窄的用途。

WO9205782(Piu，J.)宣称教导了在制备抑制梗塞性血管疾病(即动脉再狭窄)发展的药物中，促凝血素-A2-受体拮抗剂(I)的用途。

WO9118639(Gaj等人)宣称教导了通过连续或弹丸输注施用纤维连结素，或经血管成形术导管直接输注到狭窄区，从而抑制球形血管成形术后狭窄的方法。

CA2,042,159公开的申请(0ndetti等人)宣称教导了ACE抑制剂(经口服或肠胃外途径)对于防止或减少血管成形术后再狭窄危险的用途。

U.S.4,929,602(Harker等人)宣称教导了通过施用D-苯基丙氨酰-脯氨酰-精氨酰-balo甲基酮肽衍生物或其hydrolalin acid加成产物抑制动脉再狭窄的方法。

U.S.4,820,732(Shell，等人)宣称教导了用于减少再狭窄及猝发狭窄的含前列腺素化合物的组合物。

申请人也知道Glycoined公司研制出一种肝素片段，该肝素片段可防止球形血管成形术后的动脉再狭窄。

在70年代后期和80年代早期，在基础研究方面，免疫治疗法在癌症中应起什么作用存在值得考虑的混乱。曾认为激活或“激发”巨噬细胞是重要的。然而，由Romans和Falk对患有肿瘤疾病的患者的腹膜巨噬细胞所用的检查中，有明显的迹象，已经被激活的巨噬细胞是与癌细胞共存的而并不引起它们的破坏。

由几个独立的研究人员表明，巨噬细胞的功能障碍或推测的阻断是归因于过量的前列腺素，并且用皮质甾类、ASA和非甾类抗炎药，即：消炎病、及甲氧萘丙酸(Naprosyn TM)在组织培养中可改变这点。此外，在动物肿瘤中重复地证明了这些物质和免疫增强剂的各种组合在消除实验性肿瘤方面可产生很可信的成功。Lala和同事将消炎痛治疗与白细胞介素2结合起来，并且表明这样可治愈实验性肿瘤。

在人活体体内实验中任何这些药剂的使用还存在问题，在胃肠、神经学和其它方面，所有的非甾类药剂(NSAID)都会产生较大的毒性。因此，本发明方法的基础是在一般情况下，以足够的量在人类疾病中使用这些药剂，该药物会渗透到任何病理组织以治疗性地改变部位前列腺素的产生。而存在消炎痛的静脉内制剂和目前其他药剂的静脉内制剂的资料表明，单独使用这些药物在人体中产生抑制付作用，因此，对于在肿瘤中比偶然应答更有效的作为而言，进入体内的仅仅只有不足够的量。

可是存在的主要证据表明，并且因此可以假定，初始细胞“偷偷地通过”免疫监视机制与它产生前列腺素有怎样的关系。人们只要假定一种突变，即当细胞变成“恶性”时，它可改变由细胞生产的前列腺素合成的数量，以便确定在一种免疫反应中阻断起始细胞即巨噬细胞的机制。因此，必需研制一种用于临床的NSAIDS组合物，以便提高在肿瘤疾病和其它以过量前列腺素合成为该疾病发病机制基础的其它疾病即：关节炎，以及各种其它所谓连接性组织炎性疾病和/或自身攻击性疾病的反应。

参见：

1.Modulation of Immunity in Cancer Patients byProstaglandin Antagonists，Immunty to Cancer II，Alan R.Liss，Inc.；and

2.Goodwin，J.S.(1981)Prostaglandin E and Cancer GrowthPolential for Immunotherapy with Prostaglandin SynthesisInhibitors ，Augmentive Agents in Cancer Therapy，Raven Press，New York.

本发明的一个目的是提供一种治疗方法及制品以及药物组合物，它们用于防止，例如球形血管成形术后，被球形血管成形术损伤了细胞，由此引起内皮细胞在内动脉壁上增殖而发生的动脉再狭窄。

本发明的另一目的是提供使用安全并基本无毒的透明质酸进行的上述治疗。

本发明的另一目的是提供通常用于防止和抑制例如术后外周血管系统再狭窄的治疗方法和制剂以及药物组合物。

本领域专业人员从本发明的下列摘要和有关的讨论中，可以了解本发明的其它目的。

申请人相信透明质素(hyaluronan)或透明质酸类(特别是透明质酸和其盐)可以防止损伤管壁内径(ID)的狭窄，并且特别防止由于例如因球形血管成形术或其它治疗损伤产生的结果，即由内皮细胞增殖造成的动脉壁再狭窄。可以在损伤之前期间和/或之后，以约10mg/70Kg人到不超过3000mg/70Kg人的有效量，经静脉内或注射(在直接注射少量的情况下)施用透明质酸类(例如透明质酸和透明质酸盐)。

透明质素或透明质酸是一种进化上保存的葡萄糖胺聚糖，由重复的双糖单位N-乙酰基-葡萄糖胺和葡糖醛酸组成(Laurent andFraser 1991，Faseb J.，6：2397)，透明质素在细胞粘着，移动、生长和分化中起作用，许多这些作用都是通过应答组织经透明质素受体的表达而介导的。因此，作为它与这些细胞上受体相互作用的结果，透明质素能够凝集白细胞(综述，Turley，E.A.1992，Can，Met.Rev.，11：21)。透明质素几乎只在增加的受体表达位点或在细胞外透明质素结合蛋白存在的情况下积累。已在分子水平特征描述了与受体有关的两种细胞表面，包括CD44和RHAMM(Receptor for Hyaluronan)HA-MediateMotility)。RHAMM在细胞上；特别是在应答损伤的巨噬细胞和平滑肌细胞上，存在的量较高。

因此，根据本发明的一方面，提供了在管壁已被损伤后(例如该管壁是已经受过球形血管成形术的动脉)，防止动物管壁狭窄的方法，该方法包括：给动物施用治疗有效的无毒量的透明质酸和/或其盐和/或同系物、类似物、衍生物、复合物、酯、透明质酸的片段和亚单位，以防止管壁狭窄(可以在损伤前，期间和/或之后施用透明质酸)。优选的透明质酸类是透明质酸和其盐。施用的透明质酸类的量最好在约10mg/70Kg人和约3000mg/70Kg人之间。

因此，根据本发明的另一方面，提供了在人的球形血管成形术后，防止动脉再狭窄的方法，该方法包括：给人施用治疗有效的无毒量的透明质酸和/或其盐和/或其同系物、类似物、衍生物、复合物、酯、透明质酸的片段及亚单位，以防止动脉再狭窄。再次优选的透明质素或透明质酸类是透明质酸和其盐，并且，施用的透明质酸形式的优选量在约10mg/70Kg人和约3000mg/70Kg人之间。可以在治疗步骤，如球形血管成形术前，或期间或之后(立即接着)施用透明质酸。

最好以液体形式静脉内施用该组合物，该组合物包括符合施用要求的适宜稀释剂或其它佐剂。根据施用的量，最好在或近似的治疗位点，也可以经注射施用。

治疗有效量的抑制狭窄的药物可以与施用的透明质酸类结合起来。这样的药物可以包括上文提到的，本领域专业人员了解的那些药物。其中之一是肝素。另一种是肝素片段。

在防止管壁狭窄的方法中，可以将用于增强施用的透明质酸类效果的治疗有效量的非甾类抗炎药(NSAID)与透明质酸类一起施用。在防止管壁狭窄的方法中，加入非甾类抗炎试剂可增加透明质酸的活性，例如，通过减少炎症，来增强施用的透明质酸和/或其盐防止动脉再狭窄的效果。NSAID可以是一种适于本发明目的的NSAID，可包括双氯高灭酸、消炎痛(溶于如N-甲葡糖胺)、吡氧噻嗪、Ketorolae的(±)氨基丁三醇盐、乙酰水杨酸、甲氧萘丙酸等。NSAID的量可以是给患者施用的优选的适宜的可接受剂量。在某些情况下，每Kg体重高达10mg的NSAID(如每Kg体重1-2mg NSAID)剂量也是适合的。用双氧高灭酸，更大的量也是合适的。若使用高于常规量很多的NSAID，为了减少因施用过量NSAID引起的副作用，可以施用远大于每70Kg人约200mg的透明质素或透明质酸以减少并消除施用NSAID的副作用，如胃肠痛苦、神经异常、抑郁症等。

也可以将治疗有效量的游离基清除剂和抗氧化剂如维生素C是可溶的并且由肾排泄，所以上述量可在一剂量中高达50克-100克。也可以使用其它抗氧化剂和游离基清隙剂。在一个实施方案中，组合物含有一种透明质酸类物质，特别优选的是透明质酸和/或其盐，一种NSAID，一种抑制狭窄的药物和/或维生素C，用来施用以防止管壁的狭窄(例如防止球形血管成形术后，动脉再狭窄)。该组合物含有可从中取出并使用一次剂量的复数剂量，每个剂量含有效量的各组分。

因此，根据本发明的另一方面，提供了在管壁损伤后，防止动物或人的管壁狭窄的药物组合物的用途，该用途是下述药物组合物的用途，该药物组合物含有治疗有效的无毒量的透明质酸和/或其盐和/或同系物、类似物、衍生物、复合物、酯、透明质酸的片段，和亚单位及与之有关的适当稀释剂或药物学可接受载体或其它佐剂以防止管壁狭窄，——在一个实施方案中，在正好损伤之前及在另外一个实施例中，操作即刻后施用。优选的透明质酸或透明质素形式是透明质酸和其盐，例如透明质酸钠。

根据本发明的另一方面，提供在人球形血管成形述后，防止动脉再狭窄的药物组合物的用途，该用途是下述药物组合物的用途，该药物组合物含有治疗有效的无毒量透明质酸和/或盐和/或同系物、类似物、衍生物，复合物、酯、透明质酸和片段和亚单位及与之有关的适当稀释剂、药物可接受的载体或其它佐剂，以防止动脉再狭窄，透明质酸的优选形式是选自透明质酸和其盐，透明质酸形式的数量在约10ml/70Kg人和约3000mg/70Kg人之间。

在一个实施方案中，该药物的形式是静脉内施用的，并且在损伤前即刻施用(例如，在球形血管成形术前)。另外，可以损伤后即刻施用该组合物。

根据本发明的另一方面，该药物组合物含有治疗有效量的非甾类抗炎药(NSAID)，如双氯灭酸，消炎痛(溶于N-甲葡糖胺)，吡氧噻嗪ketorolac的(±)氨基丁三醇盐，乙酰水杨酸，等，以增加透明质酸形式在防止管壁狭窄中的效果。

因此，根据本发明的另一方面，提供了在球形血管成形术后，防止动脉再狭窄的药物组合物的用途，该用途是下述药物组合物的用途，该药物组合物含有治疗有效的无毒量透明质酸和/或其盐，与之有关的适当稀释剂或药物学可接受的载体或其它佐剂以防止动脉再狭窄(通过如静脉内施用该组合物)在一些实施方案中，透明质酸和/或其盐的量在约10mg/70Kg人和约3000mg/70Kg人之间。该组合物还可含有治疗有效量的非甾类抗炎药(NSAID)用以增强施用的透明质酸和/或其盐的动脉再狭窄防止效果。NSAID的剂量可以取决于NSAID的可接受的适当剂量，例如高达10mg/70Kg体重(例如1-2mg NSAID/Kg体重)。对于双氯高灭酸的适用剂量可大些。如果需要使过过量的NSAID，透明质酸和其盐的量最好也超过约200mg/70Kg人。

该组合物也还可含有治疗有效量的维生素C或其它游离基清除剂或抗氧化剂用以增强透明质酸类防止管壁狭窄的效果。虽然很小的量比较合适，但可以以很大的量(例如甚至50-100克)使用维生素C。

该组合物也可含有有效量的抑制狭窄药物。

该组合物可含有透明质素或透明质酸及至少一种NSAID，维生素C，游离基清除剂，该氧化剂和抑制狭窄药物。

根据本发明的另一方面，提供了：

有效无毒量的透明质酸和/或其盐和/或同系物，类似物，衍生物，复合物，酯，透明质酸的片段和亚单位。

在生产药物组合物中的用途，以便在管壁被损伤后防止管壁狭窄，该用途的特征在于将治有效的无毒量透明质酸和/或其盐和/或同系物，类似物、衍生物，复合物，酸、透明质酸片段及亚单位掺入药物组合物中，且足以有效地防止损伤的管壁(如球形血管成形术后损伤的动脉)发生狭窄。透明质酸的优选形式是透明质酸和/或其盐，且组合物是以液体形式。优选地以约10mg到约3000mg/70Kg人之间的剂量使用透明质酸类，且最好以大于200mg/70Kg人的剂量使用透明质酸类。组合物可含有复数剂量。

在一个实施方案中，药物组合物是用于防止人的球形血管成形术后，动脉再狭窄。在实施方案中，在球形血管成形术前及损伤即刻后，施用该组合物。

根据本发明的另一方面，提供：

(1)透明质酸和/或其盐和/或同系物，类似物，衍生物，复合物，酯，透明质酸的片段及亚单位，和

(2)提供选自非甾类抗炎药(NSAID)，抑制狭窄的药物，和维生素C，游离基清除剂和抗氧化剂及其组合物。

在生产药物组合物(包括稀释剂、佐剂和其它载体)中，该组合物用于在管壁被损伤后，防止动脉管壁狭窄)，其中将治疗有效量的透明质酸和/或其盐和/或同系物，类似物，衍生物，复合物，酯，透明质酸的片段和亚单位与治疗有效量的药剂(2)一起给人施用，该组合物的特征在于组分(1)的数量是防止动物管壁狭窄的有效量，组分(2)可增强组分(1)在防止管壁狭窄中的效果。再者，该药物组合物可含有可从其中采用一份剂量的复数剂量。

优选的组分(1)的透明质酸和/或其盐，且组合物是以流体形式(例如静脉内使用或注射)。优选，以约10mg到约3000mg/70Kg人之间剂量使用组分(1)，在一个应用中，以大于200mg/70Kg人的剂量使用组分(1)。

以足以有效增强组分1效果的数量使用组分2。虽然小得多的数量更合适，但可以以高达每剂50-100克的量使用维生素C。可以以取决于NSAID的正常可接受剂量施用NSAID。用一些NSAID，其数量是每Kg体重1-2mg的NSAID，有些高达每Kg体重10mg，另一些如双氯高灭酸，量更大。若以超过(远大于)正常可接受剂量的数量使用NSAID，则透明质酸类的数量可超过每70Kg人200mg。适宜的NSAID包括双氯高灭酸。吡氧噻嗪，消炎痛(溶于N-甲葡糖胺中)，乙酰水杨酸，ketorolac的±氨基丁三醇，甲氧萘丙酸等。

根据本发明的另一方面，提供的药物组合物含有(如需要与稀释剂一起)有效无毒量的透明质酸和/或其盐和/或同系物、类似物、衍生物，复合物、酯，透明质酸的片段和亚单位，以用于在管壁被损伤后，防止人管壁的狭窄，该组合物的特征在于将有效无毒量的透明质酸和/或其盐和/或同系物，类似物，衍生物，复合物，酯，透明质酸的片段和亚单位掺入药物组合物以防止管壁的狭窄。优选的透明质酸形式是透明质酸和/或其盐，且优选的组合物是液体形式(如与稀释剂和药物学可接受的载体及佐剂一起在一个IV袋中的静脉内形式)。可以以约10mg到约3000mg/70Kg人之间的剂量或更多使用该透明质酸类，且在一个实施方案中，以远大于200mg/70Kg人剂量(特别是若使用过量的NSAID)使用该透明质酸类。在一个实施方案中，该药物组合物是用于防止人球形血管成形术后的动脉再狭窄。可以在球形血管成形术之间和/或之后施用该组合物该药物组合物可含有可取用其中每个剂量的复数剂量。

根据本发明的另一方面，提供的药物组合物含有(当需要时及如果需要时与稀释剂、佐剂和其它药物学可接受的载体一起)；

(1)透明质酸和/或其盐和/或同系物、类似物、衍生物，复合物、酯，透明质酸的片段和亚单位，和

(2)选自非甾类抗炎药，抑制狭窄的药物、维生素C、抗氧化剂和游离基清除剂及其组合物。

在管壁被损伤后，用于防止动物管壁的狭窄的组合物的特征在于将有效无毒量的透明质酸和/或其盐和/或同系物、类似物、复合物、酯，透明质酸的片段及亚单位与治疗有效量的组分(2)一起掺入到该组合物中，以防止管壁狭窄，该组合物的特征在于组分(1)的量是防止动物管壁狭窄的有效量，组分(2)的量可增强组分(1)在防止管壁狭窄中的效果。优选的，组分(1)是透明质酸和/或其盐，最好为透明质酸钠，且优选的是以液体剂量形式如静脉内形式(I.V.袋)。可以成批地生产该组合物，并随后分成单个剂量。可以将组合物包装以便在一个容器(贮存容器或贮器)中装入复数剂量，需要时可以从中取出单个剂量使用。在一些实施方案中，以约10mg到1000mg/70Kg人的剂量使用组分(1)。另一些中，剂量可以高达3000mg/70Kg人或更多。若使用过量的组分(2)的NSAID，则最好以远大于200mg/70Kg人的剂量使用组分(1)。在一个实施方案中，该药物组合物用于防止人球形血管成形术后，动脉再狭窄，且可以在治疗之前、期间和/或之后施用该组合物。

以可有效增强组分1效果的量使用组分2。可以在每剂量高达50-100克的量使用维生素C。可以取决于NSAID的适当剂量来施用NSAID，并且如果以过量给药，则透明质酸类的数量最好超过每70Kg人约200mg。适合的NSAIDS是双氯高灭酸、吡氧噻嗪、消炎痛(溶于N-甲葡糖胺)乙酰水杨酸，Ketorolac的I氨基丁三醇盐、甲氧萘丙酸等。

若该组合物含有选自NSAID，抑制狭窄药物，维生素C、游离基请除剂和抗氧化剂及其组合的药剂，申请人认为，透明质酸和/或其盐和/或同系物、类似物、衍生物，复合物、酯，透明质酸的片段和亚单位则有助于将该药剂运输到损伤位点以便使该试剂通过细胞(动脉，内皮细胞中)，同时有助于防止例如动脉再狭窄。

按照实施例及说明将化学药品释放或运输到哺乳动物体的位点，若直接将乙醇注射到肿瘤中，并进行声波图象鉴定，则它不会扩散到整个肿瘤中。若通过透明质酸和/或其盐将乙醇施用到肿瘤中，肿瘤的声波图象鉴定说明，乙醇扩散到了整个肿瘤中。

当申请人认为透明质酸促进运输和释放时，可以将申请人的发明作为不考虑透明质酸和/或其盐和/或同系物、类似物、衍生物，复合物、酯，透明质酸的片段和亚单位与NSAID、抑制狭窄药物、维生素C、游离基清除剂，和/或抗氧化剂混合在一起的实际操作方法的描述。

透明质酸和其盐及其它形式与不同的化学药品和药物(例如维生素C、NSAID、抑制狭窄药物、等)的组合物改变其在人体中的分布及性能，并且对于灌注的组织和/或病理组织来说产生不正常的靶目标。从这点考虑，用抗坏血酸(维生素C)作为游离基清除剂(作为维生素，在治疗目的中，每天50mg-1000mg的剂量)与300-500mg的透明质酸(透明质酸钠)一起经静脉内施用可减小炎症。透明质酸能增强抗坏血酸的作用。认为通过作为游离基清除剂，这种增强的活性消除了游离基。

用NSAID会发生相似的情况。由于需要较大量的可溶消炎痛，因此，用n-甲葡糖胺以5mg/ml n甲葡糖胺(NMG)的稀释度溶解该化学产品。然后将该物质通过22微米的Milipore滤器，以使其灭菌。在动物中，该物质以16倍的治疗剂量是无毒的，因此认为在人中使用也是合适的。因此，将溶于NMG的Indocid ^TM以高达10mg/Kg的可变剂量经静脉内或血管内施用给患者，其中将消炎痛的每一药剂均与例如200-1000mg的透明质酸(例如“Lifecore ^TM”透明质酸[透明质酸钠])结合，而所述的透明质酸还用例如“Lifecore ^TM”透明质酸在消炎痛和NMG的原溶液中稀释。这样产生一种适当的混合物，并可以以任何途经安全施用。[用其它方法即提取制备的透明质酸已经进行了相似的临床研究。对用于静脉内来讲，该提取物是令人满意的]。

因此，若将NSAID例如消炎痛(溶于n甲葡糖胺)或其它NSAID与对于1-2mg/Kg体重的NSAID(在一种情况中是消炎痛和NMG)来说远大于200mg的透明质酸一起施用，没有主要的毒副作用发生如胃肠痛苦，神经不正常，抑郁症等，甚至以升高数量的消炎痛(如果需要)，也没有。如果透明质酸的数量下降到低于那个剂量，则会发生常见的副作用。另外，若经系统的静脉内途径施用，则当NSAID(例如Indocid TM)与透明质酸结合时清楚地表明这种结合物是“靶向”组织的，观察到的这种反应较高。因此，已经观察到接受了其它化学药品(例如抗坏血酸[维生素C]，50-200mg NSAID-透明质酸(透明质酸钠)(例如消炎痛和透明质酸)的患者立刻产生了令人惊奇的疼痛减轻。因此，申请人相信加入NSAID如透明质酸(透明质酸钠)可防止阻断巨噬细胞功能的前列腺素合成酶的酶产生。因此，透明质酸(和盐及其他形式)不仅可增强NSAID的活性而且也可减少任何与使用前列腺素合成抑制剂有关的副作用和毒性。

可以以改变的剂量-10到1000mg/70Kg人使用透明质酸和其盐。由于没有毒性，可以明显过量(如3000mg/70Kg人)地施用透明质酸而没有任何有害影响。

申请人的发明中适宜使用的一种形式的透明质酸和/或其盐(例如钠盐)同系物、类似物、衍生物，复合物、酯，透明质酸的片段和亚单位最好是透明质酸和其盐，是Hyal PharmaceuticalCorporotion提供的一组分。一个这样的组分是一个15ml的透明质酸钠20mg/ml小瓶(300mg/瓶-Lot 2 F 3)。该透明质酸钠组分是2％的溶液，其重均分子量为约225,000。该组分还含有根据U.S.P有关注射制剂的要求经3次蒸馏和灭菌的适量水。可以将透明质酸和/或其盐的小瓶装在由不与小瓶内含物反应的丁基塞子密封的Typel硼硅酸-盐玻璃瓶中。

透明质酸和/或其盐(如钠盐)和同系物、类似物、衍生物，复合物、酯，透明质酸的片段和亚单位，最好是透明质酸和其盐组分可含有具有下列特征的透明质酸和/或其盐：

从自然界得到的纯化、基本无热原的透明质酸成份具有至少一个选自下列特征：

i)分子量在150,000-225,000之内；

ii)低于总重量基础约1.25％的硫酸化粘多糖；

iii)低于总重量约0.6％蛋白质；

iv)低于总重量约150ppm的铁；

v)低于总重量约15ppm的铅；

vi)葡萄糖胺低于0.0025％；

vii)葡萄糖醛酸低于0.025％；

viii)N-乙酰基葡萄糖胺低于0.025％；

ix)氨基酸低于0.0025％；

x)在257nm的UV消光系数低于约0.275；

xi)在280nm的UV消光系数低于约0.25；

xii)pH在7.3-7.9之内；最好该透明质酸是与水混合的，且透明质酸成分的重均分子量为150,000-225,000。透明质酸成分最好含有至少一种选自下列的特征：

i)低于总重量约1％的硫酸化粘多糖；

ii)低于总重量约0.4％蛋白质；

iii)低于总重量约100ppm的铁；

iv)低于总重量约10ppm的铅；

v)葡萄糖胺低于0.00166％；

vi)葡萄糖醛酸低于0.0166％；

vii)N-乙酰基葡萄糖胺低于0.0166％；

viii)氨基酸低于0.00166％；

ix)在257nm的UV消光系数低于约0.23；

x)在280nm的UV消光系数低于约0.19；和

xi)pH在7.5-7.7内

可从其它供应商处选择其它形式的透明质酸和/或其盐，同系物、类似物、衍生物，复合物、酯，透明质酸的片段和亚单位。申请人建议使用Lifecore ^TM Biomedical，Inc生产及供应的具有下列特性的透明质酸钠：特征特性外观白到乳色的颗粒气味无明显的气味粘度重均分子量＜750,000道尔顿UV/可见光扫描，190-280nm Matchers参考扫描OD，260nm ＜0.25 OD单位透明质酸酶敏感度阳性反应IR扫描 Matchers参考pH，10mg/g溶液 6.2-7.8水 8％最大值蛋白质＜0.3mcg/mg NaHy乙酸酯＜10.0mcg/mg NaHy重金属，最大ppmAs Cd Cr Co Cu Fe Pb Hg Ni2.0 5.0 5.0 10.0 10.0 25.0 10.0 10.0 5.0微生物的生物载量未观察到内毒素＜0.07 EU/mg NaHy生物安全检测通过兔目测的毒性检测

申请人还建议使用现有技术描述的透明质酸形式。

下列文献教导了透明质酸，其来源及生产方法及其回收。

美国专利4,141,973教导了透明质酸组份(包括钠盐)有：

(a)重均分子量远大于750,000，优选的远大于约1,

200,000-即限制粘度数远大于约1400cm³/

g，且最好远大于约2000cm³/g；

(b)蛋白质含量低于0.5％(重量)；

(c)在257纳米波长，1％透明质酸钠溶液的紫外光吸收值

低于3.0，在280纳米波长低于2.0；

(d)1％透明质酸钠溶液在生理缓冲液中的运动学粘带度远大

于约1000厘沲，优选的远大于10、000厘沲；

(e)0.1％-0.2％透明质酸钠溶液在生理缓冲液中在

220纳米测量的摩尔旋光度小于-11×10³度-cm²

/摩尔(双糖的)；

(f)当将溶于生理缓冲液的1毫升1％透明质酸钠植入玻璃体

中代替约一半原有的玻璃体中的液体，所述HUA存在时，

玻璃体和前室没有明显的细胞渗入，没有房水突发，玻璃

体中无混浊式闪光，猫头鹰猴眼的角膜，晶状体，虹膜，

视网膜和脉络膜无病理学改变

(g)灭菌的和无热原的

(h)非抗原的。

加拿大Letters专利1,205,031(以美国专利4,141,973作为现有技术)涉及重均分子量为50,000到100,000；250,000到350,000；及500,000到730,000的透明质酸分，并讨论了其生产方法。

若使用高分子量的透明质酸(或其盐或其它形式)，则必须将其稀释以使其可以施用确保不凝结或干扰身体功能。

由Steris Laboratories，Inc.，Phoenix，Arizone，85043U.S.A.生产了一种符合USP的抗坏血酸(维生素C)注射液制剂，并且它包括浓度为22mg/ml(等于抗坏血酸钠250mg/ml)的内含30ml、50ml、或100ml的分装，30ml大小是优选的。

用外科用的方法说明本发明的一个实施方案，并在附图中说明结果分析，其中

图1含有损伤和假手术的动脉图片。

图2用图示说明由颈动脉表达的RHAMM(透明质素介导的活动性受体)(Receptor for HA(Hyaluronan)MediatedMotitily)。

图3含有在其损伤4天后，在颈动脉的平滑细胞中，RHAMM和透明质素表达的图片。

图4用棒条图形式说明RHAMM，HA结合的[透明质素-(透明质酸)-结合的]肽(401-411)及抗-Rhamm抗体对巨噬细胞系向补体(C5a)趋药性的影响。

图5用棒条图形式说明RHAMM HA-结合肽(401-411)对嗜中性白细胞向IL-8趋药性的影响。

图6用棒条图形式说明在受伤5小时后，RHAMM HA-结合肽401-411对平滑肌细胞迁移的影响。

实施方案的主要描述

完成下列实验。

将10只兔子麻醉并对其实施球形血管成形术。用透明质素(5mg/ml)或单独缓冲液灌注这些兔子并使其复元。损伤后2、24、48小时后，处死兔子，将颈动脉加工用于组织学分析并取系列的5-10μm切片加工。用苏木精或抗RHAMM抗体将切片染色。逐一分析治疗后的10份切片。结合附图，在下文描述了分析的结果。

图1：损伤的颈动脉表明有内皮细胞层的剥蚀和白细胞的粘附(图1A)。将白细胞正染色用于与IgG有关的RHAMM的对照背景(图1B)。暴露于透明质素的颈动脉(图1C)或假手术的动脉(图1D)表明有完整的内皮细胞并没有呈现出白细胞的积累。

图2：由颈动脉表达的RHAMM的Western转印迹分析。将颈动脉匀浆，并使它在SDS-PAGE上电泳释放蛋白质，并用单一特异性抗体检测RHAMM的存在。用化学发光物质肉眼可观测抗体的存在，并用光密度检测法定量分析结合的抗体相关量。手术动物中RHAMM的存在呈现一种急性而极迅速的增加。到组织损伤后5-6天为止，RHAMM的水平逐渐下降。假手术动物在RHAMM表达方面没有增加。

图3：在其损伤4天后，RHAMM(图3A)和透明质素(图3B)在颈动脉平滑肌细胞中的表达。在白细胞上RHAMM的表达立即升高(图1)而在平滑肌细胞上，RHAMM的表达增加较晚且与其运动的开始有关。假手术动物的平滑肌细胞在RHAMM的表达方面没有相似的增加(图3C)。

图4：RHAMM肽对嗜中性白细胞应答IL-8的趋药性的影响。在Boyden室检测中模拟RHAMM透明质素结合区的RHAMM肽抑制了嗜中性白细胞的趋药性。

图5：RHAMM肽和抗体抑制了巨噬细胞系(SI，WEHI-3)应答补体的趋药性。补体，但不是热失活的补体(56℃)刺激巨噬细胞系的趋药性。模拟RHAMM透明质素结合区的RHAMM肽和抗-RHAMM抗体抑制了趋药性。

图6：RHAMM肽抑制了平滑肌细胞应答损伤的运动。模拟RHAMM透明质素结合区的RHAMM肽抑制了损伤平滑肌细胞的运动。这种拼凑的肽没有表明是“意义”肽特征的作用。

RHAMM表达(使用对RHAMM单特异性的抗体经称为Western转印迹的分析检测法检测的(Turley，e.A.Austin，L.，Vandeligt，K.and Clary，C.，1991，J.Cell Biol.，112：1041)，表明到2个小时为止(图2)，在对照动物中观察到白细胞粘附到内皮上(图2)这段时间内，可检测出这种抗体的表达有急速的增加[有关RHAMM的进一步讨论参见文章“Identification of Two Hyaluronan-binding Domainsin the Hyaluronan Receptor RHAMM”，Baihua Yang，Liying Zhang and Eva Ann Turley，The Journal ofBiological Chemistry，Vol 268，No.12，Issue ofApril 25，pp.8617-8623，1993]。在对侧动脉，RHAMM也增加，表明从损伤组织释放了调节RHAMM表达的可溶因子。然而假手术动物的RHAMM表达几乎没有增加(图2)。在实验动物中，RHAMM的表达可保持几天，然后水平下降。固定组织检测说明，大多数表达RHAMM的细胞的激活的白细胞和平滑肌细胞(图1，3)。用图像分析测定随机运动，用Boyden室测定趋药性，从而在体外评估RHAMM卷入白细胞和平滑肌细胞运动的情况。模拟RHAMM区(特别是透明质素结合区)的肽(100ng/平板)对巨噬细胞(图4)，嗜中性白细胞(图5)和平滑肌细胞(图6)迁移的抑制达到了高度显著的程度(P＞0.0001，学生的“T”试验)。相关地，这些结果表明RHAMM，且特别是其透明质素结合能力，对于白细胞和平滑肌细胞的运动是必需的，并且在总中实验性地将球形导管插入后，其在组织损伤拉总的表达升高。

仅在其损伤前进行的兔透明质素治疗使白细胞不能粘附到内皮上，从而得到按组织学标准检测，看起来完整的组织(图1)。损伤后几天经透明质素治疗过的兔的颈动脉与呈现完整内皮的对照组相似。

这些结果的基本原理是，透明质素与高水平表达其受体，RHAMM的细胞结合，并防止了随后这些细胞与内皮的相互作用。期望其它透明质素受体(CD44)的表达也会升高。

在本申请中有关术语和表达方式的讨论及说明，参考文献包含在作为“Schedule A”附在题目为“Neointimal Formationafter Balloon Catheter Injury：A Role of Hyaluronanand the Hyaluronan Receptor RHAMM”的未发表的文章中，讨论及说明本文所涉及的术语和表达方式的这些部分均通过参考结合在本文中。

由于在不偏离本发明范围的情况下，可以对本发明作许多改变，因此预期认为包含在本发明中的所有物质是为了说明本发明而不是意味着限制的。

Claims

1.有效无毒量的透明质酸形式

在制备用于防止动物管壁损伤后管壁狭窄的药物组合物中的用途，其中加入到药物组合物中的透明质酸形式选自透明质酸或其药用盐。

2.权利要求1的用途，其中透明质酸形式是分子量低于750,000道尔顿但大于150,000道尔顿的透明质酸钠。

3.权利要求1或2的用途，其中以静脉形式使用的透明质酸形式是透明质酸钠。

4.权利要求1或2的用途，其中透明质酸形式的量是10mg到3000mg。

5.权利要求1或2的用途，其中，透明质酸形式的量大于200mg。

6.权利要求1或2的用途，其中该药物组合物是用于防止人球形血管成形术后，之前和/或期间的动脉再狭窄的药物组合物。

7.(1)治疗有效非毒性量的透明质酸形式，其选自透明质酸或其药用盐，和

(2)选自非甾类抗炎药、再狭窄抑制药、维生素C、抗氧化剂、和游离基清除剂的药物及其混合物在

制备用于防止动物管壁损伤后管壁狭窄的药物组合物中的用途，其中治疗有效量的透明质酸形式与治疗有效量的药物(2)一起使用，其中组分(1)的量是防止动物管壁狭窄的有效量，且组分2可增强组分(1)防止管壁狭窄的作用。

8.权利要求7的用途，其中组分1是分子量低于750,000道尔顿但大于150,000道尔顿的透明质酸钠。

9.根据权利要求7或权利要求8的用途，其中以静脉形式使用的透明质酸形式是透明质酸钠。

10.根据权利要求7或8的用途，其中组分(1)的量为10m到3000mg。

11.权利要求7或8的用途，其中组分(1)的量大于200mg。

12.权利要求7或8的用途，其中药物组合物是用于防止人球形血管形术后，之前和/或期间的动脉再狭窄的药物组合物。

13.权利要求1，2，3，4，5或6的用途，其进一步包括用于增强透明质酸形式作用的治疗有效量非甾类抗炎药。

14.权利要求13的用途，其进一步包括用于增强透明质酸形式防止动脉狭窄作用的有效量的至少一种维生素C，抗氧化剂，游离基清除剂和狭窄抑制药。

15.治疗有效非毒性量的透明质酸形式和增强透明质酸形式作用的治疗有效量的选自非甾类抗炎药，狭窄抑制药，维生素C，游离基清除剂，抗氧化物和其混合物的药物在制备用于抑制管壁狭窄的药物组合物中用途，

所述抑制动脉狭窄的透明质酸形式的分子量小于750,000道尔顿但大于150,000道尔顿，其中透明质酸形式或其药用盐的量为10mg-3000mg。

16.权利要求15的用途，其中透明质酸形式是透明质酸钠，以静脉形式使用的治疗有效量药物选自非甾类抗炎药，维生素C，狭窄抑制剂，抗氧化剂，游离基清除剂或它们的混合物。

17.权利要求15的用途，其中药物是狭窄抑制药。

18.权利要求15的用途，其中透明质酸形式为透明质酸钠且其量大于200mg但小于3000mg。

19.权利要求15的用途，其中非甾类抗炎药是双氯芬酸或其钠盐。

20.权利要求7，8，9，10，11或12的用途，其中非甾类抗炎药是双氯芬酸或其钠盐。