SK36895A3 - Use of hyaluronic acid and forms to prevent arterial restenosis - Google Patents

Description

Doterajší stav techniky zahŕňa rad návrhov akým spôsobom zabraňovať restenóze.

V US patente 5 087 244 (Wolinsky et al.) je navrhované použitie katétru, ktorý obsahuje na jednom koncu neelastický balónik, ktorý má na povrchu usporiadané malé otvory. Balónik obsahuje koncentrovaný roztok heparínu, ktorý je týmito otvormi uvoľňovaný, a tak prichádza do styku s artériou po angioplastike a zabraňuje vzniku restenózy.

V US patente č. 5 116 864 (Hathaway et al.) je opisovaná prevencia restenózy v periférnych alebo srdcových vaskulárnych systémoch po vaskulárnej rekanalizácii, táto prevencia zahŕňa podávanie fotoaktivovateľného psoralénu.

Tým sa má dosiahnuť taká hladina psoralénu v sére, ktorá inhibuje rast buniek hladkého svalstva.

V US patente č. 5 092 841 (Spears J. R.) je navrhovaná liečba arteriálnych stien poranených behom angioplastiky tým, že sa medzi stenu a katéter, použitý pri angioplas tike, dodáva bioprotektívny materiál. Tento bioprotektívny materiál je tu zachytený a preniká do tkaniva arteriálnych stien, ked je proti nim umiestnený katéter pre angioplastiku

V EP 356 275-A (Petitou et al.) je navrhované použitie nových o-acylovaných derivátov glykosaminoglykánu pri inhibícii postoperačnej restenózy.

V publikácii Berk B. C. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 1991, sv. 17, č. 6, dodatok B, strana 111B až 117B je diskutovaná farmakologická úloha heparínu a glukokortikoidov pri prevencii restenózy po koronárnej angioplastike.

V prihláške WO 92/09561 (Itoh et al.) je navrhované použitie nových amidových derivátov inhibujúcich ACAT pri liečbe restenózy po perkutánnej transluminálnej koronárnej angioplastike.

V prihláške WO 92/08472 (Scarborough et al.) je navrhované použitie peptidu alebo peptidov zabraňujúcich zlepovanie krvných doštičiek pre prevenciu restenózy po angioplastike. Použité peptidy sú získané z hadieho jedu.

V prihláške WO 92/07852 (Bovy et al.) je navrhované použitie určitých derivátov bifenylalkylxantínu pre prevenciu restenózy po angioplastike.

V prihláške WO 92/05782 (Pili, J.) je navrhované použitie antagonistov (I) tromboxán-A2-receptoru pri výrobe liečiv, ktoré majú slúžiť pre inhibíciu proliferatívneho vývoja pri obštruktívnych vaskulárnych poruchách, tj. arteriálnej restenózy.

V prihláške WO 91/18639 (Gaj et al.) je navrhovaná inhibícia stenózy po balónovej angioplastike podávaním fibronektínu pomocou kontinuálnej infúzie alebo velkoobjemovej jednorázovej infúzie (bolus) alebo pomocou priamej infúzie do stenotickej oblasti prostredníctvom katétru pre angioplastiku.

V zverejnenej prihláške CA 2 042 159 (Ondetti et al.) je navrhované použitie inhibítoru ACE (podávaného orál4 nou alebo parenterálnou cestou) pre prevenciu alebo zníženie rizika restenózy po angioplastike.

V US 4 929 602 (Harker et al.) je opísaný spôsob inhibície arteriálnej restenózy podávaním peptidového derivátu D-fenylalanylprolylarginyl-balometylketónu alebo jeho adičného produktu s kyselinou hydrolalínovou.

V US 4 820 732 (Shell et al.) je navrhované použitie prostriedku obsahujúceho prostaglandínovú zlúčeninu pre zníženie restenózy a prerušenie stenózy.

Prihlasovateľ berie do úvahy tiež aktivitu firmy Glycomed, ktorá vyvinula fragment heparínu zabraňujúci arteriálnej restenóze po balónovej angioplastike.

V základnom výskume konca 70. a počiatku 80. rokov existovala značná nejednotnosť názorov, pokiaľ sa týka úlohy imunoterapie pri liečbe rakoviny. Za dôležitú bola považovaná aktivácia (tzv. hyping) makrofágov. Výskumy peritoneálnych makrofágov získaných od pacientov s neoplastickou chorobou, ktoré vykonával Romans a Falk, poskytli však jasný dôkaz, že tieto makrofágy už boli aktivované a napriek tomu koexistovali s rakovinovými bunkami a nespôsobovali ich deštrukciu.

Niekoľko nezávislých vedcov ukázalo, že špatná funkcia makrofágov alebo údajné blokovanie je spôsobené nadbytkom prostaglandínu, a je možné je v tkanivovej kultúre modifikovať kortikosteroidmi, ASA a nesteroidnými protizápalovými liečivami, ako je indometacín a naproxén (Naprosyn^^R^).

Pri zvieracích nádoroch bolo opakovane demonštrované, že tieto látky môžu meniť odpoveď na neoplastické bunky a že pri použití rôznych kombinácií týchto látok s činidlami zvyšujúcimi imunitu sa môže dosiahnuť veľmi vierohodný úspech pri odstra5 ňovaní experimentálnych nádorov. Lala a jeho spolupracovníci kombinovali liečbu indometacínom s liečbou interleukínom 2 a ukázali, že je tak možné dosiahnuť vyliečenie experimentálnej neoplazmy.

Použitie všetkých týchto činidiel pri skutočnej praxi liečenia človeka in vivo je však spojené s neustálymi problémami. Všetky nesteroidné protizápalové činidlá (NSAID) vykazujú značnú toxicitu v gastrointestinálnej, neurologickej a v iných oblastiach. Podstatou terajšieho prístupu je, zaistenie takých všeobecných podmienok, pri ktorých by bolo možné používať tieto činidlá pri liečbe humánnych chorôb v dostatočných množstvách a tak, aby liečivo preniklo do ktoréhokoľvek patologického tkaniva a svojim terapeutickým pôsobením zmenilo lokálnu produkciu prostaglandínu. Indometacín a teraz aj iné liečivá sú síce k dispozícii vo forme intravenóznych prostriedkov, je však k dispozícii veľké množstvo údajov, že používanie týchto liečiv samotných spôsobuje prohibitívne vedľajšie účinky humánnych pacientov. Do tela je preto možné zaviesť len nedostatočné množstvo týchto liečiv, čo má za následok len príležitostnú odpovedí novotvarov.

Na základe veľkého množstva dôkazov je možné tvrdiť, že základ neoplastického vývoja a spôsob akým sa počiatočné bunky prešmyknú mechanizmom imunitnej kontroly, má vzťah k produkcii prostaglandínu. Pre stanovenie mechanizmu zablokovania počiatočnej bunky pri akejkoľvek imunitnej reakcii, tj. makrofágu, je potrebné predpokladať len jednu mutáciu vyvolávajúcu zmenu množstva prostaglandínu syntetizovaného bunkami, keď sa stanú malignými. Je teda dôležité vyvinúť kombináciu nesteroidného protizápalového liečiva pre klinické použitie, s ktorým by bolo možné dosiahnuť podstatné zlepšenie odpovedi pri neoplastických chorobách a iných chorobách, pri ktorých je základom patogenéza chorobného stavu nadmerná syntéza prostaglandínu, ako je napríklad artritis a rôzne iné inflamatorné poruchy tnzv. spojivových tkanív a/alebo autoagresívne choroby.

Pozri tiež nasledujúce citácie:

1. Modulation of Immunity in Cancer Patients by Prostaglandin Antagonists, Immunity to Cancer II, Alan R. Liss, Inc.;

2. Goodwin J. S. (1981) Prostaglandin E and Cancer Growth Potential for Immunotherapy with Prostaglandin Synthesis Inhibitors, Augmentive Agents in Cancer Therapy, Raven Press, New York, USA.

Úlohou tohto vynálezu je teda vyvinúť spôsob liečby a prípravky či farmaceutické prostriedky pre prevenciu arteriálnej restenózy, napríklad po balónovej angioplastike, kedy dochádza k proliferácii buniek endotelu na vnútorných stenách artérie v dôsledku podráždenia týchto buniek balónovou angioplastikou.

Ďalšou úlohou vynálezu je vyvinúť taký spôsob liečby pri použití kyseliny hyalurónovej, ktorá je bezpečná a v podstate netoxická.

Ďalšou úlohou vynálezu je vyvinúť spôsob liečby a prípravky či farmaceutické prostriedky všeobecne pre prevenciu restenózy a inhibíciu restenózy, napríklad po operácii periférnych vaskulárnych systémov.

Ďalšie úlohy, ktoré vynález rieši, budú odborníkom v tomto odboru zrejmé z nasledujúceho opisu vynálezu.

Podstata vynálezu

Prihlasovatei sa domnieva, že rôzne formy hyaluronanu alebo kyseliny hyalurónovej, najmä kyselina hyalurónová a jej soli, zabraňujú stenóze vnútorného priemeru podráždených tubulárnych stien a najmä zabraňujú restenóze arteriálnych stien, ku ktorým dochádza napríklad pri proliferácii buniek endotelu po ich podráždení balónovou angioplastickou alebo inou liečbou. Tieto formy kyseliny hyalurónovej, naprí klad kyselina hyalurónová a soli kyseliny hyalurónovej , je možné podávať intravenózne alebo injekčné (v prípade priamej injekcie malého množstva), v účinnej dávke v rozmedzí od asi 10 mg/70 kg do viac ako 3 000 mg/70 kg, pričom podávanie je možné uskutočniť pred, v priebehu a/alebo po poranení.

Hyaluronan alebo kyselina hyalurónová je glykosaminoglykán, ktorý je evolučné konzervovaný a skladá sa z opaku júcich sa disacharidových jednotiek N-acetylglukosamínu a kyseliny glukurónovej (Laurent and Fraser, 1991, Faseb J., 6:2397). Hyaluronan pôsobí na adhéziu, pohyblivosť, rast a diferenciáciu buniek a mnoho z týchto účinkov sú sprostredkované expres iou receptorov hyaluronanu v respondujúcich tka nivách. Tak bolo ukázané, že hyaluronan je schopný agregovať biele krvinky pri jeho interakcii s receptormi prítomnými v týchto bunkách (prehlad vičí Turley E. A., 1992, Can. Met. Rev. 11: 21). Hyaluronan sa akumuluje takmer výlučne v miestach so zvýšenou expresiou receptoru alebo v prítomnosti extracelulárnych proteínov viazajúcich hyaluronan. Dva receptory na povrchu buniek boli charakterizované na molekulárnej úrovni a zahŕňajú CD44 a RHAMM [skratka receptoru pre hyaluronan (HA) - sprostredkujúci pohyblivosť]. RHAMM je prítomný v zvýšenom množstve na bunkách, najmä makrofágach a bunkách hladkého svalstva pri odpovedi na poranenie.

δ

Jedným aspektom tohoto vynálezu je spôsob prevencie zužovania tubulárnych stien u živočíchov po traumatizácii týchto tubulárnych stien (napríklad v tom prípade, že boli tubulárne steny artérií podrobené balónovej angioplastike), ktorého podstata spočíva v tom, že sa pacientovi podáva terapeuticky účinné netoxické množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej, za účelom prevencie zužovania týchto tubulárnych stien. (Kyselina hyalurónová sa môže podávat pred poškodením, v priebehu poškodzovania a/alebo po ňom.) Prednostne sa ako kyselina hyalurónová používa samotné kyselina hyalurónová a jej soli. Množstvo kyseliny hyalurónovej alebo jej hore uvedenej formy, ktoré sa pacientovi podáva, leží prednostne v rozmedzí od asi 10 mg/70 kg do asi 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti.

Iným aspektom tohto vynálezu je spôsob prevencie arteriálnej restenózy po balónovej angioplastike u človeka, ktorého podstata spočíva v tom, že sa pacientovi podáva terapeuticky účinné netoxické množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej, za účelom prevencie arteriálnej restenózy.

I tu platí, že sa ako hyaluronan alebo kyselina hyalurónová používa samotná kyselina hyalurónová a jej soli. Množstvo kyseliny hyalurónovej alebo jej hore uvedenej formy, ktoré sa pacientovi podáva, leží prednostne v rozmedzí od asi 10 mg/70 kg do asi 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti. Kyselina hyalurónová sa môže podávat pred ošetrením, napríklad balónovou angioplastikou, v jeho v priebehu alebo po ňom (ihneď po skončení tohto ošetrenia).

Prostriedky sa prednostne podávajú intravenózne v kvapalnej forme a zahŕňajú vhodné riedidlá alebo iné adju9 vanty, ktoré sú potrebné pre podávanie. Podávanie sa prednostne uskutočňuje injekčné v mieste bezprostredne susediacim s ošetrením s ohľadom na dosiahnutie čo najväčšej koncentrácie liečiva v tomto mieste.

S kyselinou hyalurónovou sa pri podávaní môže kombinovať terapeuticky účinné množstvo liečiva inhibujúceho stenózu. Tieto liečivá môžu zahŕňať ktorékoľvek z hore uvedených liečiv, pričom tieto iné liečivá sú známe odborníkom v tomto odboru. Jedným z takých liečiv je heparín a iným fragment heparínu.

S kyselinou hyalurónovou (alebo jej ľubovoľnou formou) sa môže kombinovať terapeuticky účinné množstvo nesteroidného protizápalového liečiva, ktoré zvyšuje účinok kyseliny hyalurónovej pri prevencii zužovania tubulárnych stien. Prídavok nesteroidného protizápalového liečiva zvyšuje účinnosť kyseliny hyalurónovej pri prevencii zužovania tubulárnych stien a napríklad zvyšuje preventívnu účinnosť kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí pri prevencii arteriálnej restenózy tým, že obmedzuje zápal. Ako nesteroidné protizápalové liečivo sa môže použiť akékoľvek liečivo vhodné pre tento účel napríklad zvolené zo súboru zahŕňajúceho diclofenac, indometacín (solubilizovaný napríklad v N-metylglukamíne), piroxicam, (±)-trometamínovú soľ ketorolacu, kyselinu acetylsalicylovú, naproxén apod. Množstvo nesteroidného protizápalového liečiva zodpovedá množstvu, ktoré sa pacientom prednostne podáva a je nimi akceptované.

V niektorých prípadoch môže toto množstvo činiť až 10 mg/kg telesnej hmotnosti (napríklad 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti). V prípade diclofenacu je možné použiť podstatne vyššie množstvo. Pokial sa použije nesteroidné protizápalové liečivo v množstve vyššom, ako je to obvyklé, môže sa za účelom zníženia jeho vedľajších účinkov, ako sú podráždenie gastrointestinálneho traktu, neurologické abnormality, depresie atd., podávať hyaluronan alebo kyselina hyalurónová v množstve vyššom ako je 200 mg/70 kg telesnej hmotnosti.

Pre zvýšenie účinnosti podávanej kyseliny hyalurónovej alebo hyaluronanu sa do prostriedku môže tiež zahrnúť terapeuticky účinné množstvo látky pohlcujúce volné radikály a antioxidantu, ako je vitamín C. Množstvo vitamínu C môže byť až 50 až 100 g, pretože táto látka je rozpustná a vylučuje sa obličkami, napriek tomu, že normálne sa používajú podstatne nižšie množstvá. Tiež sa môžu používať iné antioxidanty a látky pohlcujúce volné radikály. V jednom predvedení obsahuje farmaceutický prostriedok podlá vynálezu určitú formu kyseliny hyalurónovej, prednostne samotnú kyselinu hyalurónovú a/alebo jej sol, nesteroidné protizápalové liečivo, ako činidlo inhibujúce stenózu a/alebo vitamín C, pričom tento prostriedok sa podáva za účelom prevencie zužovania tubulárnych stien, napríklad prevencie arteriálnej restenózy po balónovej angioplastike. Farmaceutický prostriedok môže zahŕňať väčší počet dávkovacích jednotiek, pričom pri podávaní sa z prostriedku, tj. balenia, vyberie a podá jedna forma. Každá z týchto jednotkových dávkovacích foriem obsahuje účinné množstvo všetkých zložiek.

Ďalším aspektom vynálezu je použitie farmaceutického prostriedku pre prevenciu zužovania tubulárnych stien zvieraťa alebo človeka po traumatizácii týchto stien, pričom použitý farmaceutický prostriedok obsahuje terapeuticky účinné netoxické množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej v spojení s vhodným riedidlom alebo farmaceutický vhodným nosičom alebo inými adjuvantmi, za účelom prevencie zužovania tubulárnych stien. Pri jednom z predvedení vynálezu sa tento prostriedok podáva tesne pred traumou a pri inom tesne po ňom. Kyselina hyalurónová alebo hyaluronan sa prednostne používa vo forme samotnej kyseliny hyalurónovej alebo jej soli, napríklad hyaluronátu sodného.

Ďalším aspektom vynálezu je použitie farmaceutického prostriedku pre prevenciu arteriálnej restenózy po balónovej angioplastike u človeka, pričom použitý farmaceutický prostriedok obsahuje terapeuticky účinné netoxické množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analogov, derivátov, komplexov, estérov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej v spojení s vhodným riedidlom alebo farmaceutický vhodným nosičom alebo inými adjuvantmi, za účelom prevencie arteriálnej restenózy. Kyselina hyalurónová alebo hyaluronan sa prednostne používa vo forme samotnej kyseliny hyalurónovej alebo jej soli. Množstvo akejkoľvek formy kyseliny hyalurónovej pritom leží v rozmedzí od asi 10 mg/70 kg do asi 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti.

Pri jednom z predvedení vynálezu sa používa farmaceutický prostriedok pre intravenózne podávanie a tento farmaceutický prostriedok sa podáva tesne pred traumou (napríklad pred balónovou angioplastikou) a pri inom tesne po ňom.

Podľa ešte ďalšieho aspektu tohto vynálezu obsahuje farmaceutický prostriedok terapeuticky účinné množstvo nesteroidného protizápalového liečiva, ako je napríklad diclofenac, indometacín (solubilizovaný v N-metylglukamíne), piroxicam, (±)-trometamínová soľ ketorolacu, kyselina acetylsalicylová apod., pre zvýšenie účinku použitej formy kyseliny hyalurónovej pri prevencii zužovania tubulárnych stien.

Ďalším aspektom vynálezu je teda použitie farmaceutického prostriedku pre prevenciu arteriálnej restenózy po balónovej angioplastike, pričom použitý farmaceutický prostriedok obsahuje terapeuticky účinné netoxické množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej soli v spojení s vhodným riedidlom alebo farmaceutický vhodným nosičom alebo inými adjuvantmi, za účelom prevencie arteriálnej restenózy. Tento prostriedok sa môže podávať napríklad intravenózne. Pri niektorých predvedeniach môže množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí ležať v rozmedzí od asi 10 mg/70 kg do asi 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti. Tento prostriedok môže ďalej obsahovať terapeuticky účinné množstvo nesteroidného protizápalového liečiva, pre zvýšenie účinku použitej kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí pri prevencii arteriálnej restenózy.

Nesteroidné protizápalové liečivo sa môže používať v obvykle akceptovaných dávkach v závislosti od konkrétne použitého liečiva, pričom dávkovanie môže činiť až napríklad 10 mg/70 kg telesnej hmotnosti (napríklad 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti). V prípade diclofenacu je možné použiť podstatne vyššie množstvá. Pokial sa použije nesteroidné protizápalové liečivo v množstve vyššom, ako je to obvyklé, môže sa podávať kyselina hyalurónová alebo jej soí prednostne v množstve vyššom ako je asi 200 mg/70 kg telesnej hmotnosti.

Do prostriedku sa môže ďalej tiež zahrnúť terapeuticky účinné množstvo vitamínu C alebo inej látky pohlcujúcej volné radikály alebo antioxidantu pre zvýšenie účinnosti použitej formy kyseliny hyalurónovej pri prevencii zužovania tubulárnych stien. Množstvo vitamínu C môže byt až 50 až 100 g, napriek tomu, že normálne sa používa podstatne nižšie množstvo.

Tento farmaceutický prostriedok môže tiež obsahovať účinné množstvo liečiva inhibujúceho stenózu.

Farmaceutický prostriedok môže obsahovat hyaluronan alebo kyselinu hyalurónovú a aspoň jednu z látok zvolených zo súboru zahŕňajúceho nesteroidné protizápalové liečivo, vitamín C, látku pohlcujúcu voíné radikály, antioxidant a liečivo inhibujúce stenózu.

Ďalším aspektom tohoto vynálezu je použitie účinného netoxického množstva kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej pri výrobe farmaceutického prostriedku pre prevenciu zužovania tubulárnych stien u živočíchov potom, čo boli tieto tubulárne steny traumatizované, ktorého podstata spočíva v tom, že sa terapeuticky účinné netoxické množstvo kyseliny hyalurónové a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej zavedie do tohto farmaceutického prostriedku, pričom toto množstvo postačuje pre účinnú prevenciu zužovania tubulárnych stien potom, čo boli tieto tubulárne steny traumatizované, ako je tomu napríklad u artérií poškodených balónovou angioplastikou. Kyselina hyalurónová sa prednostne používa vo forme samotnej kyseliny hyalurónovej alebo jej solí a prostriedok má prednostne kvapalnú formu. Množstvo akejkolvek formy kyseliny hyalurónovej pri tom leží v rozmedzí od asi 10 mg/70 kg do asi 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti a prednostne je vyšší ako 200 mg/70 kg telesnej hmotnosti. Prostriedok môže obsahoval väčší počet dávkovacích jednotiek.

Pri jednom predvedení slúži tento farmaceutický prostriedok pre prevenciu arteriálnej restenózy po balónovej angioplastike u človeka. Pri tom sa tento farmaceutický prostriedok podáva pred balónovou angioplastikou alebo ihneď po traume.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je použitie

1) kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej a

2) látky zvolenej zo súboru zahŕňajúceho nesteroidné protizápalové liečivo, liečivo inhibujúce stenózu, vitamín C, látku pohlcujúcu voľné radikály, antioxidanty a ich kombinácií pri výrobe farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje riedidlá, adjuvanty a iné nosiče, pre prevenciu zužovania tubulárnych stien u živočíchov potom, čo boli tieto tubulárne steny traumatizované, ktorého podstata spočíva v tom, že sa terapeuticky účinné množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej podá človeku spolu s terapeuticky účinným množstvom látky 2), pričom množstvo zložky 1) postačuje pre účinnú prevenciu zužovania tubulárnych stien živočícha a množstvo zložky 2) zvyšuje účinnosť zložky 1) pri prevencii zužovania tubulárnych stien. Tento farmaceutický prostriedok môže tiež obsahovať väčší počet dávkovacích jednotiek, ktoré sa z balenia odoberajú.

Ako zložka 1) sa prednostne používa samotná kyselina hyalurónová a/alebo jej soli a prostriedok má prednostne kvapalnú formu (napríklad vhodnú pre intravenózne podávanie alebo podávanie injekciami). Množstvo zložky 1) pri tom leží v rozmedzí od asi 10 mg/70 kg do asi 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti a prednostne je vyšší ako 200 mg/70 kg telesnej hmotnosti.

Zložka 2) sa používa v množstve účinne zvyšujúcim účinnosť zložky 1). Množstvo vitamínu C môže byt až 50 až 100 g na dávku, napriek tomu, že normálne sa prednostne používajú podstatne nižšie množstvá. Nesteroidné protizápalové činidlo sa môže podávať v množstve zodpovedajúcom bežne akceptovaným dávkam, v závislosti od konkrétneho druhu použitého liečiva. Pri niektorých nesteroidných protizápalových liečivách leží toto množstvo v rozmedzí od 1 do 2 mg/kg telesnej hmotnosti, pri iných leží až do asi 10 mg/kg telesnej hmotnosti a ešte iných, ako napríklad diclofenacu, sa môžu použiť podstatne vyššie množstvá. Pokial sa použije nesteroidné protizápalové liečivo v množstve vyššom, ako je obvyklé, môže sa podávať použitá forma kyseliny hyalurónovej prednostne v množstve vyššom ako je asi 200 mg/70 kg telesnej hmotnosti. Ako vhodné nesteroidné protizápalové liečivo sa môže použiť liečivo zvolené zo súboru zahŕňajúceho diclofenac, indometacín (solubilizovaný napríklad v N-metylglukamíne), piroxicam, (±)— trometamínovoú sol ketorolacu, kyselinu acetylsalicylovú, naproxén apod.

Ďalším aspektom vynálezu je farmaceutický prostriedok, ktorého podstata spočíva v tom, že spolu s prípadnými riedidlami, obsahuje účinné netoxické množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej pre prevenciu zužovania tubulárnych stien človeka potom, čo boli tieto tubulárne steny traumatizované pričom tento prostriedok obsahuje účinné netoxické množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej zavedené do tohto farmaceutického prostriedku za účelom prevencie zužovania tubulárnych stien. Kyselina hyalurónová sa prednostne používa vo forme samotnej kyseliny hyalurónovej alebo jej solí a prostriedok má prednostne kvapalnú formu (ako napríklad formu pre intravenózne (i.v.) podávanie v podobe i.v. sáčku s riedidlami a farmaceutický vhodnými nosičmi a adjuvantmi). Množstvo akejkolvek formy kyseliny hyalurónovej pri tom leží v rozmedzí od asi 10 mg/70 kg do asi 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti alebo je vyšší, pričom v jednom predvedení je toto množstvo vyššie ako 200 mg/70 kg telesnej hmotnosti (najmä pokial sa používajú nadmerne vysoké množstvá nesteroidných protizápalových činidiel). Pri jednom predvedení slúži tento farmaceutický prostriedok pre prevenciu arteriálnej restenózy po balónovej angioplastike u človeka. Pri tom sa tento farmaceutický prostriedok podáva pred balónovou angioplastikou a/alebo po nej. Prostriedok môže obsahovať väčší počet dávkovacích jednotiek.

Ďalším aspektom vynálezu je farmaceutický prostriedok, ktorého podstata spočíva v tom, že spolu s prípadnými riedidlami, adjuvantmi a inými farmaceutický vhodnými nosičmi použitými podlá potreby obsahuje

1) kyselinu hyalurónovú a/alebo jej soli a/alebo homológy, analógy, deriváty, komplexy, estery, fragmenty alebo podjednotky kyseliny hyalurónovej a

2) látku zvolenú zo súboru zahŕňajúceho nesteroidné protizápalové liečivo, liečivo inhibujúce stenózu, vitamín C, látku pohlcujúcu volné radikály, antioxidant a ich kombinácie pre prevenciu zužovania tubulárnych stien u živočíchov potom, čo boli tieto tubulárne steny traumatizované, pričom sa účinné netoxické množstvo kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej zavedie do tohto prostriedku spolu s terapeuticky účinným množstvom látky 2) pre prevenciu zužovania tubulárnych stien, pričom množstvo zložky 1) postačuje pre účinnú prevenciu zužovania tubulárnych stien živočícha a množstvo zložky 2) zvy šuje účinnosť zložky 1) pri prevencii zužovania tubulárnych stien. Ako zložka 1) sa prednostne používa samotná kyselina hyalurónová a/alebo jej soli, prednostne hyaluronát sodný a prostriedok má prednostne kvapalnú formu (napríklad vhodnú pre intravenózne podávanie, ako sú i.v. sáčky. Tento farmaceutický prostriedok môže byť vyrobený vo velkom množstve a dodatočne rozdelený na jednotkové dávkovacie formy. Vzniknuté jednotkové dávkovacie formy sa môžu vo väčšom počtu zabaliť do zásobníku, z ktorého sa jednotlivé dávky odoberajú v prípade potreby. Množstvo zložky 1) pri tom v niektorých predvedeniach vynálezu leží v rozmedzí od asi 10 mg/70 kg do asi 1 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti. V iných predvedeniach môže byť toto množstvo až 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti alebo môže byť i vyššie. Prednostne je toto množstvo vyššie ako 200 mg/70 kg telesnej hmotnosti, najmä pokial sa nesteroidné protizápalové liečivo v zložke 2) používa v nadbytku. Pri jednom predvedení slúži tento farmaceutický prostriedok pre prevenciu arteriálnej restenózy po balónovej angioplastike u človeka. Pri tom sa tento farmaceutický prostriedok podáva pred balónovou angioplastikou, v jej priebehu a/alebo po nej.

Zložka 2) sa používa v množstve účinne zvyšujúcom účinnosť zložky 1). Množstvo vitamínu C môže byt až 50 až 100 g na dávku. Nesteroidné protizápalové činidlo sa môže podávať v množstve zodpovedajúcom bežne akceptovaným dávkam, v závislosti od konkrétneho druhu použitého liečiva. Pokial sa použije nesteroidné protizápalové liečivo v množstve vyššom, ako je to obvyklé, môže sa podávať použitá forma kyseliny hyalurónovej prednostne v množstve vyššom ako je asi 200 mg/70 kg telesnej hmotnosti. Ako vhodné nesteroidné protizápalové liečivo sa môže použiť liečivo zvolené zo súboru zahŕňajúceho diclofenac, indometacín (solubilizovaný na18 príklad v N-metylglukaroíne), piroxicam, (±)-trometaminovú soľ ketorolacu, kyselinu acetylsalicylovú, naproxén apod.

Keď prostriedok obsahuje činidlo zvolené zo súboru zahŕňajúceho nesteroidné protizápalové liečivo, liečivo inhibujúce stenózu, vitamín C, látku pohlcujúcu voľné radikály, antioxidant a ich kombinácie, prejavuje sa pôsobenie kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov a/alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej uľahčením transportu činidla na miesto podráždenia, čo sa prejavuje schopnosťou činidla preniknúť do buniek (v artérii do buniek endotelu) a má spoločne za následok zlepšenie prevencie napríklad arteriálnej restenózy.

Uľahčenie dodávky či transportu chemikálie na určité miesto v tele cicavca je možné ilustrovať príkladom, pri ktorom sa do rakovinového nádoru priamo vstrekuje etanol. Po priamom vstreknutí etanolu ukazuje sonografické vyšetrenie (vyšetrení ultrazvukom), že etanol nie je dispergovaný v nádore. Keď sa etanol podávaný do nádoru umiestni v kyseline hyalurónovej a/alebo jej soliach, ako nosiču, sonografické vyšetrenie nádoru ukazuje, že došlo k dispergácii etanolu v nádore.

Prihlasovateľ síce učinil predpoklad, že kyselina hyalurónová uľahčuje dodávku a transport liečiv, ale tento predpoklad vynález žiadnym spôsobom neobmedzuje. Vynález sa nechá použiť bez ohľadu na to, aký je skutočný mechanizmus pôsobenia pri aplikácii kyseliny hyalurónovej a/alebo jej solí a/alebo homológov, analógov, derivátov, komplexov, esterov, fragmentov a podjednotiek kyseliny hyalurónovej v kom binácii s nesteroidným protizápalovým liečivom, liečivom inhibujúcim stenózu, vitamínom C, látkou pohlcujúcou voľné radikály a/alebo antioxidantom.

Kombinácie kyseliny hyalurónovej a jej solí a iných foriem s rôznymi chemikáliami a liečivami, ako napríklad liečivom inhibujúcim stenózu, vitamínom C, nesteroidným protizápalovým liečivom atd. mení distribúciu týchto chemikálií a liečiv v ludskom tele, ovplyvňuje ich účinnosť a zaisťuje neobvyklé zacielenie na špatné prekrvované a/alebo patologické tkanivo. Tak napríklad použitie kyseliny askorbovej (vitamínu C), ako látky pohlcujúcej voľné radikály (v dennej dávke 50 g, čo je dávka 1 000 x vyššia ako je dávka, ktorá sa používa pre terapeutické účely ako vitamínu) pri intravenóznom podaní v kombinácii s 300 až 500 mg kyseliny hyalurónovej alebo hyaluronátu sodného znižuje zápaly. Predpokladá sa, že sa zvýšenie účinnosti prejavuje elimináciou voľných radikálov, a že teda kyselina askorbová pôsobí ako látka, ktorá pohlcuje voľné radikály.

K podobnej situácii dochádza u nesteroidných protizápalových liečiv. Pretože je potrebné veľké množstvo rozpustného indometacínu, prevedie sa tento chemický produkt do roztoku pri použití N-metylglukamínu pri stupni zriedenia 5 mg/l ml N-metylglukamínu (NMG). Vzniknutá látka sa potom nechá prejsť filtrom (Milipore, 22 μιη), čím dôjde k jej sterilizácii. Táto látka je pri šestnásťnásobnom prekročení terapeutickej dávky u zvierat netoxická, a preto bola považovaná za vhodnú pre použitie u humánnych pacientov. Indocid^^R\ rozpustený v NMG, je teda napríklad možné podávať humánnym pacientom intravenózne alebo intravaskulárne v rôznych dávkach, až do 10 mg/kg, pričom každá dávka indometacínu sa kombinuje napríklad s 200 až 1 000 mg kyseliny hyalurónovej, napríklad LifeCore^^R^ (hyaluronát sodný). Tak vzniká vhodná zmes, ktorá sa dá bezpečne aplikovať akýmikoľvek cestami. Podobné klinické štúdie boli tiež uskutočnené s kyselinou hyalurónovou vyrobenou inými metódami, napríklad extrakciou. Extrahovaná látka sa dobre hodí pre intravenóznu aplikáciu.

Ked sa nesteroidné protizápalové liečivo, napríklad indometacín (rozpustený v N-metylglukamíne) alebo iné nesteroidné protizápalové liečivo aplikuje v kombinácii s viac ako 200 mg kyseliny hyalurónovej, vztiahnuté na dávku 1 až 2 mg nesteroidného protizápalového liečiva na kg telesnej hmotnosti (v tomto konkrétnom prípade indometacínu a NMG) nedochádza k vzniku väčších toxických vedľajších účinkov, ako sú poruchy gastrointestinálneho systému, neurologické poruchy, depresie, atd., i ked sa v prípade potreby použijú zvýšené dávky indometacínu. Ked sa množstvo kyseliny hyalurónove j zníži zhruba pod tuto hodnotu, môžu sa obyčajne vedľajšie účinky objaviť opát. Pozorovaná odpoved je okrem toho lepšia, ked sa nesteroidné protizápalové liečivo (napríklad Indocid^)) kombinuje s kyselinou hyalurónovou, čo jasne ukazuje, že táto kombinácia sa teraz zacielila na tkanivo, napriek faktu, že bola podaná systemicky, tj. intravenóznou cestou. Bolo totiž pozorované, že ked sa pacientom okrem iných chemikálií (napríklad kyseliny askorbovej, tj. vitamínu C) a 500 až 200 mg nesteroidného protizápalového liečiva podá i kyselina hyalurónová (napríklad v podobe hyaluronátu sodného), tj. ked sa napríklad podá kombinácia indometacínu a kyseliny hyalurónovej, pocítia pacienti okamžite dramatickú úľavu od bolesti. Prihlasovateľ sa preto domnieva, že podanie napríklad nesteroidného protizápalového liečiva s kyselinou hyalurónovou (hyaluronátom sodným) zabraňuje enzymatickej produkcii prostaglandín syntetázy, ktorá bráni normálnej funkcii makrofágov. Kyselina hyalurónová (a jej soli a iné formy) teda nielen zvyšuje účinnosť nesteroidných protizápalových liečiv, ale znižuje i vedľajšie účinky a toxicitu spojenú s použitím inhibítorov syntézy prostaglandínu.

Kyselina hyalurónová a jej soli sa môžu používať v rôznych dávkach v rozmedzí od 10 do l 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti. Pretože kyselina hyalurónová, ani jej rôzne formy, nie sú toxické, môžu sa prirodzene podávať i vo vyš21 šich dávkach, napríklad 3 000 mg/70 kg telesnej hmotnosti, bez toho, aby sa to prejavovalo nežiadúcimi účinkami.

Jedna forma hyalurónovej kyseliny a/alebo jej solí (napríklad sodnej soli), homológu, analógu, derivátu, komplexu, esteru, fragmentu a podjednotiek kyseliny hyalurónovej, prednostne hyalurónovej kyseliny samotné a jej soli, ktoré, sa hodia pre použitie podlá vynálezu, je tvorená frakciou dodávanou firmou Hyal Pharmaceutical Corporation. Jedna taká frakcia je obsiahnutá v 15 ml flaštičke obsahujúcej hyaluronát sodný 20 mg/ml (300 mg/flaštička - várka 2F3). Frakcia hyaluronátu sodného je tvorená 2 % roztokom látky so strednou molekulovou hmotnosťou približne 225 000. Táto frakcia tiež obsahuje vodu q.s., ktorá je trojnásobne predestilovaná a sterilná, v súlade s požiadavkami lekárskeho predpisu US.P. pre injekčné prípravky. Flaštičky s hyalurónovou kyselinou a/alebo jej solí môžu byť zhotovené z borosilikátového skla typu 1 a uzatvorené butylkaučukovou zátkou, ktorá nereaguje s obsahom flaštičky.

Frakcia hyalurónovej kyseliny a/alebo jej soli (napríklad sodnej soli), homológu, analógu, derivátu, komple xu, esteru, fragmentu a/alebo podjednotiek kyseliny hyalurónovej, prednostne hyalurónovej kyseliny samotnej a jej soli, môže obsahovať hyalurónovú kyselinu a/alebo jej sol s nasledujúcimi vlastnosťami:

Prečistená, v podstate apyrogénna frakcia hyalurónovej kyseliny, získanej z prírodného zdroja, ktorá má aspoň jednu z vlastností zvolených z dalej uvedeného súboru:

(i) molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 150 000 do 225 000;

(ii) obsah sulfátovaných mukopolysacharidov nižší ako asi 1,25 % hmotnostných, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(iii) obsah proteínu nižší ako asi 0,6 % hmotnostných, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(iv) obsah železa nižší ako asi 150 ppm, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(v) obsah olova nižší ako asi 15 ppm, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(vi) obsah glukosamínu nižší ako 0,0025 %;

(vii) obsah glukurónovej kyseliny nižší ako 0,025 %;

(viii) obsah N-acetylglukosamínu nižší ako 0,025 %;

(ix) obsah aminokyselín nižší ako 0,0025 %;

(x) UV-extinkčný koeficient pri 257 nm nižší ako asi 0,275;

(xi) UV-extinkčný koeficient pri 280 nm nižší ako asi 0,25; a (xii) hodnotu pH v rozmedzí od 7,3 do 7,9.

Hyalurónová kyselina je prednostne zmiešaná s vodou a použitá frakcia hyalurónovej kyseliny má strednú molekulovú hmotnosť v rozmedzí od 150 000 do 225 000. Frakcia hyalurónovej kyseliny s výhodou vyhovuje aspoň jednej vlastnosti zvolenej z nasledujúceho súboru:

(i) obsah sulfátovaných mukopolysacharidov nižší ako asi % hmotnostné, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(ii) obsah proteínu nižší ako asi 0,4 % hmotnostných, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(iii) obsah železa nižší ako asi 100 ppm, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(iv) obsah olova nižší ako asi 10 ppm, vztiahnuté na celkovú hmotnosť;

(v) obsah glukosamínu nižší ako 0,00166 %;

(vi) obsah glukurónovej kyseliny nižší ako 0,0166 %;

(vii) obsah N-acetylglukosamínu nižší ako 0,0166 %;

(viii) obsah aminokyselín nižší ako 0,00166 %;

(ix) UV-extinkčný koeficient pri 257 nm nižší ako asi 0,23;

(x) UV-extinkčný koeficient pri 280 nm nižší ako asi 0,19; a (xi) hodnotu pH v rozmedzí od 7,5 do 7,7.

Môže sa tiež používať hyalurónová kyselina a/alebo jej soli (napríklad sodné soli), homológ, analóg, derivát, komplex, ester, fragment a/alebo podjednotky kyseliny hyalurónovej od iných výrobcov, napríklad hyaluronát sodný, ktorý vyrába a dodáva firma LifeCore^^R^ Biomedical, Inc. , ktorý má nasledujúce vlastnosti:

Vlastnosť	Opis
vzhlad	biele až krémovo zafarbené častice
zápach	žiadny zápach nie je zistený
viskozitná stredná molekulová hmotnosť	< 750 000 dalton
UV/Vis 190-820nm	zhodný s referenčnou vzorkou

optická hustota (OD), 260 nm <0,25 jednotky OD

citlivosť na hyaluronidázu	pozitívna odpovedí
IČ	zhodný s referenčnou vzorkou
pH, 10 mg/g roztok	6,2 až 7,8
voda	maximálne 8 %
proteín	< 0,3 μg/mg NaHy
acetát	< 10,0 gg/mg NaHy

ťažké kovy, maximálny obsah (ppm)

As Cd Cr Co Cu Fe Pb Hg Ni

2,0 5,0 5,0 10,0 10,0 25,0 10,0 10,0 5,0 mikrobiálne biologické znečistenie endotoxín skúšanie ‘biologickej bezpečnosti nie je pozorované < 0,07 EU/mg NaHy úspešne prejde skúškou toxicity v oku králika

Tiež sa môžu použiť rôzne formy kyseliny hyalurónovej , ktoré sú opísané v doterajšom stave techniky.

Odkazy na potenciálne vhodnú hyalurónovú kyselinu, jej zdroje, spôsoby jej výroby a jej izoláciu sú uvedené v nasledujúcich literárnych citáciách:

V US patente č. 4 141 973 sú opísané frakcie hyalurónovej kyseliny (vrátane jej sodných solí, ktoré majú

a) priemernú molekulovú hmotnosť vyššiu ako asi 750 000, prednostne vyššiu ako asi 1 200 000, t.j. limitné viskozitné číslo vyššie ako asi 1400 cm³/g a prednostne vyššie ako asi 2 000 cm³/g;

b) obsah proteínu nižší ako 0,5 % hmotnostných;

c) absorbanciu ultrafialového svetla 1% roztoku hyaluronátu sodného nižšiu ako 3,0 pri vlnovej dĺžke 257 nm a nižšiu ako 2,0 pri vlnovej dĺžke 280 nm;

d) kinematickú viskozitu 1% roztoku hyaluronátu sodného vo fyziologickom tlmivom roztoku vyššiu ako asi 10 “³ m²/s prednostne vyššiu ako 10 “² m²/s;

e) molárnu optickú otáčavosť 0,1 až 0,2% roztoku hyaluronátu sodného vo fyziologickom tlmivom roztoku nižšiu ako -11 x 10³ deg-cm²/mol (disacharid), merané pri 220 nm;

f) ked sa 1 ml 1 % roztoku tohto hyaluronátu sodného rozpusteného vo fyziologickom roztoku implantuje do sklovca oka opice (Owl monkey), pričom sa ním nahradí približne 1/2 prítomného kvapalného sklovca, nedôjde k žiadnej podstatnej celulárnej infiltrácii Camera vitrea bulbi a Camera oculi anterior, žiadnym zábleskom v Humor aquosus, žiadnemu zákalu alebo zábleskom v sklovci a žiadnym patologickým zmenám rohovky, šošovky, dúhovky, sietnice a choroidea;

pričom táto hyalurónová kyselina je dalej

g) sterilná, neobsahuje pyrogény a

h) neantigénna.

Kanadský patent č. 1 205 031 (ktorý cituje US patent č. 4 141 973, ako doterajší stav techniky) sa týka frakcií hyalurónovej kyseliny so strednou molekulovou hmotnosťou od 50 000 do 100 000; od 250 000 do 350 000 a od 500 000 do 730 000, pričom sú tu diskutované spôsoby ich výroby.

Pokial sa používa kyselina hyalurónová s vysokou molekulovou hmotnosťou (alebo jej soli alebo iné formy) musí sa zriediť, aby bolo možné ju podávať a zaistiť, že nebude dochádzať k jej koagulácii a interferencii s telesnými funkciami .

Jeden injekčný prostriedok na báze kyseliny askorbovej (vitamínu C) podlá lekárskeho predpisu US.P. vyrába firma

Steris Laboratories Inc., Phoenix, Arizona, 85043 USA. Tento prostriedok obsahuje 22 mg/ml kyseliny askorbovej (čo zodpovedá 250 mg/ml askorbátu sodného) a je umiestnený v zásob níkoch s objemom 30, 50 alebo 100 ml. Zásobníkom s objemom 30 ml sa venuje prednosť.

Prehľad obr. na výkresoch

Na obr. 1 je uvedená fotografia poranených a simulovane operovaných artérií.

Na obr. 2 je znázornený graf ilustrujúci expresiu RHAMM (receptor pre HA (hyaluronanom) sprostredkovanú motilitu) karotidovými artériami (plné štvorčeky patria poraneným, prázdne štvorčeky kontralaterálnym a plné trojuholníky simulovane operovaným artériám).

Na obr. 3 sú uvedené fotografie ilustrujúce expresiu RHAMM a hyaluronanu v bunkách hladkého svalstva karotidovej artérie 4 dni po jej poranení.

Na obr. 4 je znázornený stĺpcový graf ilustrujúci účinok RHAMM peptidov viazajúcich HA (hyaluronan-(kyselinu hyalurónovú)) (401 až 411) a anti-RHAMM protilátok na chemotaxiu makrofágových bunečných línií v odpovedi na komplement (C5a).

Na obr. 5 je znázornený stĺpcový graf ilustrujúci účinok RHAMM peptidov viazajúcich HA (401 až 411) na chemotaxiu neutrofilov v odpovedi na IL-8.

Na obr. 6 je znázornený stĺpcový graf ilustrujúci účinok RHAMM peptidov viazajúcich HA (401 až 411) na migráciu buniek hladkého svalstva 5 hodín po poranení.

Obr. 7, 8, 9, 10, 11 a 12 sa vzťahujú k článku s názvom Neointimal Formation after Balloon Catheter Injury: A Role of Hyaluronan and the Hyaluronan Receptor RHAMM”, ktorého obsah je reprodukovaný ďalej.

Na obr. 7 sú uvedené fotografie buniek endotelu a buniek hladkého svalstva karotidových artérií zjazvených potkanov, ktoré boli použité pri skúšaniu.

Na obr. 8 je ilustrovaná expresia rôznych izoforiem RHAMM po špecifikovaných časových úsekoch.

Na obr. 9 je ilustrovaná distribúcia hyaluronanu.

Na obr. 10 je znázornený stĺpcový graf ilustrujúci účinok RHAMM peptidov viazajúcich HA (401 až 411) na chemotaxiu neutrofilov v odpovedi na IL-8.

Na obr. 11 je znázornený stĺpcový graf ilustrujúci účinok RHAMM peptidov viazajúcich HA (401 až 411) a antiRHAMM protilátok na chemotaxiu makrofágových bunečných línií v odpovedi na komplement (C5a).

Na obr. 12 je znázornený stĺpcový graf ilustrujúci účinok RHAMM peptidov viazajúcich HA (401 až 411) na migráciu buniek hladkého svalstva 5 hodín po poranení.

Boli uskutočnené nasledujúce pokusy.

Anestetizuje sa 10 králikov a vykoná sa u nich balónová angioplastika. Králici sa podrobia perfúzii hyaluronanom (5 mg/ml) alebo samotným tlmivým roztokom a nechajú sa zotaviť. Po 2, 24 a 48 hodinách od poranení sa králici usmrtia a ich karotidová artéria sa spracuje na vzorku pre histológiu. Pre ďalšiu prácu sa používajú 5 až 10 μ,ιη rezy. Tieto rezy sa ofarbia hematoxylínom alebo anti-RHAMM protilátkami. Ana lyzuja sa 10 rezov pri každom ošetrení.

Výsledky tejto analýzy sú opísané ďalej vo vzťahu k obrázkom.

Obr. 1: Poranené karotidové artérie vykazujú denudáciu vrstvy buniek endotelu a adherenciu bielych krviniek (obr. 1A). Biele krvinky sú pozitívne vyfarbené na RHAMM vzhľadom na IgG kontrolné pozadie (obr. IB). Karotidové artérie, ktoré boli exponované hyaluronanu (obr. 1C) alebo simulovane operované artérie (obr. ID) vykazujú intaktnú vrstvu buniek endotelu a nie je na nich patrná akumulácia bielych krviniek.

Obr. 2: Analýza Western Transblot expresie RHAMM karotidovými artériami. Karotidové artérie sa homogenizujú, uvolnené proteíny sa podrobia elektroforéze na SDS-PAGE a pomocou monošpecifickej protilátky sa zisťuje prítomnosť RHAMM. Prítomnosť protilátky sa vizualizuje chemoluminiscenciou a relatívne množstvo viazanej protilátky sa kvantifikuje optickou denzitometriou. Operované zvieratá vykazujú akútny velmi rýchly nárast prítomnosti RHAMM. Hladina RHAMM klesne po 5 až 6 dňoch od poranení tkaniva. Simulovane opero vané zvieratá nevykazujú nárast expresie RHAMM.

Obr. 3: Na obr. 3 je znázornená expresia RHAMM (obr. 3A) a hyaluronanu (obr. 3B) v bunkách hladkého svalstva karotidovej artérie 4 dni po jej poranení. Expresia RHAMM na bielych krvinkách sa ihneď zvýši (obr. 1), zatial čo k zvýšení expresie RHAMM na bunkách hladkého svalstva dôjde neskoršie a súčasne so začiatkom ich lokomócie. Bunky hladkého svalstva simulovane operovaných zvierat nevykazujú podobné zvýšenie expresie RHAMM (obr. 3C).

Obr. 4: Na tomto obrázku je znázornený účinok RHAMM peptidov na chemotaxiu neutrofilov v odpovedi na IL-8. RHAMM peptidy, ktoré simulujú väzbovú doménu pre hyaluronan RHAMM inhibujú chemotaxiu neutrofilov pri skúške v Boydenovej komore.

Obr. 5: Z tohto obrázku je zrejmé, že RHAMM peptidy a protilátky inhibujú chemotaxiu makrofágových bunečných línií (SI, WEHI-3) v odpovedi na komplement. Komplement, ale nie tepelne (56°C) inaktivovaný komplement, simuluje chemotaxiu makrofágových bunečných línií. RHAMM peptidy, ktoré simulujú väzbovú doménu pre hyaluronan RHAMM a anti-RHAMM protilátky inhibujú chemotaxiu.

Obr. 6: RHAMM peptidy inhibujú lokomóciu buniek hladkého svalstva v odpovedi na poranenie. RHAMM peptidy, ktoré simulujú väzbovú doménu pre hyaluronan RHAMM inhibujú lokomóciu buniek hladkého svalstva po poranení.

Pomiešaný (scrambled) peptid nevykazuje žiadny účinok, čo ukazuje špecificitu na sense peptid.

Expresia RHAMM stanovená detekčnou metódou označovanou názvom Analýza Western Blot pri použití monošpecifických protilátok vzhľadom na RHAMM (Turley E. A., Austin L., Vandeligt K. a Čiary C., 1991, J. Celí. Biol. 112; 1041) vykazuje akútny nárast, ktorý je detegovateľný do dvoch hodín (obr.2), čo je časový rámec, v ktorom je u kontrolných zvierat pozorovaná adhézia bielych krviniek k endotelu (obr. 2). [Ďalšia diskusia RHAMM je uvedená v článku Identification of Two Hyaluronan-binding Domains in the Hyaluronan Receptor RHAMM, Baihua Yang, Liying Zhang a Eva Ann Turley, The Journal of Biological Chemistry, zv. 268, č. 12, aprílové číslo 25, str. 8617 až 8623, 1993]. Hladina RHAMM je tiež zvýšená v kontralaterálnej artérii, čo ukazuje, že z pora31 neného tkaniva sa uvolňuje rozpustný faktor regulujúci expresiu RHAMM. Simulovane operované zvieratá však vykazujú malý nárast expresie RHAMM (obr. 2). U experimentálnych zvierat sa expresia RHAMM udržiava počas niekolkých dní a potom hladina RHAMM poklesne. Vyšetrenie fixovaného tkaniva ukazuje, že hlavnými bunkami exprimujúcimi RHAMM sú aktivované biele krvinky a bunky hladkého svalstva (obr. 1 a 3). Podiel RHAMM na lokomócii bielych krviniek a buniek hladkého svalstva sa zisťuje in vitro pri použití obrazovej analýzy na meranie náhodnej lokomócie a Boydenovej komory na meranie chemotaxie.

Peptidy (100 ng/miska), ktoré simulujú oblasti RHAMM (najmä oblasti viazajúce hyaluronan), inhibujú migráciu makrofágov (obr. 4), neutrofilov (obr. 5) a buniek hladkého svalstva (obr. 6) s vysokým stupňom štatistickej významnosti (p > 0,0001 pri Študentovom T teste). Kolektívne tieto výsledky ukazujú, že RHAMM a najmä jeho schopnosť viazať hyaluronan, sú podstatné pre lokomóciu bielych krviniek a buniek hladkého svalstva a že expresia RHAMM sa na mieste poranenia tkaniva po experimentálnej balónovej katétrizácii u králikov zvýši.

Ošetrenie králikov hyaluronanom tesne pred ich poranením má za následok odstránenie adherencie bielych krviniek endotelu, čo sa prejavuje tým, že tkanivo vypadá intaktné pri detekcii za použitia histologických kritérií (obr. 1). Niekolko dní po poranení vypadajú karotidové artérie králikov ošetrených hyaluronanom podobne ako karotidové artérie kontrolných králikov, v ktorých je endotel intaktný.

Tieto výsledky je možné objasniť tým, že hyaluronan sa naviazal na bunky exprimujúce vysokú hladinu svojho receptoru RHAMM a zabránil následným interakciám týchto buniek s endotelom. Očakáva sa, že expresia iného receptoru hyaluronanu, CD44, bude tiež zvýšená.

Diskusia a ilustrácia rôznych termínov použitých v tomto opise sú uvedené v dosial nepublikovanom článku s názvom Neointimal Formation after Balloon Catheter Injury: A Role of Hyaluronan and the Hyaluronan Receptor RHAMM, ktorý je reprodukovaný dalej.

«Tvorba neointima po poranení balónovým katétrom: úloha hyaluronanu a hyaluronanového receptoru RHAMM

Abstrakt

Pretože hyaluronan (HA) a jeho interakcia s HA receptorom RHAMM (Receptor for HA-Mediated Motility) boli implikované pri migrácii buniek hladkého svalstva in vitro, skúmali sme expresiu týchto molekúl pri in vitro modelovom poranení, ktorým dochádza k postihnutí buniek hladkého svalstva pri použití deendotelizácie karotidovej artérie potkana pri balónovej katétrizácii. Expresiou RHAMM po poranení boli zasiahnuté prevážne leukocyty a bunky hladkého svalstva. Dve hodiny po poranení došlo k adhézii neutrofilov a makrofágov k miestu poranenia a k silnej expresii RHAMM. Do 6 hodín bolo možné v blízkosti internej elastickej laminy identifikovať subpopuláciu mediálnych buniek hladkého svalstva, čo ukazuje zvýšenú expresiu RHAMM. 48 hodín po deendotelizácii sa v susedstve lúmenu vytvorila vrstva buniek hladkého svalstva silne sa vyfarbujúca ako na RHAMM, tak na HA. V rozmedzí od 7 do 14 dní od poranení táto neointimálna vrstva pokračovala v expresii vysokej hladiny RHAMM, ale expresia HA bola obmed- , zená na bunky nachádzajúce sa na spojení medzi mediálnou a neointimálnou vrstvou. V kontrolných artériách boli zaznamenané dve izoformy RHAMM (65 a 84 kDa). Súčasne so zvýšeným vyfarbovaním na RHAMM a HA pozorovaným v poranených artériách bola v rozmedzí od 36 do 72 hodín po poranení pozorovaná 70kDa izoforma, ktorou môže byt membránová forma RHAMM. Chemotaxia makrofágov a neutrofilov bola inhibovaná anti-RHAMM antisérom a peptidom kódujúcim HA-väzbovú doménu RHAMM. Týmito reagenciami bola tiež inhibovaná migrácia buniek hladkého svalstva po poranení in vitro. Kolektívne tieto výsledky ukazujú, že HA a RHAMM majú svoju úlohu pri migračných odpovediach na vaskulárne poranenie.

Úvod

Deendotelizácia karotidovej artérie potkana indukovaná balónovým katétrom je dobre zavedený model restenózy po balónovej angioplastike¹. Sekvencie javov zahŕňajúce adherenciu inflamatorných buniek, proliferáciu buniek hladkého svalstva a migráciu do intima, ktorá je nasledovaná nadmernou produkciou extracelulárnej matrice, sa prejavuje stenózou postihnutej cievy po poranení endotelu¹“⁵. Tento proces je regulovaný rastovými faktormi, ako je rastový faktor z krvných doštičiek (PDGF)⁶ a transformačný rastový faktor β (TGF-β)⁷, hormónmi, ako je angiotenzín⁸ a proteázami, ako sú aktivátory tkanivového a urokinázového plazminogénu. Inflamatorné bunky môžu tiež modulovat odpovedí produkciou širokého spektra rastových faktorov, vrátane PDGF a TGF-β₁. Po poranení dôjde k proliferácii malej časti buniek hladkého svalstva v mediálnej vrstve a migrácií týchto buniek internou elastickou laminou sa vytvorí neointimálna vrstva¹¹. Nadbytočné ukladanie extracelulárnej matrice týmito bunkami hladkého svalstva vedie k zníženiu velkosti priesvitu poranenej artérie¹². Mechanizmus alebo mechanizmy, akými dochádza k chemotaxii inflamatorných buniek a migrácii buniek hladkého svalstva po in vivo poranení zostávajú nejasné.

Už skôr sme ukázali in vitro, že pre migráciu ras-transformovaných buniek¹³ a buniek hladkého svalstva do rán (Savani et al.,) je nutná interakcia RHAMM a HA. Poranenie monovrstvy sa prejavilo zvýšením HA asociovanej s bunkami, expresiou novej 70kDa izoformy RHAMM a lokalizáciou RHAMM na povrchu buniek súčasne s vysokou rýchlosťou lokomócie po poranení. Polyklonálne RHAMM antiséra blokujúce väzbu HA k svojmu receptoru okrem toho inhibujú migračnú odpoveď na poranenie (Savani et al.,). Pri tejto štúdii sme skúmali rozdelenie a expresiu ako RHAMM, tak HA pri poranení karotidovej artérie potkana balónovým katétrom v priebehu vývoja neointima a študovali sme účinky antiRHAMM antisér a RHAMM peptidov na chemotaxiu a migráciu vaskulárnych buniek.

Materiál a metódy

Zvieratá

Pri týchto pokusoch bolí použití samci potkana Sprague-Dawley (Charles River) s hmotnosťou 325 až 350 g, starí 15 týždňov.

Poranenie balónovým katétrom

Zvieratá sa anestetizovali intramuskulárnym podaním 80 mg/kg ketamínu (Aveco) a 6 mg/kg xylazínu (Haver). iLavá karotidová artéria bola vystavená pôsobeniu balónového katétru 2F Fogarty (Baxter, model 12-060-2f), ktorý bol zavedená do priesvitu tepny. Balónovým katétrom sa po nafúknutí balónku trikrát posunulo, aby došlo k odstráneniu endotelu. Byli izolované obidve karotidové artérie poranených zvierat. U simulovane operovaných zvierat bola ľavá karotidová artéria exponovaná katétru bez pohybu a pre štúdiu bola izolovaná pravá artéria.

Anti-RHAMM antisérum a peptid viazajúci HA RHAMM

Polyklonálne antisérum anti-peptid aa²⁶⁹“²⁸⁸Ab (Savani et al.) bolo vypestované v králikoch v odpovedi na peptid aa²⁶⁹“²⁸⁸ kódovaný v RHAMM cDNA¹⁴. Bolo ukázané, že toto antisérum blokuje ako HA-stimulovanú náhodnú lokomóciu, tak migráciu buniek hladkého svalstva po poranení a že sčasti blokuje väzbu HA na RHAMM (Savani et al.).

Oblasť viazajúci. HA v RHAMM sa skladá z dvoch desaťaminokyselinových domén umiestnených v blízkosti karboxylového konca proteínu¹⁵. Peptid simulujúci doménu I (aminokyseliny^{401 _411})- YKQKIKHWKLK a pomiešaný (scrambled) peptid, ktorý sa skladá z rovnakých aminokyselín, ale usporiadaných náhodným spôsobom, bol syntetizovaný v Ústave bunečnej biológie (Manitoba Inštitúte of Celí Biology, Kanada). Obidva peptidy boli pri skúškach lokomócie použité v konečnej koncentrácii 2 μg/ml.

Imunocytochémia

Artérie izolované pre imunocytochémiu boli fixované v 10 % formalínu tlmenom fosfátom, uložené do parafínu a spra cované na 5 μπι rezy. Nešpecifické miesta tkaniva boli blokované jednohodinovým pôsobením 1,5% kozieho séra v 0,01M fyziologickom solnom roztoku tlmenom Tris-tlmivým roztokom (TBS). Rezy boli inkubované cez noc bud s antipeptidom aa²⁶⁹“²⁸⁸Ab (pri zriedení 1 : 100) rozpusteným v 0,01M TBS s 1,5 % kozieho séra pre detekciu RHAMM, alebo s biotinylovanou HA viazajúcou oblasťou agrekanu (zriedenie 1 : 300) izolovaného z hovädzej nosovej chrupky¹⁶ pre detekciu HA. Rezy určené pre farbenie RHAMM boli inkubované s biotinylovaným kozím protikráličím IgG (Vectastain ABC peroxidase kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 5 μΙ/ml 0,01M TBS. Aktivita endogénnej peroxidázy bola odstránená jednohodinovým pôsobením 0,6 % peroxidu vodíka v metanole (Mallinckrodt) pri teplote miestnosti. Všetky rezy bolo potom inkubované s komplexom avidín-biotín-peroxidáza (Vectastain, Vecto Labs.) 1 hodinu pri teplote miestnosti. Vyfarbenie bolo získané pri použití diaminobenzadínu (DAB, Sigma, 10 mg/ml v 0,05M TBS) a reakcia bola zastavená destilovanou vodou. Zafarbenie reakčného produktu bolo zosilnené desaťminútovým pôsobením 0,5% síranu meďnatého v 0,9% roztoku chloridu sodného. Dofarbenie bolo vykonané pätnásťminútovým pôsobením 0,25% roztoku metylovej zeleni. Po vyjasnení v n-butanole a xyléne boli rezy upevnené v zariadení Permountí^R^ (Fisher Scientific). Špecificita farbenia na RHAMM bola potvrdená výrazne nižším vyfarbením, ktoré bolo pozorované po použití séra, z ktorého boli RHAMM protilátky odstránené afinitnou chromatografiou. Špecificita farbenia na Ha bola potvrdená jednak inkubáciou vzorky s nadbytkom HA pred farbením a jednak predbežným spracovaním rezov so Streptomyces hyaluronidase za účelom degradácie HA pred farbením. Ako negatívna kontrola bolo použité normálne králičie IgG (5 μg/ml,

Sigma) a ako pozitívna kontrola boli použité anticytoskeletálne aktínové protilátky (zriedenie 1 : 1 000, Sigma).

Imunobloty

Karotidové artérie boli zmrazené v kvapalnom dusíku a udržované pri teplote -80”C až do ďalšej analýzy. Tkanivá boli homogenizované v tlmivom roztoku pre lýzu [25mM Tris-HCl, 0,1 % dodecylsulfát sodný, 1 % Tri ton X-100, 1 % deoxycholát sodný, 0,15 M chlorid sodný, 1 mM EDTA s prísadou inhibítoru proteázy leupeptínu (1 μg/ml) fenylmetylsulfonylfluoridu (2mM) a pepstatínu A (1 μg/ml), aprotinínu (0,2 TlU/ml) a 3,4-dichlorisokumarínu (200μΜ). Koncentrácia proteínu bola stanovená skúšobnou metódou pre proteíny DC (BioRad, Richmond, CA, USA) pri použití rovnakej vzorky tlmivého roztoku pre lýzu pri stanovení pozadia. 5 μg proteínu bolo oddelených z každej vzorky na 10 % SDS PAGE a potom bol proteín transblotovaný na nitrocelulózovú membránu. Ďalšie miesta viazajúce proteín boli blokované 5% odtučneným mliekom v TTBS (0,01 M Tris-báza, 150 mM chlorid sodný, pH 7,4 s prísadou 0,05 % Tween 20, Sigma Chemical Company, St. Louis,

MO, USA). Bloty boli inkubované s primárnou protilátkou (antipeptidom aa^269_288Ab zriedeným v pomeru 1 : 250 1% odtučneným mliekom v TTBS) cez noc pri teplote 4'C. Primárna protilátka bola detegovaná pri použití kozej protikráličej IgG protilátky konjugovanej k chrenovej peroxidáze (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA, 0,2 gg/ml v 1 % odtučnenom mlieku v TTBS) po jednohodinovej inkubácii pri teplote miestnosti a bola vizualizovaná chemoluminiscenciou (ECL, Amersham) pódia inštrukcií výrobca.

Bunky a bunečné línie

Z hovädzej aorty boli izolované bunky hladkého svalstva spôsobom opísaným skôr pre izoláciu buniek z aorty potkana¹⁷. Izolované bunky boli udržiavané v Dulbeccom modifikovanom Eaglesovom médiu (DME), ktoré bolo doplnené fetálnym teíacím sérom (FCS) (10%) a tlmivým roztokom HEPES (20mM), pri pH 7,2, teplote 37'C a v atmosfére obsahujúcej 5 % oxidu uhličitého vo vzduchu. Všetky pokusy boli uskutočňované pri použití definovaného média [DM, Dulbeccom modifikovaného Eaglesového média doplneného tlmivým roztokom HEPES, pH 7,2 s 0,5 U/ml inzulínu (suspenzia zinku, hovädzí dobytok a ošípané; Novo Laboratories Ltd., Willowdale, Ontario, Kanada) a 4 μ5/ιη1 transferínu (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA)] Kultivačné médium sa nahradí 24 hodín pred vytvorením filmu. Poškodenie konfluentných monovrstiev poranením spočívalo v odstránení poloviny monovrstvy pri použití odberového zariadenia pre bunky a pridaní čerstvého DM v prítomnosti budf RHAMM peptidu aa⁴®^1-411 alebo pomiešaného peptidu na báze rovnakej domény, ktorý bol opísaný hore.

Pre analýzu účinku protilátok a syntetického peptidu na chemotaxiu makrofágov na endotoxínom aktivované myšie sérum (AS) boli použité makrofágové bunečné línie SI a WEHI-3

Tieto bunečné línie boli tiež uchovávané v DME s 10 % FCS a mM tlmivého roztoku HEPES s pH 7,2 pri 37°C v atmosfére obsahujúcej 5 % oxidu uhličitého vo vzduchu.

Z vzoriek periférnej krvi normálnych dobrovoľníkov boli izolované humánne neutrofily. Tieto neutrofily boli zmiešané s roztokom ACD (0,085M citran trojsodný, 0,065M kyselina citrónová, 2 % dextróza), aby sa zabránilo zrážaniu K zmesi bol pridaný 5 % dextrán a bola odstránená oddelená plazma a biele krvinky. Bunky boli premyté dvakrát v PBS s pH 7,2 a pre separáciu lymfocytov bol použitý Ficoll gradient. Izolované neutrofily boli potom premyté a resuspendované v PBS. Červené krvinky boli podrobené lýzi krátkou expozíciou hypotonickému PBS.

Priebežná cinemikrografia

Poškodené bunečné monovrstvy boli monitorované na motilitu pri použití inverzného mikroskopu IM 35 Zeiss, ku ktorému bola pripojená videokamera (Hamamatsu CCD, Inc., Japonsko). Bunky boli uchovávané pri teplote 37C pri použití vyhrievacej dosky (TRZ 3 700, Zeiss, Nemecko). Lokomócia buniek bola sledovaná pomocou obrazovej analýzy (Image 1, Universal Imaging Corp., Westchester, PA, USA). Tento program umožnil kvantifikáciu presunu jadier zo sekvencie digitalizovaných obrazov. Motilita 30 buniek pri každom pokusu bola sledovaná počas 24 hodín a každú hodinu bola vypočítaná stredná rýchlost pohybu.

Skúška chemotaxie

Chemotaxia bola stimulovaná buď pri použití myšieho séra aktivovaného bakteriálnym endotoxínom (AS) vyrobeného spôsobom podľa Stevensona et al.¹⁸ pre makrofágové bunečné línie alebo 100 ng/ml interleukínu-8 (IL-8) pre neutrofily.

V prvom prípade bolo pre kontrolu použité teplom inaktivo39 vané sérum (20 minút pri 56’C) a v druhom samotné médium. Použitá skúška chemotaxie predstavuje kolorimetrické stanovenie vyvinuté v našom laboratóriu, ktoré bolo podrobne opísaní inde¹⁹. V krátkosti je možné túto skúšku opísať takto: Použije sa 96-jamková komora pre chemotaxiu so spodným zahĺbením, ktoré je dostatočne široké, aby mohlo pridržovať mikrotitrovú dosku (Neuro Próbe, skladové číslo MBA 96) a rámčekový filter 5 gm (Neuro Próbe, skladové číslo PED 5/A). Mikrotitrová doska sa naplní chemoatraktantami a kontrolnými reagenciami a umiestni do zahĺbenia komory pre chemotaxiu.

Na hornú časť naplnenej mikrotitrovej dosky sa položí rámčekový filter. Potom sa komora uzatvorí a do jamiek vrchnej dosky sa umiestni 200 μΐ bunečnej suspenzie (2,5 x 10⁵ buniek/ml v DME). Komora sa inkubuje pri 37”C počas 4 až 6 hodín v atmosfére obsahujúcej 5 % oxidu uhličitého vo vzduchu. Po inkubácii sa médium v jamkách vrchnej dosky nahradí 200 μΐ PBS s obsahom 20μΜ EDTA a nasleduje 30 minútová inkubácia pri 4^eC. Bunky, ktoré zostanú na vrchnej strane polykarbonátovej membrány sa odstránia vatovými Q-tampónmi. Bunky, ktoré migrovali do filtru alebo filtrom sa odstránia centrifugáciou pri použití 50 ml skúmavkového adaptéra (10 minút, 500 g) a prenesú do 96-jamkovej dosky. Počet premiestnených buniek sa kvantifikuje prídavkom 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)2,5-di-fenoltetrazóliumbromidu (MTT) do konečnej koncentrácie 250 gg/ml s 4 hodinovou inkubáciou pri 37’C. Tmavo purpurové kryštály vzniknuté redukciou MTT sa rozpustia zmiešaním s 100 μΐ izopropanolovej kyseliny chlorovodíkovej (2mM). Doska sa analyzuje do 2 hodín pri použití čítacieho zariadenia pre mikrotitrové dosky ELISA s filtrom 540 nm. Stupeň redukcie MTT zodpovedá relatívnemu počtu buniek¹⁹.

Výsledky

Bolo zistené, že po poškodení karotidovej artérie balónovým katétrom dochádza k zvýšenej expresii RHAMM a HA.

Bunky endotelu a hladkého svalstva karotidových artérií získaných od neporanených potkanov boli mierne pozitív ne na RHAMM (obr. 7A). Dve hodiny po poranení došlo k prilip núti neutrofilov a makrofágov k obnaženej oblasti a k silnej expresii RHAMM (obr. 7B). Do 6 hodín po poranení však čast buniek hladkého svalstva vykazovala zvýšenú expresiu RHAMM (obr. 7C) a do 48 hodín bunky hladkého svalstva, ktoré vytvorili neointima, sa silne vyfarbovali na RHAMM (obr. ID). Do 7 dní a až do 14 dní po poranení dochádzalo k zväčšovaniu neointimálnej vrstvy. Bunky v tejto vrstve pokračovali v expresii vysokej hladiny RHAMM (obr. 7E a 7F). Rezy inkubované s preimunným IgG a anti-RHAMM antisérom, ktoré boli chromátografované na stĺpci RHAMM-GST (fúzia proteínov) za účelom odstránenia anti-RHAMM protilátok, sa nevyfarbovali (údaje nie sú uvedené).

Expresia RHAMM bola dalej skúmaná pri použití analýzy Western Blot artérií poranených a simulovane operovaných zvierat pri použití anti-peptidu aa^269-288 Ab. U neporanených artérií bola pozorovaná významná expresia dvoch izoforiem RHAMM s molekulovou hmotnosťou 84 a 65 kDa (údaje nie sú uvedené). U poranených artérií však bola pozorovaná konzistentná zvýšená expresia izoformy RHAMM s molekulovou hmotnosťou 84 kDa v rozmedzí od 2 do 24 hodín po deendotelizácii (obr. 8) a po tomto čase expresia tejto izoformy poklesla (obr. 8). Nasledujúci nárast hladiny izoformy s molekulovou hmotnosťou 84 kDa bol pozorovaný v rozmedzí od 72 do 168 hodín (obr. 8). Zmeny v expresii 65kDa izoformy boli u poranených artérií len minimálne (obr. 8). Zaujímavé je, že v rozmedzí od 36 do 72 hodín po poranení bola prídavné exprimovaná 70 kDa izoforma (obr. 8), ktorá sa dočasne prekrývala so silným farbením na RHAMM a HA pozorovaným u poranených artérií (obr. 7).

Distribúcia HA u neporanených karotidových artérií bola obmedzená na endotel a adventitia (obr. 9A). Dve hodiny po poranení prilipli neutrofily a makrofágy k obnaženej oblasti, čo sa prejavilo miernym zvýšením farbenia na HA (obr. 9B). Až do 48 hodín boli bunky hladkého svalstva vytvárajúce neointima silne pozitívne na HA (obr. 9C), čo sa prekrývalo s expresiou vysokej hladiny RHAMM (obr. 9D). V rozmedzí od • 7 do 14 dní farbenia na HA klesalo a postupne sa obmedzovalo na bunky na spojenie medzi médiom a neointima (obr. 9D a E).

• Rezy, ktoré boli predbežne ošetrené hyaluronidázou alebo preinkubované s biotinylovanou sondou viazajúcou HA s HA, sa nefarbili (údaje nie sú uvedené), čo ukazuje, že skúška je špecifická.

Ďalej bolo zistené, že interakcia HRAM:HA reguluje chemotaxiu inflamatorných buniek.

Pretože expresia RHAMM bola zvýšená v inflamatorných bunkách prilipnutých k poranenej oblasti karotidovej artérie, bola študovaná úloha interakcie RHAM:HA pri chemotaxii neutro filov a makrofágov jednak pri použití peptidu kódujúceho jednu z dvoch domén viazajúcich HA RHAMM (aa^401-411)¹⁴ a jednak anti-peptidu aa^269-288 Ab, u ktorého bolo už skôr ukázané, že interferuje s väzbou HA na RHAMM (citácia 14 a Savani et al.). Chemotaxia humánnych neutrofilov k IL-8 bola značne inhibovaná peptidom aa⁴⁰¹“⁴¹-¹- (obr. 10) a obidva peptidy, t j . (aa^401-411)¹⁴ a anti-peptid aa^269-288 Ab, inhibovali chemotaxiu dvoch humánnych bunečných línií makrofágov SI a WEHI-3 na endotoxínom aktivované myšie sérum (obr. 11).

Ďalej bolo zistené, že interakcia RHAMM:HA reguluje migrácii buniek hladkého svalstva po poškodení poranením.

Už skôr sme ukázali, že anti-RHAMM antisérum inhibuje orientovanú migráciu monovrstiev buniek hladkého sval42 stva do rán (Savani et al.). Za účelom ďalšieho potvrdenia úlohy interakcie RHAMM:HA pri odpovedi na poranenie sme skúmali účinok peptidu kódujúceho jednu z domén viazajúcich HA RHAMM (aa^401-411)¹⁴. Tento peptid podstatne znižoval rýchlost translokácie buniek hladkého svalstva po poranení monovrstiev (obr. 12). Pomiešaný peptid obsahujúci rovnaké aminokyseliny ako peptid aa^401-411, nemal žiadny vplyv na odpoveď na poranenie (obr. 12).

Diskusia

Hyaluronan, čo je zložka extracelulárnej matrice, bol implikovaný pri lokomócii buniek v priebehu embryogenézie²⁰'²¹, invázie nádorov²², transformácie onkogénov¹³ a pri odpovedi na poranenie^23-25. Účinok HA na lokomóciu buniek sa zdá byt sprostredkovaný špecifickými receptormi¹³'²⁶, ako je CD44²⁷ a RHAMM¹⁴. HA bol implikovaný pri migrácii buniek endo telu a buniek hladkého svalstva^28-30 a bola konštatovaná dôležitosí RHAMM pri migrácii embryonických buniek hladkého svalstva³¹ a buniek hladkého svalstva dospelých po poškodení poranením (Savani et al.). Pretože migrácia buniek hladkého svalstva predstavuje kritickú zložku patogenéze restenózy po balónovej angioplastike³, učinili sme hypotézu, že expresia a distribúcia RHAM a HA by mohla hrat tiež úlohu po deendotelizácii in vivo karotidovej artérie potkana pôsobe ním balónového katétru.

Časná akumulácia inflamatorných buniek v obnaženej oblasti poranených artérií už bola opísaná skôr³² a naše výsledky túto skutočnosí potvrdzujú. Akumulácia inflamatorných buniek na miestach poranenia vyžaduje ich chemotaktickú migráciu na toto miesto a nasledujúce prilipnutie³³. Prilipnutie (adhézia) je iniciovaná interakciou so selekciami a vedie k odvaíovaniu buniek pozdĺž cievnej steny s následným silným prilipnutím prostredníctvom špecifických vaskulámych integrínov. Potom nasleduje extravazácia (prehlad je uvedený v citácii 34). Zvýšená expresia RHAMM v inflamatorných bunkách prilipnutých k obnaženému endotelu môže vykonávať nieko Iko funkcií. Zo zistenia, že ako chemotaxia neutrofilov, tak chemotaxia makrofágov, môže byť blokovaná pri použití antiRHAMM antiséra alebo peptidu simulujúceho niektorú z domén viazajúcich HA RHAMM ukazuje, že interakcie RHAM:HA by mohli prispievať k akumulácii inflamatorných buniek na mieste poranení prostredníctvom chemotaxie. Tiež sme ukázali, že interakcie RHAMM:HA regulujú pseudopodánu extenziu vo fibroblastoch, čo je proces potrebný pre extravazáciu. Podobne má RHAMM svoju úlohu pri tomto procesu behom extravazácie makrofágov. V súčasnosti skúmame túto možnosť.

Nedávno sme zistili, že quiescentné monovrstvy buniek hladkého svalstva významne exprimujú 65kDa izoformu RHAMM a že spolu so zvýšenou migráciou, ku ktorej dochádza po poškodení poranením sa tiež vytvára 70 kDa izoforma.

posledne uvedenej forme sa predpokladalo, že predstavuje membránovú formu RHAMM, pretože jej výskyt koinciduje so zvýšenou imunofluorescenciou RHAMM lokalizovaného v membráne pri analýze FACS (Savani et al.,. V tejto práci ukazujeme, že podobne ako bunky hladkého svalstva in vitro i neporanené karotidové artérie exprimujú 65kDa RHAMM a že po poranení sa objavuje 70kDa izoforma. Táto izoforma RHAMM bola exprimovaná len v rozmedzí od 36 do 72 hodín po poranení, čo koinciduje so správami o časovom rámci migrácie buniek hladkého svalstva na miesto poranenia¹'³. Úloha tejto izoformy RHAMM pri lokomócii buniek je v súčasnosti študovaná. Pretože 84kDa proteín ale bol produkovaný bunkami hladkého svalstva in vitro, jeho povaha a typ buniek, ktoré jej exprimujú, nie sú v súčasnosti známe.

Nedávno sme ukázali, že po poškodení poranením sa zvyšuje asociácia HA s monovrstvami buniek hladkého svalstva súčasne s lokalizáciou RHAMM v membráne a expresiou 70kDa izoformy (Savani et al.). K zvýšenému farbeniu na HA pri súčasnej štúdii dochádzalo v období maximálnej migrácie a expresie 70kDa izoformy RHAMM. Tieto výsledky podporujú hypotézu, že interakcie RHAMM:HA regulujú motilitu buniek. Schopnosť reakčných činidiel, ako je anti-RHAMM antisérum a RHAM peptid, blokovať funkciu RHAMM in vitro, je v súlade s týmto predpokladom.

Už skôr bol rad rastových faktorov, najmä PDGF-BB³⁵ a TGF-βΙ³⁶, implikovaný s migráciou buniek hladkého svalstva a s patogenézou restenózy⁶'⁷. PDGF-BB pochádzajúci ako z adherentných doštičiek, tak z buniek hladkého svalstva samotných, má väčší vplyv na migráciu, ako na proliferáciu buniek hladkého svalstva⁶·. TGF-β1 je produkovaný bunkami hladkého svalstva v poranenom mieste a prispieva k proliferácii buniek hladkého svalstva a abnormálnemu ukladaniu extra celulárnej matrice v neskorších štádiách procesu restenózy⁷. Rastové faktory boli tiež implikované pri regulácii lokomócie inflamatorných buniek. Tak, TGF-β1 reguluje chemotaxiu monocytov³⁷. Zvýšenie lokomócie fibroblastov stimulované TGF-βΙ je sprostredkované interakciou RHAMM:HA a TGF-βΙ reguluje ako expresiu RHAMM, tak syntézu HA vo fíbroblastoch °. Regulácia expresie RHAMM a HA v bunkách hladkého svalstva prostredníctvom TGF-βΙ a PDGF-BB je v súčasnosti skúmaná.

V tejto štúdii sme teda ukázali, že po vaskulárnom poranení in vivo dochádza k hlbokým zmenám expresie RHAMM a HA a že pre chemotaxiu inflamatorných buniek a pre migrácii buniek hladkého svalstva in vitro je nutná interakcia RHAMM:HA. Tieto údaje ospravedlňujú predpoklad, že činidlá blokujúce interakcie RHAMM:HA in vivo by bolo možné použiť pre znižovanie alebo prevenciu vývoja restenózy po poranení balónovým katétrom. Také štúdie sú v súčasnosti uskutočňované v našom laboratóriu.

Poďakovanie

Tento výskum bol financovaný Kanadskou radou pre lekársky výskum (Medical Research Council of Canada (MRC), číslo grantu 10 948 (EAT) a Manitobskou nadáciou lekárskych služieb (Manitoba Medical Services Foundation (RCS)). EAT je príjemcom štipendia Chilren's Hospital of Winnipeg Research Foundation Scholarschip. Vysoko oceňovaná je odborná pomoc panej Elaine Garagonovej a panej Laurie Langeovej.

Citácie

1. Fems, GAA Stewart-Lee, AL a Änggárd, EE: Arterial response to mechanical injury: balloon catheter de-endothelialization. Atherosderosis 1992, 92:89-104

2. Ross, R: The pathogenesis of atherosderosis: a perspective for the 1990'š. Náture 1993,362:801-809

3. Casscells, W: Migration of smooth muscle and endothelial cells: Critical events in restenosis. Circulation 1992, 86(3):723-729

4. Tanaka, Y, Adams, DH a Shaw, S: Proteoglycans on endothelial cells present adhesion-inducing cytokines to leukocytes. Immunol Today 1993, 14(3):111-115

5. Lôvqvist, A. Emanuelsson, H, Nilsson, J, Lundqvist, H a. Carlsson, J: Pathophysiological mechanisms for restenosis following coronary angioplaisty: possible preventative' altematives. J Int Med 1993, 233:215-226

6. Jawien, A, Bowen-Pope, DF, Lindner, V, Schwartz, SM a Clowes, AW: Platelet-derived Growth Factor promotes smooth muscle celí. migration and intimal thickening in a rat model of balloon angioplasty. J Clin Invest 1992,89:507-511

7. Majesky, MW, Linder, V, Twardzik, DR, Schwartz, SM a Reidy, MA: Productíon of Transforming Growth Factor βχ during repair of arterial injury. J Clin Invest 1991, 88:904-910

8. Rakugi, H, Jacob, HJ, Krieger, JE; Ingelfinger, JR a Pratt, RE: Vascular injury induces aniotensinogen gene expression in the média and neointima. Circulation 1993, 87:283-290

9. Clowes, AW, Clowes, MM, Au, YPT, Reidy, MA a Belin, D: Smooth muscle cells express urokinase during mitogenesis and tisšue- 47 • ^f· iľ ’í ŕ i i ’· » i :

type plasminogen activator during migration in injured rat carotid artery. Circ Res 1990,67:61-67

1θ· Miano, JM, Vlásie, N, Tota, RR a Stemerman, MB:

Smooth muscle celí immediate-early gene and growth factor activation follows vascular injury: A putative in vivo mechanism for äutocrine growth. Arterioscler Thromb 1993, 13:211-219

11· Clowes, AW a Schwartz, SM: Significance of quiescent smooth muscle celí migration in the injured rat carotid artery. Circ Res 1985,56:139-?

12. Clowes, AW, Reidy, MA a Clowes, MM: Mechanisms of stenosis after arterial injury. Lab Invest 1983,49(2):208-215

13. Turley, EA, Austen, L, Vandeligt, K a Čiary, C: Hyaluronan and a cell-associated hyaluronan binding protein regulate the locomotion of ras-transformed cells. J Celí Biol 1991,112(5): 1041-1047

14. Hardwick, C, Hoare, K, Owens, R, Hohn, HP, Hook, M, Moore, D, Cripps, V, Austen, L, Nance, DM a Turley, EA: Molecular cloning of a novel Hyaluronan receptor that mediates tumor celí motility.

J Celí Biol 1992,117(6): 1343-1350

15. ’ Yang, B, Zhang, L a Turley, EA: Identification of two hyaluronan-binding domains in the hyaluronan receptor RHAMM. J Biol Chem 1993,268:8617-8623

16. Ripellino, JA, Killinger, MM, Margolis, RU a Margolis, RK: The hyaluronic acid binding región as a specific próbe for the localization of hyaluronic acid in tissue sections. J Hisotchem Cytochem 1985,33:1066-1086

17. Majack, RA a Clowes, AW: Inhibition of vascular smooth muscle celí migration by heparin-like glycosaminoglycans. J Celí Physiol 1984,118:253-256

- 48 - ‘ !

18. Stevenson, MM, Kongshovn, AL a Skamen, E: Genetic linkage of resistance to Listeria monocytogenes with macrophage inflammatory responses. J Immunol 1981, 127:402

19. Shi, Y, Komovski, BS, Savani, RC a Turley, EA: A rapid, multiwell colonnetric assay for chemotaxis. J Immunol Methods 1993, v tiskú

20. Laurent, TC a Fraser, JRE: Hyaluronan FASEB J 1992, 6:2397-2404

21. Toole, BP: Developmental role of hyaluronate, Conn Tiss Res 1982,10:93-100

22. Turley, EA: Hyaluronan and celí locomotíon. Cancer Met Rev 1992,11:21-30

23. Waldenstrôm, A, Martinussen, HJ, Gerdin, Ba Hä llgren, R: Accumulation of hyaluronan and tissue edema in experimental myocardial infarction. J Clin Invest 1991, 88:1622-1628

24. Weigel, PH, Fuller, GM a LeBoeuf, RD: A model for the role of hyaluronic acid and fibrinogen in the early evenls of inflammatory response and wound healing. J Theoret Biol 1986,119:219-234

25. Bray, BA, Sampson, PM, Osman, M, Giandomenico, A a Turino, GM: Early changes in lung tissue hyaluronan (hyaluronic acid) and hyaluronidase in bleomycin-induced alveolitis in hamsters. Am Rev Resp Dis 1991,143:284-288

26. Toole, BP: Hyaluronan and its binding proteins, the hyaladherins. Curr Opn Celí Biol 1990, 2:839-844

27. Haynes, BF, Liao, H-X a Patton, KL: The transmembrane hyaluronate receptor (CD44): multiple ŕunctions, multiple forms. Cancer Cells 1991,3(9):347-350

28. Ausprunk, DH, Boudreau, CL a Nelson, DA: Proteoglycans in the microvasculature II: Histochemical localization in proliŕerating capillaries of the rabbit comea. Am J Pathol 1981,103:367-375

29. West, DC a Kumar, S: The effect of hyaluronate and its oligosaccharides on endothelial celí proliferation and monolayer integrity. Exp Celí Res 1989,183:179-196

30. Boudreau, N a Rabinovitch, M: Developmentally regulated changes in extracellular matrix in endothelial and smooth Muscle Cells in the ductus arteriosus may be related to intimal proliferation. Lab Invest 1991, 64(2):187-199

31. Boudreau, N, Turley, EA a Rabinovitch, M: Fibronectin, Hyaluronan, and a Hyaluronan Binding Proteín contribute to increased ductus arteriosus smooth muscle celí migration. Develop Biol 1991, 143:235-247

32. Kockx, MM, De Meyer, GRY, Jacob, WA, Bult, H a Herman, AG: Triphasic sequence of neointimal formation in the cuffed carotid artery of the rabbit. Arteriosd Thromb 1992,12:1447-1457

33. Lásky, LA: Selections: Interpreters of cell-specific carbohydrate Information during inflammation. Science 1992, 258:964-969

34. Dustin, ML a Springer, TA: Annu Rev Immunol 1991, 9:27-66

35. Welsh, CJ, Schmeichel, K a McBride, K: Platelet-Derived Growth Factor activates Phospholipase D and chemotactic responses in vascular smooth muscle cells. In Vitro Celí Dev Biol 1991, 27A:425-431

36. Merwin, JR, Roberts, A, Kondaiah, P, Tucker, A a Madri, JA:. Vascular celí responses to TGF-fij mimic those TGF-Ej in vitro. Growth Factors 1991,5(149-158)

37. Wahl, SM, Hunt, DA, Wakefíeld, LM, McCartney-Francis, N, Wahl, LM, Roberts, AB a Spom, MB: Transforming growth factor type beta induces monocyte chemotaxis and growth factor production. Proc Natl Acad Sci, USA 1987,84 (Augustl987):5788-5792

38. Samuel, SK, Hurta, RAR, Spearman, MA, Wright, JA, Turley,. EA a Greenberg, AH: TGF-δι stimulation of celí locomotion is mediated by the hyaluronan receptor RHAMM and hyaluronan. J Celí Biol 1993, v tiskú.

Claims (9)

1. Použitie účinného netóxického množstva formy kyseliny hyalurónovej zvolenej zo súboru zahŕňajúceho kyselinu hyaluronovú. jej farmaceutický vhodné soli, fragmenty a potí jednotky _ kyseliny ' hyalurónovej pri výrobe farmaceutického prostriedky pre prevenciu zužovania tubulárnych stien u živočíchov po tom, ako boli tieto tubulárne steny traumatizované, pri ktorom sa účinné netoxické množstvo formy kyseliny hyalurónovej zavedie do

I tohto farmaceutického prostriedku.

2- Použitie podľa nárejku 1, pri ktorom je formou kyseliny hyalurónovej kyselirja hyaluronová a/alebo jej soľ s molekulovou hmotnosťou nižsóu ako 750 000 Da.

3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, pri ktorom sa vyrába

I farmaceutický prostriedok vhodný na intravenózne podávanie.

4. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, pri ktorom podané množstvo formy kyseliny hyalurónovej sa nachádza v rozmedzí od 10 ' do 3 000 mg/70 kg hmotnosti človeka. i

I • i

5. Použitie podľa nároku 4, pri ktorom podané množstvo formy kyseliny hyalurónovej je vyššie ako 200 mg/70 kg hmotnosti človeka.

I

G- Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov.

I pri ktorom sa vyrába farmaceutický prostriedok vhodný na

I prevenciu arteriálnej res teriéry P° balónkovej angioi.’lastike u človeka.

I

7. Použitie

1?

kyseli ny kyse J inu fragmenty terapeuticky hyaluronovel hya1uronovú. a pod jednotky účinného netoxického množstva formy zvolenej zo súboru zahŕňajúceho jej j farmaceutický vhodné soli. kyseliny hyaluronovel a i

2? činidla zvolenho so sjúborn zahŕňajúceho nesteroidné protizápalové liečivá, liečivá inhibujúce stcnózu, vitamín C, ant ioxidanty, látky pohlcujúce voľné radikály a ich kombinácie :

pri výrube farmaceutického prostriedku na prevenciu zužovania tubulárnych stien živočícha po tom, steny traumatizované, pri ktorom množstvo kyseliny hyalurohovej s terapeuticky účinným množstýoia činidla 2>, pričom zložka

I

1.) sa podáva v účinnom množstve na prevenciu zužovania tubulárnych stien živočícha a žložka 2) zvyšuje účinok zložky bJjlárnycl

1) pri prevencii zužovania tubi čo holi títo tubulárne ;a terapeuticky účinné podá človeku spolu nych stien8. Použitie podľa nároku í 7, kde zložkou 1) je kyselina

I hyalurouová a/alebo jej soľ si molekulovou hmotnosťou nižšou ako 750 000 Da. ¹

y. Použitie podľa nároku 7 alebo 8. pri ktorom sa vyrába farmaceutický prostriedok vhodrý pre intravenózne podávanie.

10- Použitie podľa niektorého z nárokov 7 až 9, pri ktorom sa zložka 1) používa 'v dávke od j.0/70 kg hmotnosti človeka do 3 000 mg/70 kg hmotnosti človekaj

11. Použitie podľa nárokJ 10, pri ktorom sa zložka 1>

používa v dávke vyššej ako 200 |mg/70 kg hmotnosti človeka.

I i

i ⁵3

12. Použitie podľa niektorého z nárokov 7 až 11, pri ktorom sa vyrába farmaceutický prostriedok vhodný na prevenciu arteriálnej restenpzy po balónkovcj ougioplastike u č 1oveka13. Farmaceutický prostriedok, vyznačujú c i sa t ý m , ž e spolu s Riedidlami, ad juvanc iam i a inými farmaceutickými nosičmi. ktoRé sa používajú podľa potreby, obsahuje

1) formu kyseliny hyaluránovej zvoleneú zo súboru, ktorý zahŕňa kyselinu hyaluronovú, jej farnaceufcicky vhodné soli, fragmenty a podjednotky kyseliny hyalurónovej a

2? liečivo inhibujúce sténózu.

na prevenciu zužovania tubuláRnych stien živočícha po Loiii, čo

I boli tieto tubulárne steny b^ra,jmäkizovanč, pričom do tohto prostriedku sa zavádza dejinné netoxické množstvo formy kyseliny hyalurónovej spolu b terapeuticky účinným množstvom činidla 2) za účelom prevencie zužovania tubulárnych stien, pričom v tomto prostriedku jfe zložka 1.) prítomná v účinnom množstve na . prevenciu zužovania tubulárnych stien živočícha t

a zložka 2) zvyšuje účinok zložky 11 .pri prevencii zužovania tubulárnych stien.

14. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 13. vyznačujúci sa tým.že zložka 2) ďalej obsahuje činidlo zvolené zo £úboru. ktorý zahŕňa nesteroidní protizápalové liečivá, vitamíh C. látky, ktoré pohlcujú voľné radikály, antioxidanty a ich kombinácie.

15. ľíirnaccutický prostriedok podľa vyznačujúci sa tým.

nároku 13 alebo 14. ž e zložkou 1) je . ŕ · ”! kyselina hyaluronová a/alebo: jej farnaceuticky vhodná soľ s

I molekulovou hmotnosťou nižšou ako 750 000 Da.

36. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 13 až 15, v y z n a C u j j ú c í so t ý π , ž c má podobu vhodnú na injekčné ¹ alebo intravenózne podávanie, i

pričom zložka 1) je hyaluronáf. sodný.

17. Farmaceutický prostr 13 až 16, vyznačuj edok podľa niektorého z nárokov tým , že sa zložka 3) používa v dávke v rizmedzí od 10 do 3 000 mtf/70 kú

I hmotnosti človeka.

13- Farmaceutický v y z n a f; u j ú c í prostriedok · podľa tým. že nároku 17, sa zložka 1) používa v dávke vyššej ako 20Ó m<j/70 k<3 hmotnosti človeka.

1.9- Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 13 až 19. v y z n a č u jiú c i sa t ý m , ž e je určený na prevenciu arteri^lnej j.estenózy po balónkovej i

angioplastike u človeka.

I

I

20. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý n , ž e obsahuje väcsí počet dávkových množstiev podľa niektorého z nárokov 13-až 19.

Ol-2O06-93-Ce