CN105749266A

CN105749266A - 一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗及其制备方法

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Publication number: CN105749266A
Application number: CN201610266210.4A
Authority: CN
Inventors: 宋晓飞; 张小军; 王蕾; 陈辉; 田真; 王景伟; 史须斌; 马珊珊
Original assignee: Qilu Animal Health Products Co ltd
Current assignee: Qilu Animal Health Products Co ltd
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2036-04-26
Also published as: CN105749266B

Abstract

本发明涉及一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗及其制备方法。本发明采用的疫苗制造及检验用菌株铜绿假单胞菌WD005株、DL007株、ZC118株是从临床分离获得的，这些菌株针对当前水貂出血性肺炎流行血清型，针对性更强，保护更全面；经过毒力试验、免疫原性试验，免疫免疫原性良好；肉毒梭菌C型C62?4株具有免疫原性优良的特点。本发明的二联灭活疫苗可以同时预防G型、B型、C型铜绿假单胞菌和C型肉毒梭菌对水貂的攻击，具有减少接种次数、使用方便等优点。减轻了免疫接种的劳动强度，降低了免疫成本，减少了动物应激反应，更加经济可靠。

Description

一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗及其制备方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

水貂出血性肺炎是由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的水貂的一种急性传染病。该病主要发生在每年8～10月份，以水貂出血性肺炎、败血症为主要特征，发病急，死亡快，常呈地方性暴发流行，发病貂场死亡率在10％～50％。1953年Knox等在丹麦首次报道了水貂出血性肺炎，之后在欧洲的其他国家、北美洲、南美洲、亚洲也见有该病的发生。在我国，潘镰生首次报道了该病，此后陆续有报道(潘镰生.水貂假单胞菌脂多糖菌苗研制初报.经济动物学报,1984,(1):1-3)。2001后该病在我国各省频繁暴发，山东、吉林、黑龙江、河北、内蒙古等省水貂养殖场相继暴发了水貂出血性肺炎，给我国水貂养殖业造成了较大的损失。本病世界各地均有发生，是危害水貂养殖业的重要传染病之一。

在对水貂铜绿假单胞菌血清型的研究中，丹麦Hammer A S等于1998～2001年分离的72株铜绿假单胞菌中G型占75％，B型占8％，C型占17％(Hammer A S，Pedersen K，Andersen TH.Comparison of Pseudomonas aeruginosa isolates from mink by serotyping and pulsed-fieldgelelectrophoresis.Veterinary Microbiology，2003，94:237-243.)；国内白雪等于2002～2010年间从山东、辽宁、黑龙江等5个省水貂养殖场中分离获得45株铜绿假单胞菌，通过日本的血清分型系统首次确定我国水貂出血性肺炎的主要流行血清型为G型，占93.3％，次要流行血清型为B型，占4.4％(白雪,柴秀丽,闫喜军,高晗,张海玲,赵建军,张蕾,邵西群,罗国良,王长凤.水貂绿脓杆菌分离株的生物学特性和血清型分析.畜牧与兽医,2011,07:31-35.)，与欧洲和美国报道的主要流行血清型相同。

水貂肉毒梭菌中毒症是由肉毒梭菌污染肉类饲料产生的外毒素而引起的，是一种动物中枢神经系统病变为主的急性中毒病。主要表现为运动神经不全或全麻痹，失去运动性和迅速死亡。本病一旦暴发，对貂群会造成毁灭性打击，水貂常来不及治疗就大面积突然死亡(王乐乐,李昆朋,邹本革,刘焕奇,张启迪,毕可东.水貂肉毒梭菌毒素中毒的诊治.中国畜牧兽医文摘,2011,04:166-167。)。

免疫接种是水貂出血性肺炎和肉毒梭菌中毒症防制的重要措施。目前市场上仅有水貂出血性肺炎二价灭活疫苗和肉毒梭菌中毒症(C型)灭活疫苗单苗，为有效预防水貂出血性肺炎和肉毒梭菌中毒症的发生，需要单独免疫上述两种灭活疫苗。单独免疫猪水貂出血性肺炎二价灭活疫苗和肉毒梭菌中毒症(C型)灭活疫苗存在繁琐、费时、费力、增加成本等问题，且容易造成漏种，直接影响免疫效果。

目前预防水貂出血性肺炎和肉毒梭菌中毒症，至少需要免疫两次，为了达到免疫一次预防这两种疫病的目的，我公司通过科技攻关开发联合疫苗，降低了免疫成本、减少了动物应激反应、减轻了饲养者的劳动强度，更加经济可靠。疫苗制备工艺关键点：通过去除铜绿假单胞菌培养液中的内毒素，解决疫苗安全性问题；通过去除肉毒梭菌培养液中的菌体，提高疫苗安全性；通过浓缩毒素，使得肉毒梭菌毒素含量达到配制联合疫苗所需的浓度。

发明内容

本发明的目的在于提供水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗，含有灭活的铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株和灭活的肉毒梭菌C型C62-4株毒素；该二联灭活疫苗免疫后保护性抗体产生快，免疫攻毒保护率高，对G型、B型、C型铜绿假单胞菌和C型肉毒梭菌毒素的攻毒保护率均达到80％以上。

本发明的技术方案

1.一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗主要成分为灭活的G型铜绿假单胞菌、B型铜绿假单胞菌、C型铜绿假单胞菌的灭活细菌和C型肉毒梭菌的毒素，用于预防由G型、B型、C型铜绿假单胞菌引起的水貂出血性肺炎和C型肉毒梭菌引起的水貂肉毒梭菌中毒症。

2.如权利要求1所述一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗，其特征在于所述该疫苗主要成分为G型铜绿假单胞菌WD005、B型铜绿假单胞菌DL007株、C型铜绿假单胞菌ZC118株的灭活细菌和C型肉毒梭菌C62-4株的毒素。

3.如权利要求2所述一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗，其特征在于疫苗中的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)G型WD005株、B型DL007株和C菌型ZC118株已于2016年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为：CGMCC No.12305、CGMCC No.12303和CGMCC No.12304。

4.如权利要求1～3中任意一项所述一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于该疫苗系用所述G型铜绿假单胞菌WD005株、B型铜绿假单胞菌DL007株、C型铜绿假单胞菌ZC118株和所述C型肉毒梭菌C62-4株分别接种适宜的培养基培养，铜绿假单胞菌培养菌液分别经甲醛溶液灭活后，浓缩；肉毒梭菌培养菌液经甲醛溶液灭活、脱毒、过滤去除菌体、浓缩；将铜绿假单胞菌浓缩菌液和肉毒梭菌浓缩毒素按一定比例混合均匀，加入氢氧化铝胶制成。

本发明具体实施方式

1细菌疫苗株的选育

本发明人从疑似水貂出血性肺炎的发病水貂肺脏、肝脏和脾脏中成功分离出151株铜绿假单胞菌。用玻片凝集法对分离菌株进行血清型鉴定，结果表明151株分离菌株分属3个血清型，其中G型124株，占总分离数的82.1％，B型23株，占总分离数的15.2％，C型4株，占总分离数的2.7％，与国内、外报道的流行血清型基本一致。对临床分离的铜绿假单胞菌进行毒力试验，筛选出对小鼠毒力最强的G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株，并进行免疫原性研究，结果证明铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株菌株均有良好的免疫原性，可以作为疫苗株。该3株铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株已于2016年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为：CGMCC No.12305、CGMCC No.12303和CGMCC No.12304；肉毒梭菌C型C62-4株，肉毒梭菌(Clostrdium botulinum)C62-4(CVCC 60353)(中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏中心编中国兽医菌种目录，第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p40)购自中国兽医微生物菌种保藏中心。对菌株进行免疫原性研究，证明菌株具有良好的免疫原性，可以作为疫苗株。

(1)铜绿假单胞菌G型WD005株选育

将铜绿假单胞菌G型WD005株第0代菌种接种改良马丁肉汤培养基，37℃培养12小时，进行活菌计数，甲醛溶液灭活完全后，将菌液用无菌生理盐水调整菌液浓度为1.25×10⁹CFU/ml、2.5×10⁹CFU/ml、5.0×10⁹CFU/ml，分别与无菌氢氧化铝胶按照9:1比例混合均匀，再加入1％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌，制备3批疫苗。

取2月龄健康易感水貂20只，随机分为4组，每组5只。第1组～第3组分别皮下注射3批疫苗，1.0ml/只；第4组不免疫作为对照。免疫后21日，免疫组和对照组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌G型WD005株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU)。结果配苗前≥2.5×10⁹CFU/ml的疫苗免疫水貂，免疫后21日攻毒保护率为100％(5/5)，对照水貂100％(5/5)死亡，表明铜绿假单胞菌G型WD005株具有良好的免疫原性，可作为疫苗研制的候选菌株。

(2)铜绿假单胞菌B型DL007株选育

将铜绿假单胞菌B型DL007株第0代菌种接种改良马丁肉汤培养基，37℃培养12小时，进行活菌计数，甲醛溶液灭活完全后，将菌液用无菌生理盐水调整菌液浓度为1.25×10⁹CFU/ml、2.5×10⁹CFU/ml、5.0×10⁹CFU/ml，分别与无菌氢氧化铝胶按照9:1比例混合均匀，再加入1％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌，制备3批疫苗。

取2月龄健康易感水貂20只，随机分为4组，每组5只。第1组～第3组分别皮下注射3批疫苗，1.0ml/只；第4组不免疫作为对照。免疫后21日，免疫组和对照组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌B型DL007株菌液1.0ml(含活菌数约为1.3×10⁹CFU)。结果配苗前抗原含量≥2.5×10⁹CFU/ml的疫苗免疫水貂，免疫后21日攻毒保护率为80％(4/5)以上，对照水貂100％(5/5)死亡，表明铜绿假单胞菌B型DL007株具有良好的免疫原性，可作为疫苗研制的候选菌株。

(3)铜绿假单胞菌C型ZC118株选育

将铜绿假单胞菌C型ZC118株第0代菌种接种改良马丁肉汤培养基，37℃培养12小时，进行活菌计数，甲醛溶液灭活完全后，将菌液用无菌生理盐水调整菌液浓度为1.25×10⁹CFU/ml、2.5×10⁹CFU/ml、5.0×10⁹CFU/ml，分别与无菌氢氧化铝胶按照9:1比例混合均匀，再加入1％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌，制备3批疫苗。

取2月龄健康易感水貂20只，随机分为4组，每组5只。第1组～第3组分别皮下注射3批疫苗，1.0ml/只；第4组不免疫作为对照。免疫后21日，免疫组和对照组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌C型ZC118株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU)。结果配苗前抗原含量≥2.5×10⁹CFU/ml的疫苗免疫水貂，免疫后21日攻毒保护率为80％(4/5)以上，对照水貂100％(5/5)死亡，表明铜绿假单胞菌B型DL007株具有良好的免疫原性，可作为疫苗研制的候选菌株。

(4)肉毒梭菌C型C62-4株选育

取灭活、浓缩的第5代、第10代、第15代肉毒梭菌C型C62-4株毒素，分别用无菌生理盐水调整毒素含量为50000MLD/ml、25000MLD/ml和12500MLD/ml，与无菌氢氧化铝胶按9:1比例混合均匀，制备9批疫苗。

肉毒梭菌C型C62-4株第5代、第10代、第15代菌种分别培养，灭活脱毒完全的菌液离心去除菌体，上清液进行浓缩。用浓缩毒素制备成不同毒素含量的疫苗，分别皮下免疫2月龄健康易感水貂，免疫后21日，连同条件相同的对照水貂各腹腔注射10个水貂最小致死量的肉毒梭菌C型C62-4株毒素。结果配苗前毒素含量≥25000MLD/ml时，制备疫苗免疫水貂，21日攻毒保护率为86.7％(13/15)以上；对照水貂100％(5/5)死亡，表明肉毒梭菌C型C62-4株具有良好的免疫原性，可作为疫苗研制的候选菌株。

2.菌株特性

(1)铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株

1)染色与形态观察菌株革兰氏染色为阴性，两端钝圆的短小杆菌。

2)培养特性菌株在含5％新生牛血清的营养琼脂平板上生长，为圆形、光滑、湿润、扁平的菌落；在麦康凯培养基上生长，菌落呈灰白色；在绵羊鲜血琼脂平板上能产生明显的β溶血；在绿脓菌素测定用培养基(PDP)上生长，产绿色素，菌落周围呈浅绿色。

3)生化特性菌株均能水解明胶，发酵葡萄糖，均不发酵乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖；氧化酶、触酶、硝酸盐均为阳性，靛基质、M.R、VP和H₂S试验阴性。

4)血清学试验经玻片凝集试验进行鉴定，铜绿假单胞菌WD005株鉴定为G型，铜绿假单胞菌DL007株鉴定为B型，铜绿假单胞菌ZC118株鉴定为C型。

5)毒力将筛选出的WD005株、DL007株、ZC118株培养菌液以不同剂量滴鼻接种2月龄健康易感水貂，最终得出铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株对水貂的最小致死量。以此为依据制定铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株毒力标准如下：

G型WD005株用2～12月龄健康易感水貂5只，各滴鼻接种铜绿假单胞菌G型WD005株1.0ml(约含活菌数1.5×10⁹CFU)，攻毒后连续观察7日，应全部死亡。

B型DL007株用2～12月龄健康易感水貂5只，各滴鼻接种铜绿假单胞菌B型DL007株菌液1.0ml(约含活菌数1.3×10⁹CFU)，攻毒后连续观察7日，应全部死亡。

C型ZC118株用2～12月龄健康易感水貂5只，各滴鼻接种铜绿假单胞菌B型DL007株菌液1.0ml(约含活菌数1.5×10⁹CFU)，攻毒后连续观察7日，应全部死亡。

6)免疫原性将铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株菌液菌数分别调至1.25×10⁹CFU/ml、2.5×10⁹CFU/ml、5.0×10⁹CFU/ml，甲醛灭活后与无菌的氢氧化铝胶按照9:1比例均匀混合，制备9批疫苗。9批疫苗分别分别皮下注射2月龄左右健康易感水貂进行效力检验。以此为依据制定铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株免疫原性标准如下：

G型WD005株按本法制成单苗(每毫升疫苗含铜绿假单胞菌G型WD005株2.25×10⁹CFU)。用2～12月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性)10只，随机分成2组，每组5只。第1组水貂各腿部皮下注射疫苗1.0ml，第2组水貂不免疫作为对照。免疫后21日，两组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌G型WD005株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU)，攻毒后连续观察7日。对照组水貂应全部死亡，免疫组水貂应至少保护4只。

B型DL007株按本规程制成单苗(每毫升疫苗含铜绿假单胞菌B型DL007株2.25×10⁹CFU)。用2～12月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性)10只，随机分成2组，每组5只。第1组水貂各腿部皮下注射疫苗1.0ml，第2组水貂不免疫作为对照。免疫后21日，两组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌B型DL007株菌液1.0ml(含活菌数约为1.3×10⁹CFU)，攻毒后连续观察7日。对照组水貂应全部死亡，免疫组水貂应至少保护4只。

C型ZC118株按本规程制成单苗(每毫升疫苗含铜绿假单胞菌C型ZC118株2.25×10⁹CFU)。用2～12月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性)10只，随机分成2组，每组5只。第1组水貂各腿部皮下注射疫苗1.0ml，第2组水貂不免疫作为对照。免疫后21日，两组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌C型ZC118株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU)，攻毒后连续观察7日。对照组水貂应全部死亡，免疫组水貂应至少保护4只。

(2)肉毒梭菌C型C62-4株

1)染色与形态观察本菌为革兰氏阳性粗大杆菌，陈旧培养物往往变成革兰氏阴性，产生偏端芽孢。

2)培养特性本菌为严格厌氧菌，在肉肝胃酶消化汤半固体培养基中呈中度生长。在厌气肉肝汤中生长不良或不生长，培养基加新鲜肝块时，生长良好，产气，有臭味。在鲜血琼脂平板上厌氧条件下，37℃培养48小时，菌落为不规则的圆形，直径3mm左右，半透明，边缘不整，有略大于菌落的溶血圈。

3)血清学试验用肉毒梭菌阳性血清进行中和试验，应为C型。

4)毒力将菌株接种加入新鲜生肝块的厌气肉肝汤，35℃培养5日，取菌液上清10^-4稀释后，静脉注射2只体重16～20g小鼠的SPF级或清洁级昆明系小鼠，0.2ml/只，应在3日内死亡；或取菌液上清10^-3稀释后，腹腔注射2～12月龄健康易感水貂(肉毒梭菌中和抗体阴性)2只，1.0ml/只，应在7日内死亡。

5)免疫原性下列方法任择其一。

①用2～12月龄健康易感水貂(肉毒梭菌中和抗体阴性)5只，各腿部皮下注射疫苗1.0ml，21日后连同条件相同的对照水貂5只，各腹腔注射10MLD的肉毒梭菌C型C62-4株毒素，攻毒后连续观察7日，对照水貂应全部死亡，免疫水貂应至少保护4只。

②用体重1.5～2.0kg家兔5只，各皮下注射1.0ml。21日连同条件相同的对照家兔5只，各静脉注射10MLD的肉毒梭菌C型C62-4株毒素，攻毒后连续观察14日，对照家兔应全部死亡，免疫家兔至少应保护4只。

3.水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗的制备

(1)将铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株分别进行培养。将菌种接种改良马丁肉汤培养基，37℃培养12～18小时，划线接种含5％新生牛血清的营养琼脂平板，37℃培养18～36小时，挑选5～10个典型菌落，接种绵羊鲜血琼脂斜面若干支，37℃培养18～36小时，作为一级种子。将一级种子接种改良马丁肉汤培养基，37℃培养12～18小时，作为二级种子。按发酵罐容量装入80％左右的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40min。待培养基温度冷却至37℃左右时，按培养基总量的1％左右接入二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法进行培养，37℃培养10～12小时。进行纯粹检验和活菌计数，按菌液总量的0.5％加入甲醛溶液，充分混匀，待温度升至37℃开始计时，灭活48小时，间隔6～8小时搅拌一次。将灭活检验合格的菌液分别进行离心，菌泥用灭菌生理盐水悬浮，最终每毫升菌悬液含菌数应不少于1.5×10¹⁰CFU。

(2)将肉毒梭菌C型C62-4株菌种接种于厌气肉肝汤培养基中，37℃培养3日后，用普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和普通肉汤各2管，每管接种0.2ml。培养3～5日，进行纯粹检验，检验合格后作为一级种子。将一级种子接种厌气肉肝汤或肉肝胃酶消化汤培养基，37℃培养3～5日，进行纯粹检验，检验合格后做为二级种子。按发酵罐容量装入80％左右的培养基，116℃灭菌40min。待培养基温度冷至37℃左右时，按培养基总量的1％～2％接入二级种子，同时加入灭菌的葡萄糖溶液，使其终浓度为0.5％，30～35℃静止培养5～7日。进行纯粹检验和毒素测定，按菌液量0.8％加入甲醛溶液，充分混匀，37℃脱毒10日，每日搅拌3次。将脱毒检验合格的菌液用0.22μm滤膜过滤除菌，上清液用孔径为50kD的超滤系统进行浓缩，最终每毫升上清液毒素含量为20万个小鼠最小致死量单位(MLD)。

(3)将铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株浓缩菌液和过滤除菌、浓缩的肉毒梭菌上清液按1:1:1:3比例混合均匀；与灭菌氢氧化铝胶按9:1的体积比进行配苗，充分搅拌，再加入1％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株，本发明人从疑似水貂出血性肺炎的发病水貂肺脏、肝脏和脾脏中成功分离出151株铜绿假单胞菌中经试验筛选出来的。是以上株已于2016年3月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：G型WD005株为CGMCC No.12305，B型DL007株为CGMCC No.12303，C型ZC118株为CGMCC No.12304；肉毒梭菌(Clostrdium botulinum)C62-4(CVCC 60353)购自(中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏中心编中国兽医菌种目录，第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p40)。

本发明的优点

(1)本发明疫苗制造及检验用菌株铜绿假单胞菌WD005株、DL007株、ZC118株是从临床分离的151株菌株中，经毒力试验、免疫原性试验筛选出来的。筛选的菌株针对当前水貂出血性肺炎流行血清型，针对性更强，保护更全面；经过毒力试验、免疫原性试验，免疫免疫原性良好。

(2)本发明的疫苗株肉毒梭菌C型C62-4株通过发酵罐培养，制备的疫苗毒素含量高，每毫升疫苗毒素含量均≥10万个小鼠最小致死量单位(MLD)，具有免疫原性优良的特点。

(3)本发明半成品制备工艺中将铜绿假单胞菌菌液，以7000r/min离心30min，菌泥用灭菌生理盐水悬浮，去除培养菌液中的内毒素，解决了疫苗的安全性问题。

(4)本发明半成品制备工艺中将脱毒检验合格的肉毒梭菌培养液用连续流离心机以14000r/min，进料速率约700ml/min离心，收获上清液，去除菌体，提高了疫苗安全性。

(5)本发明半成品制备工艺中将灭活检验合格的、去除菌体的肉毒梭菌毒素经孔径为50kD的超滤系统进行浓缩，浓缩的毒素保证了多联疫苗中肉毒梭菌毒素的抗原含量。

(6)本发明的二联灭活疫苗可以同时预防G型、B型、C型铜绿假单胞菌和C型肉毒梭菌对水貂的攻击，具有减少接种次数、使用方便等优点。减轻了免疫接种的劳动强度，降低了免疫成本，减少了动物应激反应，更加经济可靠。

实施例

本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。

实施例1

——菌种的检验

1.形态和生化特性

铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株为革兰氏阴性、两端钝圆短小杆菌。生化特性符合细菌分类学中本菌的特性。

肉毒梭菌C型C62-4株为革兰氏阳性粗大杆菌，陈旧培养物往往变成革兰氏阴性，产生偏端芽孢。生化特性应符合细菌分类学中本菌的特性。

2.培养特征

铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株在营养琼脂平板上生长，为圆形、光滑、湿润、扁平的菌落；在麦康凯培养基上生长，菌落呈灰白色；在绵羊鲜血琼脂平板上，能产生明显的β溶血；在绿脓菌素测定用培养基(PDP)上生长，产绿色素，菌落周围应呈浅绿色。

肉毒梭菌C型C62-4株为严格厌氧菌。在肉肝胃酶消化汤半固体培养基中呈中度生长；在厌气肉肝汤培养基中生长不良或不生长，添加新鲜肝块时，生长良好，产气，有臭味；在鲜血琼脂平板上，厌氧条件下37℃培养48小时，菌落为不规则的圆形，直径3mm左右，半透明，边缘不整，有略大于菌落的溶血圈。

3.血清学特性

用玻片凝集法进行鉴定，铜绿假单胞菌WD005株为G型，铜绿假单胞菌DL007株为B型，铜绿假单胞菌ZC118株为C型。

用肉毒梭菌阳性血清进行中和试验，肉毒梭菌C62-4株为C型。

4.毒力

(1)铜绿假单胞菌对水貂毒力

1)铜绿假单胞菌G型WD005株用2～5月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性)5只，分别滴鼻接种铜绿假单胞菌G型WD005株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU)，连续观察7日，全部死亡。

2)铜绿假单胞菌B型DL007株用2～5月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性)5只，分别滴鼻接种铜绿假单胞菌B型DL007株菌液1.0ml(含活菌数约为1.3×10⁹CFU)，连续观察7日，全部死亡。

3)铜绿假单胞菌C型ZC118株用2～5月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性)5只，分别滴鼻接种铜绿假单胞菌C型ZC118株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU)，连续观察7日，全部死亡。

(2)铜绿假单胞菌对小鼠毒力

1)铜绿假单胞菌G型WD005株用体重16～20g的SPF级或清洁级昆明系小鼠10只，分别腹腔注射铜绿假单胞菌G型WD005株菌液0.3ml(含活菌数约为2.0×10⁷CFU)，连续观察7日，全部死亡。

2)铜绿假单胞菌B型DL007株用体重16～20g的SPF级或清洁级昆明系小鼠10只，分别腹腔注射铜绿假单胞菌B型DL007株菌液0.3ml(含活菌数约为2.0×10⁷CFU)，连续观察7日，全部死亡。

3)铜绿假单胞菌C型ZC118株用体重16～20g的SPF级或清洁级昆明系小鼠10只，分别腹腔注射铜绿假单胞菌B型DL007株菌液0.3ml(含活菌数约为3.0×10⁷CFU)，连续观察7日，全部死亡。

(3)肉毒梭菌对小鼠毒力将肉毒梭菌C型C62-4株接种肉肝胃酶消化汤培养基，30～35℃静止培养5～7日，取菌液上清10^-4稀释后，静脉注射5只体重16～20g的SPF级或清洁级昆明系小鼠，0.2ml/只，连续观察3日，全部死亡。

(4)肉毒梭菌对水貂毒力将肉毒梭菌C型C62-4株接种肉肝胃酶消化汤培养基，30～35℃静止培养5～7日，取菌液上清10^-3稀释后，腹腔注射5只2～12月龄健康易感水貂(肉毒梭菌中和抗体阴性)，1.0ml/只，连续观察7日，全部死亡。

5.免疫原性

(1)铜绿假单胞菌G型WD005株按本法制成单苗(每毫升疫苗含铜绿假单胞菌G型WD005株2.25×10⁹CFU)。用2～12月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性)10只，随机分成2组，每组5只。第1组水貂各腿部皮下注射疫苗1.0ml，第2组水貂不免疫作为对照。免疫后21日，两组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌G型WD005株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU)，连续观察7日。对照组水貂全部死亡，免疫组水貂至少保护4只。

(2)铜绿假单胞菌B型DL007株按本法制成单苗(每毫升疫苗含铜绿假单胞菌B型DL007株2.25×10⁹CFU)。用2～12月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性)10只，随机分成2组，每组5只。第1组水貂各腿部皮下注射疫苗1.0ml，第2组水貂不免疫作为对照。免疫后21日，两组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌B型DL007株菌液1.0ml(含活菌数约为1.3×10⁹CFU)，连续观察7日。对照组水貂全部死亡，免疫组水貂至少保护4只。

(3)铜绿假单胞菌C型ZC118株按法制成单苗(每毫升疫苗含铜绿假单胞菌C型ZC118株2.25×10⁹CFU)。用2～12月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性)10只，随机分成2组，每组5只。第1组水貂各腿部皮下注射疫苗1.0ml，第2组水貂不免疫作为对照。免疫后21日，两组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌C型ZC118株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU)，连续观察7日。对照组水貂全部死亡，免疫组水貂至少保护4只。

1)按本法制成单苗(每毫升疫苗含肉毒梭菌C型C62-4株毒素为22500MLD)，用2～12月龄健康易感水貂(肉毒梭菌中和抗体阴性)10只，随机分成2组，每组5只。第1组水貂分别皮下注射疫苗1.0ml，第2组水貂不免疫作为对照。免疫后21日，免疫组和对照组水貂分别腹腔注射10MLD的肉毒梭菌C型C62-4株毒素，连续观察7日，对照水貂全部死亡，免疫水貂至少保护4只。

2)按本法制成单苗(每毫升疫苗含肉毒梭菌C型C62-4株毒素为22500MLD)，用体重1.5～2.0kg家兔10只，随机分成2组，每组5只。第1组家兔分别皮下注射疫苗1.0ml，第2组家兔不免疫作为对照。免疫后21日，免疫组和对照组家兔分别静脉注射10MLD的肉毒梭菌C型C62-4株毒素，连续观察14日，对照家兔全部死亡，免疫家兔至少保护4只。

6.纯粹

铜绿假单胞菌用含5％新生牛血清的营养琼脂平板进行检验，结果纯粹。

将肉毒梭菌C型C62-4株菌种分别接种TG小管、GA斜面、肉肝胃酶消化汤培养基各2支，每支0.2ml，1支置37℃培养，1支置25℃培养，另取肉毒梭菌C型C62-4株菌种，接种1支GP小管，每支0.2ml，置25℃培养，分别培养7日，结果纯粹。

实施例3

——疫苗制备

1.铜绿假单胞菌菌液制备

(1)一级种子繁殖及鉴定铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株分别进行培养。将菌种接种改良马丁肉汤培养基，37℃培养12～18小时，划线接种含5％新生牛血清的营养琼脂平板，37℃培养18～36小时，挑选5～10个典型菌落，接种绵羊鲜血琼脂斜面若干支，37℃培养18～36小时，作为一级种子。取样用含5％新生牛血清的营养琼脂平板进行纯粹检验，应纯粹。置2～8℃保存，使用期应不超过14日。

(2)二级种子繁殖及鉴定铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株分别进行培养。将一级种子接种改良马丁肉汤培养基，37℃培养12～18小时，作为二级种子。取样用含5％新生牛血清的营养琼脂平板进行纯粹检验，应纯粹。置2～8℃保存，使用期应不超过3日。

(3)制苗用菌液制备铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株分别进行培养。按发酵罐容量装入80％左右的改良马丁肉汤培养基，116℃灭菌40分钟。待培养基温度冷却至37℃左右时，按培养基总量的1％左右接入二级种子液，采用逐渐增大通气量的方法进行培养，37℃培养10～12小时。

(4)菌液检验

1)纯粹检验用含5％新生牛血清的营养琼脂平板进行纯粹检验，应纯粹。

2)活菌计数用含5％新生牛血清的营养琼脂平板，按现行《中国兽药典》附录进行活菌计数，应不低于8.0×10⁹CFU/ml。

(5)菌液灭活按菌液总量的0.5％加入甲醛溶液，充分混匀，待温度升至37℃时开始计时，灭活48小时，期间间隔6～8小时搅拌一次。灭活结束后，用含5％新生牛血清的营养琼脂平板，按现行《中国兽药典》附录中的方法进行灭活检验，应无菌生长。

(6)抗原离心将灭活检验合格的铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株菌液分别进行离心，菌泥用灭菌生理盐水悬浮，最终每毫升菌悬液含菌数应不少于1.5×10¹⁰CFU。取样按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。

2.肉毒梭菌C型C62-4株菌液制备

(1)一级种子繁殖及鉴定将肉毒梭菌C型C62-4株菌种接种于肉肝胃酶消化汤培养基中，33℃～35℃静置培养3～5日，作为一级种子。取样进行纯粹检验，应纯粹。2～8℃保存，使用期应不超过15日。

(2)二级种子繁殖及鉴定将肉毒梭菌C型C62-4株一级种子接种肉肝胃酶消化汤培养基，33℃～35℃静置培养3～5日，作为二级种子。取样进行纯粹检验，应纯粹。2～8℃保存，使用期应不超过5日。

(3)制苗用菌液制备按发酵罐容量装入80％左右的肉肝胃酶消化汤培养基，116℃灭菌40分钟。待培养基温度冷至37℃左右时，按培养基总量的1％～2％接入肉毒梭菌C型C62-4株二级种子液，同时加入灭菌的葡萄糖溶液，使其终浓度为0.5％，30～35℃静止培养5～7日。

(4)纯粹检验菌液培养完成后，取样分别接种TG小管、GA斜面、肉肝胃酶消化汤培养基各2支，每支0.2ml，1支置37℃培养，1支置25℃培养，另取培养菌液，接种1支GP小管，每支0.2ml，置25℃培养，分别培养7日，应纯粹。

(5)毒素测定取离心后的肉毒梭菌C型C62-4株菌液上清，用0.22μm滤膜过滤去除菌体，滤过液10^-4倍稀释后再进行2倍系列稀释，分别静脉注射体重16～20g的SPF级或清洁级昆明系小鼠2只，0.2ml/只，连续观察3日，记录小鼠死亡情况，每毫升菌液毒素含量应不低于50000MLD。

(6)灭活脱毒按菌液总量的0.8％加入甲醛溶液，充分混匀，待温度升至37℃时开始计时，脱毒10日，期间每隔6小时搅拌一次，每次30分钟。

(7)灭活检验灭活结束后，取样接种肉肝胃酶消化汤培养基2支，每管0.2ml，置37℃培养7日，应无菌生长。

(8)脱毒检验灭活结束后，将灭活菌液离心取上清，静脉注射体重16～20g的SPF级或清洁级昆明系小鼠2只，每只0.4ml，连续观察5日，应全部健活。如有小鼠死亡，应继续脱毒。

(9)毒素浓缩将脱毒检验合格的肉毒梭菌C型C62-4株菌液用连续流离心机离心(转速为14000r/min，进料速率为700ml/min)或用0.22μm中空纤维滤器过滤去除菌体，上清液或滤过液用孔径为50kD的超滤系统进行浓缩，最终每毫升浓缩液毒素含量应不少于20万MLD。

(10)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

3.疫苗制备将过滤除菌、浓缩的肉毒梭菌C型C62-4株毒素pH调至7.0±0.2，充分摇匀；将铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株、C型ZC118株浓缩菌液和肉毒梭菌C型C62-4株浓缩毒素按1:1:1:3比例混合均匀；与灭菌氢氧化铝胶按9:1的比例进行配苗，充分搅拌，再加入1％的硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌。

4.分装定量分装，加盖密封。分装时，应随时搅拌使其混合均匀。

按上述方法连续生产3批疫苗，批号分别为1404001、1404002、1404003。

实施例4

——疫苗的检验

1.性状静置后，上层为澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2.装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验，均符合规定。

3.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

4.安全检验下列方法任择其一。

(1)用水貂检验3批实验室制品分别皮下注射2月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性；肉毒梭菌中和抗体阴性)5只，各腿部皮下注射疫苗2.0ml，连续观察14日，结果水貂全部健活，且不出现因疫苗引起的局部和全身不良反应。具体结果见表1。

表1 3批制品水貂安全性试验检验结果

(2)用小鼠检验3批实验室制品分别腹腔注射体重16～20g的SPF级小鼠10只，各腹腔注射疫苗0.5ml，连续观察14日，结果小鼠全部健活。具体结果见表2。

表2 3批制品小鼠安全性试验检验结果

疫苗批号	注射剂量(ml)	小鼠数量(只)	安全检验结果
				1404001	0.5	10	小鼠10/10健活
1404002	0.5	10	小鼠10/10健活
				1404003	0.5	10	小鼠10/10健活

5.效力检验

(1)铜绿假单胞菌部分下列方法任择其一。

1)用水貂检验用2～12月龄健康易感水貂(铜绿假单胞菌G型、B型、C型玻片凝集试验抗体阴性，附注1)30只，随机分为6组，每组5只。第1组、第2组、第3组水貂各腿部皮下注射疫苗1.0ml，第4组、第5组、第6组水貂不免疫作为对照。免疫后21日，第1组、第4组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌G型WD005株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU，菌液制备方法见附注2)；第2组、第5组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌B型DL007株菌液1.0ml(含活菌数约为1.3×10⁹CFU，菌液制备方法见附注2)；第3组、第6组水貂分别滴鼻接种铜绿假单胞菌C型ZC118株菌液1.0ml(含活菌数约为1.5×10⁹CFU，菌液制备方法见附注2)，连续观察7日。结果对照水貂全部死亡，免疫水貂80％以上保护。具体检验结果见表3。

表3 3批实验室制品水貂效力检验结果

2)用小鼠检验用体重16～20g的SPF级或清洁级昆明系小鼠60只，随机分为6组，每组10只。第1组、第2组、第3组小鼠各腹腔注射40倍稀释的疫苗(1份疫苗加39份10％氢氧化铝胶盐水)0.3ml，第4组、第5组、第6组小鼠不免疫作为对照。免疫后21日，第1组、第4组小鼠分别腹腔注射铜绿假单胞菌G型WD005株菌液0.3ml(含活菌数约为2.0×10⁷CFU，菌液制备方法见附注2)；第2组、第5组小鼠分别腹腔注射铜绿假单胞菌B型DL007株菌液0.3ml(含活菌数约为2.0×10⁷CFU，菌液制备方法见附注2)；第3组、第6组小鼠分别腹腔注射铜绿假单胞菌C型ZC118株菌液0.3ml(含活菌数约为3.0×10⁷CFU，菌液制备方法见附注2)，连续观察7日。结果对照小鼠全部死亡，免疫小鼠80％以上保护。具体检验结果见表4。

表4 3批制品小鼠效力检验结果

(2)肉毒梭菌部分下列方法任择其一。

1)用水貂检验用2～12月龄健康易感水貂(肉毒梭菌中和抗体阴性，附注3)10只，随机分成2组，每组5只，第1组水貂分别腿部皮下注射疫苗1.0ml，第2组水貂不免疫作为对照。免疫后21日，免疫组和对照组水貂分别腹腔注射10MLD的肉毒梭菌C型C62-4株毒素，连续观察7日，结果免疫水貂80％以上保护，对照水貂100％死亡。具体结果见表5。

表5 3批制品水貂效力检验结果

疫苗批号	肉毒梭菌C62-4株攻毒结果(保护数/攻毒数)
		1404001	5/5
1404002	5/5
		1404003	5/5
对照组	0/5

2)用家兔检验用体重1.5～2.0kg家兔10只，随机分成2组，每组5只，第1组家兔分别腿部皮下注射疫苗1.0ml，第2组家兔不免疫作为对照。免疫后21日，免疫组和对照组家兔分别静脉注射10MLD的肉毒梭菌C型C62-4株毒素，连续观察14日，结果免疫家兔均80％以上保护，对照家兔均100％死亡。具体结果见表6。

表6 3批制品家兔效力检验结果

疫苗批号	肉毒梭菌C62-4株攻毒结果(保护数/攻毒数)
		1404001	4/5
1404002	5/5
		1404003	5/5
对照组	0/5

6.甲醛和汞类防腐剂残留量测定分别按现行《中国兽药典》附录进行测定，均符合规定。

Claims

2.如权利要求1所述一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗，其特征在于所述该疫苗主要成分为G型铜绿假单胞菌WD005株、B型铜绿假单胞菌DL007株、C型铜绿假单胞菌ZC118株的灭活细菌和C型肉毒梭菌C62-4株的毒素。

3.如权利要求2所述一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗，其特征在于疫苗中的铜绿假单胞菌G型WD005株、B型DL007株和C菌型ZC118株已于2016年03月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为：CGMCC No.12305、CGMCCNo.12303和CGMCC No.12304。