CN102391975B - 一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株及制备方法，为猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT，CCTCCNO:M2011410。其步骤：1.培养基制备，A、称取酵母粉、葡萄糖、谷氨酸钠、MgSO4、FeSO4·7H2O，溶入纯水中，调节pH值，灭菌；B、称取NaH2PO4、K2HPO4配成母液，灭菌；C、称取NAD配成母液，滤膜过滤；D、按量将步骤A、B、C得到的溶液混合，得到培养基；2.发酵培养，a）将冻干种子用含NAD的TSA平板活化，至单菌落长出；b）挑取单菌落摇瓶培养；c）将培养好的种子液转接到发酵培养基中；d）发酵初始低搅拌，低通气；e）对数期，提高转速和通气，并在线控制pH；f溶氧回升，放罐收菌。适合用于灭活疫苗制备的毒力强，抗原效果好，价格低廉，菌体生长快、密度高，易于控制。
Description
技术领域
本发明属于动物疫苗工程技术领域，更具体涉及一株猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT，同时还涉及一种猪胸膜肺炎放线杆菌的制备方法，该方法适用于高密度发酵猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT及其他血清型菌株，以大量制备抗原用于猪传染性胸膜肺炎单价或多价疫苗。
技术背景
猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的以胸膜肺炎和出血性坏死性肺炎为特征的一种重要的猪呼吸道传染病。其病原猪胸膜肺炎放线杆菌是高度专一寄生于猪呼吸道的一种革兰氏阴性致病菌，病原本身根据研究年代的不同就曾经被划分于不同类属的细菌，经历了一系列从表型鉴定到基因鉴定的过程，其毒力因子和保护性抗原因素复杂，目前为止根据其荚膜多糖和脂多糖抗原差异共有15个血清型，导致所引起疾病的病原学因素复杂，目前该病在全球呈暴发流行，对世界养猪业造成了巨大危害。自我国发现PCP流行以来，很多科研工作者对该病的病原学、流行病学、诊断及免疫防制等方面都进行了大量的研究，取得了一定的成就。但目前该病在我国发病率仍逐年上升，有的猪场阳性率已达到70％以上，血清型有1、2、3、5、7与8型等，已经成为当前集约化猪场的主要传染病之一，严重危害着我国的养猪业。而且，APP产生的毒力因子对肺部防御系统的破坏，使得此病往往与副猪嗜血杆菌病、猪肺疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等疾病混合或继发感染，进一步加大疾病的危害，使之已成为危害养猪业最严重的疾病之一。疫苗免疫作为疾病防控的重要手段，随着对该菌毒力因子在致病性和免疫保护作用研究的深入，国内已经有针对性防治猪胸膜肺炎放线杆菌血清型1型、3型、5型、7型感染的单价或多价疫苗的报道，但由于不同血清型所分泌毒素及表面抗原差异巨大，往往导致对其他血清型猪胸膜肺炎放线的保护效果不佳，而由于我国地域广阔，又从许多国家进口生猪，导致现有疫苗在对某一或几种血清型株到达防治效果的同时，又会导致其他血清型的分离率上升，而猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型是在一种在全球广泛流行的血清型，因此筛选到一株抗原效果好的2型菌显得尤为必要。另一方面，长期以来我国细菌性疫苗的关键生产技术中，大规模的菌体高密度培养技术严重滞后，对猪胸膜肺炎放线杆菌的培养没有系统优化的培养基和针对其生长特性的培养条件控制手段，导致企业的生产成本高、效率低，从而使产品价格相对较高，影响了免疫普及率。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株，该菌具有适合用于灭活疫苗制备的毒力强，抗原效果好，保护力高等优点。
本发明的另一个目的是在于提供了一种猪胸膜肺炎放线杆菌的制备方法，该方法具有原料来源广泛、价格低廉、质量可控，菌体生长快、密度高，易于控制等优点
为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案完成：
其技术构思是：猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株的分离、筛选和鉴定：申请人从湖南湘潭市某猪场送检的病料中分离并鉴定得到一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌，该菌株命名为猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2XT，XT为分离地湘潭拼音首字母)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2011410
1.1病料分离：无菌取濒死猪肺、咽喉扁桃体等组织，接种到TSA琼脂培养上，10％CO2、37℃条件下培养24～36h后挑选典型的单个菌落进行纯化培养。挑选纯化好的单菌落接种于TSB液体培养液中，37℃摇床(220r/min)培养过夜。
1.2采用显微观察、PCR法、生化鉴定及琼脂扩散验进行了分类和分型鉴定，具体步骤如下：
1.2.1PCR鉴定
模板的制备：用接种环挑取数个纯化后的菌落至装有40μL无菌三蒸水的EP管中，水煮5～10min，立即放入冰水混合物中，待完全冷却后，12000r/min离心3min，取上清4℃保存备用
PCR引物序列：P1：5’CCGACTTTTAAATCCGT3’；P2：5’GAACAGTTGTTCGCTAA3’
PCR反应条件：10倍缓冲液5μL；25mmol/L MgCl2 3μL；2mmol/L dNTPs 1.0μL；1.5μmol/L上游引物(P1)1.5μL；1.5μmol/L下游引物(P2)1.5μL；TaqDNA酶0.5μL；无菌水27.5μL；模板10μL。反应程序：94℃预变性4min后，按94℃40s，65℃40s，72℃1min40s的循环程序进行30次循环，最后一个循环结束后再延伸10min，取PCR产物于含EB的0.8％(m/v)琼脂糖胶中电泳，紫外线灯下观察分析。预期扩增的靶基因为APP外膜脂蛋白基因610bp大小的片段，并以猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型4226(Actinobacilluspleuropneumoniae serotype 2 2264，由澳大利亚昆士兰州动物研究所Blackall和Ross博士惠赠，Blackall PJ，Pahoff JL.Characterisation of porcine haemophili isolated fromAustralian pigs between 1988 and 1992，Aust Vet J.1995 Jan；72(1)：18-21.)作标准对照。
1.2.2生化鉴定：根据《伯杰氏细菌鉴定手册第八版》关于胸膜肺炎放线杆菌鉴定所需的生化项目，选择所需的微量鉴定管(购于杭州天和微生物试剂有限公司)。按照微量鉴定管的说明书来操作。挑取1纯化培养好的菌落接种于相应培养基做尿酶、β-溶血、NAD依赖性、cAMP等特性试验，并以猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型4226作标准对照。。
1.2.3琼脂扩散鉴定：用0.15mol/L NaCl收集TSA平板上培养了6h的菌落，于5000r/min离心15min，洗涤一次，沉淀菌体用68℃去离子水作适量稀释，混匀后加等积的68℃的平衡酚，于68℃水浴20min，其间不断搅拌。取出后冰浴冷却，4℃7000r/min 20min，取水相；再加与第一次等量的68℃的去离子水，如上法水浴冰浴，离心，取水相。将两次水相混匀，即为抗原。抗血清由陈凡(陈凡等，2004，胸膜肺炎放线杆菌生物I型标准抗血清的制备及初步临床应用.中国预防兽医学报，2004，26(6)：458-461)将标准菌株免疫兔制备。琼斯扩散实验，将琼脂1g，NaCl8.5g，溶于100mL蒸馏水中，在微波炉中加热至充分溶解，倒入90mm平板中，琼脂层3～4mm厚，待其凝固后，用打孔器在平板上按需要打孔(孔径3mm、孔距4mm)，封底，中央孔加入抗原，周围孔加入各型阳性血清，以加满为宜(每孔约15μl左右)，以未免疫家兔的血清为对照。放入湿盒中，置于37℃，24h后观察结果。以抗原与抗体孔之间出现清晰白色沉淀线为阳性。
根据以上鉴定结果，确定上述分离菌为猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型，命名为猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT。该菌的培养必须需要添加V因子，在绵阳血平板上，可产生稳定的β溶血，金黄色葡萄球菌可增强其溶血圈(CAMP阳性)，在10％CO2、37℃的条件下生长旺盛。在TSA(含NAD)固体培养基上，于10％CO2、37℃下，培养24h后形成直径1～2mm透明、圆润的菌落。镜检呈革兰氏阴性，菌体平直，两极着色的短杆菌。发酵葡萄糖、蔗糖产酸，不发酵乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、海藻糖、密二糖，在麦康凯平板上不能生长。该菌的毒力较强，以TSB(含NAD)12h培养物2ml滴鼻攻毒10周龄仔猪，6～8小时内出现呼吸困难、咳嗽、食欲减退、精神沉郁、发烧、有的伴有呕吐症状，20左右小时出现死亡。
一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT的制备方法，其步骤是：
以猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT发酵一定时间后的活菌量(cfu/ml)为指标，通过两水平正交实验从众多营养组分中筛选出对猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT生长影响较显著的组分，包括酵母粉、葡萄糖、谷氨酸钠、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、辅酶I，接着通过爬坡实验找到影响最大的四种组分的最适浓度区间，再通过中心组合实验和响应面分析确定其最终浓度。实验得出优化培养基的组分及浓度范围为酵母粉20～30g/L，葡萄糖3～5g/L，谷氨酸钠1～3g/L，K2HPO4 2～5g/L，NaH2PO4 0.5～2g/L，MgSO4 0.5～1g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1g/L，辅酶I(NAD)0.01～0.03g/L，最优配方浓度为酵母粉27.55g/L，葡萄糖3.45g/L，谷氨酸钠2.77g/L，K2HPO4 4.41g/L，NaH2PO4 1.00g/L，MgSO4 0.80g/L，FeSO4·7H2O 0.10g/L，NAD 0.02g/L。
上所述培养基的配制方法如下(1L体积)：
1、按上述配方称取除酵母粉20～30g/L，葡萄糖3～5g/L，谷氨酸钠1～3g/L，K2HPO4 2～5g/L，NaH2PO4 0.5～2g/L，MgSO4 0.5～1g/L，FeSO4·7H2O 0.05～0.1g/L，辅酶I(NAD)0.01～0.03g/L，将除NaH2PO4、K2HPO4、辅酶I之外的其他组分，溶入900ml纯水中，调节pH值到7.4±0.2，115℃下灭菌25min。
2、将NaH2PO4、K2HPO4配成10倍浓度母液，121℃下灭菌15min后，取100ml。
3、将辅酶I配成1000倍浓度母液，0.2μm孔径滤膜过滤后，取1ml。
4、将上述步骤1、2、3得到的溶液混合，即得到所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT高密度发酵培养基。
本发明进一步在100L发酵罐(本发明使用高机BIOF6000型全自动发酵罐)中对猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT在上述优化培养基中的生长控制条件进行控制摸索，确定工艺条件如下：
1.将冻干种子菌用添加有NAD的TSA平板37℃活化18～24h，至明显单菌落长出。
2.挑取单菌落至添加有NAD的TSB摇瓶种子培养基中，培养6～8h至OD600值达到0.4～0.6。
3.以3％～5％接种量将培养好的种子液转接到装液系数为70％的优化培养基发酵罐中。
4.发酵初期100r/min低速搅拌，通气量控制在1800L/h，温控为恒温37℃。
5.发酵2h后，逐步提高转速到200r/min，通气量到3000L/h，并在线补加NH3控制pH在7.0左右。
6.发酵10h左右，观察到NH3停止补加且溶氧DO值回升到80以上时，放罐收菌。
最后，将本发明培养得到的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT菌体制备成灭活疫苗，进行免疫攻毒实验。
按如下工艺制备常规猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗：
1、灭活：将检验合格的菌液，按菌液总量的0.4％(体积比)加入甲醛溶液，37℃灭活48小时，期间每隔4小时搅拌1次，然后取样并进行灭活检验，应无细菌生长。
2、浓缩：将灭活检验合格的菌液离心，按灭活前的活菌计数结果用生理盐水调节猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT浓度到3×109CFU/ml。取样做无菌检验，应无细菌生长。
3、配苗：油相的制备，取埃克森美孚进口白油94份(以毫升为单位)，加入硬脂酸铝1份(以克为单位)，边加边搅拌，直到透明为止，再加入司本-80 6份(以毫升为单位)，充分混匀，130℃灭菌30分钟，冷却至室温(20-25℃，以下相同)备用；水相的制备，将浓缩好的菌液加入灭菌后的吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解，使其终浓度为4.0％。
4、乳化与分装：水相与油相的比例为1∶1.5。将水相缓慢加入油相均质3～5分钟后，剪切，制成均匀乳剂。定量分装后，加塞密封，置2～8℃保存。
免疫试验方案：
用28～35日龄健康断奶仔猪12头，其中5头各肌肉注射发明制得的疫苗2ml，含1个使用剂量，首免后21日进行第二次免疫；另5头免疫常规TSB(发酵制备疫苗作为对照组；剩下2头作为未免疫组。免疫后测定动物体温，观察临床表现。
二免后14日，以同一批制苗强毒株12h培养物4mL滴鼻攻毒效检，攻毒后观察其临床症状和死亡情况，计算两组疫苗的保护率。
本发明特点在于提供一株高致病猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT，通过培养基优化得到适用于猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT培养的培养基，并通过发酵控制优化保证菌体旺盛生长了一种可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT灭活疫苗生产的大规模增殖培养基及培养方法，所用材料和工艺均以疫苗生产为最终目的。采用上述培养基及培养方法培养猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT，与其他培养基相比能获得较高的菌量，而且材料来源广泛且价格低廉，在疫苗生产过程中能得到高纯度的细菌。在100L发酵罐生产中的应用显示，本发明的培养基及培养方法发酵猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT，终点活菌数可达到94亿/ml，菌体制备的灭活疫苗抗原效果好，攻毒免疫保护力高于80％。
附图说明
图1为一种病原菌PCR鉴定胶示意图。
其中1-4号泳道为肺脏分离菌，5-6号泳道为扁桃体分离菌，7号泳道为阴性对照，8号泳道为APP标准菌株4226.
图2为猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT在装有50ml本发明优化培养基和TSB培养基的250ml摇瓶培养过程中的生长曲线对比图。
图3为一种是猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT在使用本发明优化培养基及培养方法在100L发酵罐中的发酵过程曲线图。
具体实施方式
实施例1：菌种分离及鉴定
从猪场送检的濒死病料中无菌取猪肺、咽喉扁桃体等组织，接种到TSA琼脂培养基上，10％CO2，37℃培养24～36h后挑选典型的单个菌落进行纯化培养。挑选纯化好的单菌落接种于TSB液体培养液中，37℃摇床(220r/min)培养过夜。
培养特性：该菌在10％CO2，37℃的条件下生长良好，液体培养基上生长旺盛。在TSA(含NAD)固体培养基上，于10％CO2、37℃下，培养24h后形成直径1～2mm透明、圆润的菌落。
病原的形态特征：自然发病猪和实验感染小鼠的肺和纯培养物镜检，可见有革兰氏阴性，菌体平直，两极着色的短杆菌。
PCR检测结果：6个待检样品中有2个扩出610bp特异性条带(见图1)，其中1-4号为肺脏，5-6为扁桃体，说明肺脏和扁桃体均是APP的靶组织，提示可以用采集肺脏和扁桃体作为APP的待检病料，该患猪已经感染猪传染性胸膜肺炎
对从上述PCR鉴定阳性病料中分离的单菌落进行生化鉴定，结果见表1，
表1生化鉴定试验
琼脂扩散血清型鉴定：抗血清由陈凡(陈凡等，2004，胸膜肺炎放线杆菌生物I型标准抗血清的制备及初步临床应用.中国预防兽医学报，2004，26(6)：458～461)将标准菌株免疫兔制备。琼斯扩散实验，将琼脂1g，NaCl8.5g，溶于100mL蒸馏水中，在微波炉中加热溶解。平板3～4mm厚，待其凝固后，用打孔器在平板上按需要打孔(孔径3mm、孔距4mm)，封底，中央孔加入抗原，周围孔加入各型阳性血清，以加满为宜(每孔约15μl左右)，以未免疫家兔的血清为对照。放入湿盒中，置于37℃，24h后观察结果。以抗原与2型抗抗血清孔之间出现清晰白色沉淀线为阳性，其他孔均为阴性。
动物试验：4头10周龄仔猪，以2ml培养菌液滴鼻攻毒后，在16～24h内全部急性死亡，，剖解见到与自然发病相同的典型的胸膜肺炎，鼻孔流出血性分泌物，取肺组织涂片镜检可见与自然发病形态相同的菌体。
根据细菌病原形态学观察、培养特性、生化特性、PCR鉴定、动物试验以及病死猪临床症状、病理剖解变化，可以判定所分离的细菌为猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型，命名为猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT。
实施例2：培养基优化
首先通过两水平正交试验对猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT高密度培养基的营养组分进行了初步筛选(表1，表2)，结合原料的成本及操作简便性确立该培养基的组分因子包括：酵母粉、葡萄糖、谷氨酸钠、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、辅酶I，并且得到了对活菌量影响最大的四个组分因子，依次为：酵母粉＞K2HPO4＞谷氨酸钠＞葡萄糖，接着通过爬坡实验找到影响最大的四种组分最适的浓度区间，再通过中心组合实验和响应面分析确定其最终浓度。实验得到的优化培养基配方浓度范围为酵母粉20～30g/L，葡萄糖3～5g/L，谷氨酸钠1～3g/L，K2HPO4 2～5g/L，NaH2PO4 0.5～2g/L，MgSO4 0.5～1g/L，FeSO4·7H2O0.05～0.1g/L，辅酶I(NAD)0.01～0.03g/L，最优配方浓度为酵母粉27.55g/L，葡萄糖3.45g/L，谷氨酸钠2.77g/L，K2HPO4 4.41g/L，NaH2PO4 1.00g/L，MgSO4 0.80g/L，FeSO4·7H2O 0.10g/L，NAD 0.02g/L。
表2正交试验培养基组分及浓度
表3培养基优化正交试验设计及结果
注：*代表差异显著性＞010
实施例3：培养基配制
培养基组分及配比/L
葡萄糖3g； 酵母粉30g；
谷氨酸钠3g； K2HPO4 4.5g；
NaH2PO4 1g； MgSO4 0.8g
FeSO4·7H2O 0.1g NAD 0.02g
经下列方法制得：
A、按量称取酵母粉、葡萄糖、谷氨酸钠、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、辅酶I，定容至900ml，调整pH到7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌25min；
B、按量称取K2HPO4、NaH2PO4，定容至100ml，在121℃高压蒸汽下灭菌15min；
C、称取2gNAD，定容至100ml，通过0.2μm孔径滤膜过滤后，取1ml备用；
D、将以上三种溶液混合均匀，即得到猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT高密度发酵培养基。
实施例4：发酵工艺
在100L发酵罐中，按70％装液系数配制培养基(同实施例2)，再按如下工艺过程活化、增殖猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT。
1、将猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT冻干种子菌用添加有NAD的TSA平板37℃活化18～24h，至明显单菌落长出，进行纯粹检验。
2、挑取单菌落至添加有NAD的TSB摇瓶种子培养基中，培养6～8h至OD600值达到0.4～0.6。
3、以3％～5％接种量将培养好的种子液转接到装液上述系数为70％的优化培养基发酵罐中。
4、发酵初期100r/min低速搅拌，通气量控制在1800L/h，温控为恒温37℃。
5、发酵2h后，逐步提高转速到200r/min，通气量到3000L/h，并在线补加NH3控制pH在7.0左右。
6、发酵10h左右，观察到NH3停止补加且溶氧DO值回升到80以上时，放罐收菌，取菌液作平板稀释计数，并检验纯粹性。
实施例5：猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT灭活苗的制备及免疫保护实验
1、灭活：将实施例4得到的检验合格的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT菌液，按菌液总量的0.4％(体积比)加入甲醛溶液，37℃灭活48小时，期间每隔4小时搅拌1次，然后取样进行灭活检验，应无细菌生长。
2、离心：将灭活检验合格的菌液离心，按灭活前的活菌计数结果用生理盐水调节菌体浓度到3×109CFU/ml。取样做无菌检验，应无细菌生长。
3、配苗：油相的制备，取埃克森美孚进口白油94份(以毫升为单位)，加入硬脂酸铝1份(以克为单位)，边加边搅拌，直到透明为止，再加入司本-80 6份(以毫升为单位)，充分混匀，130℃灭菌30分钟，冷却至室温(20-25℃，以下相同)备用；水相的制备，将检验合格的菌体浓度为3×109CFU/ml菌液，加入灭菌后的吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解，使其终浓度为4.0％。
4、乳化与分装：水相与油相的比例为1∶1.5。将水相缓慢加入油相均质3～5分钟后，剪切，制成均匀乳剂。定量分装后，加塞密封，置2～8℃保存。
免疫试验方案：
用28～35日龄健康断奶仔猪12头，其中5头各肌肉注射本发明制得的疫苗2ml，含1个使用剂量，首免后21日进行第二次免疫；另5头免疫用TSB发酵培养制备的疫苗(制作流程同上)为对照组；剩下2头作为未免疫组。免疫后测定动物体温，观察临床表现，见表4。
二免后14日，以同一批制苗强毒株12h培养物2mL滴鼻攻毒效检，攻毒后观察其临床症状和死亡情况，计算两组疫苗的保护率，见表5。
表4疫苗接种仔猪(28～35日龄)后的平均体温变化
如表4所示，两组疫苗免疫后对28～35日龄健康断奶仔猪免疫接种观察结果表明，疫苗接种猪都仅表现短时性的体温升高，并且平均体温升高不超过1℃。另外，所有仔猪接种后食欲、精神均表现正常，无其它可见临床反应。
表5：疫苗免疫保护力结果
如表5所示，猪二免后攻毒结果表明两组疫苗对28～35日龄健康断奶仔猪均有80％以上的保护率，而TSB组中1头猪出现了短时发病症状后恢复正正常，优化组未出现发病。
Claims (2)
1.一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株，其特征在于：猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae）血清2型XT，CCTCC NO:M2011410。
2.权利要求1所述的一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株在制备抗猪胸膜肺炎疫苗药物中的应用。
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| P Dom, etc..In vivo association of Actinobacillus pleuropneumoniae serotpye2 with the respiratory epithelium of pigs.《Am Soc Microbiol》.1994,第62卷(第4期),1262页材料与方法. |
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