CN103197081B - 一种蛋白质芯片及其制备和检测方法 - Google Patents
一种蛋白质芯片及其制备和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103197081B CN103197081B CN201310134867.1A CN201310134867A CN103197081B CN 103197081 B CN103197081 B CN 103197081B CN 201310134867 A CN201310134867 A CN 201310134867A CN 103197081 B CN103197081 B CN 103197081B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- chip
- solution
- detection
- platelet
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 77
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 claims description 16
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101800000734 Angiotensin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102400000344 Angiotensin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims 1
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 claims 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 claims 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims 1
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 abstract description 23
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 8
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 abstract description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 59
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 5
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229960003685 imatinib mesylate Drugs 0.000 description 4
- YLMAHDNUQAMNNX-UHFFFAOYSA-N imatinib methanesulfonate Chemical compound CS(O)(=O)=O.C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 YLMAHDNUQAMNNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- VJLOFJZWUDZJBX-UHFFFAOYSA-N bis(2-hydroxyethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].OCC[NH2+]CCO VJLOFJZWUDZJBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical group OC(=O)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003851 azoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 iron ion Chemical class 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- DUWWHGPELOTTOE-UHFFFAOYSA-N n-(5-chloro-2,4-dimethoxyphenyl)-3-oxobutanamide Chemical compound COC1=CC(OC)=C(NC(=O)CC(C)=O)C=C1Cl DUWWHGPELOTTOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种蛋白质芯片，其利用组氨酸标签与阳离子的亲和作用将待固定于芯片固相载体上的蛋白固定在芯片载体上，该结合方式对于蛋白质的功能基本不产生影响，同时组氨酸标签的携带简化了蛋白质的分离纯化及在SPR芯片上的固定方法，所述蛋白质芯片制备简单、易于实施，是一种低成本高通量的蛋白质芯片。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质芯片领域，尤其涉及一种通过组氨酸标签与固相载体上阳离子之间的亲和作用将待固定于芯片固相载体上的蛋白固定于所述固相载体的蛋白质芯片及其制备和检测方法。
背景技术
在人体或其他生物体生命活动中，蛋白质作为生物功能的主要执行者，参与和主导许多体内的生物活动，包括蛋白质-蛋白质相互作用，酶催化底物的反应并生成新的产物，抗体蛋白和多种不同来源的抗原之间的相互作用，蛋白质和核酸等生物大分子之间的相互作用。更为重要的是，蛋白质和不同小分子物之间的相互作用，主要体现在细胞信号传导过程中的激素和受体，细胞因子和受体蛋白等的相互作用。那些具有极强功能重要性并在病理分析过程中起着重要作用的蛋白质在疾病诊断和药物筛选中都是非常重要的目标蛋白。就药物筛选而言，可针对这些目标蛋白，通过不同方法找到具有高亲和力和目标蛋白结合的小分子药物。而对于疾病诊断，则需要将这些目标蛋白作为检测对象，测试其是否存在，而无论是疾病诊断还是药物筛选过程中，都需要高纯度的具有生物学活性的蛋白质，通常应用大肠杆菌或其他蛋白表达体系获得毫克级的蛋白高效表达，并应用色谱等一系列的蛋白纯化方法纯化出高纯度的蛋白。同时，必须进行相关生物功能实验来检测和保证获得的蛋白仍然具有生物学活性。
蛋白质芯片是指以生物分子作为配基，将其固定在固相载体的表面，形成的蛋白质微阵列（protein microarray）。根据其固定生物分子的不同，可以分为受体配体检测芯片，抗原芯片，抗体芯片等。根据芯片载体的不同，分为普通玻璃载玻片，多孔凝胶覆盖芯片和微孔芯片3种主要形式。目前应用最普遍的是玻璃片，另外PVDF膜，聚丙烯酰氨凝胶，硝化纤维素膜，聚苯乙烯微珠，磁性微珠等也有报道。近几年一种液相芯片逐渐受到人们的重视，该芯片由100种不同颜色的微球组成，每种颜色的微球可以携带一种生物探针。探针通过羧基结合到微球表面，通过鉴定微球颜色来确定反应类型，通过靶物质上的报告分子作定量分析。具有灵活性好、通量大的优点，可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测，现已被用在与各种抗原抗体反应相关的检测中。
蛋白质芯片在生物以及医药领域获得了广泛应用，目前蛋白质芯片主要用于以下方面（1）用于基因表达的筛选；（2）特异性抗原抗体的检测；（3）蛋白质的筛选及研究；（4）生化反应的检测；（5）药物筛选以及（6）疾病诊断。
蛋白质芯片技术主要包括四个基本要点：芯片阵列的构建，样品的制备，芯片生化反应，信号检测及分析。蛋白质芯片的核心技术是蛋白芯片的制备和反应信号的检测分析。由于蛋白质分子的活性依赖于不同的折叠方式，因此对芯片的表面修饰至关重要，要保证被点在芯片上的蛋白质不失活而又能牢固的固定在芯片上。对最普遍应用的玻璃片片基而言，用于制备蛋白质芯片的方法主要有戊二醛修饰法、聚赖氨酸修饰法、巯基修饰法和多糖修饰法等。但是这些方法普遍存在成本较高、操作复杂、效率较低等缺点。
本领域中需要能够进一步提高工作效率，同时大幅降低成本、简化操作的新的蛋白质芯片。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、易于实施的低成本高通量的蛋白质芯片及其制备和检测方法。
为了达到本发明的目的，采用了如下技术方案：
在第一方面，本发明提供了一种蛋白质芯片，其中待固定于芯片固相载体上的蛋白在N端连接组氨酸标签。
在本发明的蛋白质芯片中，所述待固定于芯片固相载体上的蛋白可通过所述组氨酸标签与固相载体上阳离子之间的亲和作用固定于所述固相载体，优选地所述阳离子为Cu2+、Fe3+、Zn2+、Co2+或Ni2+，更优选地为Ni2+。
在本发明的蛋白质芯片中，所述固相载体可以为96孔板。
本发明的蛋白质芯片，其可与质谱和/或表面等离子体共振联用。
在第二方面，提供了如第一方面所述的蛋白质芯片的制备方法，所述方法包括为所述待固定于芯片固相载体上的蛋白加上组氨酸标签。
本发明的蛋白质芯片的制备方法可以包括：
1）根据待固定于芯片固相载体上的蛋白的氨基酸序列，合成或克隆出相应的cDNA片段；
2）将所述cDNA片段以所述cDNA片段表达为蛋白质时在N端连接6*His-Tag的方式与表达载体可操作地连接；
3）将连接后的载体转化至表达宿主中；
4）挑选正确表达所述待固定于芯片固相载体上的蛋白的表达宿主进行培养，获得含有所述待固定于芯片固相载体上的蛋白的培养物；
5）利用组氨酸标签-阳离子亲和层析对所述培养物进行纯化，得到适用于蛋白质芯片固定的待固定于芯片固相载体上的蛋白；和
6）将所获得的待固定于芯片固相载体上的蛋白溶解后在固相载体上进行点样，获得蛋白芯片；
其中，所述表达载体优选为pQE-30；
所述表达宿主优选为大肠杆菌，更优选的为E.coli M15菌株，所述E.coliM15菌株含有卡那霉素抗性的质粒pREP4，同时带有表达lac抑制子的基因；并且
所述组氨酸标签-阳离子亲和层析中所用的阳离子优选为铜离子、铁离子、锌离子、钴离子或镍离子，更优选地为镍离子。
在第三方面，提供了如第一方面所述的蛋白质芯片的检测方法，所述方法包括采用质谱和/或表面等离子体子共振对所述蛋白芯片上待测物的结合进行检测。
本发明的蛋白质芯片的检测方法可包括：
a）配制待测物溶液；
b）将待测物溶液与所述蛋白芯片接触；
c）使用质谱检测所述蛋白芯片上待测物的结合和/或使用表面等离子体共振检测所述蛋白芯片上待测物与所述固定于芯片固相载体上的蛋白的结合常数/解离常数。
在本发明的蛋白质芯片的检测方法中，所述待测物可以为化合物、蛋白或核酸。
在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的蛋白质芯片在基因表达筛选、特异性抗原抗体、蛋白质筛选、药物筛选或用于疾病诊断的药物的制备中的用途。
本发明的有益效果：
（1）本发明所述蛋白质芯片基于质谱及表面等离子共振检测（SPR）技术的蛋白质芯片利用组氨酸标签与镍离子的亲和作用将待固定于芯片固相载体上的蛋白固定在芯片载体上，该结合方式对于蛋白质的功能基本上不产生影响。
（2）组氨酸标签的携带简化了蛋白质的分离纯化及在SPR芯片上的固定方法。在应用质谱进行检测时，不需要在待测物上携带特定荧光探针，大大降低了制备待测物的成本，可以保持生物分子的天然活性，使检测结果更加接近实际情况。
（3）使用质谱方法检测蛋白质芯片将大大提高检测的灵敏度，从而降低了对固定于芯片固相载体上的蛋白和待测物的量的需求。通过表面等离子共振检测技术，可计算得出化合物与蛋白质的结合、解离常数，该数据可为后续药物设计提供非常重要的信息。
附图说明
图1：小分子化合物与固定于芯片固相载体上的蛋白结合情况质谱检测结果图。
图2：小分子化合物与固定于芯片固相载体上的蛋白结合情况表面等离子共振检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例：以血小板源性生长因子（PDGF）为固定于芯片固相载体上的蛋白的蛋白质芯片制备以及利用所述芯片筛选与其具有高效结合的小分子化合物的实验方法。
1、试剂和仪器：
人肝癌细胞系(SMC-7721)、E.coli M15细胞株、pQE-30载体为本公司保藏，Taqplus DNA polymerase购自天根生化，限制性内切酶购自Promega公司，HBS-EP缓冲液(0.01mol/L HEPES，pH=7.4，0.15mol/L NaCl，3mmol/L EDTA，质量分数为0.005%的Surfactant P20)、Glycine-HCl、[N-乙基-N′-(3-二乙氨基丙酸)]碳二亚胺(EDC)、基琥珀酰亚胺(NHS)和盐酸乙醇胺购自Amersham Biosciences公司，胰蛋白酶(Trypsin)、基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、三氟乙酸(TFA)、3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(SA)购自Sigma公司，乙腈为国产分析纯试剂。
质谱仪为Bruker公司的Bruker MALDI-TOF-MS系统，表面等离子共振仪为Amersham Biosciences公司的BIA core3000系统，全自动点样仪为PerkinElmer公司PELSBiochip Array系统。小分子化合物库由美国科罗拉多大学化学实验中心馈赠，蛋白质芯片载体采用德国Qiagen公司的Ni NTA HisSorb Plates，SPR芯片载体采用美国BIAcore公司的biosensor chip NTA。
2、构建一套带有组氨酸标签的PDGF表达、纯化系统：
1）根据GeneBank中PDGF的cDNA序列，设计相应引物，以人肝癌细胞系(SMC-7721)的总RNA为模板克隆出相应的cDNA片段；
2）将克隆出的cDNA片段与载体pQE-30连接，该载体表达蛋白质时可在N端添加6*His-Tag；
3）将载体转化至E.coli M15菌株，该菌株含有卡那霉素抗性的质粒pREP4，同时它带有表达lac抑制子的基因，可以高效表达lac抑制子，阻遏外源蛋白的表达；
4）使用卡那霉素抗性挑选转化子进行培养，对阳性克隆进行培养，抽提质粒进行酶切验证及蛋白质电泳检测，获得3株表达PDGF的菌株；
5）以兔抗PDGF血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔Ig为二抗，TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)为显色底物，以PDGF为参比对照检测所表达蛋白的抗原性；
6）将活化后的表达菌株按1%接种至1L的LB培养液中，诱导表达后的菌液8000r/min离心10min收获菌体，用溶菌缓冲液溶解沉淀，超声波充分破碎后离心。取上清液过Ni-NTA(已用溶菌缓冲液平衡)。洗涤缓冲液(50mmol·L-1NaH2PO4，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑)将杂蛋白洗去，最后用洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑)将目标蛋白洗脱。得到100mg纯度为99.6%的PDGF蛋白。
3、将带有组氨酸标签的PDGF固定在Ni NTA HisSorb Plates96孔板上：
1）将蛋白质溶解至PBS缓冲液，检测溶液OD值，并根据检测结果确定蛋白质浓度；
2）将蛋白质溶液稀释至1μg/μL，使用PELS Biochip Array全自动点样仪按照每微孔100μL的体积将蛋白质溶液点样至Ni NTA HisSorb Plates96孔板上；
3）室温下静置30min，将上溶液吸弃，此时每微孔内可固定蛋白质1-5μg。
4、化合物库的点样
1）将小分子化合物溶解至PBS缓冲液中，控制终浓度为1×10-12mol；
2）使用PELS Biochip Array全自动点样仪，将化合物溶液点入每一微孔，并使用甲磺酸伊马替尼溶液作为阳性对照，使用去离子水作为阴性对照；
3）室温下静置30min后将上溶液吸弃；
4）使用PBS缓冲液清洗微孔2-3次，洗去非特异性结合的化合物。
5、质谱检测
1）采用10mmol/L Glycine-HCl(pH=2.5)作为基质喷雾加到芯片表面，采用C18ZipTipTM脱盐，并进行干燥；
2）使用Bruker MALDI-TOF-MS飞行时间质谱仪检测芯片。氮气激光源(337nm，脉冲宽度3ns)，加速电压为25kV，Grid设为92.5%，延迟时间为1000ns，质谱信号单次扫描累加100次，PMF测定时，使用反射模式，加速电压为20kV，Grid设为64.5%，延迟时间为100ns，质谱信号单次扫描累加50次。使用标准肽混合物Angiotensin1(Mr=1296.6853)和ACTH18-39片段(Mr=2465.1989)作为外标校正，均为正离子模式。
检测结果参考图1：
其中，上图为甲磺酸伊马替尼的检测结果，Mass值为588.7，其实际分子量为587.7差别的1个道尔顿是由于质谱检测前需使样品带有一个电荷的缘故；下图为KA0086412号化合物的检测结果，结果显示，Mass值为565.3，与其实际分子量564.3相吻合。此外共有12个样品具有不同程度的结合（图略）。
6、表面等离子共振检测：
1）按操作说明书将PDGF耦联到biosensor chip NTA芯片的FC1通道上，活化条件相同但表面没有固定PDGF的FC2通道设为空白对照，偶联后使用60μL盐酸乙醇胺(pH=8.0)封闭芯片。整个实验使用HBS-EP缓冲液为工作液，温度为25℃；
2）小分子化合物用HBS-EP缓冲液稀释成5种不同浓度（40nmol/L，60nmol/L，80nmol/L，100nmol/L，200nmol/L），每次进样30μL，流速为5μL/min。
检测结果参考说明书附图2：
其中，上图为甲磺酸伊马替尼与PDGF结合与解离的动力学曲线；下图为KA0086412号化合物与PDGF的结合与解离的动力学曲线。
计算公式参考：Rep/Mr=cRmax/(c+KD)
采用BIA evaluation(Version3.1)软件，使用1∶1(Langmuir)Binding模型，计算动力学参数(Ka，Kd)。结果显示：甲磺酸伊马替尼与PDGF的Ka=2.76×105，Kd=1.21×10-3，KA0086412号化合物与PDGF的Ka=1.35×105，Kd=2.47×10-3。
由以上结果可以得知，在本发明的蛋白质芯片中，可以利用组氨酸标签与镍离子的亲和作用成功地将蛋白固定在芯片载体上，并且这种结合方式对于蛋白质的功能基本上不产生影响。并且本发明的蛋白质芯片可以定量定性检测待测物与芯片上蛋白的结合情况，为后续的应用提供了更多更准确的数据信息。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细结构特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (1)
1.一种蛋白质芯片的检测方法，其特征在于，包括：
1)根据GeneBank中血小板源性生长因子的cDNA序列，设计相应引物，以人肝癌细胞系的总RNA为模板克隆出相应的cDNA片段；
2)将克隆出的cDNA片段与载体pQE-30连接，所述载体表达蛋白质时在N端添加6*His-Tag；
3)将载体转化至E.coli M15菌株，所述菌株含有卡那霉素抗性的质粒pREP4，同时它带有表达lac抑制子的基因；
4)使用卡那霉素抗性挑选转化子进行培养，对阳性克隆进行培养，抽提质粒进行酶切验证及蛋白质电泳检测，获得3株表达血小板源性生长因子的菌株；
5)以兔抗血小板源性生长因子血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔Ig为二抗，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺为显色底物，以血小板源性生长因子为参比对照检测所表达蛋白的抗原性；
6)将活化后的表达菌株按1％接种至1L的LB培养液中，诱导表达后的菌液8000r/min离心10min收获菌体，用溶菌缓冲液溶解沉淀，超声波充分破碎后离心；取上清液过Ni-NTA；含有50mmol·L-1 NaH2PO4，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑的洗涤缓冲液将杂蛋白洗去，最后用含有50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl和250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱，得到100mg纯度为99.6％的血小板源性生长因子蛋白；
7)将带有组氨酸标签的血小板源性生长因子固定在Ni NTA HisSorb Plates 96孔板上：a)将蛋白质溶解至PBS缓冲液，检测溶液OD值，并根据检测结果确定蛋白质浓度；b)将蛋白质溶液稀释至1μg/μL，使用PELS Biochip Array全自动点样仪按照每微孔100μL的体积将蛋白质溶液点样至Ni NTA HisSorb Plates 96孔板上；c)室温下静置30min，将上溶液吸弃，每微孔内固定蛋白质1-5μg；
8)化合物库的点样：a)将小分子化合物溶解至PBS缓冲液中，控制终浓度为1×10- 12mol；b)使用PELS Biochip Array全自动点样仪，将化合物溶液点入每一微孔，并使用甲磺酸伊马替尼溶液作为阳性对照，使用去离子水作为阴性对照；c)室温下静置30min后将上溶液吸弃；d)使用PBS缓冲液清洗微孔2-3次，洗去非特异性结合的化合物；
9)质谱检测：a)采用pH＝2.5的10mmol/L Glycine-HCl作为基质喷雾加到芯片表面，采用C18ZipTipTM脱盐，并进行干燥；b)使用Bruker MALDI-TOF-MS飞行时间质谱仪检测芯片；337nm，脉冲宽度3ns的氮气激光源，加速电压为25kV，Grid设为92.5％，延迟时间为1000ns，质谱信号单次扫描累加100次，PMF测定时，使用反射模式，加速电压为20kV，Grid设为64.5％，延迟时间为100ns，质谱信号单次扫描累加50次；使用Mr＝1296.6853的标准肽混合物Angiotensin 1和Mr＝2465.1989的ACTH18-39片段作为外标校正，均为正离子模式。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310134867.1A CN103197081B (zh) | 2013-04-17 | 2013-04-17 | 一种蛋白质芯片及其制备和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310134867.1A CN103197081B (zh) | 2013-04-17 | 2013-04-17 | 一种蛋白质芯片及其制备和检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103197081A CN103197081A (zh) | 2013-07-10 |
| CN103197081B true CN103197081B (zh) | 2016-08-10 |
Family
ID=48719769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310134867.1A Expired - Fee Related CN103197081B (zh) | 2013-04-17 | 2013-04-17 | 一种蛋白质芯片及其制备和检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103197081B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103454245B (zh) * | 2013-08-28 | 2016-04-20 | 中国科学院植物研究所 | 一种定性定量检测植物激素活性赤霉素的方法及其专用芯片 |
| CN104749226A (zh) * | 2013-12-25 | 2015-07-01 | 辰欣药业股份有限公司 | 一种用电位滴定法测定甲磺酸伊马替尼含量的方法 |
| CN104237344A (zh) * | 2014-09-02 | 2014-12-24 | 济南大学 | 用于卡那霉素检测的电化学适体电极及其制备方法 |
| CN109142501B (zh) * | 2015-03-17 | 2020-06-05 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 全自动多肽提取飞行时间质谱检测仪 |
| CN105823807B (zh) * | 2016-01-04 | 2018-04-20 | 浙江农林大学 | 抗癌药物羟喜树碱药效检测装置及检测方法 |
| CN108956540A (zh) * | 2018-05-01 | 2018-12-07 | 中国科学院大学 | 一种快速筛选电荷反转型阳离子基因载体的spr方法 |
| CN109239153B (zh) * | 2018-08-16 | 2021-06-01 | 上海交通大学医学院 | 一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法及其在小分子抑制剂研发中的应用 |
| CN115445677A (zh) * | 2022-08-23 | 2022-12-09 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 一种与maldi-tof-ms分析联用的微流控芯片 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1381723A (zh) * | 2002-05-16 | 2002-11-27 | 复旦大学 | 一种蛋白质芯片及其制作方法 |
| CN101063143A (zh) * | 2007-05-11 | 2007-10-31 | 北京现代高达生物技术有限责任公司 | 一种重组巨细胞病毒gp52蛋白及其应用 |
| CN102449476A (zh) * | 2009-05-28 | 2012-05-09 | 东国大学校产学协力团 | 筛选抑制目标蛋白质-蛋白质相互作用的候选新药以开发一类药物的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005326165A (ja) * | 2004-05-12 | 2005-11-24 | Hitachi High-Technologies Corp | タンパク質相互作用解析のための抗タグ抗体チップ |
| CN101486662A (zh) * | 2009-02-25 | 2009-07-22 | 中国科学技术大学 | 一种氮川三乙酸亲和分子层的制备方法 |
-
2013
- 2013-04-17 CN CN201310134867.1A patent/CN103197081B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1381723A (zh) * | 2002-05-16 | 2002-11-27 | 复旦大学 | 一种蛋白质芯片及其制作方法 |
| CN101063143A (zh) * | 2007-05-11 | 2007-10-31 | 北京现代高达生物技术有限责任公司 | 一种重组巨细胞病毒gp52蛋白及其应用 |
| CN102449476A (zh) * | 2009-05-28 | 2012-05-09 | 东国大学校产学协力团 | 筛选抑制目标蛋白质-蛋白质相互作用的候选新药以开发一类药物的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Fabrication of Histidine-Tagged Fusion Protein Arrays for Surface Plasmon Resonance Imaging Studies of Protein-Protein and Protein-DNA Interactions;Greta J. Wegner，et al.;《Analytical Chemistry》;20030801;第75卷(第18期);摘要 * |
| NiⅡ-NTA修饰的银纳米粒/多孔硅芯片在线分离组氨酸标记蛋白和MALDI-TOF质谱分析;颜红 等;《无机化学学报》;20110831;第27卷(第8期);全文 * |
| 人血小板衍生生长因子BB 原核表达及生物学活性鉴定;杨春露 等;《南方医科大学学报》;20081231;第28卷(第2期);第166-167页"l材料和方法"部分 * |
| 固定化金属亲和磁性纳米粒子的制备及其纯化组氨酸标签蛋白质的研究;郭晓翔;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (工程科技Ⅰ辑)》;20100715;摘要 * |
| 表面等离子共振技术测定药物与人血清白蛋白的相互作用;路萍萍 等;《中国药理学与毒理学杂志》;20070430;第21卷(第2期);摘要 * |
| 表面等离子共振-质谱法对相互作用的生物分子在 10*E-15mol水平的微量鉴定;聂松 等;《高等学校化学学报》;20050131;第26卷(第1期);摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103197081A (zh) | 2013-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103197081B (zh) | 一种蛋白质芯片及其制备和检测方法 | |
| CN101144814A (zh) | 应用适配子型试剂检测、鉴定和/或定量化合物的方法 | |
| JP2007044043A (ja) | 分離検出法におけるオンライン酵素消化 | |
| Zhang et al. | Development of a MALDI-TOF MS strategy for the high-throughput analysis of biomarkers: on-target aptamer immobilization and laser-accelerated proteolysis. | |
| CN108982737A (zh) | 一种规模化的核心岩藻糖基化修饰位点占有率定量方法 | |
| CA2287545A1 (en) | Ma family polypeptides and anti-ma antibodies | |
| EP2229402B1 (en) | Synthetic peptides immuno-reactive with rheumatoid arthritis auto-antibodies | |
| CN111777696B (zh) | 一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法 | |
| CN106153876A (zh) | 一种利用血糖仪定量检测生物标识物的方法 | |
| CN113567685B (zh) | 基于核酸适配体探针的hgfr识别方法及检测hgfr的试剂盒 | |
| CN110873766B (zh) | 筛选药物引起结构和相互作用变化蛋白质的质谱分析方法 | |
| Shively et al. | Highlights of protein structural analysis | |
| WO1998011436A1 (en) | Non-specific affinity enhancement to identify combinatorial library members | |
| WO2020014883A1 (zh) | 一种特异性识别妥布霉素的单链dna适配体及其应用 | |
| US20240168034A1 (en) | Methods and systems for single cell protein analysis | |
| CN114539362B (zh) | 一种肉毒毒素特异性底物肽、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN111239271A (zh) | 利用同位素标记技术定量微量生物样本蛋白质组的方法 | |
| CN106153746A (zh) | IgG2型单抗二硫键配对分析方法 | |
| CN112625091B (zh) | 一条结合猪瘟病毒Erns蛋白的多肽序列及应用 | |
| CN110308281B (zh) | 一种泛素链固相检测方法和应用 | |
| CN103033628A (zh) | 制备个体全蛋白质组芯片的方法及其应用 | |
| CN110423731A (zh) | Jo-1蛋白的制备方法及其应用 | |
| CN113567684B (zh) | 基于核酸适配体探针的IFNg识别方法及检测IFNg的试剂盒 | |
| Iliuk et al. | Quantitative phospho-proteomics based on soluble nanopolymers | |
| CN113945720B (zh) | 基于核酸适配体探针的pdgf-bb识别方法及检测pdgf-bb的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20161209 Address after: 518000 Guangdong city of Shenzhen province Qianhai Shenzhen Hong Kong cooperation zone before Bay Road No. 1 building 201 room A (located in Shenzhen Qianhai business secretary Co. Ltd.) Patentee after: SHENZHEN QIANHAI ICECOLD INFORMATION TECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 214192 Jiangsu city of Wuxi province Xishan Economic Development Zone in three Furong Road No. 99 room 311 5 zuiun Patentee before: Wuxi Youchuang Biological Science & Technology Co., Ltd. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160810 Termination date: 20180417 |