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CN105473702A - 通过控制氧利用率从不具有“异常特征”的富脂质微藻生物质工业生产粉的方法 - Google Patents

通过控制氧利用率从不具有“异常特征”的富脂质微藻生物质工业生产粉的方法 Download PDF

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CN105473702A
CN105473702A CN201480046493.0A CN201480046493A CN105473702A CN 105473702 A CN105473702 A CN 105473702A CN 201480046493 A CN201480046493 A CN 201480046493A CN 105473702 A CN105473702 A CN 105473702A
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CN
China
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biomass
lipid
algae
chlorella
respiratory quotient
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CN201480046493.0A
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西尔万·德拉罗什
马里·勒吕耶
劳伦特·塞盖拉
海克·耶罗施
阿芒迪娜·德吕翁
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Corbyn Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Roquette Freres SA
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Abstract

本发明涉及一种用于以工业规模发酵生产具有可接受感官特性的小球藻属的微藻的富脂质生物质的方法,其特征在于通过追踪所述微藻的呼吸商来控制发酵罐中的溶解氧利用率。

Description

通过控制氧利用率从不具有“异常特征”的富脂质微藻生物质工业生产粉的方法
本发明涉及用于以工业规模生产具有可接受的感官品质的小球藻属的富脂质微藻的生物质的新颖方法。
本发明特别适合控制伴随富含单不饱和脂肪酸(具体地是油酸)的微藻生物质随时间推移的不稳定性的氧化酸败。
背景技术
在历史上,藻类“只需水和阳光”来生长,因此藻类长期被认为是食物的来源。
存在若干可用于食品中的藻类物种,大部分为“大型藻类”,例如海带、海白菜(石莼(Ulvalactuca))和紫菜属(Porphyra)(培养于日本)或“红皮藻(dulse)”(帕尔玛利亚掌叶(Palmariapalmata))型红藻。
然而,除这些大型藻类外,还存在其他由“微藻”代表的藻类来源,也就是海洋或非海洋起源的光合作用或非光合作用单细胞微型藻类,其经培养应用于生物燃料或食品中。
举例来说,在开放的泻湖中(在光养条件下)培养螺旋藻(钝顶螺旋藻(Arthrospiraplatensis))以用作食品补充剂或以少量掺入糖果产品或饮料中(通常小于0.5%重量/重量)。
其他富含脂质的微藻,包括属于小球藻属的某些物种,在亚洲国家作为食品增补剂也非常受欢迎。
使用可以被用于碳和能量代谢的葡萄糖或其他基于碳的底物,微藻的若干物种能够变光合自养生长(凭借光生长,该光提供能量用于转化CO2为基于碳的链)为异养生长(不需要光)。
当今工业上使用三种用于生产微藻的方法:
-在异养反应器中(完全封闭的);
-在露天池中;
-在玻璃管中。
由这些培养方法生产具有可变特性和组合物的小球藻属物种。它们的组合物将根据它们是否在光照中产生和是否在露天中产生而不同。
例如在文件WO2010/120923和WO2010/045368中描述了小球藻型微藻粉的生产和用途,该生产经由异养途径并且是在不存在促进它们的生长速度的光的条件下进行的。
微藻粉的油部分可基本上由单不饱和油构成,与常见于常规食物产品中的饱和、氢化和多不饱和油相比,可提供营养及健康优势。
然而,当期望从其生物质工业生产微藻粉粉末时,主要困难仍然不仅来自所生产组合物的技术观点,而且来自所生产组合物的感官特征的观点。
实际上,尽管例如使用以光合作用方式培养于室外池塘中或通过光生物反应器制造的藻类粉末是可商购的,但其具有深绿色(与叶绿素有关)和强烈的难闻味道。
即使配制于食物产品中或作为营养补充剂,这些藻类粉末也总是赋予食物产品或营养补充剂这种在视觉上无吸引力的绿色且具有难闻腥味或海洋藻类的气味。
至于小球藻,本领域中通常所接受的描述语为“绿茶”味道,其略微类似于其他绿色植物粉末(例如粉末状绿色大麦或粉末状绿色小麦),该味道是源于其高叶绿素含量。
它们的气味通常仅在它们与具有强烈气味的植物或柑橘类果汁混合时才被遮蔽。
此外,对于富脂质小球藻,会发生难闻的气味(异常特征),这些难闻的气味具体地关联脂质尤其是单不饱和脂肪酸的氧化降解产物。
因此,例如,油酸(C18:1)是对氧化敏感的,并且它的氧化降解导致:
-具有酸败气味的氢过氧化物和挥发性有机化合物的过氧化物的形成,以及
-不饱和脂肪酸的营养价值的损失。
不饱和脂肪酸的氧化降解(酶解或通过自动氧化)的产物主要是赋予非常特异性气味的由5至9个碳组成的羰基化合物和醇。
因此,包括9个碳的化合物,例如(E,Z)-2,6-壬二烯醛具有黄瓜和甜瓜的气味。包括8个碳的化合物(1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、1,5-辛二烯-3-醇)构成了植物的气味或构成了金属气味,即使单独地这些化合物具有蘑菇或天竺葵的气味。包括6个碳的化合物(己醇、己醛、(E)-2-己烯醛和(Z)-3-己烯-1-醇)参与了青香气味并且参与了藻类的气味。就其本身而言,(E,E)-2,4-庚二烯醛具有黄瓜的青香气味。
为了在实验室规模上控制脂肪酸的氧化降解,通过监测溶解氧压力(pO2)来控制为了满足微藻的氧需求的生物质的曝气度。
然后发酵方案包括借助以下进行的pO2的调节:
-气流速率和/或
-氧流速率和/或
-搅拌功率。
然而,当提出了将方案从实验室规模改换至工业规模的问题时,pO2的这种控制具有大难度。
这是因为,pO2是根据在饱和时发酵液中的溶氧浓度来限定。如果是在室温下并且是在大气压下,在空气下使水充气持续足够长的时段,则认为pO2是等于100%。
事实上,在发酵罐中,pO2探头的校准期间,溶解氧含量受到残余盐的浓度影响并且受发酵温度影响。
此外,常规接受的是,对于实验室发酵罐,pO2仅受由发酵液的高度产生的压力的影响,并且受混合效果的影响。
然而,在中等容量(约1m3)至大容量(约数百m3)的发酵罐上的工业化期间,与其相反,发酵液的高度将:
-对溶解氧压力有影响;以及
-在“并未完美搅拌的”发酵罐中引起复杂的现象。
从这个意义上来说,在实验室规模上建立的pO2值不能因此被外推至工业规模。
因此,仍存在对于具有保证具有适合的感观品质的小球藻属微藻粉组合物的工业规模生产的方法的未满足需要,使得能够将其用于更多的更多样化食物产品中。
发明概述
本申请人公司已经发现,可通过监测呼吸商(使用气体分析器),而不是通过监测pO2探头的响应,来调节所述氧转移需要,从而克服在控制必须足以满足微藻的需要同时尽可能防止产生的单不饱和脂肪酸的氧化降解作用的溶解氧利用率方面的这一难题。
此外,这一控制使得可使:
-藻种的代谢行为可视化,并且
-克服只可以通过测量pO2而常规观察到的过量氧合作用的问题。
因此,本发明涉及用于优选以工业规模发酵生产富脂质微藻生物质的方法,该方法包括至少一个培养步骤,在该培养步骤期间,通过监测所述微藻的呼吸商来控制发酵罐中的溶解氧利用率。
优选地在异养条件下培养微藻。
优选地,微藻属于小球藻属,并且可以选自下组,该组由以下各项组成:普通小球藻、耐热性小球藻和原壳小球藻。相当特别优选地,微藻是原壳小球藻。
微藻是富脂质的。获得的生物质具体地具有按生物质的干重计,多于30%或40%的脂质含量。
其间通过监测呼吸商来控制发酵罐中的溶解氧利用率的培养步骤优选地是脂质累积步骤。具体地,只要生物质具有按生物质的干重计,多于25%、优选地多于30%的脂质含量,就可以通过监测呼吸商来控制发酵罐中的溶解氧利用率。
根据本发明所述的方法使得可获得具有可接受的感官品质的生物质,该生物质特别包括很少或没有感官上不合意化合物,该感官上不合意化合物例如是单不饱和脂肪酸的氧化降解产物,并且更具体地是油酸的氧化降解产物。具体地,可以借助包括以下项的描述语,来进行这一感官品质的评估:颜色、涂层质地、甜味和以下风味:蘑菇味、谷物味、黄油/乳制品味、酸败油味和植物余味。
可以使用包括以下项的微藻粉组合物来进行感官分析:
o5%-10%的微藻粉组合物,优选地大约7%;
o0.5%-2%的糖,优选地大约1%;
o0.1%-0.5%的香草香料,优选地大约0.25%;以及
o剩余部分为脱脂奶,优选地大约91.75%,
该百分比是以该组合物的重量计,
所述组合物被匀质化并且在60℃-85℃、优选地大约75℃加热,持续2-10分钟,优选地大约5分钟。
感官分析还可以包括用与感官分析的描述语关联的挥发性有机化合物的SPME/GC-MS进行分析。优选地,所述挥发性有机化合物属于饱和和二不饱和醛、不饱和酮和羧酸以及其衍生物的家族。
为了防止或减少这些不合意化合物的生产,可以在监测期的期间,优选地在脂质累积期期间,当按生物质的干重计,脂质含量多于25%时,将呼吸商维持在大于1.5、优选地大于1.6、更优先地大于1.7、并且甚至更优先地大于1.8的值。
可以借助气体分析器来监测呼吸商,并且可以通过向发酵培养基供应氧,具体地通过调节搅拌速度、反压力或进入的空气(注入培养基中的空气)中的氧浓度,来控制呼吸商。
这一控制还使得可获得累积的YO2/S代谢比率(从发酵开始时计算),该代谢比率维持在小于0.28、优先地小于0.27、更优先地小于0.26的值。可替代地,它还使得可获得在脂质累积期期间,优选地当生物质包含多于25%的脂质、优选地多于30%的脂质(%表示按生物质的干重计)时观察到的YO2/S代谢比率,该代谢比率维持在小于0.28、优先地小于0.27、更优先地小于0.26的值。
发明详述
定义
出于本发明目的,在由感官小组对在食物配制品中的微藻粉组合物进行评估推断不存在改变含有这些微藻粉组合物的所述食物配制品的感官品质的异常特征时,该微藻粉组合物具有“可接受的感官品质”。
“异常特征”与特异性的不合意气味和/或芳香分子的存在有关。
术语“感官品质”旨在意指食物关于味道、气味、外观、颜色和稠度的特性。
“呼吸商”对应于每单位时间产生的CO2的量和消耗的O2的量之间的比率。可以通过分析留在发酵罐中的气体来获得这一商值。
“YO2/S代谢比率”对应于消耗的O2的量和消耗的底物(一般是葡萄糖)的量之间的比率。
“生产力”对应于分批补料模式下,每升并且每小时的发酵所产生的生物质的量。
“Yx/s转化率”常规地代表所形成的生物质和所消耗的葡萄糖之间的比率。
“小球藻属的微藻”在此旨在意指选自下组的微藻,该组由以下各项组成:原壳小球藻、凯氏小球藻(Chlorellakessleri)、微小小球藻(Chlorellaminutissima)、小球藻属、耐热性小球藻、黄绿小球藻(Chlorellaluteoviridis)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、瑞氏小球藻(Chlorellareisiglii)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、嗜糖小球藻(Chlorellasaccarophila)、凯氏拟小球藻(Parachlorellakessleri)、拜氏拟小球藻(Parachlorellabeijerinkii)、大型无绿藻(Protothecastagnora)和桑椹型无绿藻(Protothecamoriformis),优选地选自下组,该组由以下各项组成:普通小球藻、耐热性小球藻以及原壳小球藻。特别优选地,微藻是原壳小球藻。
发明主题
本领域技术人员常规地通过测量氧分压(pO2)确定发酵培养基中的溶解氧利用率。
这一技术在小的发酵罐上是令人满意的,因为可以认为由pO2探头给出的值代表了整个发酵罐。
然而,它并不使得可获知大工业发酵罐中的总体O2利用率,因为其中pO2并不是均匀分布的。
为了克服这一问题,本申请人公司因此已经开发了用于借助发酵的呼吸商的水平来控制氧合作用的方法,该呼吸商是包含在发酵罐中的微藻的代谢的迅速且可靠的指标。
因此本发明涉及用于工业生产富含脂质并且不具有感官上不合意化合物的微藻(优选是小球藻属的微藻)的生物质的新颖方法。这一方法其特征在于使用适合于大发酵罐的间接方法(监测微藻藻种的呼吸商)来控制溶解氧利用率,间接方法的概念与借助测量氧分压(pO2)的探头来测量溶解氧利用率的直接方法形成对比。
通过监测微藻的呼吸商来控制溶解氧利用率的目标是减少促成出现异常特征的分子(具体地是单不饱和脂肪酸的氧化降解产物,例如油酸)的合成。
确实,代谢途径的发育导致不合意分子取决于发酵培养基中的O2利用率。
与用于生物合成感兴趣分子的代谢途径(在恰当的例子中是用于生物合成C18:1油酸型的单不饱和脂肪酸的代谢途径)相比,这些降解途径需要更多氧。
这导致与靶向的生物合成途径相比,这些降解途径的更低的呼吸商。
因此,如在实施例中说明,对于选择为本发明的方法中的参照微藻的原壳小球藻而言,呼吸商是1.8-这反映了每摩尔的消耗的O2,产生了1.8摩尔的CO2-这时在细胞代谢中,油酸生物合成途径占优势。
从另一方面来说,当发酵是过量氧合的并且微藻产生氧化降解产物时,呼吸商不超过1.5。
根据本发明的方法是用于发酵生产富脂质生物质的方法,该方法包括培养步骤,在该培养步骤期间,通过监测微藻的呼吸商来控制发酵罐中的溶解氧利用率。
微藻优先地属于小球藻属。具体地,它们可以选自下组,该组由以下各项组成:普通小球藻、耐热性小球藻和原壳小球藻。优选地,微藻是原壳小球藻。
虽然它可以按更小的规模使用,但是优选地,以工业规模进行该方法,即在中等容量(大约1m3至100m3)和大容量(多于100m3)的发酵罐中。根据一个实施例,在具有至少1、10、25、50、75、100、500或1000m3的容量的发酵罐中进行该方法。
根据一个优选模式,在异养条件下培养微藻,该异养条件即没有光照,使用碳基基质(优选地是葡萄糖)作为碳和能量的来源。
借助根据本发明的方法获得的生物质是富脂质生物质。如在本申请中使用的表述“富脂质”是指按生物质的干重计,多于20%的脂质含量,优选地多于25%的脂质含量。根据一个具体实施例,借助根据本发明的方法获得的生物质具有按生物质的干重计,多于30%、35%、40%或44%的脂质含量。
优选地,其间通过监测微藻的呼吸商来控制发酵罐中的溶解氧利用率的培养步骤是其间生物质累积脂质的步骤。
脂质累积阶段是其间生物质的脂肪酸含量增加的培养阶段。这一步骤可以在专门旨在增加生物质的量的生长步骤之后。该步骤可以在生物质的量已经达到预定阈值例如大约70g/l时,具体地通过用氢氧化钾替换氨水调节pH,来触发。
更特别优选地,只要按生物质的干重计脂肪酸含量大于25%、优选地按生物质的干重计大于30%,就可以通过监测呼吸商来控制发酵罐中的溶解氧利用率。可替代地,可以贯穿发酵的持续期,来进行微藻的呼吸商的监测。
根据一个优选模式,借助根据本发明的方法获得的生物质具有可接受的感官品质。具体地,所述生物质包含很少或不包含感官上不合意化合物,例如单不饱和脂肪酸的氧化降解产物。具体地,生物质包含很少或不包含油酸氧化降解产物。
优选地,感官上不合意化合物的含量保持低于感官小组的检测阈值。具体地,相对于干生物质中脂肪酸的总重量,按重量计,亚油酸(油酸氧化降解产物)的含量小于18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%或7%。
可以通过制备微藻粉品尝组合物,并且通过询问优选地由至少10名个体组成的小组,来评估涉及外观、质地、气味和风味的描述语,从而限定生物质的感官品质。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法,例如像专利申请WO2010/12093中描述的方法,来从研磨且干燥的生物质来制备微藻粉。术语“微藻粉组合物”旨在意指按干重计,包括至少50%、60%、70%、80%、90%或95%的微藻生物质的组合物。然而,其他成分可任选地包含于此组合物中。微藻生物质是源自微藻细胞,这些微藻细胞可为全细胞或破裂细胞或全细胞和破裂细胞的混合物。
此外,在法国专利申请号1356113中,本申请人公司已经定义了非常简单的品尝基质,该品尝基质使得可进行类似于用远远更复杂且非常不同的处方(例如冰激凌或奶油糕点)所获得的感官评估的感官评估。使用此品尝基质的评估的精确性或准确性远高于使用简单水溶液所实施者,后者已证明不能预测(例如)微藻粉组合物在冰激凌中的感官品质。
因此,优选地,用于评估生物质的感官品质的微藻粉品尝组合物包括:
-5%-10%的微藻粉组合物,优选地大约7%;
-0.5%-2%的糖,优选地大约1%;
-0.1%-0.5%的香草香料,优选地大约0.25%;以及
-剩余部分为脱脂奶,优选地大约91.75%,
百分比是通过组合物重量来表示。
通过匀质化获得这一组合物,并且然后在60℃-85℃、优选地大约75℃加热,持续2-10分钟,优选地大约5分钟。
通过与参照组合物进行比较来评估该组合物的描述语,该参照组合物即是从鉴定为符合(即具有可接受的感观品质(由所述小组感知为符合测试的所有描述语))的参照微藻粉获得的品尝组合物。
优选地,如下表中所呈现的参照产物与每一描述语相关联:
在每一品尝阶段,针对每一描述语与视为具有可接受感官品质的参照批次相比来评估产品。
以(例如)1到9范围的量表以下列方式依次评估所有产品:
值1:所评估描述语并不呈现于产品中;
值5:所评估描述语以与具有可接受感官品质的参照产品完全相同的方式呈现于产品中;
值9:所评估描述语完全呈现于产品中。
重要的是应注意,具有可接受感官品质的参照批次未必为具有最佳感官特征的微藻粉:其优选地为由感官小组视为“满意”、尤其关于测试的所有描述语具有等级5的微藻粉组合物。
此外,本申请人公司已经确立,微藻粉组合物的感官特征还可以通过特定气味性分子、尤其是具体挥发性有机化合物的性质和检测阈值来定义(参见法国专利申请号1356113)。
确实,已经鉴定出13种挥发性有机化合物的系列,其在微藻粉组合物中的总含量使得可测定其感官品质。
这13种挥发性有机化合物如下:庚醛、3-辛烯-2-酮、2,4-庚二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、2,4-壬二烯醛、2,4-癸二烯醛、己酸、2-乙基己酸、庚酸、肉豆蔻酸酯-1、月桂酸酯-1、肉豆蔻酸酯-2和香叶基丙酮。
优选地,这些挥发性有机化合物通过固相微提取(SPME)进行采样且通过气相色谱GC、尤其通过GC-MS(气相色谱-质谱)进行分析。
13种挥发性有机化合物中的每一者的含量是通过对应于此挥发性有机化合物的SPME-GC/MS色谱图中特定离子的峰表面积来测定,并且是与参照产物的含量进行比较来测定。
通过使13种化合物中的每一者的含量相加,优选地,通过测定对应于13种化合物的色谱峰的总表面积,来获得总含量。然后可以将总含量与感官品质被限定为可接受或不可接受的参照微藻粉组合物的总含量进行比较。
因此,这13种挥发性有机化合物的低总含量与最佳化感官品质有关。与之相反,这13种挥发性有机化合物的更高总含量与中等或甚至较差或不可接受的感官品质有关。
根据一个具体实施例,用根据本发明的方法获得的微藻粉组合物具有的这13种挥发性有机化合物的总含量比具有不可接受感官品质的组合物的总含量低至少两倍,优选地低至少5、10或15倍。
根据另一个具体实施例,用根据本发明的方法获得的微藻粉组合物具有的这13种挥发性有机化合物的总含量与具有可接受感官品质的组合物的总含量相比是相同的或更低的。
根据一个优选实施例,在其间监测呼吸商的培养步骤期间,所述商值被维持在大于1.5、优选地大于1.6、更优先地大于1.7、并且甚至更优先地大于1.8的值。
因此,在一个具体实施例中,在脂质累积步骤期间,并且更具体地只要生产的生物质包含多于25%的脂质,优选地多于30%的脂质(%是用生物质的干重表示),就控制用于发酵微藻(优选原壳小球藻)的条件,以便将呼吸商维持在大于1.5、优选地大于1.6、更优先地大于1.7、并且甚至更优先地大于1.8的值。
可以借助分析从发酵罐逸出的气体的气体分析器,来连续地或半连续地监测呼吸商,具体地,该气体分析器对CO2和O2进行定量。
在这些测量的基础上,则可调节氧供应,以调节微藻的呼吸商并且因此来有效控制其代谢。
因此,在其中呼吸商太低的情况下,减少氧供应。在相反的情况下,可以增加氧供应或使其维持不变。
具体地,可以借助调节搅拌速度、反压力或进入的空气(注入培养基中的空气)中的氧浓度来进行至发酵培养基的氧供应。
本申请人公司还观察到,YO2/S代谢比率(表示消耗的氧的量/消耗的葡萄糖的量)可以被用于测定氧合作用是否在正确范围内。
因此,根据一个优选模式,具体地当微藻是原壳小球藻时,并且当借助根据本发明的方法生产的生物质具有按生物质的干重计多于30%的脂质含量时,累积YO2/S代谢比率(从发酵开始时计算)被维持在小于0.28、优先地小于0.27、更优先地小于0.26的值。
根据另一个优选模式,在脂质累积阶段期间,具体地是当生产的生物质包含多于25%的脂质、优选地多于30%的脂质(%是用生物质的干重表示)时观察到的YO2/S代谢比率被维持在小于0.32、优先地小于0.28、更优先地小于0.27、并且相当特别优选地小于0.26的值。
根据另一个方面,本发明还涉及用于异养培养微藻的方法,该方法包括:
-允许微藻生长的第一培养步骤,以及
-使得可富集具有脂质的生物质的第二培养步骤,并且在此期间,通过监测所述微藻的呼吸商,来控制发酵罐中的溶解氧利用率。
优选地,在第二步骤中,只要按生物质的干重计脂肪酸含量大于25%、优选地按生物质的干重计大于30%,就可以通过监测呼吸商来控制溶解氧利用率。
还将上述实施例应用于本发明的这一方面。
根据另一个方面,本发明还涉及用于生产微藻粉组合物的方法,其特征在于该方法包括根据本发明的方法生产微藻生物质,并且从所述生物质获得微藻粉。
本发明将借助于以下实施例更清楚地被理解,这些实施例旨在为说明性的和非限制性的。
实施例
实施例1:生产富脂质原壳小球藻-控制的氧合作用
使用的藻种是原壳小球藻UTEX250
预培养
-在一个2l埃伦迈尔烧瓶(Erlenmeyerflask)中的500ml培养基;
-该培养基的组成:
表1.
孵育在以下条件下进行:时间:72h;温度:28℃;摇动:110rpm(伊孚森莫特顿(InforsMultitron)孵育器)。
随后将预培养物转移到赛多利斯(Sartorius)30l发酵罐中。
用于生物质生产的培养:
基础培养基如下:
表2.
在接种后将发酵罐的初始体积(Vi)调节至7l。达到15-20l的最终体积。
用于进行不同测试的参数如下:
表3.
当葡萄糖的残余浓度下降至低于10g/l,则连续地提供处于在700g/l的浓缩溶液的形式的葡萄糖,以维持发酵罐中的葡萄糖含量在0和20g/l之间。
当已经消耗了1000g的葡萄糖时并且当生物质已经达到70g/l的浓度时,用氢氧化钾替换氨水来调节pH。这使得生物质能够累积脂质。
结果
用三个水平的氧合作用来进行这些测试。发酵罐中测量的溶解氧含量(pO2)被表示为当发酵罐被维持在大气压下并且供应空气时,在饱和下获得的含量百分比。100%的pO2对应于大约7mg/l的含氧量。
两个代谢指标用于量化氧合作用的水平对代谢的影响:
-呼吸商(RQ)=产生的CO2/消耗的O2
-产率YO2/S=消耗的O2/消耗的葡萄糖。
它们都是从留在发酵罐中的气体的氧气和CO2的含量计算,这些含量是使用气体分析器测量的。
对脂肪酸而言,用甲醇盐酸进行酯基转移并且用氯仿进行提取后,通过气相色谱以甲酯形式测定脂肪酸。结果用%分布来表示;经由内部标准化方法进行分析。
使用一个装配有分流-不分流注射器(带有tapfocus衬垫)以及火焰离子化检测器的色谱仪(美国瓦里安公司(VARIAN)3800)。
制备了一种内部校准溶液,该溶液包含大约精确地0.5mg十七酸甲酯/ml甲醇。十七酸甲酯作为色谱参照点使用。
将大约精确地30mg的预干燥样品称量进入6ml试管。使用具有两个测量线的移液器添加1ml的内部校准溶液然后是2ml3N的甲醇盐酸。然后将试管塞住并将其放置在恒温为110℃的干浴中持续4h。
冷却后,添加0.5ml的水和0.5ml的饱和水性氯化钠,并用1ml的氯仿进行3次提取。氯仿相在6ml的试管中回收并将它们在包含硫酸钠的柱上干燥。将它们在氮流下浓缩至1ml并注射。
每种脂肪酸(i)的%分布通过相对于在色谱上精确定位的所有峰的表面积总和(包括从月桂酸(C12:0)到DHA(C22:6Δ4c,7c,10c,13c,16c,19c),十七酸甲酯的峰排除在外)的这种脂肪酸的峰表面积比率来获得。
表4.
氧合作用的增加导致呼吸商的降低(相对于CO2生产,氧消耗增加)和YO2/S代谢比率的增加(相对于葡萄糖消耗,氧消耗增加)。
通过与合成饱和脂肪酸相比,需要更多氧的脂肪酸脱饱和途径的发展解释了这一点。
在限制的氧合作用的条件下,这些脱饱和途径未能很好地发展,如在获得的生物质中亚油酸的低比例所示,并且在发酵结束时观察到的呼吸商的值(1.86)接近油酸合成途径的理论值:
35/6C6H12O6+9.5O2→C18H34O2+17CO2+18H2O
与之相反,在过量氧合作用条件下,如在测试2中,其中呼吸商被维持在小于1.5的值,也就是说,远远低于最佳值,观察到生物质中亚油酸的累积(19.6%),并且还出现异常特征(由感官小组检测到的显著酸败气味)。
图1和图2的图示出作为时间和脂肪酸含量(按生物质的干重计)的函数,三个测试的呼吸商的进展。这两个示图示出,过量氧合作用导致呼吸商值的阻断低于1.5。从另一方面来说,当氧合作用条件恰当时,具体地,当按生物质的干重计,脂肪酸含量是至少25%时,在脂质累积步骤期间的呼吸商大于1.5。
实施例2:在实施例1中生产的3个批次的感官评估
在这一实施例中,本申请人公司提出测定从实施例1中生产的3个批次制备的微藻粉的感官品质,根据专利申请WO2010/12093中描述的方法,已经研磨并且干燥了从生物质制备的所述粉。
在法国专利申请号1356113中,本申请人公司定义了非常简单的品尝基质,该品尝基质使得可进行类似于用远远更复杂并且非常不同的处方(例如冰激凌或奶油糕点)所获得的感官评估的感官评估。使用此品尝基质的评估的精确性或准确性远高于使用简单水溶液所实施者,后者已证明不能预测(例如)微藻粉组合物在冰激凌中的感官品质。
因此,微藻粉品尝组合物包括:
-7%的微藻粉组合物;
-1%的糖;
-0.25%的香草香料;以及
-91.75%的脱脂奶,
百分比是通过组合物重量来表示。
随后将该组合物匀质化,并且然后在75℃加热5分钟。
集中一组的15名个体,从而与鉴定为符合也就是说具有可接受的感官品质(参照批次)的参照微藻粉的样品,即由所述小组感知为符合所有测试的描述语的微藻粉批次(这是该小组内部的标准)进行比较,来评估若干微藻粉组合物的描述语。
如下表5中所呈现的参照产物与每一描述语相关联:
表5.
在每一品尝阶段,针对每一描述语与视为具有可接受感官品质的参照批次相比来评估产品。
以1到9范围的量表以下列方式依次评估所有产品:
值1:所评估描述语并不呈现于产品中;
值5:所评估描述语以与具有可接受感官品质的参照产品完全相同的方式呈现于产品中;
值9:所评估描述语完全呈现于产品中。
具有可接受感官品质的参照批次是由感官小组感知为“满意”,也就是说关于所有测试的描述语具有5的等级的微藻粉组合物。
数据处理软件
使用R软件(自由出售)实施分析:
R2.14.1版(2011-12-22)
版权(C)2011R基础统计学计算(TheRFoundationforStatisticalComputing)
ISBN3-900051-07-0
平台:i386-pc-mingw32/i386(32位)
该软件是需要加载含有计算函数的模块的工作环境。
此研究中所使用的模块如下:
-对于PCA:程序包FactoMineR1.19版
-对于ANOVA:程序包car2.0-12版
-对于线性回归:程序包stats2.14.1版
数据处理
实施方差分析(ANOVA)以评估描述语(对于模型描述语~组合物+判断中的组合效应,与费歇尔测试-类型-1ANOVA有关的p值小于0.20的描述语)的辨别能力。
将“组合”效应解释为描述语的辨别能力:如果没有效应(临界概率>0.20),则不能根据此准则辨别组合物。该临界概率越小,则描述语的辨别能力越大。
然后实施主要组分分析(PCA)以获得组合物的感官图以及所有组合物关于所有描述语的同步表现。
根据上述方法,分析实施例1的3个批次。
此处呈现关于描述语“黄油/乳制品味”和“植物余味”的两个实例。
植物余味”:
方差分析表
黄油/乳制品味”
方差分析表
关于所研究2种描述语的与组合效应有关的临界概率似乎小于0.2:由此辨别2种描述语。关于“植物余味”描述语的临界概率小于关于“奶油/乳制品”描述语者,由此暗示在组合物之间所观察关于第一准则的差异大于关于第二准则者。
下文为汇总针对所有描述语的组合物和判断效应获得的临界概率表。
表6.
黄色、植物余味、谷物味和蘑菇味描述语都是有差别的;它们都被保持用于确立PCA。
由于芳香是组合物的基本准则,所以仅对关于风味的描述语(蘑菇味、谷物味、植物余味、乳制品味、酸败味)实施PCA。此PCA的图示提供于图3和图4中。
此方法使得可确立从实施例1的3个测试生产的不同微藻粉的感观品质的分类。因此,从测试1和测试3(基础的或限制性的氧合作用)获得的粉具有类似的感观品质,远远好于从测试2(过量氧合作用)获得的粉的那些感观品质。
这是因为定义为“过量”的氧合作用条件导致更大的蘑菇和谷物风味,并且导致植物余味。因此应禁忌这些条件,以保证产物的味道的中性。
定义为“限制性的”氧合作用条件提供了与定义为“基础的”氧合作用条件下获得的产物相比,略微更黄但是在味道方面不是非常不同的产物,并且其自身非常接近参照产物。
实施例3:与从实施例1获得的微藻粉组合物的3个批次中的不 可接受的异常特征感官分类相关的挥发性有机化合物(VOC)的分析
为实施从实施例1中生产的生物质获得的3个批次的微藻粉组合物的SPME/GC-MS分析,如下所述来实施方法。
将3g试样的测试样品引入密封SPME烧瓶(20ml)中且在60℃下培育15min,且然后在60℃下使用DVB/CAR/PDMS(二乙烯基苯/卡博森/聚二甲基硅氧烷的缩写,df50/30μm)SPME纤维提取45min。
在来自赛默科技的TSQGC-MS系统的注入器中解吸所提取挥发性有机化合物,且然后在CPwax52(60m×0.25mm,0.25μm)管柱上使用氦气在1.5ml/min下分离。
温度程序如下:50℃恒温3min,然后以5℃/分钟程序升温到230℃,然后恒温20min。
通过电子轰击(EI)质谱实施检测并且通过与NIST文库的EI光谱进行比较来鉴别化合物。
如上所指出,在法国专利申请号1356113中,本申请人公司鉴定了使得可限定根据本发明获得的微藻粉的感官品质的13种化合物。
这13种化合物如下:庚醛、3-辛烯-2-酮、2,4-庚二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、2,4-壬二烯醛、2,4-癸二烯醛、己酸、2-乙基己酸、庚酸、肉豆蔻酸酯-1、月桂酸酯-1、肉豆蔻酸酯-2和香叶基丙酮。因此,在此表现的是二不饱和醛、不饱和酮、羧酸和羧酸衍生物的家族。
关于这13种化合物在水中的嗅觉阈值呈现于下表7中。
表7.
(*)嗅觉阈值由本申请人公司确立
图5呈现了对于实施例1的3个批次,13种化合物中每一种的单独风味值。
显现出:
-4种主要化合物具有检测的所有风味:2,4-庚二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、2,4-壬二烯醛和2,4-癸二烯醛,根据现有技术中已知内容为不饱和脂肪酸氧化降解(过氧化作用)产物;
-与“过量”批次相比,“基础的”和“限制性的”批次的2,4-庚二烯醛和3,5-辛二烯-2-酮含量相对更低,“限制性的”批次具有最低含量;
-与“过量”批次相比,“基础的”和“限制性的”批次的2,4-壬二烯醛和2,4-癸二烯醛含量相对更低,“基础的”批次具有最低含量。
这些结果反映了“限制性的”和“基础的”批次的更好的感官品质。
下表8呈现这13种化合物的单独风味值的总和,由此呈现总风味值,其是从13种化合物的相对含量和其嗅觉阈值测定的:
总FV=ΣFVx(单独FV的总和),
其中FVx=化合物x的浓度/化合物x的嗅觉阈值,针对的是微藻粉组合物的批次中的每一者(值100%指定给“过量”批次)。
表8.
再次,这一GC/MS分析还使得可证明,从实施例1的测试1和测试3(基础的或限制性的氧合作用)获得的粉具有类似的感观品质,远远好于从测试2(过量氧合作用)获得的粉的那些感观品质。
附图说明
图1:对于测试1(基础的pO230%)、2(pO20%)和3(pO2120%),作为发酵时间(按小时计)的函数的呼吸商的演化。
图2:对于测试1(基础的pO230%)、2(pO20%)和3(pO2120%),作为脂肪酸含量的函数的呼吸商的进展。
图3:PCA的不同批次的图示(点云图)。
图4:代表不同批次的芳香特征的PCA关联性的圆圈。
图5:3个生产批次的单独风味值。

Claims (15)

1.一种用于发酵生产富脂质微藻生物质的方法,其特征在于该方法包括至少一个培养步骤,在该培养步骤期间,通过监测所述微藻的呼吸商来控制发酵罐中的溶解氧利用率。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于该发酵生产是以工业规模进行的。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于在异养条件下培养这些微藻。
4.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于这些微藻属于小球藻属,优选地选自下组,该组由以下各项组成:普通小球藻(Chlorellavulgaris)、耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)和原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)。
5.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于这些微藻是原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)。
6.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于借助所述方法生产的生物质具有按生物质的干重计多于30%、优选多于40%的脂质含量。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于所述培养步骤是脂质累积步骤,在所述培养步骤期间通过监测所述呼吸商来控制发酵罐中的溶解氧利用率。
8.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于只要该生物质具有按生物质的干重计多于25%、优选多于30%的脂质含量,就可以通过监测所述呼吸商来确保发酵罐中的溶解氧利用率。
9.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于在该监测期期间,所述呼吸商被维持在大于1.5、优选地大于1.6、更优先地大于1.7、并且甚至更优先地大于1.8的值。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于累积的YO2/S代谢比率(从发酵开始时计算)被维持在小于0.28、优先地小于0.27、更优先地小于0.26的值。
11.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于在该脂质累积阶段期间,优选地当该生物质包含多于25%的脂质、优选地多于30%的脂质(%表示按生物质的干重计)时观察到的YO2/S代谢比率被维持在小于0.28、优先地小于0.27、更优先地小于0.26的值。
12.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于生产的该生物质具有可接受的感官品质。
13.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于按重量计,相对于干生物质中的脂肪酸的总重量而言,生产的该生物质中的亚油酸的含量小于18%,优选地,按重量计,相对于干生物质中的脂肪酸的总重量而言,生产的该生物质中的亚油酸的含量小于14%。
14.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于使用气体分析器来监测所述呼吸商。
15.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于通过调节搅拌速度、反压力或进入的空气中的氧浓度,改变供应至发酵培养基的氧供应,来控制该氧利用率。
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