CN105483193B - 从含酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法及试剂盒 - Google Patents
从含酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105483193B CN105483193B CN201510823449.2A CN201510823449A CN105483193B CN 105483193 B CN105483193 B CN 105483193B CN 201510823449 A CN201510823449 A CN 201510823449A CN 105483193 B CN105483193 B CN 105483193B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- digestion
- enzyme
- chromatographic column
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 68
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 68
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 7
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 101
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 16
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 19
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 19
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 19
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 18
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 18
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 18
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 16
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 7
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 4
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002542 isoureas Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 1
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请公开了一种从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤：将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱上；将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附目的蛋白；将融合蛋白依次流经第一层析柱和第二层析柱。本发明的方法采用一步层析法，节省了纯化步骤，并且提高了纯化效率。
Description
技术领域
本申请涉及一种从融合蛋白纯化蛋白的方法，具体涉及一种节约程序与成本的酶切纯化蛋白的方法。
背景技术
酶固定化技术在生物技术领域已有使用的先例，比如生物柴油技术，食品工程，废水处理等，但是在制药领域还没有发现相关的技术报道。融合蛋白技术是为获得大量标准蛋白而进行的有目的性的基因融合，利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。例如，有些融合蛋白是含有凝血酶或者肠激酶酶切位点的硫氧还蛋白和目的蛋白融合表达，在后续纯化中采用凝血酶或者肠激酶将硫氧还蛋白和目的蛋白切开，并采用多步柱层析将这两种蛋白分开，达到预期的纯化效果。因此要得到目的蛋白需分为两个步骤：酶切和纯化。目前通过基因工程手段表达有特殊标记的融合蛋白技术已经非常成熟，现有技术中采用静态酶切法，将目的蛋白置换到相应的酶切溶液内，静态酶切一定的时间，然后用不同的层析柱达到分离纯化的目的。
目前的酶切技术通常采用的静态酶切法，是将酶和底物蛋白充分混匀后，在合适的酶切条件下酶将融合蛋白切成目的蛋白和融合头，此时，酶只对它周围能接触到的蛋白产生酶切作用，酶切效率低，酶用量大，另外，酶和蛋白同时溶解在一种溶媒内，后续目的蛋白纯化中会有酶残留的问题。而且酶切时间长，酶和蛋白同时溶解在一种溶媒内，不仅给后续目的蛋白纯化带来影响，而且残留的酶对蛋白有进一步的酶切，使酶切终点不好控制，酶切的变异性增加。经过酶切的蛋白通常需要采用进一步的层析进行纯化，如果接下来纯化不能有效去除酶，则残留的酶会继续发挥作用，从而引入额外的杂质，无法有效的纯化目的蛋白。经过酶切的蛋白溶液内成分较复杂，如果按照常规的层析方法，目的蛋白吸附在层析介质上，然后再根据其不同的表面电荷和疏水性等物理性质将目的蛋白和杂蛋白分开，势必要经过多步层析，每一步层析柱都需要至少五种溶液来完成层析步骤，整个层析工艺比较复杂。每增加一步柱层析，会增加很多工作量，同时蛋白的回收率也会下降，因此用尽可能少的层析步骤达到相同的纯化效果是纯化工艺的最佳境界。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的问题，本申请在蛋白纯化工艺中，发明人巧妙地设计了一种可以一步纯化的方法：采用串联的两个层析柱一次纯化目的蛋白，大大缩减了成本和时间。具体而言，首先，将酶固定在介质上，然后将介质装到层析柱内，制成酶切层析柱，将固定有酶的层析柱和另一根有特定介质的层析柱串联，当融合蛋白在特定的缓冲条件下流经该串联的装置，目的蛋白直接从串联柱流穿，杂蛋白吸附在层析介质上，这样一步层析就可以得到高纯度的目的蛋白。
在一个实施方式中，本发明提供了一种一步从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤：
将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱内的介质上；
将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白的非目的蛋白(下文中也称为融合头)部分，并且不会吸附目的蛋白；
将含有所述融合蛋白的样品依次流经第一层析柱和第二层析柱。依照此方法，可以一步获得高纯度的目的蛋白，大大节省了成本，并且避免了多种杂蛋白的产生。
在一个优选的实施方式中，所述酶为凝血酶、肠激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。在实际操作中，可以根据这些酶的酶切位点来设计融合蛋白的结构，以便能够利用上述酶有效切得目的蛋白。
在一个进一步优选的实施方式中，所述第一层析柱内的介质选自高交联的琼脂糖、葡聚糖和纤维素中的一种。采用适当的固定方法，能够将酶固定到这些介质上。
在又一个优选的实施方式中，所述第二层析柱选自用于纯化含有标签蛋白的亲和层析填料、离子交换类填料和分子筛类填料中的一种。具体而言，第二层析柱内的介质的选择有几种情况：
当融合蛋白表达时含有标签的，第二层析柱选择用于纯化标签蛋白的亲和层析填料，例如，纯化his标签蛋白时，就选择Ni亲和填料，纯化BMP标签蛋白时，选用DextrinSepharose系列的填料，纯化Strep(II)标签蛋白时，选择StrepTactin Sepharose系列填料，纯化GST标签蛋白时选用Glutathione Sepharose FF系列填料；
当融合蛋白表达没有标签时，对融合蛋白、目的蛋白和酶切后的非目的蛋白部分进行分析，当目的蛋白等电点偏碱性，而全长融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等电点偏酸性，则可以选择阴离子交换系列介质作为第二层析柱的介质，(例如强阴离子交换Qsepharose系列、弱阴离子DEAE Sepharose FF)；当目的蛋白等电点偏酸性，而全长融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等电点偏碱性，则可以选择阳离子交换系列介质作为第二层析柱的介质(例如强阳离子层析介质SP Sepharose系列和弱阳离子CMSepharoseFF)。
当酶切后的目的蛋白和融合蛋白分子量差异很大时，第二层析柱可以选择分子筛介质，流动相经过时，收集不同的组分(例如：Superdex系列和Sephacryl系列)。第一层析柱中所述酶的固定在4±2℃，pH8-8.5条件下进行12-20小时，可以根据具体的酶和第一层析柱的选择具体优化固定酶的条件，例如可优选4℃，pH8.0，固定16小时。
本发明还提供了一种纯化蛋白的试剂盒，包括第一层析柱和第二层析柱，其中第一层析柱中的介质固定有能够从融合蛋白酶切得到目的蛋白的酶，第二层析柱中的介质能够吸附所述融合蛋白被酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附所述目的蛋白，所述试剂盒在使用时依次串联连接第一层析柱和第二层析柱。酶和层析柱可选的种类如上述方法中所述。
利用所述试剂盒可以实现上述纯化方法，并且，对于特定的融合蛋白，有成套的层析柱存在于试剂盒中，省略了制备上述特定层析柱的步骤，更进一步节省了纯化的时间。
本发明的纯化方法相对于现有技术中的纯化方法具有如下优势：1、提高酶切效率，降低酶反应时间，酶可以回收利用；2、酶经过固定化，不会对后续工艺造成污染，无需增加去除残余酶步骤；3；酶切体系和串联的层析柱平衡条件相同，减少了溶液种类和用量；4、酶切后的柱层析采用穿透模式，目的蛋白直接从柱上流穿，整个纯化工艺简单紧凑。
附图说明
图1为本发明的示意性流程图；
图2为示例性酶与介质偶联的化学方程式；
图3为本发明实施例1中酶切效率定量测量的结果，测定了实施例1的方法中不同流速的酶切效果图，其中各泳道说明如下：pre：酶切前；1、0.5ml/min流速柱上酶切，保留时间10min；2、1ml/min流速柱上酶切，保留时间5min；3、2ml/min流速柱上酶切，保留时间2.5min；4、5ml/min流速柱上酶切，保留时间1min；
图4为实施例1中重复酶切效果图，其中各泳道说明如下：pre：酶切前；1、酶切第一次；2、酶切第2次；3、酶切第3次；
图5为实施例2中不同酶切时间的肠激酶酶切效果图，各泳道说明如下：1、融合蛋白、2、酶切时间1分钟；3、酶切时间12分钟；4、酶切时间10分钟；5、酶切时间2分钟；6、酶切时间4分钟；7、酶切时间6分钟；8、酶切时间8分钟；
图6为根据实施例3的凝血酶切柱和精纯Q柱串联纯化后样品的电泳图；
图7为根据实施例4的肠激酶切柱和Ni柱串联酶切纯化效果图，其中各泳道分别为：1、分子量标记；2、Ni洗脱杂峰；3、Ni柱穿透的目的蛋白1；4、Ni柱穿透的目的蛋白2；各条带成分：a、剩余的融合蛋白；b、GH目的蛋白；c、融合头蛋白；
图8为PTH融合蛋白常规纯化工艺和固定化酶切与阴离子串联纯化工艺流程图对比。
具体实施方式
为了更详细地说明本发明的技术方案，下面通过具体实施方式示例性说明本发明，本领域技术人员应了解，这些实施方式仅仅为说明本发明的实施，并不构成对本发明的保护范围的限定。
在蛋白质工程化表达的现有技术中，能够直接表达出目的蛋白，而不带有其他杂质的情况很少，很多情况下通常是先表达出融合蛋白，然后通过酶切将融合蛋白上的非目的蛋白部分酶切掉，再通过纯化步骤得到目的蛋白。由于步骤繁琐，不仅耗时，整个生产线的成本也比较高，而且纯度经常达不到理想的要求。
本发明针对现有技术的不足，设计出新的纯化策略：将酶固定在固态介质上，不与目的蛋白互溶，因此不会给后续蛋白分离纯化带来影响。并且，酶经固定在介质上后，酶切效率提高，同时酶的稳定性提高，经过清洗后，可以多次使用。
根据本发明的一个实施方式，在制订蛋白质生产的整个策略之前，首先要选择合适的表达和纯化方式，表达载体和表达方式决定了融合蛋白的成分，从而决定了酶的种类。优选在融合蛋白中加入标签，例如组氨酸标签、GST、Strep(II)和BMP标签，并在标签和目的蛋白之间设计加入酶切识别位点，例如，凝血酶的酶切位点是Ile-Glu-Gly-Arg，肠激酶的酶切位点是DDDDK；木瓜蛋白酶的酶切位点是arg、lys、gly、L-Citrulline；胃蛋白酶的酶切位点是phe、trp、tyr等疏水氨基酸，胰蛋白酶的酶切位点是K-Lys和R-Arg后的Lys和Arg；，这样在酶切之后，通过针对标签设计的第二层析柱特异性结合上述标签，达到更便捷的纯化。
第一层析柱的选择可以根据所要固定化的酶来进行。而第二层析柱的选择则要根据融合蛋白中的标签、融合蛋白中非目的蛋白部分与目的蛋白的区别来选择。例如，当表达的融合蛋白带有组氨酸标签时，当融合蛋白表达时含有标签的，第二层析柱选择用于纯化标签蛋白的亲和层析填料。例如，纯化his标签蛋白时，就选择Ni亲和填料；纯化BMP标签蛋白时，选用Dextrin Sepharose系列的填料；纯化Strep(II)标签蛋白时，选择StrepTactinSepharose系列填料；纯化GST标签蛋白时选用Glutathione Sepharose FF系列填料。
当融合蛋白表达没有标签时，对融合蛋白、目的蛋白和酶切后的非目的蛋白部分进行分析：当目的蛋白等电点偏碱性，而全长融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等电点偏酸性，则可以选择阴离子交换作为第二层析柱，例如强阴离子交换Q sepharose系列、弱阴离子DEAE Sepharose FF；当目的蛋白等电点偏酸性，而全长融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等电点偏碱性，则可以选择阳离子交换作为第二层析柱，例如强阳离子层析介质SPSepharose系列和弱阳离子CMSepharoseFF。
当酶切后的目的蛋白和融合蛋白分子量差异很大时，第二层析柱可以选择分子筛介质，流动相经过时，收集不同的组分。例如：Superdex系列和Sephacryl系列。
通过选择合适的层析串联酶切，可以不更换缓冲液，使目的蛋白流穿，融合头和未切的融合蛋白吸附在柱上，一步纯化就可以得到高纯度的目的蛋白。流程图参见图1。
下文结合具体实施例示例性说明本发明的技术构思。
制备例固定化酶的制备方法(介质活化和酶的偶联)
酶的固定化基质可选用比较适宜生物大分子的富含羟基的大孔网琼脂糖为载体，经溴化氢活化后再与酶蛋白的氨基偶联，完成酶固定化过程，如图2所示。富含羟基的介质在酸性水溶液中充分溶胀后，生成亚胺碳酸活性基团，该基团能与蛋白质或伯胺NH2发生翻译，生成异脲衍生物，对外表现为蛋白质和介质成为一体。偶联后的介质用低pH值和高pH值缓冲液交替洗涤，去掉游离的和结合不牢固的酶。
将固定化酶介质装填到合适的色谱柱内，即得到第一层析柱。
制备例1：固定化凝血酶柱(第二层析柱)的制备
1.取2.1g CNBr活化的Sepharose 4B填料粉末用300ml 1mM HCl分次溶胀，然后用该溶液反复冲洗填料(最终填料体积为5ml)；
2.取1瓶凝血酶(1000IU/瓶)用3ml ddH2O溶解，分2次用HiTrap脱盐柱(5ml)换液至0.1M NaHCO3pH 8.3；500mM NaCl，最终得到换液后的凝血酶5ml；
3.将步骤1中的5ml活化后的填料用50ml 0.1M NaHCO3pH 8.3，500mM NaCl充分平衡后，加入5ml换液后的凝血酶，4℃缓慢搅拌过夜；
4.用0.1M Tris-HCl，pH8.0溶液以2ml/min的流速封闭未结合凝血酶的位点。
制备例2：固定化肠激酶柱的制备
1.取1.5g CNBr活化的Sepharose 4B填料粉末用1mM HCl溶胀，用200ml的1mM HCl分批反复冲洗填料(最终填料体积为3.75ml)；
2.取肠激酶3.0ml(0.9mg/ml批号为“0909043.6U/ul)，分2次用HiTrap DesaltingColumn(5ml)脱盐至0.1M NaHCO3pH 8.3，500mM NaCl，最终得到换液后的肠激酶溶液5ml；终浓度为A280为0.6OD/ml
3.3.75ml活化后的填料加入3.75ml Coupling Buffer后加入3.75ml换液后的肠激酶(EK酶)，4℃缓慢搅拌过夜，复测上清中肠激酶的浓度A280为0.15OD/ml；
4.用0.1M Tris-HCl，pH8.0溶液以2ml/min的流速封闭未结合EK酶的位点。
固定化酶的酶切
使用前需对固定化酶进行酶切效率定量，测定方法如下：
将底物蛋白溶液以一定的流速流经固定化酶的层析柱，记录酶与蛋白的接触时间，根据酶切效率，确定合适的酶切时间，后续重复酶切时，控制相同的酶切时间即可。
根据测量的酶切效率，调整底物蛋白溶液和流速(即酶的接触时间)，收集流穿峰，即得酶切后的混合液。
实施例1：固定化凝血酶酶切硫氧还蛋白-PTH融合蛋白(Trx-PTH)
目的：将Trx-PTH以不同流速通过制备例1制备的固定化凝血酶柱，确定合适的酶切流速，以确定合适的酶切时间。
分析：1、硫氧还蛋白-PTH融合蛋白含有凝血酶的酶切位点，没有标签；适用的第一层析柱选择溴化氢活化的介质(Sepharose 4B)，通过上述介绍的固定化酶的方法，将凝血酶固定到介质上，装在第一根层析柱内；2、由于酶切后的目的蛋白等电点大于9.0，而融合蛋白和非目的蛋白的等电点均低于7.5，因此第二层析柱选择阴离子交换介质(QSepharoseBigBeads)。
层析柱：固化凝血酶的Sepharose 4B XK16/20柱，5ml
平衡液：25mM Tris,pH8.0；50mM NaCl
样品：PTH融合蛋白Trx-PTH(1140401-2)
缓冲液:25mM Tris,pH8.0；50mM NaCl；1M尿素),OD为5.0mg/ml
上样1：0.5ml/min,保留时间10min，上样温度为25℃
上样2：1ml/min,保留时间5min，上样温度为25℃
上样3：2ml/min,保留时间2.5min，上样温度为25℃
上样4：5ml/min,保留时间1min，上样温度为25℃
收集流穿，电泳检测如图3所示，从电泳结果可以看出，酶切条件为25mM Tris，pH8.0；50mM NaCl在室温条件下酶切1-5分钟，均能将融合蛋白酶切掉90％以上。
为了验证固定化酶切柱可以重复使用。在酶切保留时间为2.5分钟，2.0ml/min流速下重复使用多次固定化酶柱。酶切效果没有变化。结果如图4所示。
固定化凝血酶柱在5ml/min以下的流速下对Trx-PTH进行酶切，80％融合蛋白被酶切，对比静态酶切数据如下表1所示：
表1：凝血酶传统静态酶切和固定化酶切融合蛋白对照表
由上表可见，就凝血酶来说，在时间成本和酶的使用量上，本发明的固定化酶切的方法都显著优于静态酶切。
实施例2：固定化肠激酶酶切硫氧还蛋白-GH融合蛋白(Trx-GH)
分析：硫氧还蛋白-GH融合蛋白中包括的肠激酶酶切位点DDDDK以及His纯化标签，因此第一层析柱选择溴化氢活化的介质(Sepharose 4B)，通过上述介绍的固定化酶的方法，将肠激酶固定到介质上，装在第一根层析柱内，融合蛋白和酶切后的非目的蛋白部分均带有His标签，因此第二层析柱选择Ni亲和柱(NI Sepharose FF层析)；
层析柱：固定化肠激酶的Sepharose 4B XK16/20柱，5ml
平衡液：25mM Tris,pH8.0；50mM NaCl
样品：GH融合蛋白PA沉淀1.2g，(H401-2),用Buffer:50mM Tris,pH8.0；50mM NaCl充分溶解,离心去除沉淀，OD为7.5OD/ml。
为了检测酶切是否完全，重复上样多次，用来增加酶切时间，以便于判断不同酶切时间的酶切梯度效果，并电泳检测其酶切结果。
上样1：上样流速5ml/min,保留时间1min，上样温度为25℃
上样2：上样流速2.5ml/min,保留时间2min，上样温度为25℃
上样3：收集上样2穿透峰，重复上样，流速为2.5ml/min,保留时间4min，上样温度为25℃
上样4：收集上样3流穿液重复上样一次，保留时间6min，上样温度为25℃
上样5：收集上样4流穿液重复上样一次，保留时间8min，上样温度为25℃
上样6：收集上样5流穿液重复上样一次，保留时间10min，上样温度为25℃
上样7：收集上样6流穿液重复上样一次，保留时间12min，上样温度为25℃
收集流穿，电泳检测如图5所示。
从电泳结果可以看出，酶切条件为50mM Tris,pH8.0；50mM NaCl在室温条件
下酶切10-12分钟，均能将融合蛋白酶切掉90％以上。
由此可见，固定化酶切比传统酶切无论在成本上，还是时间上都占有很大优势，详见表2。
固定化肠激酶柱在50mM Tris,pH8.0；50mM NaCl在室温条件下在酶切时间为10分钟，对GH融合蛋白进行酶切，90％以上的融合蛋白被切开，本发明的固定化酶切对比传统静态酶切数据如下：
表2：传统酶切和固定化肠激酶酶切融合蛋白对照表
由上表可见，就肠激酶来说，在时间成本和酶的使用量上，本发明的固定化酶切的方法也都显著优于静态酶切。
固定化酶柱和层析柱的串联
利用融合蛋白的酶切得到目标蛋白时，通常在融合头和目的蛋白之间插入合适的标签，如6His，GST，BMP等可以较为方便纯化的融合蛋白，同时也可以在酶切后方便的去除融合头。固定化酶之后串联标记的亲和层析，可以方便的去除融合头和未切的融合蛋白，直接得到目的蛋白。例如，对于带6His标签的融合蛋白经过固定化酶切之后，含有融合头、目的蛋白和未被切的融合蛋白，酶切液直接通过串联的金属螯合层析柱，融合头和未被切的融合蛋白被吸附在层析柱上，而目的蛋白流穿。通过一个步骤就可以得到高纯度的目的蛋白，节省了时间，提高了效率。
不带标记的融合蛋白也可以根据目的蛋白的性质串联层析柱，达到一步酶切和纯化的目的。当目的蛋白和融合头的等电点相差较大，而目的蛋白的等电点高于酶切pH时，可以用阴离子层析柱和固定化酶柱串联，经过酶切后的目的蛋白等不吸附在阴离子交换介质上，而偏酸性会吸附在柱子上，同时脱离的酶也能吸附到阴离子介质上。
实施例3：固定化凝血酶和阴离子交换柱的串联
将固化凝血酶柱XK16/20柱(5ml)和Q sepharose Big Bead柱XK16/20(5ml)串联。以下面程序进行层析操作：
平衡液：25mM Tris-HCl(pH8.0)+50mM NaCl，平衡50ml
上样：以2ml/min流速将Trx-PTH加入串联的层析柱，酶切时间为2.5分钟
收峰：收集穿透峰。
收集到的穿透峰进行电泳。通过串联酶切和纯化一个步骤目的蛋白的纯度达到90％以上。
结果参见图6。
由上述结果可见，使用本发明的方法，不仅节省了时间和经济成本，简化了程序，避免了污染的可能，还能保持甚至得到更高的目的蛋白纯度。
实施例4：固定化肠激酶和NI亲和柱的串联
层析柱：固定化肠激酶的Sepharose 4B XK16/20柱，5ml串联NI FF层析柱5ml
平衡液：25mM Tris,pH8.0；50mM NaCl
样品：GH融合蛋白PA沉淀1.2g，(H401-2),用Buffer:50mM Tris,pH8.0；50mM NaCl充分溶解,离心去除沉淀，OD为7.5OD/ml
上样流速1ml/min,保留时间4min，上样温度为25℃
收集穿透峰，电泳检测纯度。
参见图7可见，得到的蛋白纯度较高
由上述结果可见，使用本发明的方法，不仅节省了时间和经济成本，简化了程序，避免了污染的可能，还能保持甚至得到更高的目的蛋白纯度。
使用后，拆开两根串联柱，分别清洗，保存备用。
另外，发明人经反复试验发现，本发明中的酶切柱可以保存在20％酒精内，不影响其酶切效率。因此，本发明的试剂盒能够长久保存，而且不影响其效果，适合商品化出售。
虽然上文结合具体实施例示例性说明了本发明，但是在不脱离本发明的精神的情况下，本领域技术人员可以根据本领域知识对其进行适当的修改，这些修改也应落入本发明保护的范围内。本发明的范围由权利要求书限定。
Claims (3)
1.一种从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤：
将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱内的介质上；
将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附目的蛋白；
将含有所述融合蛋白的样品依次流经第一层析柱和第二层析柱，其中所述目的蛋白为PTH，所述酶为凝血酶，
其中，所述融合蛋白为硫氧还蛋白-PTH融合蛋白，所述第一层析柱内的介质采用高交联的琼脂糖，所述目的蛋白的等电点大于9.0，所述融合蛋白和非目的蛋白的等电点低于7.5，所述第二层析柱采用阴离子交换介质。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述酶的固定在4±2℃，pH8-8.5条件下进行12-20小时。
3.一种利用如权利要求1所述的方法纯化蛋白的试剂盒，包括第一层析柱和第二层析柱，其中第一层析柱中的介质固定有能够从融合蛋白酶切得到目的蛋白的酶，第二层析柱中的介质能够吸附所述融合蛋白被酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附所述目的蛋白，所述试剂盒在使用时依次串联连接第一层析柱和第二层析柱，其中，所述融合蛋白为硫氧还蛋白-PTH融合蛋白，所述酶为凝血酶，其中所述目的蛋白为PTH，所述第一层析柱内的介质采用高交联的琼脂糖，所述目的蛋白的等电点大于9.0，所述融合蛋白和非目的蛋白的等电点低于7.5，所述第二层析柱采用阴离子交换介质。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510823449.2A CN105483193B (zh) | 2015-11-24 | 2015-11-24 | 从含酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510823449.2A CN105483193B (zh) | 2015-11-24 | 2015-11-24 | 从含酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105483193A CN105483193A (zh) | 2016-04-13 |
| CN105483193B true CN105483193B (zh) | 2019-03-29 |
Family
ID=55670464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510823449.2A Active CN105483193B (zh) | 2015-11-24 | 2015-11-24 | 从含酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105483193B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK3500586T3 (da) * | 2016-10-17 | 2021-05-31 | Enzene Biosciences Ltd | Kontinuerlig fremgangsmåde til at reducere heterogenitet af terapeutisk protein |
| CN107058093A (zh) * | 2017-02-06 | 2017-08-18 | 北京美正生物科技有限公司 | 一种离心式固相酶切柱及其制备方法和用途 |
| CN114790473B (zh) * | 2021-11-08 | 2025-01-28 | 汉肽生物医药集团有限公司 | 一种利拉鲁肽融合蛋白在位酶切和纯化的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1795209A (zh) * | 2003-04-23 | 2006-06-28 | 伯瑞恩药物公司 | 使用粒酶b蛋白酶切割融合蛋白 |
| CN1842600A (zh) * | 2003-08-27 | 2006-10-04 | 奥夫莱夫塔埃克尼公司 | 蛋白水解裂解和纯化重组蛋白的方法 |
| KR20130124195A (ko) * | 2012-05-03 | 2013-11-13 | 고려대학교 산학협력단 | 효소-모노리식 컬럼 및 그 제조방법 |
| CN203976809U (zh) * | 2013-11-28 | 2014-12-03 | 中山康方生物医药有限公司 | 一种蛋白标签柱酶切系统 |
-
2015
- 2015-11-24 CN CN201510823449.2A patent/CN105483193B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1795209A (zh) * | 2003-04-23 | 2006-06-28 | 伯瑞恩药物公司 | 使用粒酶b蛋白酶切割融合蛋白 |
| CN1842600A (zh) * | 2003-08-27 | 2006-10-04 | 奥夫莱夫塔埃克尼公司 | 蛋白水解裂解和纯化重组蛋白的方法 |
| KR20130124195A (ko) * | 2012-05-03 | 2013-11-13 | 고려대학교 산학협력단 | 효소-모노리식 컬럼 및 그 제조방법 |
| CN203976809U (zh) * | 2013-11-28 | 2014-12-03 | 中山康方生物医药有限公司 | 一种蛋白标签柱酶切系统 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Development of an on-line immobilized-enzyme reversed-phase HPLC method for protein digestion and peptide separation;Lee Wah Lim,et al.;《 Analytical and Bioanalytical Chemistry》;20061031;第386卷(第3期);摘要，第615页左栏2-3段，右栏第1段，第619页全部以及图1，图3 |
| 柱上切除GST 标签制备幽门螺杆菌Lpp20蛋白;姜茵等;《中国公共卫生》;20120731;第28卷(第7期);第987-989页 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105483193A (zh) | 2016-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gutierrez et al. | Immobilized metal‐ion affinity chromatography: status and trends | |
| Godawat et al. | Periodic counter‐current chromatography–design and operational considerations for integrated and continuous purification of proteins | |
| Zhou et al. | Viral clearance using disposable systems in monoclonal antibody commercial downstream processing | |
| CN105483193B (zh) | 从含酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法及试剂盒 | |
| Wouters et al. | Immobilized-enzyme reactors integrated into analytical platforms: Recent advances and challenges | |
| CN103197081B (zh) | 一种蛋白质芯片及其制备和检测方法 | |
| Nicoli et al. | Trypsin immobilization on three monolithic disks for on-line protein digestion | |
| CN104884147A (zh) | 使用mes和mops作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分子 | |
| US20210207128A1 (en) | Aptamer of nattokinase and method for screening the aptamer | |
| Bhown | Protein/Peptide Sequence Analysis: Current Methodologies | |
| Rozenski et al. | Overview of in‐capillary enzymatic reactions using capillary electrophoresis | |
| WO2009003952A2 (en) | Column and method for preparing a biological sample for protein profiling | |
| CN102206621A (zh) | 一种基于阳离子交换膜的酶固定化方法及酶微反应器 | |
| CN108084252A (zh) | 一种新型链霉亲和素纯化填料及其制备方法 | |
| Tsai et al. | Purification of hepatocyte growth factor using polyvinyldiene fluoride-based immobilized metal affinity membranes: equilibrium adsorption study | |
| AU2019264349B2 (en) | Qualitative analysis of proteins | |
| Graumann et al. | Development and scale up of preparative HIC for the purification of a recombinant therapeutic protein | |
| CN110090635A (zh) | 一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质及其制备方法和应用 | |
| JP5392782B2 (ja) | 液体クロマトグラフィー装置 | |
| Ke et al. | Preparation of the immobilized metal affinity membrane with high amount of metal ions and protein adsorption efficiencies | |
| CN104236984A (zh) | 一种生物样品纯化的装置及其应用 | |
| Forstater et al. | Data-rich process development of immobilized biocatalysts in flow | |
| Geuijen et al. | Rapid buffer and ligand screening for affinity chromatography by multiplexed Surface Plasmon Resonance imaging | |
| Gupta et al. | Enzymology: early insights | |
| Ding et al. | Application of docking methods for metal chelate affinity precipitation of endo-glucanase using pH-response polymer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method and kit for purifying protein from fusion protein containing enzyme digestion site Effective date of registration: 20220629 Granted publication date: 20190329 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shanghai branch Pledgor: SHANGHAI UNITED CELL BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022310000101 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230828 Granted publication date: 20190329 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shanghai branch Pledgor: SHANGHAI UNITED CELL BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022310000101 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method and Kit for Purification of Proteins from Fusion Proteins Containing Enzymatic Digestion Sites Effective date of registration: 20230829 Granted publication date: 20190329 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shanghai branch Pledgor: SHANGHAI UNITED CELL BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023310000493 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20190329 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shanghai branch Pledgor: SHANGHAI UNITED CELL BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023310000493 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |