CN105658310A

CN105658310A - 使用质量标签和次级离子质谱术的组织复用成像

Info

Publication number: CN105658310A
Application number: CN201480057396.1A
Authority: CN
Inventors: S·C·本多尔; G·P·诺兰; R·M·安杰洛
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2013-09-13
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2016-06-08
Also published as: AU2020200535A1; EP3570037B1; EP3570037A1; US20150080233A1; AU2022202132A1; WO2015038784A1; AU2014318698B2; EP3043891A1; AU2014318698A1; EP3043891B1; CA2924284A1; JP2019215349A; JP2023011554A; US10041949B2; EP3043891A4; JP7499566B2; CA2924284C; US20190162729A1; JP2016537643A; JP6546177B2

Abstract

本发明提供了一种生成包括细胞和细胞外结构的样品的高分辨率二维图像的方法。在某些实施方案中，该方法包括：用至少一个质量标签标记样品，从而产生标记样品；用次级离子质谱仪(SIMS)离子束扫描该样品以生成数据集，该数据集包括整个该样品区域中的质量标签的丰度的空间可寻址测量值；以及输出该数据集。在许多实施方案中，该数据集含有质量标签的标识和丰度。还提供一种用于进行该方法的系统。

Description

使用质量标签和次级离子质谱术的组织复用成像

交叉引用

本申请要求在2013年9月13日提交的美国临时专利申请序列号为61/877,733和2014年3月26日提交的美国临时专利申请序列号为61/970,803的优先权，其申请通过整体引用并入本文。

政府权利

本发明是根据由国家卫生研究院授予的合同号CA034233、AI057229、CA130826、EY018228、HHSN272200700038C、1K99GM104148-01在政府的支持下做出的。在本发明中政府具有某些的权利。

发明背景

在1942年首先在组织切片分析中采用抗体，以使在注入活菌的小鼠的器官活检中肺炎球菌抗原可视化。从那时起，免疫组织化学(IHC)已成为临床诊断和基础研究的支柱，其主要用于评价组织切片中一个或两个(罕见更多个)抗原的空间分布。尽管许多抗体的特异性高，但是大多数抗原的浓度不足以允许无信号放大的常规测定的检测。信号放大通常使用多价、结合一级抗体的Fc部分的酶联二级抗体来实现。在亮视场显微镜下，最常使用的报告酶是辣根过氧化物酶，通常用于氧化3,3'-二氨基联苯胺(DAB)，导致棕色沉淀积累。然而，使用二级抗体连同由于非线性染色使其与一级抗原浓度的相关性差限制可靠复用和定量。

同时检测多种抗原可易受额外的制约，该制约限制现有的基于IHC的分析用于人体临床试验和临床诊断中预测生物标记物发展的效用。已经报道使用多个酶联二级抗体进行4个抗原的比色法检测，但由于在样品制备和成像中所遇到的困难，在实践中该途径通常限制为两个。荧光标记可提供更高的信号噪声比，并更频繁地用于同时检测多个分子靶。实践中的限制包括需要在不同的宿主物种中生成的一级抗体和需要非重叠报告发射光谱。因此，该常规的IHC方法论不支持理解分子水平上组织微体系结构和表达之间的关系所需的复用、定量数据的稳健生成。

发明概述

提供了一种生成包括细胞和细胞外结构的样品的高分辨率二维图像的方法。在某些实施方案中，该方法包括：用至少一个质量标签标记样品，从而产生标记样品；用次级离子质谱仪(SIMS)离子束扫描该样品以生成数据集，该数据集包括整个该样品区域中的质量标签的丰度的空间可寻址测量值；以及输出该数据集。在许多实施方案中，该数据集含有质量标签的标识和丰度。

可能以多种不同的方式用至少一种质量标签来标记该样品。例如，质量标签由组织化学染料组成，或它可能偶联于捕获剂，例如抗体。在其它情况下，该样品可能在活着时被注入质量标签，且该质量标签可能通过代谢已经并入该样品的其它分子。

在某些实施方案中，标记步骤可能涉及将该样品与至少两种不同的特异性结合试剂接触，每一试剂包括不同的质量标签。在这些实施方案中，可扫描该样品以生成包括通过该样品的区域的每一质量标签的丰度的空间可寻址测量值的数据集。

在具体实施方案中，可使用特异性结合试剂完成标记，如含有用作质量标签的螯合原子的抗体，其制作方法已知。在一些实施方案中，质量标签的质量在12-238个原子质量单位的范围内，例如，21至238个原子质量单位，包括C、O、N和F加合物。在一些实施方案中，质量标签可能是具有原子数在21-90范围内的元素的原子，例如，原子数21-29、39-47、57-79或89的元素。在一些情况下，元素是镧系元素。

在一些情况下，该方法可能包括从数据集构建该样品的图像。在一些实施方案中，该图像的分辨率可高达1nm、5nm，例如，高达10nm、高达50nm、高达100nm、高达500nm或高达5000nm。

在一些实施方案中，该方法还包括通过分割图像限定在图像中单独细胞的边界(以及，任选地，单细胞中亚细胞特征或其它所关注的特征)，其方法已知。在这些实施方案中，该方法可还包括整合对应于图像中每一单独细胞或其亚细胞特征的数据，其可提供整体描述细胞的一组值(每个对应于单个质量标签)。该方法的实施方案可还包括基于所获取的每一细胞的整合数据将单独细胞分类(例如分为细胞类型或分为正常或不正常等)。在这些实施方案中，该方法可还包括显示组织样品的图像，其中该细胞是按其分类以颜色编码(即，第一类细胞以第一种颜色表示，第二类细胞以第二种颜色表示和第三类细胞以第三种颜色表示等)。在一些情况下，在该图像的任一像素中，该像素的颜色强度与所获得的通过扫描获得的所述像素的信号整合幅度相关联。

在一些实施方案中，将组织样品安装在导电基底上，且通过离子束对整个样品的光栅扫描(rastering)来完成扫描。可对合适的样品进行该方法，这些样品包括来自植物、动物和切片的包括微生物(例如，细菌、细胞)的样品。在具体实施方案中，该样品可以是组织切片，例如福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)切片，其厚度在例如2至20微米的范围内(例如3至12微米)。

还提供了分析样品的系统。该系统可包括：a)包括保持包含样品的基底的支架的次级离子质谱术(SIMS)系统，其中所述系统配置为(i)用SIMS离子束扫描所述样品，并生成包括与所述样品结合的特异性结合试剂的丰度的空间可寻址测量值的数据集以及(ii)输出所述数据集；以及b)包括处理所述数据集以产生所述样品的图像的图像分析模块的计算机。所述支架处在可移动的阶段，可被控制至少在x和y方向(其在该样品的平面内)移动(例如，步进式或连续移动)以便于扫描。可将图像分析模块编程为执行上述方法的许多步骤。例如，在一些实施方案中，图像分析模块可分割所述图像来确定图像中单独细胞的边界，和，任选地，单独细胞内亚细胞特征。在一些情况下，图像分析模块可整合所述图像中每一单独细胞或其亚细胞特征的数据，以及任选地基于所获取的每一细胞的整合数据将单独细胞分类。图像分析模块还可显示组织样品的图像，其中所述细胞按其分类以颜色编码。如上所述，在所述图像的任一像素中，像素的颜色强度与所得的通过SIMS系统获得的所述像素的信号幅度相关联。

附图简述

当结合附图阅读时，可最好地理解以下详细描述的某些方面。要强调的是，根据惯例，附图的各种特征并不是按比例的。相反，为了表达清楚，各种特征的尺寸都任意地扩大或缩小。附图包括以下各图：

图1：复用离子束成像(MIBI)的工作流程汇总。生物样本，如FFPE组织或细胞悬液，被固定在导电基底上，如铟锡氧化物涂层的玻璃或硅晶片。随后用与特有的过渡元素报告同位素偶联的抗体对样品进行染色，干燥以及在真空下装载以进行MIBI分析。用初级离子束(O-)对样品表面进行光栅扫描，其使原产于样品表面的抗体特异性报告同位素飞溅出作为次级离子。为每一像素获得元素的质谱。对划分每一细胞的核和胞质区室的所关注的区域进行整合、制表和分类。构建由伪彩色的分类特征和定量三色叠加组成的复合图像以汇总多维表达数据。

图2：使用质谱细胞计量术和MIBI分析由金属偶联抗体染色的PBMC。(A)由七种抗体染色的PBMC被固定在硅晶片上，并使用MIBI成像。所关注的单细胞区域使用CD45表面表达分割，并对于每一抗体而被整合。(B，C)所得数据的分层控制产生相对于质谱细胞计量术所发现的那些的七个细胞群体的比较值。(D)对各细胞群体的相对丰度的皮尔逊相关性(Pearsoncorrelation)表明两种方法之间具有强烈的一致性(r＝0.98,p<0.0001，双尾t检验)。

图3：使用MIBI的人乳腺肿瘤的10色成像。(A)一级抗体的亲和力不受金属偶联的影响。为了解金属偶联对抗体亲和力的影响，来自单一人乳腺肿瘤的连续切片的免疫过氧化物酶染色是用Ki67或ER-α的金属偶联或非修饰的一级抗体进行染色。当使用金属偶联的或非修饰的一级抗体时，比较强度的染色阳性核以相似数量存在。(B)MIBI数据的可视化表现。单通道离子数据可进行彩色映射并融合以构建伪-亮视场或伪-暗视场图像，分别类似于传统的免疫过氧化物酶或免疫荧光染色。(C)人乳腺肿瘤的10色成像。使用MIBI分析来自三个不同患者的FFPE组织切片。相对于每一样本的已知免疫表型，适当表达HER2、ER和PR。ER、PR和Ki67表明界限清楚的核阳性，而e-钙粘蛋白、肌动蛋白、HER2和角蛋白表达是适当的膜状的。

图4：肿瘤免疫表型的定量分析。(A)对于定量单细胞分析，离子图像被分割为划分核和胞质区室的ROI。(B)使用传统的双轴散点图的所得数据检验证明定量表达模式匹配已知每一各个肿瘤免疫表型。

图5使用分类和定量着色法的多维度MIBI数据的复合表现。(A)胞质特征的定量着色法。融合绿色编码的e-钙粘蛋白，红色编码的肌动蛋白和编码为蓝色的波形蛋白通道以生成蛋白表达和共区域化的定量表现。(B)核的分类着色法。ER/PR/Ki67阳性或ER/PR阳性核的亚群分别是伪黄色或浅绿色。(C)在复合图像中汇总多维度数据，说明定量和分类表达模式。

定义

除非上下文另有规定外，否则本文所使用的全部技术和科学用语具有与本发明所属领域的普通技术人员之一所普遍理解的相同的含义。虽然与本文所描述的那些相似或等效的任何方法和材料可在本发明的实践或测试中使用，但是描述优选方法和材料。

本文所提到的全部专利和出版物，包括全部在这些专利和出版物中公开的序列，通过引用明确并入。

数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则分别以5'至3'的方向从左向右书写核酸，以氨基至羧基方向从左向右书写氨基酸序列。

本文所提供的标题并不限制本发明的各个方面或实施方案。因此，下面即将定义的术语通过整体引用说明书而被更加充分地定义。

除非另有规定，否则本文所使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员之一所普遍理解的相同的含义。Singleton等,DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,2DED.,JohnWiley和Sons,纽约(1994),和Hale&Markham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,N.Y.(1991)为技术人员提供本文所使用的术语中的许多的一般含义。不过，为了清楚和易于引用，特定术语定义如下。

如本文所使用的，术语“标记”指的是将可检测部分附接到分析物上，以便通过评估标记的存在和/或丰度来确定分析物的存在和/或丰度。术语“标记”包括使用组织染料(在此情况下，质量标签可能是一部分或偶联到染料)标记和使用捕获剂标记，例如抗体或寡核苷酸探针，其已偶联到质量标签。也可以通过向样品提供加质量标签的化合物(例如IdU或BrdU)来标记该样品，所述加质量标签的化合物在固定之前被代谢且并入样品中。

如本文所使用的，术语“所关注的生物特征”指的是通过结合抗体来染色或表示的细胞的任何部分。例如，可使用染料来定义和检验整体组织(突出，例如，肌肉纤维或结缔组织)，细胞群体(比如，将不同血细胞分类)或单独细胞内的细胞器。染料可以是类别特异性的(DNA、蛋白质、脂类、碳水化合物)。所关注的示例性生物特征包括细胞壁、细胞核、细胞质、细胞膜、角蛋白、肌纤维、胶原、骨骼、蛋白质、核酸、脂肪等。所关注的生物特征还可用免疫组化的方法表示，例如使用捕获剂如偶联标记的抗体。在这些实施方案中，捕获剂结合样品中表位，例如蛋白表位。示例性表位包括但不限于癌胚抗原(用于识别腺癌)、角蛋白(用于识别癌，但还可在一些肉瘤中表达)、CD15和CD30(用于霍奇金病(Hodgkin'sdisease))、甲胎蛋白(用于卵巢囊肿瘤和肝细胞癌)、CD117(用于胃肠道间质瘤)、CD10(用于肾细胞癌和急性淋巴细胞性白血病)、前列腺特异性抗原(用于前列腺癌)、雌激素和孕激素(用于识别肿瘤)、CD20(用于识别B细胞淋巴瘤)和CD3(用于识别T细胞淋巴瘤)。

如本文所使用的，术语“复用”指的是使用一个以上标记进行生物活性材料的同时或连续检测和测量。

如本文所使用的，术语“特异性结合试剂”指的是标记试剂，其可特异性结合细胞内或细胞上特异性分子靶中的一个或多个位点(例如，特异性蛋白、磷脂、DNA分子或RNA分子)。例如，特异性结合试剂包括抗体、核酸和核酸适配体。如本文所使用的，“核酸适配体”是人工合成寡核苷酸或多肽分子，其特异性结合特异性靶分子。

如本文所使用的，术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中互换使用，且由在本领域内那些人很好地理解。那些术语指的是由特异性结合抗原的一个或多个多肽组成的蛋白。抗体的一种形式构成抗体的基础结构单元。该形式是四聚体，且包括两个同一抗体链对，每一对具有一条轻链和一条重链。在每一对中，轻链和重链的可变区共同负责结合到抗原，且恒定区负责抗体效应子功能。

公认的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链和α、γ(IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄)、δ、ε和μ重链或其它物种中的等效物。全长免疫球蛋白“轻链”(约为25kDa或约214个氨基酸)包含NH₂-端约110个氨基酸的可变区和COOH-端的κ或λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸)，同样包含可变区(约116个氨基酸)和前述重链恒定区之一，例如γ(约330个氨基酸)。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任一同型的抗体或免疫球蛋白，保持特异性结合抗原的抗体片段包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人化抗体、微型抗体、单链抗体和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。术语还包括Fab’、Fv、F(ab’)₂和或其它保持特异性结合抗原的抗体片段和单克隆抗体。抗体可以多种其它形式存在，包括，例如，Fv、Fab和(Fab’)₂以及双功能(即双特异性)杂种抗体(例如，Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17,105(1987))和单链(例如，Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)和Bird等,Science,242,423-426(1988),其通过引用并入本文)。(见，一般，Hood等,“Immunology”,Benjamin,N.Y.,第二版，(1984),和Hunkapiller和Hood,Nature,323,15-16(1986),)。

术语“特异性结合”指的是结合试剂优先结合到具体分析物的能力，该分析物存在于不同分析物的均质混合物中。在某些实施方案中，特异性结合相互作用将区分样品中所需的和不需的分析物，在一些实施方案中，超过约10至100倍或更多(例如，超过约1000-或10,000-倍)。

在某些实施方案中，当结合试剂和分析物在捕获剂/分析物复合物中特异性结合时，它们之间的亲和力的特征为K_D(解离常数)低于10^-6M、低于10^-7M、低于10^-8M、低于10^-9M、低于10^-9M、低于10^-11M或低于约10^-12M或更低。

如本文所使用的，术语“加质量标签的”指的是用单一种类的稳定同位素加标签的分子，该同位素以其特有的质量或质量分布或相同的组合来识别，其中稳定同位素的组合提供识别符。稳定同位素的组合允许通道压缩和/或条形编码。以其质量识别的元素实例包括贵金属和镧系元素，但可采用其它元素。元素可作为一个或多个同位素存在，且该术语还包括带正电和带负电金属的同位素。术语“加质量标签的”和“加元素标签的”可在本文互换使用。

如本文所使用的，术语“质量标签”意为任一元素的任一同位素，包括过渡金属、后过渡金属、卤化物、贵金属或镧系元素，这可由其质量识别，区别于其它质量标签，且已经用于对生物活性材料或分析物加标签。质量标签具有区别于在所关注的粒子中和分析样品中存在的原子质量的分子质量。术语“单一同位素的”意为含有单一类型金属同位素的标签(虽然任一标签可含有相同类型的多个金属原子)。

如本文所使用的，术语“镧系元素”意为具有原子数为58至71的任一元素。镧系元素还称为“稀土金属”。

如本文所使用的，术语“贵金属”意为数个金属元素的任一个，其电化电位比标准氢电极的电位更正很多，因此，为抗氧化的元素。实例包括钯、银、铱、铂和金。

如本文所使用的，术语“元素分析”指的是一种评估样品的元素的存在和/或丰度的方法。

“多个(plurality)”含有至少2个成员。在某些情况下，多个可具有至少10、至少100、至少100、至少10,000、至少100,000、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸或至少10⁹或更多的成员。

“包含细胞的样品”是含有完整，例如固定的，细胞的生物来源的样品。在一些实施方案中，该样品可大体上是平面的。这些样品的实例包括组织切片，通过将分离的细胞沉积到平面表面而制得的样品和通过使一片细胞在平面表面生长而制得的样品。

如本文所使用的，术语“扫描”指的是辐射源(例如，激光)对表面进行斜向(zig-zagged)或光栅扫描直至大体上的二维区域可被能量源所辐照的方法。

如本文所使用的，术语“空间可寻址测量值”指的是一组值，其中每一个值与表面上特定位置相关联。空间可寻址测量可被映射到样品的一个位置，并可用于重新构建样品的图像。

如本文所使用的，术语“在整个区域中”在整个样品区域中的质量标签的丰度的空间可寻址测量值的上下文中，指的是测量在样品表面上或下(例如，在接近样品表面的细胞上或里面)的质量标签。所分析的区域的深度依赖于离子束的能量发生改变。

其它的术语定义可出现在整个说明书中。

发明详述

为了进一步说明本发明，给出以下具体实施例，需理解提供它们是为了说明本发明，且不应该以任何方式被解释为对其发明范围的限制。

本文所描述的方法采用质量标签，即，可由其质量进行识别的稳定同位素，用于对含有细胞和细胞外结构的生物样品进行标记，可使用次级离子质谱仪(SIMS)(例如，静态或动态SIMS)用能够定量元素组成和空间配准的仪器进行测量。

质量标签可以是染料的一部分或偶联到染料，或偶联到捕获剂如抗体。在某些实施方案中，质量标签可包括由重复单位的金属螯合剂组成的螯合聚合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，其与单一非生物同位素的一个或多个原子螯合。在一些实施方案中，质量标签在大小上可大体一致，因此特异性结合试剂的丰度将与标签原子的数量成正比。然后将所标记的特异性结合试剂与生物样品相接触、清洗和用能够定量存在于样品中的标签原子的数量的空间配准的SIMS仪器进行测量。分析物的丰度可从每一检测试剂的标签原子的摩尔比率推断出来。

上述方法可被复用是由于使用多种特异性结合试剂进行试验(例如，超过2种特异性结合试剂、高达5种特异性结合试剂、高达10种特异性结合试剂、高达20种特异性结合试剂、高达50种特异性结合试剂或高达100种特异性结合试剂或更多)。每一特异性结合试剂可被连接到不同的质量标签，其中通过次级离子质谱术所述质量标签相互区别。或者或此外，复用可涉及为所关注的特定特征使用染料。

自然界中很多元素以多个稳定同位素存在。例如，¹⁵³Eu占地球上52％铕，且¹⁵¹Eu组成剩余48％中的大多数，而铕的不稳定、放射性同位素构成不足1％。许多稳定同位素以粉末或盐制剂在市场上销售，以不同程度的纯度，包括99％(2N)、99.9％(3N)、99.99％(4N)、99.999％(5N)和99.9999％(6N)纯度。在一些实施方案中，金属螯合剂标签可使用浓缩同位素进合成。例如，质量点可使用151Eu合成(例如，氧化151铕，纯度为99.999％，美国元素)。在美国专利公布2012/0178183Al中描述质量点，其通过引用并入本文。使用浓缩同位素使同位素标签的特有物种的数量最大化，该同位素标签可在复用分析中同时检测。此外，所关注的空间不同特征可使用相同金属标签标记以进一步复用该分析。可基于一个或多个其它金属标签的共定位来区分这些空间不同特征。例如，使用相同金属标签的Her2膜染料和ER核染料可区别于使用不同金属标签的基于dsDNA或组蛋白H3染料，其将与ER染料共定位。

质量标签可以是染料的一部分或与染料偶联。在这些实施方案中，染料可以是鬼笔环肽、钆双胺、吖啶橙、俾斯麦棕、barmine、考马斯亮蓝、brystal紫、DAPI、苏木素、伊红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、hoechst染料、碘、孔雀石绿、甲基绿、亚甲基蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇(正式名称：四氧化锇)、若丹明、番红、磷钨酸、四氧化锇、四氧化钌、钼酸铵、碘化镉、碳酰肼、氯化铁、乌洛托品(hexamine)、三氯化铟、硝酸镧、乙酸铅、柠檬酸铅、铅(II)硝酸盐、高碘酸、磷钼酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银、氯金酸钠、硝酸铊、氨基硫脲、乙酸双氧铀、硝酸双氧铀、硫酸氧钒或其任一衍生物。染料可以对所关注的任一特征具有特异性，如蛋白或蛋白类、磷脂、DNA(例如，dsDNA、ssDNA)、RNA、细胞器(例如，细胞膜、线粒体、内质网、高尔基体、核膜等)、细胞区室(例如，细胞溶质、核部分等)。染料可增强细胞内或细胞外结构的对比或成像。

在某些实施方案中，该染料可适于施用于活体受试者。通过任一合适的手段将染料施用于受试者，如摄入、注射(例如，进入血液循环)或局部施用(例如，手术期间)。此染料对组织、生物结构(例如血管、病变)或所关注的细胞类型具有特异性。染料可并入细胞过程的受试者的细胞，如葡萄糖摄取。这些染料的实例包括但不限于钆、顺铂、卤化碳水化合物(例如，含氟、氯、溴、碘的碳水化合物)等。可将在成像技术(例如，如MRI、PET扫描、CT扫描等)中使用的其它可注射染料偶联到质量标签(如果其不能与质量标签内在相关)，并将其施用到活体受试者。施用后可从受试者中获得样品，用于本文所描述的方法中。

在其它实施方案中，以及如将在下面更为详细描述的，质量标签可偶联到捕获剂，例如，识别样品上表位的抗体。在复用测定中，可使用捕获剂和染料的组合物。

在本方法中所使用的质量标签可以是在分析的样品中不常见的、任一稳定同位素。这些可包括，但不限于，过渡金属(例如，Rh、Ir、Cd、Au)、后过渡金属(例如，Al、Ga、In、Tl)、非金属(例如，Te、Bi)、碱金属、卤素和锕系元素的高分子量的成员，虽然可在一些情况下使用其它元素。质量标签的质量可为21至238原子质量单位的范围。在某些实施方案中，可使用镧系元素。周期表的镧系元素包括15个元素，其中14个具有稳定同位素(La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu)。由于镧系元素在生物圈中罕见，因此其能易于使用。在1和238AMU之间有元素的大于100个非生物稳定同位素。在一些实施方案中，加标签的同位素可包括可为本文所描述的应用形成稳定金属螯合剂标签的非镧系元素。在基于SIMS的测量形态下，不同于基于ICP-MS的一些形态，报告元素还包括较低MW，在生物基底中不常见的过渡元素(例如，Al、W和Hg)。

在某些实施方案中适合在本方法中使用的元素包括但不限于镧系元素和贵金属。在某些情况下，元素标签的原子数可为21-90。在具体实施方案中，元素标签可含有过渡金属，即，具有以下原子数的元素，21-29、39-47、57-79和89。过渡元素包括镧系元素和贵金属。见，如Cotton和Wilkinson,1972,第528-530页。本文所采用的元素标签是非生物的，因为它们是人造的，并不存在于典型的生物样品中，例如，细胞，除非它们为外源提供。

在具体实施方案中，连接到结合试剂的质量标签可为以下公式：R-MT，其中R是活性基团，其可与特异性结合试剂上的活性基团形成连接，且MT是质量标签。化合物还可含有R和MT之间的间隔物。在具体实施方案中，R可以是，例如，马来酰亚胺或具有巯基活性的含卤素的基团，具有胺活性的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)-碳酸盐或具有羟基活性的N,N-二异丙基-2-氰乙基亚磷酰胺。在特异性结合试剂上这些基团与其它基团反应，例如，半胱氨酸或抗体的其它残基或寡核苷酸的巯基。在许多实施方案中，活性基团和质量标签间的连接为非可选择性地裂解，例如，为非光裂解。

在具体实施方案中，MT可能是例如10-500个单位的多聚物，其中多聚物的每一单位含有配位过渡金属。合适的活性基团和含有配位基团的多聚物(包括基于DOTA和DTPA的多聚螯合剂)在各种出版物中被描述，包括：Manabe等(BiochemicaetBiophysicaActa883:460-467(1986))描述使用环酐法将高达105个DTPA残基附接到多聚-L-赖氨酸支柱上，以及使用2-二硫吡啶接头将聚赖氨酸-聚-DTPA聚螯合剂附接到单克隆抗体(抗-HLAIgG₁)以实现每位点特异性高分子高达约42.5个螯合剂(DTPA残基)；Torchilin(美国专利6,203,775)描述标记包括抗体活性、通用公式的镧系元素螯合化合物的抗体的通用方法；Sieving(U.S.5,364,614)，含有连接到蛋白的聚赖氨酸支柱的基于DOTA的聚螯合剂的摘要。这些部分的进一步描述见，例如：US20080003616(多聚物支柱元素标签)，US6,203,775(为蛋白标记的螯合多聚物)，US7,267,994(元素编码的亲和力标签)，US6,274,713(聚螯合剂)和5,364,613(含有大环螯合剂部分的聚螯合剂)以及许多其它的。这些出版物通过引用并入用于其通用或活性基团和含有配位基团的多聚物的特定学说，以及制得这些化合物的方法。除了以上引用的参考文献中所描述的方法，用于制得基于多聚物的元素标签的方法还在Zhang等(AgnewChem.Int.Ed.Engl.200746:6111-6114)中详细描述。此外，可使用任何能结合到金属标签的螯合剂。这些包括EDTA、EGTA和血红素。这些螯合剂能够结合到金属标签的+1、+2、+3、+4离子。本领域已知将这些标签连接到结合试剂的方法。例如，由DVSSciences所生产的MAXPAR试剂是DTPA的马来酰亚胺官能化多聚物，其平均长度为30个单体。使用MAXPAR方案，可能将典型的IgG抗体与6或7个多聚体偶联，从而每个抗体平均偶联200个加标签的同位素原子。

当使用基于质量的元素分析时，在21和238原子质量单位(amu)之间可获得超过100个非生物元素同位素质量，其可以同时测量，实际上无重叠。由于这些稀土金属在生物分离物中通常不存在，因此检测的唯一限制为它们所偶联的试剂的灵敏度和进行该测量的仪器的灵敏度。

在具体实施方案中，在复用测定中可采用以上所描述的方法，在此测定中用多个不同质量标签的结合试剂(例如，很多不同抗体)对异质性细胞群体进行标记。由于超过80个天然存在元素具有超过200个稳定同位素，因此可使用至少5种、至少10种、至少20种、至少30、至少50种或至少100种、高达150种或更多种不同的结合试剂(其结合到，例如，不同细胞表面标记物)对细胞群体进标记，每一以不同的质量加标签。标记细胞群体后，使用上述方法对其进行分析。

如上所述，本方法中所使用的特异性结合试剂可以是任一类型的分子(例如，抗体、肽-MHC四聚体、核酸(例如，ssRNA或ssDNA)、适配体、细胞表面受体的特异性配体等)，其能够特异性结合到细胞内或细胞上的结合配偶体。结合配偶体可以是蛋白、核酸或另一类型的细胞高分子(例如，碳水化合物)。结合配偶体可以在细胞表面，或其可以是细胞外的或细胞内的(例如，与细胞核或另一细胞器，或细胞质有关)。

在某些方面，特异性结合试剂可以是偶联于核酸的MT，该核酸与特定性RNA和/或DNA序列杂交。MT所偶联的核酸可以用于与任一合适的技术组合来检测靶(例如，RNA、DNA、蛋白或蛋白复合物)，如标准原位杂交，原位杂交应用分支DNA探针(例如，如Affymetrix所提供的)、邻位连接(PLA)和滚环扩增(例如，如由Olinkbioscience所提供的)等。原位杂交技术，包括采用分支DNA探针的那些由MonyaBaker等(NatureMethods9,787-790(2012))所描述。简而言之，使用分支DNA探针的原位杂交利用一系列的ssDNA探针，其中第一组DNA探针与靶DNA或RNA序列特异性杂交，且第二组DNA探针可与第一组DNA探针的一部分杂交，从而扩大DNA探针的数量，该探针可(间接)结合到单一DNA或RNA分子。第三组可以同样的方式结合到第二组DNA探针，以此类推。一组或多组DNA探针可偶联到金属标签来标记靶DNA或RNA分子。由描述邻位连接技术，包括检测单一RNA分子、DNA分子和蛋白复合物由Weibrecht等(NatureMethods9,787-790(2012))描述，其通过引用并入本文。滚环扩增由Larsson等(Nat.Methods1,227-232(2004))描述，其通过引用并入本文。简而言之，在滚环扩增前的邻近连接中，核酸杂交到两个近端RNA或DNA链，其后核酸被连接且然后扩增，导致与核酸互补的序列的许多拷贝。因此，互补序列比原始的近端RNA或DNA链存在的拷贝数更高，并更易于检测(例如，通过与互补序列杂交的MT偶联核酸)。每一近端RNA或DNA链偶联到不同抗体(例如，其中每一不同抗体对蛋白复合物的不同蛋白具有特异性)。

上述技术的任一种可用于分辨单一分子靶(例如，单个RNA分子、DNA分子、蛋白或蛋白复合物)。由于单一分子靶作为离散puncti是可分辨的，金属同位素的组合物可用于唯一地标记分子靶。在一个实施例中，特异性结合试剂可以是核酸，其可偶联到金属同位素的特有组合物。在另一个实施例中，MT偶联核酸的组合物(例如，每一偶联到不同的质量标签)可共同用于用金属同位素的特有组合物来标记分子靶。同样地，很多质量标签可以组合用于标记2ⁿ不同分子靶，前提是分子靶可在空间上区分的。本文所描述的方法可用于测定含有细胞的生物来源的样品，其中需要确定某些成分(例如，蛋白、核酸或其它分子)的量。在一些实施方案中，可使用SIMS仪器(例如，Cameca的NanoSIMS、PhysicalElectronics的NanoTOF)来完成该分析。次级离子质谱术是表面灵敏技术，其允许样品表面的化学组合物的检测和定位。该仪器可使用精确聚焦、脉冲初级离子束来从样品表面解吸和电离分子种类。所得次级粒子被转移到质谱仪，其中使用标准质谱分析器(例如，飞行时间、扇形磁场、四极、离子阱或其组合)来对它们进行质量分析和定量。显示从样品表面收集到的质谱生成化学图像。在所得的每一个像素基本上代表一个质谱。值得注意的是，该仪器将只需要“单位分辨率”-辨别由1AMU或更多分离的质量报告物的能力。NanoTOF使用同步于TOF检测器的低强度脉冲源。Cameca使用DC束(即，连续和非脉冲)。

当高速脉冲或连续离子束(初级离子)在高真空下被照射到固体样品表面上时，该表面的成分通过解吸-电离现象释放入真空。生成的带正电荷或负电荷的离子(次级离子)通过电场被集中在一个方向，并在远程位置进行检测。当脉冲初级离子被照射到固体表面上时，根据样品表面的组成生成具有不同质量的次级离子。在次级离子中，在TOF管内具有较小质量的离子会比具有较大质量的离子飞行更快。因此，测量次级离子生成和检测之间的时间(飞行时间)可进行所生成的次级离子的质量分析。当初级离子被照射时，只有在固体样品的最外层表面所生成的次级离子释放入真空，因此，能获取关于样品最外层表面(例如，深度小于1nm、小于2nm、小于5nm，小于10nm、小于20nm、小于50nm、小于100nm或大于100nm)的信息。在TOF-SIMS中，被照射的初级离子的量明显小，因此当维持其化学结构时有机化合物被电离，且可从质谱中识别有机化合物的结构。对次级离子质谱术的原理的描述在如Belu等(Biomaterials，200324:3635-53),Pól等(HistochemCellBiol，2010134:423-43)和Klitzing(MethodsMolBiol，2013950:483-501)。

如上所述，获得原始数据后，数据用于构建样品的图像。可分析该图像以识别在所述图像中单独细胞的边界和/或在单独细胞中的亚细胞特征。计算机实施的分割细胞图像的方法为本领域已知，且从相对简单的阈值处理技术(见，如Korde等，AnalQuantCytolHistol，200931,83-89和Tuominen等BreastCancerRes201012,R56)到更为复杂的方法，如，比如最大细胞大小所定义的自适应注意力窗口(adaptiveattentionwindow)(Ko等，JDigitImaging200922,259-274)或梯度流示踪(Li等JMicrosc2008231,47-58)。一些合适的图像分割方法在Ko等(JDigitImaging，200922:259-74)和Ong(ComputBiolMed，199626:269-79)进行综述。然后，对应于已由分割定义的每一单独细胞，或其亚细胞特征的数据被整合以为每一细胞提供代表每一细胞边界内每一质量标签的量的值。本方法的该步骤导致含有(对于每一细胞)与该细胞相关的每一质量标签的量的测量的数据集。在下面所示的表内解释该概念。

该数据允许将样品中的细胞进行分类。例如，在上表所示的实施例中，三个细胞可能是三种不同类型的细胞，由于它们具有不同的质量标签分布，其中分布识别类别。在具体情况下，该信息可用于提供伪彩色图像，其中每一细胞是按其分类以颜色编码。同样地，该方法可包括显示样品的图像，其中所述细胞是按其分类以颜色编码。在具体实施方案中，在图像的任一像素中，像素的颜色强度与所获得的在初始扫描中所获得的所述像素的信号幅度相关联。在这些实施方案中，所得假颜色图像可显示颜色编码细胞，其中细胞的任一单一像素中颜色强度跟与样品中对应区域有关联的特异性结合试剂的量相关。

由于初始扫描仅可导致样品的部分去除(例如，在纳米尺度上的深度)，所有可再次扫描样品以生成额外的数据集，该数据集具有穿过初始扫描的区域的一个或多个质量标签的丰度的测量值。例如，初始扫描可用于识别样品中所关注的一个或多个区域。这种扫描可能具有较低的分辨率，且因此可能是更快速的，每次在更大的区域测量质量标签丰度，和/或可导致去除较小的样品。再扫描可能是对所关注的一个或多个区域的金属标签的丰度的更高分辨率扫描。或者或此外，穿过相同区域的多个扫描可用于产生3维图像(例如，从单个二维数据集编辑)。在某些方面，在将所关注的区域从样品分离后，可进一步分析由初始扫描所识别的所关注的区域，例如，如通过激光捕获纤维解剖。

本文所描述的方法可包括作为使穿过样品和/或时间点获得的数据标准化的手段(例如，使定量的交叉样品比较)的规范化。在某些方面，使用样品中存在的标准化金属颗粒或悬浮液可进行电离和/或总测量效率的规范化。标准化的金属颗粒或悬浮液可具有已知量的一个或多个质量标签，且一个或多个质量标签的所得测量可用于规范样品中其它质量标签的测量。例如，规范化珠子可用于校准系统或将本发明方法所获得的数据规范化。使用珠子标准对质谱细胞计量术数据的规范化被描述于RachelFink等(CytometryA.83(5):483-94(2013))，其通过引用并入本文，且适用于还利用飞行时间质谱术的本发明方法。

或者或此外，可根据上述染料的任一个规范化电离和/或测量效率。例如，可将用于对ER染色的质量标签的测量规范化为给定区域内、细胞内或穿过样品中多个细胞的那个质量标签的总强度。

规范化还可用于解释例如组织固定程度、蛋白保留和特异性结合试剂的染色效率的影响。偶联到结合在广泛范围的细胞类型内稳定表达的分子靶的、充分表征的抗体的质量标签可用于规范化。这些抗体包括，但不限于，管家蛋白(如GAPDH、HSP90、β-肌动蛋白和β-微管蛋白)的抗体、dsDNA和组蛋白H3。

如上所讨论的，本发明的方法考虑到复用途径。可测量多个质量标签来确定多个分子靶(例如，特异性蛋白、DNA、RNA等)的丰度以及样品中所关注的生物特征(例如，细胞或组织结构、细胞器、细胞片段等)。此外，根据上述任一个实施方案，可规范化质量标签测量。大量非连续质量标签使在单一区域内超过2个、5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、100个或更多不同质量标签复用。多个质量标签(例如，偶联到针对相同分子靶的互补性表位的抗体)可用于重复，从而增加特异性分子靶测量中的可信度。通过使用同一质量标签来标记两个或多个不同空间的所关注的靶或特征来实现进一步复用。或者或此外，金属标签的特有组合物可用于识别不同空间的所关注的靶或特征。

系统

还提供了分析样品的系统。该系统可包括：a)包括保持包含样品的基底的支架的次级离子质谱术(SIMS)系统，其中所述系统配置为(i)用初级离子束(例如一束氧、铯、金、氩、铋、氙、C60、SF₆或镓离子或其任一混合物，例如，氧和氙离子的混合物)扫描样品，并生成包括与所述样品结合的特异性结合试剂的质量特异性丰度测量的数据集以及(ii)输出所述数据集；以及b)包括处理数据集以产生样品的图像的图像分析模块的计算机。支架处在可移动的阶段，可被控制在至少x和y方向(其在该样品的平面内)移动(例如，步进式或连续移动)以便于扫描。可将图像分析模块编程为执行上述方法的许多步骤。例如，在一些实施方案中，图像分析模块可分割图像来确定图像中单独细胞的边界，和任选地，单独细胞内亚细胞特征。在一些情况下，图像分析模块可整合图像中每一单独细胞或其亚细胞特征的数据，以及任选地基于所获得的每一细胞的整合数据将单独细胞分类。图像分析模块还可显示组织样品的图像，其中所述细胞和/或其亚细胞特征是按其分类以颜色编码。如上所述，在图像的任一像素中，像素的颜色强度与所获得的通过SIMS系统获得的所述像素的信号幅度相关联。在具体实施方案中，该系统可包括连接到四极的DC离子源(即动力源)，然后到离子脉冲发生器，然后到飞行时间(TOF)管。SIMS系统可以是动态或静态的。NanoSIMS被认为是动态的，因为它使用更高功率的DC初级离子源，而NanoTOF被认为是静态的，因为它使用更低功率的脉冲源。

图像分析模块可将从多个扫描区域获得的数据集组合成单一数据集，其中多个扫描区域的每一个与另一个互相偏移。图像分析模块可调整相邻扫描区域间的偏移，以便增加相邻扫描区域的边缘附近相似质量标签强度的像素的重叠。

图像分析模块可将数据集转变为一个或多个假颜色图像(例如伪彩色、伪亮视野、伪免疫荧光)。图像可为任一合适的图像文件格式(例如JPEG、Exif、TIFF、GIF、PNG、由如ImageJ图像分析软件可读的格式等)。在某些实施方案中，图像分析模块可通过将一个或质量标签的丰度(例如所测量的强度)转变为图像中单个像素上一个或多个假颜色的强度来产生图像。质量标签的强度和对应的假颜色的强度之间的关系可以是线性的或非线性的(例如，对数的、指数的等)。

在某些实施方案中，该系统被配置为生成包括与样品区域结合的多个质量标签的丰度的空间可寻址测量值的复用数据集。图像分析模块可将多个质量标签测量转变为产生多个假颜色图像。图像分析模块可重叠多个假颜色图像(例如，在每一像素上叠加假颜色)来获取复用假颜色图像。可将多个质量标签测量值(例如，不加权或加权)转变为单一假颜色，例如，以便代表所关注的生物特征，其特征为结合与多个质量标签中每一个有关联的特异性结合试剂。基于用户的手动输入，假颜色可能被分配给质量标签或质量标签的组合。或者或此外，可使用非监督途径来确定质量标签基团由单一假颜色所代表。非监督途径可识别差异最大化而组数最小化的质量标签组(例如，如通过主成分分析(PCA)，将共定位和/或邻近的质量标签分组(例如，通过任一合适的聚类算法)，或者可采用任一其它合适的方法来将质量标签分组使其由单一假颜色所代表。在某些方面，图像可包括只涉及与所关注的特征有关的质量标签的强度的假颜色，如在核区室的质量标签(例如，与dsDNA特异性质量标签共定位)。

图像分析模块可进一步配置为调整(例如，规范化)强度和/或质量标签强度或假颜色的对比来进行卷积运算(如质量标签强度或假颜色的模糊或锐化)，或进行其它合适的运算来增强图像。在某些方面，图像分析模块可编辑由多个2D扫描生成的数据集以产生细胞3D模型的图像。图像分析模块可进行任一以上算法来对准由连续地2D扫描所获得的像素和/或使由连续2D扫描所获得的像素的质量标签强度或假颜色模糊或平滑以产生3D模型。

图像分析方法可由计算机实施。在某些实施方案中，可将通用计算机配置为本文所公开的方法和程序的功能设置。这种计算机的硬件构造为本领域的技术人员所熟知的，且包括硬件组件，该硬件组件包括一个或多个处理器(CPU)、随机存储存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、内部或外部数据存储介质(例如，硬件驱动器)。计算机系统还可包括一个或多个图形板用于处理和输出图形信息以显示手段。以上组件通过计算机内部的总线合适的互联。计算机可还包括与通用外部组件(如监视器、键盘、鼠标、网络等)通信的合适的界面。在一些实施方案中，计算机能够平行处理或被配置为平行或分布式计算的网络的一部分，来提高本发明方法和程序的处理能力。在一些实施方案中，从存储介质所读出的程序代码可被写入计算机所插入的扩展板，或与计算机相连的扩展单位中所提供的存储器，以及扩展板或扩展单位所提供的CPU等实际上可根据程序代码的指令进行部分或全部算法，以便完成以下所述的功能。在其它实施方案中，使用云计算系统来进行该方法。在这些实施方案中，数据文件和编程可被导出到云计算机，其可运行程序并将输出返回给用户。

在某些实施方案中，该系统包括计算机，其包括：a)中央处理单位；b)主非易失性存储驱动器，其可包括一个或多个硬盘驱动器，用来存储软件和数据，其中存储驱动器由磁盘控制器控制；c)系统存储器，例如，高速随机存取存储器(RAM)，用于存储系统控制程序、数据和应用程序，包括从非易失性存储驱动器加载的程序和数据；d)系统存储器还包括只读存储器(ROM)；用户界面，包括一个或多个输入和输入装置，如鼠标、键盘和显示器；e)用于连接到任一有线或无线通讯网络的可选的网络接口卡，例如，打印机；以及f)用于互连该系统的前述元件的内部总线。

计算机系统的存储器可以是能够存储信息供处理器检索的任一装置，且可包括磁性或光学装置，或固态存储器装置(如易失性和非易失性RAM)。存储器或存储单位可具有不只一个相同或不同类型的物理存储器装置(例如，存储器可具有多个存储装置如多个驱动器、卡或多个固态存储器装置或其组合)。关于计算机可读介质，“永久性存储器”指的是永久的存储器。通过终止对计算机或处理器的电供应不能清除永久性存储器。计算机硬盘驱动器ROM(即，ROM不作为虚拟存储器使用)、CD-ROM、软盘和DVD均是永久性存储器的所有实例。随机存取存储器(RAM)是非永久性(即，易失性)存储器的实例。在永久性存储器内的文件可编辑且可重写。

计算机操作主要由操作系统控制，其由中央处理单位执行。操作系统可存储在系统存储器中。在一些实施方案中，操作系统可包括文件系统。除了操作系统，系统存储器的一个可能的实施包括实施下述方法的多个程序文件和数据文件。在某些情况下，编程可含有程序，其中程序可包括各种模块，和允许用户在用户界面以手动选择或改变输入或编程所使用的参数的用户界面模块。数据文件可包括各种对编程的输入。

在某些实施方案中，依照本文所描述的方法的操作指南可以“编程”的形式被编码到计算机可读的介质上，其中本文所使用的术语“计算机可读介质”指的是参与为计算机提供操作指南和/或数据以执行和/或处理的任一存储或传输介质。存储介质的实例包括软盘、硬盘、光盘、磁光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光盘、固态盘和网络附加存储(NAS)，无论这中装置是在计算机的内部还是外部。含有信息的文件可以“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”意为记录信息以致在稍晚的日期可由计算机获取和检索。

可使用编程执行本文所描述的计算机实施方法，其可以一种或多种的任一数量的计算机编程语言书写。这些语言包括，例如，Java(SunMicrosystems,Inc.,SantaClara,CA)、VisualBasic(MicrosoftCorp.,Redmond,WA)和C++(AT&TCorp.,Bedminster,NJ)以及许多其它中的任一个。

效用

上述方法可用于分析来自受试者的细胞以确定，例如，是否细胞是正常的或以确定是否细胞对处理有反应。在一个实施方案中，可采用该方法来确定癌细胞中的发育异常的程度。在这些实施方案中，细胞可能来自来源于多细胞生物体或微生物的样品。生物样品可以从个体分离，例如，从软组织或从体液，或从体外生长的细胞培养中分离。生物样品可从软组织制得，如大脑、肾上腺、皮肤、肺、脾、肾、肝、脾、淋巴结、骨髓、膀胱、胃、小肠、大肠、肌肉等。体液包括血液、血浆、唾液、粘液、痰、脑脊髓液、胸腔积液、眼泪、乳糜管液(lactalductfluid)、淋巴液、痰、脑脊液、关节液、尿液、羊水、精液等。生物样品还包括在体外培养生长的细胞。细胞可以是组织活检、刮取物或灌洗物的细胞或细胞。在具体实施方案中，细胞可以是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品的细胞。在具体情况下，该方法用于在FFPE样品中区分不同类型的癌细胞。

上述方法使用一组抗体在检验组织切片中发现具体的效用，在下表中提供其实例。

在一些实施方案中，该方法可涉及如上所述获得图像(已从远程位置转发的其电子形式)并可由医生或其它医学专业人员分析以确定是否患者具有异常细胞(例如，癌细胞)或存在哪种类型的异常细胞。该图像可用作确定受试者是否患有疾病或病状例如癌的诊断。在某些实施方案中，该方法可用于确定癌症的阶段，例如，以识别转移的细胞或以监测患者对治疗的反应。

在任一实施方案中，数据被转发到“远程位置”，其中“远程位置”意为不同于图像被检验的位置的位置。例如，远程位置可以是相同城市的另一位置(例如，办公室、实验室等)、不同城市的另一位置、不同州的另一位置、不同国家的另一位置等。同样地，当表示一个物品与另一个物品是“远程的”，这意为两个物品在相同的房间但是分离的，或至少在不同的房间或不同的建筑物，以及可以至少相隔1英里、10英里或至少100英里。“通信”信息引用将代表该信息的数据以电信号传送通过合适的通信信道(例如，专用或公共网络)。“转发”物品指的是使那个物品从一个位置到下一个位置的任一手段，无论是通过物理传输那个物品还是其它(在可能的情况下)并包括，至少在数据的情况下，物理传输携带数据或通信数据的介质。通信介质的实例包括无线电或红外传送通道以及连接到另一计算机或网络装置的网络，以及互联网或包括电子邮件传送和记录在网站的信息等。在某些实施方案中，图像可由MD或其它合格的医学专业人员进行分析，且基于图像分析结果的报告被转发给患者(样品从其获得)。

在一些情况下，该方法可用于多种诊断、药物发现和研究应用中，其包括但不限于诊断或监测疾病或病状(其中图像识别疾病或病状的标记物)、发现药物靶(其中图像中的标记物可作为靶进行药物治疗)、药物筛选(其中药物效果可通过图像中所示的标记物进行监测)、确定药物敏感性(其中药物敏感性与标记物有关联)和基础研究(其中期望测量样品中细胞间的差异)。

在某些实施方案中，可使用以上方法比较两个不同的样品。不同的样品可由“实验”样品，即所关注的样品，和比较实验样品的“对照”样品组成。在许多实施方案中，不同的样品是成对细胞类型或其片段，一个细胞类型是所关注的细胞类型，例如，异常细胞，且另一个为对照，例如，正常细胞。如果比较两个细胞片段，则该片段通常是来自两个细胞的每一个的相同片段。然而，在某些实施方案中，可比较相同细胞的两个片段。示例性细胞类型对包括，例如，从组织活检分离的细胞(例如，从患病如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、皮肤癌的组织或病原体感染的组织等)和从相同组织的正常细胞，通常来自相同患者；在永生化组织培养中生长的细胞(例如，具有增殖突变或永生化转基因的细胞)、病原体感染的细胞，或处理的细胞(例如，由环境或化学试剂如肽、激素、温度改变、生长条件、生理应激、细胞转化等)和正常细胞(例如除了未永生化、感染或处理等，否则与实验细胞同一的细胞)；从患有癌症、疾病的哺乳动物、老年哺乳动物或暴露于病状的哺乳动物中分离的细胞，和来自相同物种的哺乳动物的细胞，优选来自相同家族的健康或年轻的；以及来自相同哺乳动物的分化细胞和未分化细胞(例如，例如在哺乳动物中一个细胞是另一个的祖先)。在一个实施方案中，可采用不同类型的细胞，例如，神经元和非神经元细胞，或不同状态的细胞(例如，对细胞刺激前后)。在本发明的另一实施方案中，实验材料是易于被病原体如病毒(例如人类免疫缺陷病毒(HIV)等)感染的细胞且对照材料是抵抗被病原体感染的细胞。在另一实施方案中，样品对由未分化细胞(例如干细胞)和分化细胞所代表。

在本发明方法中可使用任一生物体的细胞，例如来自细菌、酵母、植物和动物(如鱼类、鸟类、爬行动物、两栖动物和哺乳动物)。在某些实施方案中，可使用哺乳动物细胞，即，来自小鼠、兔、灵长类动物或人类或其培养衍生物的细胞。

为了进一步说明本发明，给出以下具体实施例，需理解提供它们是为了说明本发明，而不应该以任何方式被解释为对其发明范围的限制。

实施例

下面描述的是使用次级离子质谱术以通过同位素纯金属元素报告子使抗体成像。复用离子束成像(MIBI)能够同时分析高达100个或更多的靶，在五个对数级的动态范围内横向分辨率为50nm。在这里，MIBI同时使用10个标记，用于分析福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)人乳腺癌组织切片。所得数据表明MIBI将提供关于组织微结构和高度复用蛋白表达模式的新见解，其与临床诊断、基础研究和药物发现有关。

该方法规避了一些与传统光线为基础的染色方法有关联的限制。该方法实际上可用在任一真空兼容的样本上，包括FFPE组织。在验证该方法时，我们能够证明相较于更为传统的途径(图2)，PBMC的免疫表型分析在定量上几乎同一以及对三个不同免疫表型的FFPE乳腺肿瘤的成像等效(染色模式和强度)，并具有同时分析十个或更多标记物的额外的优势(图3)。此外，描述细胞和亚细胞表达的定量特征提取所允许的标记物复用和成像分割，总的来说，揭示可涉及回到原来的组织初始临床病理的细胞亚群的免疫表型(图4)。最终，图像的组合假着色(或伪着色)的新途径将高维分析提炼到快速可解释的单一图像，其中多种表型将由非监督方式的单一颜色所代表(图5)。通过使用MIBI类似途径利用易获得和可解释的高维信息，这些表现为大幅提高基于显微镜的诊断创造机会。

MIBI比传统IHC技术具有优点。由于自体荧光背景信号不存在以及，且此处提出的动态范围已经为10⁵，分别超过免疫荧光和显色IHC的100倍和1000倍。由于质量分辨率低于百分之一的道尔顿，因此在不同的金属偶联一级抗体间未观察到光谱重叠，避免通道补偿的需要。由于既不需要二次标记也不需要扩增检测，因此相对于显色IHC和IF，测定线性度得到改善。同时，相对传统方法用于免疫反应，以及由于质量标签不降解，因此样品无限期稳定，允许远程制备以及集中阅读设备。

可开发试剂，其将MIBI的能力扩展到其它领域以及远离以抗体为基础的分析，如原位杂交和亚细胞代谢分析。总之，通过对现有分析系统的相对小的修饰所允许的MIBI的能力扩展引入实用、复用成像平台的前景，其整合组织学、蛋白表达、基因表达和亚细胞水平的代谢。

方法

基底制备：硅晶片(SiliconValleyMicroelectronic)被切成18mm²片，用甲醇漂洗两次，并用棉签擦光。随后，将清洁的基底浸入2％多聚-l-赖氨酸溶液(Sigma-Aldrich)10分钟，并在60℃烘烤1小时。

抗体：在下表S1可见对抗体、报告同位素和浓度的汇总。使用MaxPAR抗体偶联试剂盒(DVSSciences，Toronto,Canada)根据制造商推荐的方案每次制备100μg的金属偶联一级抗体。在CandorPBS抗体稳定溶液(CandorBioscienceGmbH,Wangen,Germany)中将下列标记抗体稀释至0.4mg/mL，并在4℃中长期保存。

表S1

细胞:根据IRB批准的方案从斯坦福血液库购买未匹配人外周血。将全部血液样品收集在肝素抗凝剂中，在室温存储4-6小时，然后使用Accuspin管(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)通过Ficoll-PaquePlus(AmershamBiosciences)将其分离，以去除红细胞、血小板和粒细胞。在10％DMSO的FCS中冷冻细胞。在37℃下5％CO2中，将细胞放置在含有10％FCS(在冷冻样品的情况下补充2mM的EDTA)、1XL-谷氨酰胺和1X青霉素/链霉素(Invitrogen)的RPMI中1小时。

外周血单核细胞的染色：细胞染色方案是基于先前所描述的过程。简而言之，将细胞放置1小时后，添加表面标记物抗体产出100μL最终反应体积，且在室温孵育30分钟。孵育后，用细胞染色介质将细胞清洗两次，并将细胞分成两等份。对于质谱细胞计量术分析，在4℃，用4℃甲醇将细胞透化10分钟，用细胞染色介质将细胞清洗两次以去除残余甲醇，然后用在含1.6％的PFA的PBS中所稀释的1mL的1:4000191/193IrDNA插入剂在室温对细胞染色20分钟。然后，用细胞染色介质清洗细胞一次，用PBS清洗一次，且然后在分析前在dH2O中稀释至约106细胞/ml。对于MIBI分析，将在PBS中稀释至约10⁷个细胞/mL的50μL细胞置于硅基底上，并允许粘附20分钟。然后用PBS轻轻漂洗该基底，用含2％戊二醛的PBS固定5分钟，并用dH2O漂洗两次。最后，经梯度乙醇系列将样品脱水，并在室温干燥该样品，在分析前将该样品在真空干燥器内存储至少24小时。

乳腺肿瘤组织切片：使用超薄切片机从人乳腺肿瘤的FFPE组织块中切下组织切片(4μm厚度)，将其安装在多聚-l-赖氨酸所包被的硅基底上进行MIBI分析或载玻片上进行免疫过氧化物酶(IPOX)染色。硅载切片在65℃烘烤15分钟，在二甲苯中脱蜡，并通过梯度乙醇系列再水化。然后将切片浸入表位恢复缓冲液(10mM柠檬酸钠，pH6)，并将切片置于高压锅(ElectronMicroscopySciences,Hatfield,PA)30分钟。随后用dH₂O将切片漂洗两次，并用清洗缓冲液(TBS，0.1％吐温，pH7.2)漂洗一次。通过用无绒棉纸轻轻触摸表面来去除残余缓冲液，之后用封闭缓冲液孵育30分钟(TBS,0.1％吐温,3％BSA,10％驴血清,pH7.2)。随后去除封闭缓冲液，且将切片在4℃下载加湿室过夜染色。次日早晨，在清洗缓冲液中将切片漂洗两次，后将其固定5分钟(PBS，2％戊二醛)，在dH₂O中漂洗，并用哈氏苏木精(Harrishematoxylin)染色10秒。最后，经梯度乙醇系列将切片脱水，并在室温干燥样品，在成像前样品在真空干燥器内存储至少24小时。使用Decloaking室(BiocareMedical,Concord,CA)用柠檬酸盐缓冲液在pH6.0,125℃和压力为15psi时进行抗原修复。在该室内的总时间长度(slide)为45分钟。在加湿室内室温下进行一级抗体孵育过夜。正常山羊血清用于封闭。生物素化的山羊抗兔(1:1000)是与分别用于扩增和信号可视化的VectastainABC试剂盒Elite和过氧化物酶基底试剂盒DAB(VectorLabs,Burlingame,CA)一起使用的二级抗体。将已知含有每一被评价的抗原的组织用作阳性对照。

MIBI分析：使用由氧双等离子体源所提供的O-初级离子束用NanoSIMS50L质谱仪(Cameca)进行MIBI分析。在每一实验之前，对初级光学、次级光学和质谱仪进行调整。使用植入硅的金属偶联抗体标准物对七个检测器车进行校准。首先将检测器车沿着焦平面移动到对应于每一抗体的金属的质量峰。然后通过进行高质量分辨率(HMR)扫描和调整每一车的检测器电压将质量峰集中在检测器上。调整水平和垂直的光束校准，以使通过质谱仪的入口狭缝的次级离子传送最大化。然后，调整样品台的z-位置，这样当浸没透镜(E0S)的第三电极的电压为大约7150V时次级离子信号最大。通过调整透镜Lduo、L0和L1，初级离子束集中在所关注的区域(ROI)。在使用D1孔径2、D0孔径0或3、大约1500V的L1电压、入射狭缝0和孔径狭缝0时，在正离子模式下读取全部数据。通过重新校准相同视野的重复扫描间的检测器车获取含有超过7个通道的图像。在NanoSIMS分析室内，使用CCD相机定位使用亮视野显微镜在连续切片上所识别的ROI。在高初级离子流中将O-植入样品，直到次级离子产物已经达到稳态。当查看周期性铝格栅的实时离子图像(RTI)时，将象散校正器八极的Oct-90和Oct-45电压手动调整到使图像失真降到最低。获得每一图像前，当查看RTI时通过调整浸没透镜(E0P)第二电极的电压手动聚焦视场。在50-100μm视场以及像素停留时间在2-10毫秒之间以及对单一区域高达10次重复扫描来获得离子图像。单一视场的总扫描时间的范围在5-25分钟，通过将多个连续视场拼接一起为单个镶嵌物来构建更大的区域。

质谱细胞计量术测量：如前所描述的，在CyTOF质谱细胞计量术仪中收集细胞事件。在双计数模式下使用“数据”校准的检测中，细胞长度被设置为10至75的范围，卷积阈值为100。使用检测器的稳定性延迟为20秒，且对全部样品进行稀释，这样采集速率低于每秒500个细胞。

PBMC镶嵌物拼接：在一系列的被排列在40x30矩形中的1200个单个方格50μm(128像素)片中收集MIBIPBMC数据。使用对数转变CD45图像确定片的相对位置。在x-和y-方向上相邻片间的所报告的偏移为40μm，但由于台位置的不准确，观察到的实际偏移改变。考虑到这一点，根据每一片所报告的偏移，初始放置它们，且然后在x-和y-方向上移动约1-20像素至多个不同的位置。在每一位置，在重叠区域内的，计算新的片和以前的片的相关性。然后将片指定到可以使重叠区域的相关性最大化的位置。

PBMC图像分割：利用二维高斯内核(Gaussiankernel)和3个像素的标准偏差对经对数变换的CD45片的镶嵌物进行卷积，然后以1的密度阈值化(thresholded)。密度大于这一阈值的每一连续区域被初步标记为单独细胞。下一步是将足够接近被初始标记为单细胞的任一组的多个细胞分离成其构成单峰。为此，对每一初步细胞，识别在边界上的两个点，该两点之间具有沿着边界的距离到欧氏距离(Euclideandistance)的最大比例(“夹点(pinchpoint)”)。当这个比例超过0.42(启发式截断)时，初步细胞被分离为具有在夹点间的新的边界段的两个细胞。该过程可在全部细胞迭代，并与创建的新的初步细胞重复，直至无细胞具有超过该分离标准的夹点。

一旦确定细胞边界，则在每一边界内合计所测量的每一通道的原始值以创建基于每一细胞的总离子强度表格。还可将每一细胞内像素数量计算为细胞大小的测量值。该表格相当于.fcs文件，如来自标准质谱细胞计量术实验。

数据分析：为过滤出双峰和碎片，通过应用根据DNA的标准细胞长度和随后根据CD45闸的细胞长度，单峰从质谱细胞计量术PBMC被闸控；将使用根据CD45的细胞区域的单峰闸应用于MIBIPBMC。MIBI和CyTOF处理的PBMC的后续闸控方案分别在图2B和图C显示。

结果

MIBI的性能评价：MIBI的工作流程与免疫荧光(IF)和显色IHC测定具有可比性(图1)。代替荧光团或酶偶联试剂，生物样本与偶合到同位素纯、稳定的镧系元素的一级抗体一起孵育(图1)。为了与样本同时孵育，一级抗体在溶液中组合。为MIBI所制备的样本被安装在样品支架上，且经历光栅扫描的氧双等离子管初级离子束。该离子束对样品的冲击使结合抗体的镧系元素加合物释放为次级离子。在本研究中，随后通过配备多个光电倍增管的扇形磁场质谱仪分析次级离子，允许平行检测多个镧系元素同位素(基于质量的报告子)。所得数据产生每一镧系元素，从而每一抗体及其对应的表位的元素分布的二维图。

使用质谱细胞计量术和MIBI平行评价由七种金属同位素偶联的一级抗体(CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD45、HLA-DR)所染色的外周血单核细胞(PBMC)(图2)。如前所述，在PBMC悬浮液中进行质谱细胞计量术。对于MIBI，细胞固定在多聚-l-赖氨酸包被的硅晶片，在真空下干燥细胞，以及随后使用NanoSIMS50L^TM质谱仪分析细胞。对顺序的50-□m视场进行成像和对每一抗体将其构建到复合镶嵌物中(图2A)。使用CD45通道，所得镶嵌物被分割为所关注的单独细胞区域(ROI)。为提取对于每一抗体的单细胞表达数据，为每一细胞ROI，整合每一通道的离子数。

质谱细胞计量术和MIBI产生可比较的结果和表达的定型模式(当其经传统双轴图(图2B)分析，其具有105的动态范围的MIBI的标记物强度时)。此外，对于七个手动闸控的细胞群体，两个平台产出定量上相似频率(图2C)，这些细胞群体中的3个在平台间的差异低于1％(B-细胞,CD8+T-细胞,CD4+T-细胞)。总之，使用PBMC作为测试实例，MIBI可产出与传统分析平台定性上和定量上等效的结果，且具有空间信息的额外的优势。

人乳腺癌组织切片的十色成像：为了利用MIBI分析诊断情况下所获得的组织切片，我们通过比较金属偶联和未修饰的一级抗体，试图验证用于传统IHC染色的金属偶联试剂的活性。来自用金属偶联或未修饰的Ki67的一级抗体或雌激素受体α(ER)处理的单个FFPE人乳腺癌组织块的连续切片的二次染色证明可比强度的阳性核染色和相似水平的背景染色(图3A)，表示金属偶联不能实质上影响特异性或非特异性染色行为。

最后，为评价MIBI在诊断性成像应用中的总体性能，分析来自三个不同患者的FFPE乳腺肿瘤组织切片。ER，孕激素受体(PR)和HER2阳性可使用确证试剂在临床IHC实验室中验证。对于MIBI，肿瘤切片被安装在多聚-l-赖氨酸包被的硅晶片、脱蜡并经历热诱导的表位修复，之后用对dsDNA、ER、孕激素受体(PR)、e-钙粘蛋白、Ki67、波形蛋白、肌动蛋白、角蛋白和HER2的金属偶联抗体进行过夜染色。方便地，通过测量苏木精的铝元素的含量，易于检测苏木精复染。次日,清洗切片，用苏木精复染，并通过梯度乙醇系列脱水。

使用MIBI分析，可构建FFPE组织的传统高分辨率图像。通过以白色到蓝色的标度编码苏木精而以白色到棕色的标度编码所需的标记物，构建模拟传统DAB染色的伪亮视场图像(图3B，顶部)。使用红色编码的dsDNA通道、编码为蓝色的苏木精通道和绿色编码的标记物通道构建模拟三色免疫荧光的伪荧光图像。在图3C中显示对于三个组织切片中每一个的在单一视场内对于每一抗体的伪亮视场和伪荧光混合物。比较三个样本中HER2、ER和PR的阳性证明关于传统IHC染色所建立的免疫表型的适当的表达。表达ER和PR的切片证明界限清楚的核染色、分散的Ki67阳性核和在间质细胞内对波形蛋白的强阳性染色。HER2阳性切片证明强的膜染色。E-钙粘蛋白、肌动蛋白和角蛋白也表现出适当的亚细胞染色模式。

图像分割和从同时获得的标记物所提取的特征：为了充分利用本研究中定量上复用的图像中固有的信息的性质，进行图像分割，从而使细胞特征得以分析和比较。对于每一肿瘤，使用CellProfiler分割苏木精和dsDNA通道，以提取描述亚细胞表达的汇总统计量(图4A)。对于核质内的每一标记物，量化平均像素强度，以及对于每一细胞，量化细胞ROI。双轴散点图证明对于每一肿瘤匹配已知免疫表型的标记物的共表达(图4B)。三阳性和ER-PR双阳性肿瘤证明ER和PR的核共表达，而不存在于HER2阳性肿瘤。三阳性和HER2阳性肿瘤证明不存在于ER-PR双阳肿瘤的胞质HER2阳性。角蛋白的亚群、e-钙粘蛋白阳性的导管细胞明显与波形蛋白阳性的间充质细胞分离。

可通过生成将定量(连续)胞质和分类(阳性或阴性)核表达模式组合的复合图像使多维MIBI数据的整合的组织学和免疫表型特征可视化(图5)。在上皮隔室内的激素受体阳性区域(其显示肌动蛋白变化的非核表达(红)和e-钙粘蛋白(绿)}可区别于散布的间充质细胞共表达肌动蛋白(红)和波形蛋白(蓝)。大约8％的细胞被认为是Ki67阳性。不同于传统的显色IHC，其不太适合检测多个标记物的共定位，MIBI分析易于证明ER-PR双阳性(浅绿色)或ER-PR-Ki67三阳性(黄色)亚群。在这种情况下，低丰度的增殖细胞群体共表达ER和PR。可以想象的是，详细的、细胞-细胞的分子表型的分析，特别是如果多个核抗原表达分布被质疑，则可证明具有临床意义，识别比大部分肿瘤群体可能对治疗具有不同反应的恶性细胞的子集。这些观察结果，结合像MIBI的质谱分析术途径的定量动态范围，适合于潜在的诊断应用，其中这些共定位和互相作用现在可以非监督的方式识别。

Claims

1.一种生成包括细胞和细胞外结构的样品的高分辨率二维图像的方法，所述方法包括：

用至少一个质量标签标记样品，从而产生标记样品，其中所关注的生物特征与所述至少一个质量标签结合；

用次级离子质谱仪(SIMS)离子束扫描所述样品以生成数据集，所述数据集包括整个所述样品区域中的所述至少一个质量标签的丰度的空间可寻址测量值；以及

输出所述数据集。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个质量标签是多个可区分的质量标签，并且其中所述数据集包括所述多个质量标签中每一个的丰度的标识和空间可寻址测量值。

3.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述数据集含有所述质量标签的标识和丰度。

4.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述标记步骤包括用至少两个不同的质量标签标记所述样品。

5.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述标记通过使用连接到所述质量标签的抗体来完成。

6.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述标记通过将所述质量标签施用到动物受试者并从所述受试者中获取所述样品来完成。

7.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)切片。

8.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述质量标签是具有原子数在21-92范围内的元素的同位素。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述元素是镧系元素。

10.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括从所述数据集构建所述样品的图像。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述图像具有至少500nm的分辨率。

12.如权利要求10所述的方法，其限定所述图像中单独细胞的边界，以及任选地，在单独细胞中的亚细胞特征。

13.如权利要求11所述的方法，其还包括整合对应于所述图像中每一所述单独细胞或其亚细胞特征的数据。

14.如权利要求13所述的方法，其还包括基于所获取的每一所述细胞或其亚细胞特征的整合数据将所述细胞分类。

15.如权利要求14所述的方法，其还包括显示所述样品的图像，其中所述细胞按其分类以颜色编码。

16.如权利要求15所述的方法，其中在所述图像的任一像素中，所述像素的颜色强度与所获得的通过所述扫描获得的所述像素的信号幅度相关联。

17.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述组织样品被安装在导电基底上。

18.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述离子束对所述样品进行光栅扫描。

19.一种分析包含细胞的样品的系统，其包括

a)次级离子质谱术(SIMS)系统，其包括保持包含样品的基底的支架，其中所述系统配置为(i)用SIMS离子束扫描所述样品，并生成包括与所述样品区域结合的质量标签的丰度的空间可寻址测量值的数据集以及(ii)输出所述数据集；以及

b)包括图像分析模块的计算机，其处理所述数据集以产生所述细胞的图像。

20.如权利要求19所述的系统，其中所述图像分析模块可限定所述图像中单独细胞的边界，以及任选地，在单独细胞中的亚细胞特征。

21.如权利要求20所述的系统，其中所述图像分析模块整合所述图像中每一所述单独细胞的数据或其亚细胞特征。

22.如权利要求21所述的系统，其中所述图像分析模块基于所获得的每一所述细胞的整合数据将所述单独细胞分类。

23.如权利要求22所述的系统，其中所述图像分析模块显示所述样品的图像，其中所述细胞按其分类以颜色编码。

24.如权利要求23所述的系统，其中在所述图像的任一像素中，所述像素的颜色强度与所获得的通过所述SIMS系统获得的所述像素的信号幅度相关联。