CN105483193A - 从含酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤：将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱上；将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附目的蛋白；将融合蛋白依次流经第一层析柱和第二层析柱。本发明的方法采用一步层析法，节省了纯化步骤，并且提高了纯化效率。
Description
技术领域
本申请涉及一种从融合蛋白纯化蛋白的方法，具体涉及一种节约程序与成本的酶切纯化蛋白的方法。
背景技术
酶固定化技术在生物技术领域已有使用的先例，比如生物柴油技术，食品工程，废水处理等，但是在制药领域还没有发现相关的技术报道。融合蛋白技术是为获得大量标准蛋白而进行的有目的性的基因融合，利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。例如，有些融合蛋白是含有凝血酶或者肠激酶酶切位点的硫氧还蛋白和目的蛋白融合表达，在后续纯化中采用凝血酶或者肠激酶将硫氧还蛋白和目的蛋白切开，并采用多步柱层析将这两种蛋白分开，达到预期的纯化效果。因此要得到目的蛋白需分为两个步骤：酶切和纯化。目前通过基因工程手段表达有特殊标记的融合蛋白技术已经非常成熟，现有技术中采用静态酶切法，将目的蛋白置换到相应的酶切溶液内，静态酶切一定的时间，然后用不同的层析柱达到分离纯化的目的。
目前的酶切技术通常采用的静态酶切法，是将酶和底物蛋白充分混匀后，在合适的酶切条件下酶将融合蛋白切成目的蛋白和融合头，此时，酶只对它周围能接触到的蛋白产生酶切作用，酶切效率低，酶用量大，另外，酶和蛋白同时溶解在一种溶媒内，后续目的蛋白纯化中会有酶残留的问题。而且酶切时间长，酶和蛋白同时溶解在一种溶媒内，不仅给后续目的蛋白纯化带来影响，而且残留的酶对蛋白有进一步的酶切，使酶切终点不好控制，酶切的变异性增加。经过酶切的蛋白通常需要采用进一步的层析进行纯化，如果接下来纯化不能有效去除酶，则残留的酶会继续发挥作用，从而引入额外的杂质，无法有效的纯化目的蛋白。经过酶切的蛋白溶液内成分较复杂，如果按照常规的层析方法，目的蛋白吸附在层析介质上，然后再根据其不同的表面电荷和疏水性等物理性质将目的蛋白和杂蛋白分开，势必要经过多步层析，每一步层析柱都需要至少五种溶液来完成层析步骤，整个层析工艺比较复杂。每增加一步柱层析，会增加很多工作量，同时蛋白的回收率也会下降，因此用尽可能少的层析步骤达到相同的纯化效果是纯化工艺的最佳境界。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的问题，本申请在蛋白纯化工艺中，发明人巧妙地设计了一种可以一步纯化的方法：采用串联的两个层析柱一次纯化目的蛋白，大大缩减了成本和时间。具体而言，首先，将酶固定在介质上，然后将介质装到层析柱内，制成酶切层析柱，将固定有酶的层析柱和另一根有特定介质的层析柱串联，当融合蛋白在特定的缓冲条件下流经该串联的装置，目的蛋白直接从串联柱流穿，杂蛋白吸附在层析介质上，这样一步层析就可以得到高纯度的目的蛋白。
在一个实施方式中，本发明提供了一种一步从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤：
将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱内的介质上；
将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白的非目的蛋白(下文中也称为融合头)部分，并且不会吸附目的蛋白；
将含有所述融合蛋白的样品依次流经第一层析柱和第二层析柱。依照此方法，可以一步获得高纯度的目的蛋白，大大节省了成本，并且避免了多种杂蛋白的产生。
在一个优选的实施方式中，所述酶为凝血酶、肠激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。在实际操作中，可以根据这些酶的酶切位点来设计融合蛋白的结构，以便能够利用上述酶有效切得目的蛋白。
在一个进一步优选的实施方式中，所述第一层析柱内的介质选自高交联的琼脂糖、葡聚糖和纤维素中的一种。采用适当的固定方法，能够将酶固定到这些介质上。
在又一个优选的实施方式中，所述第二层析柱选自用于纯化含有标签蛋白的亲和层析填料、离子交换类填料和分子筛类填料中的一种。具体而言，第二层析柱内的介质的选择有几种情况：
当融合蛋白表达时含有标签的，第二层析柱选择用于纯化标签蛋白的亲和层析填料，例如，纯化his标签蛋白时，就选择Ni亲和填料，纯化BMP标签蛋白时，选用DextrinSepharose系列的填料，纯化Strep(II)标签蛋白时，选择StrepTactinSepharose系列填料，纯化GST标签蛋白时选用GlutathioneSepharoseFF系列填料；
当融合蛋白表达没有标签时，对融合蛋白、目的蛋白和酶切后的非目的蛋白部分进行分析，当目的蛋白等电点偏碱性，而全长融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等电点偏酸性，则可以选择阴离子交换系列介质作为第二层析柱的介质，(例如强阴离子交换Qsepharose系列、弱阴离子DEAESepharoseFF)；当目的蛋白等电点偏酸性，而全长融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等电点偏碱性，则可以选择阳离子交换系列介质作为第二层析柱的介质(例如强阳离子层析介质SPSepharose系列和弱阳离子CMSepharoseFF)。
当酶切后的目的蛋白和融合蛋白分子量差异很大时，第二层析柱可以选择分子筛介质，流动相经过时，收集不同的组分(例如：Superdex系列和Sephacryl系列)。第一层析柱中所述酶的固定在4±2℃，pH8-8.5条件下进行12-20小时，可以根据具体的酶和第一层析柱的选择具体优化固定酶的条件，例如可优选4℃，pH8.0，固定16小时。
本发明还提供了一种纯化蛋白的试剂盒，包括第一层析柱和第二层析柱，其中第一层析柱中的介质固定有能够从融合蛋白酶切得到目的蛋白的酶，第二层析柱中的介质能够吸附所述融合蛋白被酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附所述目的蛋白，所述试剂盒在使用时依次串联连接第一层析柱和第二层析柱。酶和层析柱可选的种类如上述方法中所述。
利用所述试剂盒可以实现上述纯化方法，并且，对于特定的融合蛋白，有成套的层析柱存在于试剂盒中，省略了制备上述特定层析柱的步骤，更进一步节省了纯化的时间。
本发明的纯化方法相对于现有技术中的纯化方法具有如下优势：1、提高酶切效率，降低酶反应时间，酶可以回收利用；2、酶经过固定化，不会对后续工艺造成污染，无需增加去除残余酶步骤；3；酶切体系和串联的层析柱平衡条件相同，减少了溶液种类和用量；4、酶切后的柱层析采用穿透模式，目的蛋白直接从柱上流穿，整个纯化工艺简单紧凑。
附图说明
图1为本发明的示意性流程图；
图2为示例性酶与介质偶联的化学方程式；
图3为本发明实施例1中酶切效率定量测量的结果，测定了实施例1的方法中不同流速的酶切效果图，其中各泳道说明如下：pre：酶切前；1、0.5ml/min流速柱上酶切，保留时间10min；2、1ml/min流速柱上酶切，保留时间5min；3、2ml/min流速柱上酶切，保留时间2.5min；4、5ml/min流速柱上酶切，保留时间1min；
图4为实施例1中重复酶切效果图，其中各泳道说明如下：pre：酶切前；1、酶切第一次；2、酶切第2次；3、酶切第3次；
图5为实施例2中不同酶切时间的肠激酶酶切效果图，各泳道说明如下：1、融合蛋白、2、酶切时间1分钟；3、酶切时间12分钟；4、酶切时间10分钟；5、酶切时间2分钟；6、酶切时间4分钟；7、酶切时间6分钟；8、酶切时间8分钟；
图6为根据实施例3的凝血酶切柱和精纯Q柱串联纯化后样品的电泳图；
图7为根据实施例4的肠激酶切柱和Ni柱串联酶切纯化效果图，其中各泳道分别为：1、分子量标记；2、Ni洗脱杂峰；3、Ni柱穿透的目的蛋白1；4、Ni柱穿透的目的蛋白2；各条带成分：a、剩余的融合蛋白；b、GH目的蛋白；c、融合头蛋白；
图8为PTH融合蛋白常规纯化工艺和固定化酶切与阴离子串联纯化工艺流程图对比。
具体实施方式
为了更详细地说明本发明的技术方案，下面通过具体实施方式示例性说明本发明，本领域技术人员应了解，这些实施方式仅仅为说明本发明的实施，并不构成对本发明的保护范围的限定。
在蛋白质工程化表达的现有技术中，能够直接表达出目的蛋白，而不带有其他杂质的情况很少，很多情况下通常是先表达出融合蛋白，然后通过酶切将融合蛋白上的非目的蛋白部分酶切掉，再通过纯化步骤得到目的蛋白。由于步骤繁琐，不仅耗时，整个生产线的成本也比较高，而且纯度经常达不到理想的要求。
本发明针对现有技术的不足，设计出新的纯化策略：将酶固定在固态介质上，不与目的蛋白互溶，因此不会给后续蛋白分离纯化带来影响。并且，酶经固定在介质上后，酶切效率提高，同时酶的稳定性提高，经过清洗后，可以多次使用。
根据本发明的一个实施方式，在制订蛋白质生产的整个策略之前，首先要选择合适的表达和纯化方式，表达载体和表达方式决定了融合蛋白的成分，从而决定了酶的种类。优选在融合蛋白中加入标签，例如组氨酸标签、GST、Strep(II)和BMP标签，并在标签和目的蛋白之间设计加入酶切识别位点，例如，凝血酶的酶切位点是Ile-Glu-Gly-Arg，肠激酶的酶切位点是DDDDK；木瓜蛋白酶的酶切位点是arg、lys、gly、L-Citrulline；胃蛋白酶的酶切位点是phe、trp、tyr等疏水氨基酸，胰蛋白酶的酶切位点是K-Lys和R-Arg后的Lys和Arg；，这样在酶切之后，通过针对标签设计的第二层析柱特异性结合上述标签，达到更便捷的纯化。
第一层析柱的选择可以根据所要固定化的酶来进行。而第二层析柱的选择则要根据融合蛋白中的标签、融合蛋白中非目的蛋白部分与目的蛋白的区别来选择。例如，当表达的融合蛋白带有组氨酸标签时，当融合蛋白表达时含有标签的，第二层析柱选择用于纯化标签蛋白的亲和层析填料。例如，纯化his标签蛋白时，就选择Ni亲和填料；纯化BMP标签蛋白时，选用DextrinSepharose系列的填料；纯化Strep(II)标签蛋白时，选择StrepTactinSepharose系列填料；纯化GST标签蛋白时选用GlutathioneSepharoseFF系列填料。
当融合蛋白表达没有标签时，对融合蛋白、目的蛋白和酶切后的非目的蛋白部分进行分析：当目的蛋白等电点偏碱性，而全长融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等电点偏酸性，则可以选择阴离子交换作为第二层析柱，例如强阴离子交换Qsepharose系列、弱阴离子DEAESepharoseFF；当目的蛋白等电点偏酸性，而全长融合蛋白和酶切后的非目的蛋白等电点偏碱性，则可以选择阳离子交换作为第二层析柱，例如强阳离子层析介质SPSepharose系列和弱阳离子CMSepharoseFF。
当酶切后的目的蛋白和融合蛋白分子量差异很大时，第二层析柱可以选择分子筛介质，流动相经过时，收集不同的组分。例如：Superdex系列和Sephacryl系列。
通过选择合适的层析串联酶切，可以不更换缓冲液，使目的蛋白流穿，融合头和未切的融合蛋白吸附在柱上，一步纯化就可以得到高纯度的目的蛋白。流程图参见图1。
下文结合具体实施例示例性说明本发明的技术构思。
制备例固定化酶的制备方法(介质活化和酶的偶联)
酶的固定化基质可选用比较适宜生物大分子的富含羟基的大孔网琼脂糖为载体，经溴化氢活化后再与酶蛋白的氨基偶联，完成酶固定化过程，如图2所示。富含羟基的介质在酸性水溶液中充分溶胀后，生成亚胺碳酸活性基团，该基团能与蛋白质或伯胺NH2发生翻译，生成异脲衍生物，对外表现为蛋白质和介质成为一体。偶联后的介质用低pH值和高pH值缓冲液交替洗涤，去掉游离的和结合不牢固的酶。
将固定化酶介质装填到合适的色谱柱内，即得到第一层析柱。
制备例1：固定化凝血酶柱(第二层析柱)的制备
1.取2.1gCNBr活化的Sepharose4B填料粉末用300ml1mMHCl分次溶胀，然后用该溶液反复冲洗填料(最终填料体积为5ml)；
2.取1瓶凝血酶(1000IU/瓶)用3mlddH2O溶解，分2次用HiTrap脱盐柱(5ml)换液至0.1MNaHCO3pH8.3；500mMNaCl，最终得到换液后的凝血酶5ml；
3.将步骤1中的5ml活化后的填料用50ml0.1MNaHCO3pH8.3，500mMNaCl充分平衡后，加入5ml换液后的凝血酶，4℃缓慢搅拌过夜；
4.用0.1MTris-HCl，pH8.0溶液以2ml/min的流速封闭未结合凝血酶的位点。
制备例2：固定化肠激酶柱的制备
1.取1.5gCNBr活化的Sepharose4B填料粉末用1mMHCl溶胀，用200ml的1mMHCl分批反复冲洗填料(最终填料体积为3.75ml)；
2.取肠激酶3.0ml(0.9mg/ml批号为“0909043.6U/ul)，分2次用HiTrapDesaltingColumn(5ml)脱盐至0.1MNaHCO3pH8.3，500mMNaCl，最终得到换液后的肠激酶溶液5ml；终浓度为A280为0.6OD/ml
3.3.75ml活化后的填料加入3.75mlCouplingBuffer后加入3.75ml换液后的肠激酶(EK酶)，4℃缓慢搅拌过夜，复测上清中肠激酶的浓度A280为0.15OD/ml；
4.用0.1MTris-HCl，pH8.0溶液以2ml/min的流速封闭未结合EK酶的位点。
固定化酶的酶切
使用前需对固定化酶进行酶切效率定量，测定方法如下：
将底物蛋白溶液以一定的流速流经固定化酶的层析柱，记录酶与蛋白的接触时间，根据酶切效率，确定合适的酶切时间，后续重复酶切时，控制相同的酶切时间即可。
根据测量的酶切效率，调整底物蛋白溶液和流速(即酶的接触时间)，收集流穿峰，即得酶切后的混合液。
实施例1：固定化凝血酶酶切硫氧还蛋白-PTH融合蛋白(Trx-PTH)
目的：将Trx-PTH以不同流速通过制备例1制备的固定化凝血酶柱，确定合适的酶切流速，以确定合适的酶切时间。
分析：1、硫氧还蛋白-PTH融合蛋白含有凝血酶的酶切位点，没有标签；适用的第一层析柱选择溴化氢活化的介质(Sepharose4B)，通过上述介绍的固定化酶的方法，将凝血酶固定到介质上，装在第一根层析柱内；2、由于酶切后的目的蛋白等电点大于9.0，而融合蛋白和非目的蛋白的等电点均低于7.5，因此第二层析柱选择阴离子交换介质(QSepharoseBigBeads)。
层析柱：固化凝血酶的Sepharose4BXK16/20柱，5ml
平衡液：25mMTris,pH8.0；50mMNaCl
样品：PTH融合蛋白Trx-PTH(1140401-2)
缓冲液:25mMTris,pH8.0；50mMNaCl；1M尿素),OD为5.0mg/ml
上样1：0.5ml/min,保留时间10min，上样温度为25℃
上样2：1ml/min,保留时间5min，上样温度为25℃
上样3：2ml/min,保留时间2.5min，上样温度为25℃
上样4：5ml/min,保留时间1min，上样温度为25℃
收集流穿，电泳检测如图3所示，从电泳结果可以看出，酶切条件为25mMTris，pH8.0；50mMNaCl在室温条件下酶切1-5分钟，均能将融合蛋白酶切掉90％以上。
为了验证固定化酶切柱可以重复使用。在酶切保留时间为2.5分钟，2.0ml/min流速下重复使用多次固定化酶柱。酶切效果没有变化。结果如图4所示。
固定化凝血酶柱在5ml/min以下的流速下对Trx-PTH进行酶切，80％融合蛋白被酶切，对比静态酶切数据如下表1所示：
表1：凝血酶传统静态酶切和固定化酶切融合蛋白对照表
由上表可见，就凝血酶来说，在时间成本和酶的使用量上，本发明的固定化酶切的方法都显著优于静态酶切。
实施例2：固定化肠激酶酶切硫氧还蛋白-GH融合蛋白(Trx-GH)
分析：硫氧还蛋白-GH融合蛋白中包括的肠激酶酶切位点DDDDK以及His纯化标签，因此第一层析柱选择溴化氢活化的介质(Sepharose4B)，通过上述介绍的固定化酶的方法，将肠激酶固定到介质上，装在第一根层析柱内，融合蛋白和酶切后的非目的蛋白部分均带有His标签，因此第二层析柱选择Ni亲和柱(NISepharoseFF层析)；
层析柱：固定化肠激酶的Sepharose4BXK16/20柱，5ml
平衡液：25mMTris,pH8.0；50mMNaCl
样品：GH融合蛋白PA沉淀1.2g，(H401-2),用Buffer:50mMTris,pH8.0；50mMNaCl充分溶解,离心去除沉淀，OD为7.5OD/ml。
为了检测酶切是否完全，重复上样多次，用来增加酶切时间，以便于判断不同酶切时间的酶切梯度效果，并电泳检测其酶切结果。
上样1：上样流速5ml/min,保留时间1min，上样温度为25℃
上样2：上样流速2.5ml/min,保留时间2min，上样温度为25℃
上样3：收集上样2穿透峰，重复上样，流速为2.5ml/min,保留时间4min，上样温度为25℃
上样4：收集上样3流穿液重复上样一次，保留时间6min，上样温度为25℃
上样5：收集上样4流穿液重复上样一次，保留时间8min，上样温度为25℃
上样6：收集上样5流穿液重复上样一次，保留时间10min，上样温度为25℃
上样7：收集上样6流穿液重复上样一次，保留时间12min，上样温度为25℃
收集流穿，电泳检测如图5所示。
从电泳结果可以看出，酶切条件为50mMTris,pH8.0；50mMNaCl在室温条件
下酶切10-12分钟，均能将融合蛋白酶切掉90％以上。
由此可见，固定化酶切比传统酶切无论在成本上，还是时间上都占有很大优势，详见表2。
固定化肠激酶柱在50mMTris,pH8.0；50mMNaCl在室温条件下在酶切时间为10分钟，对GH融合蛋白进行酶切，90％以上的融合蛋白被切开，本发明的固定化酶切对比传统静态酶切数据如下：
表2：传统酶切和固定化肠激酶酶切融合蛋白对照表
由上表可见，就肠激酶来说，在时间成本和酶的使用量上，本发明的固定化酶切的方法也都显著优于静态酶切。
固定化酶柱和层析柱的串联
利用融合蛋白的酶切得到目标蛋白时，通常在融合头和目的蛋白之间插入合适的标签，如6His，GST，BMP等可以较为方便纯化的融合蛋白，同时也可以在酶切后方便的去除融合头。固定化酶之后串联标记的亲和层析，可以方便的去除融合头和未切的融合蛋白，直接得到目的蛋白。例如，对于带6His标签的融合蛋白经过固定化酶切之后，含有融合头、目的蛋白和未被切的融合蛋白，酶切液直接通过串联的金属螯合层析柱，融合头和未被切的融合蛋白被吸附在层析柱上，而目的蛋白流穿。通过一个步骤就可以得到高纯度的目的蛋白，节省了时间，提高了效率。
不带标记的融合蛋白也可以根据目的蛋白的性质串联层析柱，达到一步酶切和纯化的目的。当目的蛋白和融合头的等电点相差较大，而目的蛋白的等电点高于酶切pH时，可以用阴离子层析柱和固定化酶柱串联，经过酶切后的目的蛋白等不吸附在阴离子交换介质上，而偏酸性会吸附在柱子上，同时脱离的酶也能吸附到阴离子介质上。
实施例3：固定化凝血酶和阴离子交换柱的串联
将固化凝血酶柱XK16/20柱(5ml)和QsepharoseBigBead柱XK16/20(5ml)串联。以下面程序进行层析操作：
平衡液：25mMTris-HCl(pH8.0)+50mMNaCl，平衡50ml
上样：以2ml/min流速将Trx-PTH加入串联的层析柱，酶切时间为2.5分钟
收峰：收集穿透峰。
收集到的穿透峰进行电泳。通过串联酶切和纯化一个步骤目的蛋白的纯度达到90％以上。
结果参见图6。
由上述结果可见，使用本发明的方法，不仅节省了时间和经济成本，简化了程序，避免了污染的可能，还能保持甚至得到更高的目的蛋白纯度。
实施例4：固定化肠激酶和NI亲和柱的串联
层析柱：固定化肠激酶的Sepharose4BXK16/20柱，5ml串联NIFF层析柱5ml
平衡液：25mMTris,pH8.0；50mMNaCl
样品：GH融合蛋白PA沉淀1.2g，(H401-2),用Buffer:50mMTris,pH8.0；50mMNaCl充分溶解,离心去除沉淀，OD为7.5OD/ml
上样流速1ml/min,保留时间4min，上样温度为25℃
收集穿透峰，电泳检测纯度。
参见图7可见，得到的蛋白纯度较高
由上述结果可见，使用本发明的方法，不仅节省了时间和经济成本，简化了程序，避免了污染的可能，还能保持甚至得到更高的目的蛋白纯度。
使用后，拆开两根串联柱，分别清洗，保存备用。
另外，发明人经反复试验发现，本发明中的酶切柱可以保存在20％酒精内，不影响其酶切效率。因此，本发明的试剂盒能够长久保存，而且不影响其效果，适合商品化出售。
虽然上文结合具体实施例示例性说明了本发明，但是在不脱离本发明的精神的情况下，本领域技术人员可以根据本领域知识对其进行适当的修改，这些修改也应落入本发明保护的范围内。本发明的范围由权利要求书限定。
Claims (9)
1.一种从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤：
将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱内的介质上；
将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附目的蛋白；
将含有所述融合蛋白的样品依次流经第一层析柱和第二层析柱。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述酶为凝血酶、肠激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一层析柱内的介质选自高交联的琼脂糖、葡聚糖和纤维素中的一种。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述第二层析柱的介质选自用于纯化含有标签蛋白的亲和层析填料、离子交换类填料和分子筛类填料中的一种。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶的固定在4±2℃，pH8-8.5条件下进行12-20小时。
6.一种纯化蛋白的试剂盒，包括第一层析柱和第二层析柱，其中第一层析柱中的介质固定有能够从融合蛋白酶切得到目的蛋白的酶，第二层析柱中的介质能够吸附所述融合蛋白被酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附所述目的蛋白，所述试剂盒在使用时依次串联连接第一层析柱和第二层析柱。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述酶为凝血酶、肠激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述第一层析柱内介质选自高交联的琼脂糖、葡聚糖和纤维素中的一种。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述第二层析柱内介质选自用于纯化含有标签蛋白的亲和层析填料、离子交换类填料和分子筛类填料中的一种。
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