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CN105759029A - 麻疹病毒检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

麻疹病毒检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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CN105759029A CN201610100829.8A CN201610100829A CN105759029A CN 105759029 A CN105759029 A CN 105759029A CN 201610100829 A CN201610100829 A CN 201610100829A CN 105759029 A CN105759029 A CN 105759029A
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measles virus
phosphate buffer
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streptavidin
pharyngeal
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李立和
杨朕
王彦平
李铮
魏志斌
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Tianjin Baodi Hospital
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Tianjin Baodi Hospital
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Abstract

本发明公开了一种麻疹病毒免疫荧光法检测试剂盒及其检测方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：试剂盒包含有粘液溶解剂，细胞膜穿透剂，生物素化抗麻疹病毒抗体IgM，链霉亲和素偶联异硫氰酸荧光素，封片剂及生物玻片组成，通过N?乙酰?L?半胱氨酸使咽部上皮细胞表面粘液溶解，用非离子表面活性剂使咽部上皮细胞膜穿透，生物化抗体，链霉亲和素偶联异硫氰酸荧光素和甘油进入细胞内，应用链霉亲和素?生物素偶联异硫氰酸荧光素法检测麻疹病毒，能明显提高敏感性和降低背景，适用于麻疹病毒早期感染检测。

Description

麻疹病毒检测试剂盒及使用方法
技术领域
一种麻疹病毒免疫荧光法检测试剂盒及其使用方法，属于医学检验技术领域。
背景技术
麻疹病毒(measlesvirus)是儿童常见的一种急性传染病，其传染性很强，以皮丘疹、发热及呼吸道症状为特征，我国自60年代初应用减毒活疫苗以来，儿童的发病率显著下降，麻疹是儿童最常见的急性呼吸道传染病之一，其传染性很强，临床上以发热、上呼吸道炎症、眼结膜炎等而以皮肤出现红色斑丘疹和颊粘膜上有麻疹粘膜斑及疹退后遗留色素沉着伴糠麸样脱屑为特征。我国自1965年，开始普种麻疹减毒活疫苗后已控制了大流行，麻疹病毒为球形或丝形，直径约120nm～250nm，核心为单负链RNA，不分节段，基因组全长约16kb，基因组有N、P、M、F、H、L6个基因，分别编码6个结构和功能蛋白：核蛋白(nucleoprotein，NP)、磷酸化蛋白(phosphoprotein，P)、M蛋白(membraneprotein，M)、融合蛋白(fusionprotein，F)、血凝素蛋白(hemagglutinin，H)和依赖RNA的RNA聚合酶(largepolymerase，L)，核衣壳呈螺旋对称，外有包膜，表面有两种刺突，即HA和溶血素(haemolyxin，HL)，它们的成分都是糖蛋白，但性质各异，HA只能凝集猴红细胞，还能与宿主细胞受体吸附，HL具有溶血和使细胞发生融合形成多核巨细胞的作用，HA和HL均有抗原性，产生的相应抗体具有保护作用。临床实验室检测方法有，取患者发病早期的血液、咽洗液或咽拭子经抗生素处理后，接种于人胚肾、猴肾或人羊膜细胞中培养，用间接荧光抗体法或ELISA检测IgM抗体，用荧光标记抗体检查患者卡他期咽漱液中的粘膜细胞有无麻疹病毒抗原，用核酸分子杂交技术也可检测细胞内的病毒核酸。
发明内容
本发明为了解决麻疹病毒早期诊断、简便、快速，结果易于判读而提供一种麻疹病毒免疫荧光检测试剂盒。免疫荧光法简便，快速，灵敏度高，但目前的检测方法阳性率低，结果不易判读，标本处理不当，易出现假阳性及假阴性，需要进行较大改进，患者咽部上皮细胞表面粘附有大量的粘液，不易洗涤，很难分离，N-乙酰-L-半胱氨酸药物为粘液溶解剂，临床上常用于呼吸科病人降低痰液的粘稠度而易于排出，本品的巯基(-SH)结构可使粘蛋白的双硫(-S-S-)结构断裂，降低痰粘度，在本发明中，经N-乙酰-L-半胱氨酸作用使咽部上皮细胞从粘液中分离开，上皮细胞膜穿透剂为非离子表面活性剂，组成为聚氧乙烯表面活性剂0.18％，有机季铵盐0.08％，在本发明中，它可穿透细胞膜使生物化抗体、链霉亲和素偶联异硫氰酸荧光素和封片剂中甘油介质进入细胞内，进行免疫荧光法测定，封片剂甘油不仅能使细胞湿润，保持长久荧光，而且进入细胞能使细胞内结构清亮，增加对比度，更能增加荧光与背景的对比度，将生物素-链霉亲和素系统引入荧光检测系统，能明显提高敏感性及特异性，本发明能显著提高检测方法的灵敏度及特异性。
本发明是按以下技术方案实现的：
一种麻疹病毒免疫荧光法检测试剂盒，它包括盒体与盒盖，而在盒体一侧长边内形成有插孔的试剂架上，分别容纳粘液溶解剂，细胞膜穿透剂，生物素化抗麻疹病毒抗体IgM，链霉亲和素偶联异硫氰酸荧光素，封片剂，盒体内的纵向分隔板一侧形成收容磷酸盐(PBS)缓冲液瓶的空间，而分隔板另一侧形成存储生物玻片的空间，所述生物玻片上按一定间距形成有反应凹槽。
这样设计的本发明具有的优点是：所用检测时使用的试剂，生物玻片等均集中在一起，便于检测，操作简单，节省人力和时间，检测时间约为2.5小时，提供了工作效率。
附图说明
图1本发明试剂盒立体结构示意图。
图2本发明中生物玻片结构示意图。
图3是应用本发明测定方法阳性荧光图。
图4是应用原有测定方法阳性荧光图。
图中：1.盒体2.盒盖
3.插孔4.试剂架
5.粘液溶解剂试剂瓶6.细胞膜穿透试剂瓶
7.生物素化抗麻疹病毒抗体试剂瓶
8.链霉亲和素偶联异硫氰酸荧光素试剂瓶
9.封片剂瓶10.磷酸盐缓冲液试剂瓶
11.生物玻片11a.11b.11C生物反应区
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明
一种麻疹病毒免疫荧光检测试剂盒，包括盒体1与盒盖2，而在盒体1一侧长边内形成有插孔3的试剂架4上，分别容纳A试剂瓶—粘液溶解剂(5)，B试剂瓶—细胞膜穿透剂(6)，C试剂瓶—生物素化抗麻疹病毒抗体IgM(7)，D试剂瓶—链霉亲和素偶联异硫氰酸荧光素试剂瓶(8)，E试剂瓶—封片剂(9)，F试剂瓶—磷酸盐缓冲液(10)，生物玻片(11)组成，如图1。
所述的生物玻片，其按一定间距形成的凹槽，分别是3个方形凹槽11a、11b、11c，方形凹槽的规格是3×3×1mm，并对应标示有a、b、c的文字标记，如图2。
所述的麻疹病毒检测试剂盒，其盒体1、盒盖2的材料为纸质或硬质塑料。
为了减振保护瓶体，盒体1底部内衬瓦楞纸或泡沫塑料(未图示)。
按照上述结构设计的试剂盒，试剂瓶5内分别预装100ml粘液溶解剂试剂瓶，试剂瓶6内预装100ml细胞膜穿透剂，试剂瓶7内预装2ml生物素化抗麻疹病毒抗体IgM，试剂瓶8内预装2ml链霉亲和素偶联异硫氰酸荧光素试剂，试剂瓶9内预装10ml封片剂，试剂瓶10内预装100ml0.01mmol/L磷酸盐缓冲液试剂瓶。
应用本发明进行麻疹病毒免疫荧光检测步骤如下：
实施例1
1.试剂配制方法
1.10.01mol/LPBS(pH7.4)的配置NaCL8.5克，Na2HPO4.12H2O30.8克，NaH2PO4.2H2O2.8克双蒸水定容至1000ml。
1.210mg/LN-乙酰-L-半胱氨酸磷酸盐缓冲液30mgN-乙酰-L-半胱氨酸溶解到1L0.01mol/LPBS即可。
1.3穿透剂的配置聚氧乙烯表面活性剂0.18％，有机季铵盐0.08％。
1.4生物素化抗体及荧光素的配置生物素化抗麻疹抗体IgM(市售)用0.01mol/LPBS按1:100稀释成工作液；异硫氰酸荧光素的链霉亲和素(市售)用0.01mol/LPBS按1:100稀释成工作液。
1.5封片剂的配置0.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH8.5)，lOml；无荧光甘油(AR级)90ml,混合后在搅拌器上充分混匀。
2.检测方法
2.1本发明测定方法
用咽拭子擦拭患者咽部，加入到2ml含有10mg/LN-乙酰-L-半胱氨酸磷酸盐缓冲液中剧烈震荡，静至30min，高速离心10000g，10min，用PBS调整细胞数至100个/μl，点片到含有多聚赖氨酸载玻片上，56℃烘干杀死病毒并固定，密封，-70℃低温保存制成生物玻片。实验时，将生物玻片放置室温后，滴加细胞膜穿透剂50μl静置1min，0.01mol/LPBS洗3次，滴加0.01mol/LPBS1:100稀释的50μl生物素化抗麻疹病毒抗体IgM，37℃30min，0.01mol/LPBS洗2min3次；滴加0.01mol/LPBS1:100稀释的异硫氰酸荧光素的链霉亲和素，37℃60min，0.01mol/LPBS洗2min4次；封片剂封片，荧光显微镜10ⅹ40倍视野下观察；异硫氰酸荧光素在490～495nm激发，在520～530nm发射荧光，呈黄绿色，即可判断患者感染麻疹病毒。
2.2原有测定方法
用咽拭子擦拭患儿咽部，加入到2ml磷酸盐缓冲液中剧烈震荡，静至60min，高速离心10000g，10min，用PBS调整细胞数至100个/μl，点片到含有多聚赖氨酸载玻片上，56℃烘干杀死病毒并固定，密封，-70℃低温保存制成生物玻片。实验时，将生物玻片放置室温后，滴加0.01mol/LPBS1:100稀释的50μl生物素化抗麻疹病毒抗体IgM，37℃30min，0.01mol/LPBS洗2min3次；滴加0.01mol/LPBS1:100稀释的SABC-FITC，37℃60min，0.01mol/LPBS洗2min4次；封片剂封片，荧光显微镜10ⅹ40倍视野下观察；异硫氰酸荧光素在490～495nm激发，在520～530nm发射荧光，呈黄绿色，即可判断患者感染麻疹病毒。
3.结果分析
图3是本发明麻疹病毒免疫荧光法阳性标本检测图，图4是原有麻疹病毒免疫荧光法阳性标本检测图，在结果判断上，两种方法存在较大差异，本发明容易判读，荧光强度大；而原有方法荧光微弱不易判读，易造成假阳性和假阴性，因此，本发明方法虽经过简单处理，但在方法学上达到了更好的效果。

Claims (4)

1.一种麻疹病毒免疫荧光法检测试剂盒，其特征在于用咽拭子擦拭患者咽部，通过粘液溶解剂使咽部上皮细胞表面粘液溶解，用细胞膜穿透剂使咽部上皮细胞膜穿透，使生物化抗体、链霉亲和素偶联异硫氰酸荧光素和甘油进入细胞内，应用链霉亲和素-生物素偶联异硫氰酸荧光素法检测麻疹病毒。
2.根据权利要求1所述的麻疹病毒免疫荧光法检测试剂盒，其特征在于所述粘液溶解剂为含10mg/LN-乙酰-L-半胱氨酸磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的麻疹病毒免疫荧光法检测试剂盒，其特征在于所述细胞膜穿透剂为非离子表面活性剂，组成为聚氧乙烯表面活性剂0.18％，有机季铵盐0.08％。
4.根据权利要求1所述的麻疹病毒免疫荧光法检测试剂盒，其特征在于检测方法为：用咽拭子擦拭患者咽部，加入到2ml含有10mg/LN-乙酰-L-半胱氨酸磷酸盐缓冲液中剧烈震荡，静至30min，高速离心10000g，10min，用磷酸盐缓冲液调整细胞数至100个/μl，点片到含有多聚赖氨酸载玻片上，56℃烘干杀死病毒并固定，密封，-70℃低温保存制成生物玻片。实验时，将生物玻片放置室温后，滴加细胞膜穿透剂50μl静置1min，0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗3次，滴加0.01mol/L磷酸盐缓冲液1:100稀释的50μl生物素化抗麻疹病毒抗体IgM，37℃30min，0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗2min3次；滴加0.01mol/L磷酸盐缓冲液1:100稀释的链霉亲和素-生物素偶联异硫氰酸荧光素，37℃60min，0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗2min4次；封片剂封片，荧光显微镜10ⅹ40倍视野下观察；异硫氰酸荧光素在490～495nm激发，在520～530nm发射荧光，呈黄绿色，即可判断患者感染麻疹病毒。
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