CN102286391A

CN102286391A - 水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102286391A
Application number: CN2010102038791A
Authority: CN
Inventors: 闫喜军; 白雪; 柴秀丽; 罗国良; 赵建军; 张海玲; 邵西群; 张蕾; 高晗
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2010-06-21
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2030-06-21
Also published as: CN102286391B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了两种铜绿假单胞菌强毒菌株以及由该两种菌株制备的水貂出血性肺炎二价灭活疫苗。将所述铜绿假单胞菌强毒菌株接种培养基通气扩增培养，收获培养物灭活后按1-2∶1比例混合，加佐剂制备水貂出血性肺炎二价灭活疫苗。本发明所述二价灭活疫苗用于预防水貂出血性肺炎免疫效果好，可获得至少五个月的保护期，保护率在80％以上，可有效防止水貂出血性肺炎的发生，具有良好的应用前景。

Description

水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种疫苗及其制备方法。

背景技术

水貂出血性肺炎又称水貂假单胞菌性肺炎，是主要发生在每年9～11月份水貂换毛季节的一种急性传染病，以出血性肺炎、急性死亡为特征，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶弥漫性出血和败血症变化。本病世界各地均有发生，每年可造成养殖场10％～50％的死亡率，是危害水貂养殖业的重要细菌性传染病。

该病病原为假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseud-omonas)中的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginolsa)，亦称为绿脓杆菌(Bacterium pyocyaneum)，为革兰氏阴性杆菌，长1.5～3.0μm，宽0.5～0.7μm，两端钝圆，一端有一根鞭毛，能运动。不能形成芽胞及荚膜。在普通琼脂培养基上生长良好，形成大小不一的菌落。多数能产生蓝绿色水溶性色素，使菌落周围琼脂培养基着色。

绿脓杆菌广泛分布于土壤、水和空气中，在正常人与动物肠道和皮肤上亦有存在，也易从外伤、烧伤及尿道感染等发现，能引起人的烧伤感染和患囊性纤维化病人的肺部感染，具有多种致病因子而且有强侵袭力，因此认为本菌并非潜在致病菌而是完全致病菌。

水貂出血性肺炎发病急，死亡快，发病时往往来不及治疗，常用药物替米考星、阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，而且抗生素的滥用导致绿脓杆菌已产生极强的耐药性，因此需要有效的疫苗来预防，国内尚无商品化的疫苗来预防水貂出血性肺炎，国外有报道将细菌细胞壁提取物(JAMES E.PENNINGTON，1979)，和从菌体内提取的共同保护性抗原OEP(common protective antigen)(ABEC，1975；E.HONDA，1976)加类毒素成分弹性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制备过程复杂，成本高，不适合大量生产使用，而且免疫次数多，免疫期短，不适合临床应用，绿脓杆菌抗原型繁多，单一成分的细胞提取物往往很难达到很好的保护效果。

发明内容

本发明的目的是提供两种血清型铜绿假单胞菌强毒株以及由该两种强毒株制备的水貂出血性肺炎二价灭活疫苗，所述水貂出血性肺炎二价灭活疫苗预防水貂出血性肺炎，预防免疫效果佳，安全性好。

本发明提供的一种铜绿假单胞菌菌株DL15，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3811。

本发明提供的另一种铜绿假单胞菌菌株JL08，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3812。

用Reed-Muench法测定这两株毒株对小白鼠的半数致死量(LD50)，菌株DL15的LD50为250万CFU，菌株JL08的LD50为2000万CFU；菌株DL15对水貂的半数致死量(LD50)为100万CFU，菌株JL08的LD50为250万CFU。

本发明还提供由上述铜绿假单胞菌菌株制备的水貂出血性肺炎疫苗。

所述的水貂出血性肺炎疫苗，作为优选，为二价灭活疫苗。

本发明还提供一种水貂出血性肺炎二价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将铜绿假单胞菌菌株DL15和铜绿假单胞菌菌株JL08分别接种于PYG培养基培养，调整菌数为80-100亿CFU/mL按比例1-2∶1混合；

步骤2：灭活步骤1所得混合培养物；

步骤3：在步骤2所得培养物中添加防腐剂和佐剂，即得所述水貂出血性肺炎二价灭活疫苗。

作为优选，步骤1所述接种为按PYG培养基体积的3-4％接种菌株。

作为优选，步骤1所述培养为在37℃通气培养12-15h，控制绿脓杆菌的培养时间在15h以内，防止培养时间过长导致绿脓杆菌外毒素的产生，更好地保障疫苗安全性。

作为优选，步骤2所述灭活为用终浓度0.15％的甲醛灭活。更优选地，于37℃灭活24h，期间振摇2～3次。

作为优选，步骤3所述防腐剂为叠氮钠，优选终质量浓度为0.01％。

作为优选，步骤3所述佐剂为氢氧化铝溶液，优选氢氧化铝溶液体积为培养液的4％。

本发明所述铜绿假单胞菌菌株DL15和菌株JL08混合制成的水貂出血性肺炎二价灭活疫苗，一次可达到80％以上保护率，免疫期可达到五个月，可有效预防目前国内流行的水貂出血性肺炎，其制备工艺简单，适合商品化生产，具有良好的应用前景。

生物保藏信息：

菌株DL15：分类命名：铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa.于2010年5月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3811。

菌株JL08：分类命名：铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa.于2010年5月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3812。

附图说明

图1示为本发明所述铜绿假单胞菌菌株JL08、菌株DL15的显微镜下形态；

图2示本发明所述二价灭活疫苗免疫水貂的保护效率。

具体实施方式：

本发明公开了铜绿假单胞菌菌株JL08、菌株DL15及用所述两种菌株制备的水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

试验材料

PYG培养基成份：蛋白胨2％，葡萄糖1％，氯化钠0.5％，酵母粉0.3％，用去离子水配制，配完调pH值7.2-7.4，116℃30min。

绿脓杆菌分型用标准血清购自日本生研株式会社；细菌鉴定微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂公司；18～22g小白鼠购自吉林正业生物制品有限公司；甲醛，叠氮钠购自北京化学试剂厂。

实施例1：强力毒株的筛选

从山东、河北、大连、内蒙古、吉林等地的各个貂场患出血性肺炎的水貂肺中分离出67株绿脓杆菌，经生物学特性观察、生化试验鉴定为绿脓杆菌。采用日本生研株式会社的标准血清通过玻片凝集试验进行分型，确定分离株的血清型。

通过小鼠攻毒实验确定强毒力菌株，将菌株接种在PYG液体培养基中，37℃振摇12h，液体均匀混浊，呈黄绿色或白色，形成菌膜。做细菌计数后将菌数调整到20亿CFU/mL，将菌液分别稀释10倍、100倍，即菌量分别为2000万CFU/mL和200万CFU/mL，并用这两个浓度攻小鼠，每株菌每个浓度攻三只小鼠，每只小鼠攻0.2ml，一种血清型攻100倍稀释度死亡小鼠的菌株共一株，另一种血清型攻10倍稀释度死亡小鼠的菌株共一株。将这两株毒力较强的菌株作为备选疫苗株，分别命名为菌株JL08、菌株DL15。菌株JL08、菌株DL15均为革兰氏阴性杆菌，单个或成双存在，两端钝圆，不形成芽胞及荚膜。

用Reed-Muench法测定这两株毒力株对小白鼠的半数致死量(LD50)，分别为菌株DL15的LD50为250万CFU，菌株JL08的LD50为2000万CFU；对水貂的半数致死量(LD50)，菌株DL15的LD50为100万CFU，菌株JL08的LD50为250万CFU。

将上述两种强力菌株菌株JL08、菌株DL15进行生物保藏，其相关信息如下：

实施例2：本发明所述二价灭活疫苗的制备

(1)疫苗制备：将菌株DL15、菌株JL08划线接种于PYG琼脂培养基中于37℃培养18h，之后挑单菌落接种于5mlPYG肉汤培养基中37℃振摇12h作为一代种子液，再按3％比例接种于300mlPYG肉汤中37℃振摇12h作为二代种子液，将二代种子液按4％比例接种于6000mLPYG液体的10立升瓶里37℃通气12h，即为培养好的疫苗菌液，通过细菌平板计数对菌液进行计数，并通过计数结果将这两株的菌数均调整为80亿CFU/mL，之后将菌液按菌株DL15、菌株JL08比例为1∶1混合，混合后加甲醛灭活，按甲醛终浓度为0.15％灭活，37℃灭活24h，期间震荡2-3次。

(2)疫苗的灭活检验：将甲醛灭活后的菌液取200微升接于5mL液体培养基中，一次培养取三次样，每个样品接种于三个试管中观察五天进行灭活安全检验，五天后接种的液体培养基仍澄清无混浊则安全检验合格。

(3)成品疫苗制备：将灭活检验通过的菌液按菌液与铝胶4∶1的比例加入20％的氢氧化铝胶溶液，充分混匀后加入0.01％浓度的叠氮钠，混匀。

实施例3：本发明所述二价灭活疫苗的安全检验

将实施例2制备好的三批疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量注射健康水貂，后肢内侧肌肉接种。通过14d观察，接种水貂体温和食欲正常，接种局部无肿胀和炎症，未出现局部和全身反应；每批疫苗选择3只，剖杀后切开注射部位皮肤观察注射局部病理变化，水貂接种部位皮下无异常变化，后肢内侧肌肉接种部位肌肉组织正常，仅见到注射部位呈深褐色，有玉米粒大小，与周围红褐色肌肉相区别，注射部位未见炎症反应。60-70日龄幼貂继续观察至接种后30d，幼貂发育良好。说明疫苗对不同年龄的水貂具有较好的安全性。

实施例4：本发明所述二价灭活疫苗对水貂的效力试验测定

三批水貂出血性肺炎二价灭活疫苗分别免疫16～18g小白鼠20只，实验组和对照组各10只，0.2ml/只，免疫后21日连同对照组小白鼠20只分别用10LD₅₀的DL15、JL08强毒攻毒，观察7日，三批疫苗免疫组小白鼠均100％获得保护，对照组小白鼠均100％发病。

三批水貂出血性肺炎二价灭活疫苗分别免疫2-10月龄的健康水貂，每批疫苗肌肉接种水貂10只，1ml/只，免疫后21日连同对照组水貂10只分别用含10LD₅₀的DL15、JL08株强毒通过气管内滴入攻毒(每个组别5只)，观察7日，三批疫苗免疫组水貂均100％获得保护，对照组水貂均100％发病。

实施例5：本发明所述二价灭活疫苗对水貂的免疫保护期测定

采用三批二价灭活疫苗进行免疫保护期测定。分为实验组和对照组，实验组分成六组，每组30只水貂，用本发明所述三批二价灭活疫苗免疫，每批疫苗免疫10只水貂，每只后肢内侧肌肉注射1mL；对照组分为六组，每组10只水貂，后肢内侧肌肉注射生理盐水对照1mL，免疫后的第1～6个月每月用10倍量LD50的菌株JL08和菌株DL15分别攻毒(每批每株接种5只水貂)，分别测定疫苗对这两种毒株的保护力。疫苗对水貂的免疫保护性折线图如图2所示，实验结果表明，本发明所述二价灭活疫苗对水貂抗绿脓杆菌强毒菌株DL15的保护期为6个月，免疫保护率在80％以上，对水貂抗绿脓杆菌强毒菌株JL08的保护期为5个月，免疫保护率在80％以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种铜绿假单胞菌菌株DL15，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3811。

2.一种铜绿假单胞菌菌株JL08，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3812。

3.由权利要求1和权利要求2所述铜绿假单胞菌菌株制备的水貂出血性肺炎疫苗。

4.如权利要求3所述的水貂出血性肺炎疫苗，其特征在于，所述疫苗为二价灭活疫苗。

5.一种水貂出血性肺炎二价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将铜绿假单胞菌菌株DL15和铜绿假单胞菌菌株JL08分别接种于PYG培养基培养，调整菌数为80-100亿CFU/mL，按比例1-2∶1混合；

步骤2：灭活步骤1所得混合培养物；

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述接种为按PYG培养基体积的3％-4％接种菌株。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述培养为在37℃通气培养12-15h。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述灭活为用终浓度0.15％的甲醛灭活。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述防腐剂为叠氮钠。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述佐剂为氢氧化铝胶溶液。