CN105420193B - 分化培养基及其在制备神经干细胞中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分化培养基，其能够将ES细胞和/或iPS细胞诱导为神经干细胞，该分化培养基为包含1％的N2添加剂的常规培养基，所述常规培养基为以下至少一种：RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、高糖DMEM培养基和α‑MEM培养基。本发明还公开该分化培养基在制备神经干细胞中的用途以及一种制备神经干细胞的方法。利用该分化培养基能够快速、稳定的将ES细胞和/或iPS细胞诱导为神经干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体的，本发明涉及培养基及其应用，更具体得，本发明涉及一种分化培养基、分化培养基在制备神经干细胞中的用途以及一种制备神经干细胞的方法。
背景技术
干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somatic stem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等，在成体组织中存在的。
1981年,ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功,是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。而人的胚胎干细胞则始于1998年，美国威斯康辛大学(University ofWisconsin)科学家汤姆森(James A.Thomson)带领研究团队首次从人类胚胎组织中提取培养出胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES Cell)株，并且证实此株细胞具有全能干细胞特征[Thomson,J.A.,et al.Embryonic stem cell lines derived from humanblastocysts.Science,282(1998):1145-1147.]。这篇论文标志着一个时代的到来，而汤姆森也被人称作“干细胞研究之父”。
人胚胎干细胞(hES)细胞研究的应用前景主要是再生医学领域，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略,可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗,将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。
然而，一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：(1)供体卵母细胞的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，SCNT技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证；(2)免疫排斥反应,除非采用SCNT技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应；(3)hES细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题；(4)体外保持hES风险。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。
为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞,为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入爪蟾卵母细胞后,哺乳动物细胞核的分化标志物丧失,而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4则呈高表达,提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构从而表达Oct4[Byrne JA,et al.Nuclei of adult mammalian somatic cells are directlyreprogrammed to oct-4stem cell gene expression by amphibian oocytes.Curr Biol2003；13:1206-1213.]。
2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞,故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)。
Yamanaka研究小组利用相同的技术，将上述同样的4个转录因子导入到人皮肤成纤维细胞中，也成功获得了iPS细胞。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为iPS细胞。这类iPS细胞在细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性等方面与hES细胞相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的不同细胞类型[Takahashi K et al，Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.Cell 2007；131:861-872.]。与此同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hES细胞基本特征的人类iPS细胞，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导[Yu J et al，Induced pluripotent stem cell linesderived from human somatic cells.Science 2007,318:1917-1920]。这一被学界称为生物科学“里程碑”的重大突破有望帮助科学家绕过克隆技术的伦理、道德纷争，为医学应用打开大门。
继此之后，iPS在重编程的诱导方法、诱导效率、诱导细胞来源及生物安全性方面均陆续取得了重要突破。在iPS细胞再分化方面，也得到了一定的发展。目前，在iPS细胞的上皮细胞分化、肝细胞分化等方面，均已建立了较为稳定的分化体系[Ahmad Sm,etal.Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-likecells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche.StemCells,2007,25(5):1145-55.；Metallo CM,et al.Directed differentiation of humanembryonic stem cells to epidermal progenitors.Methods Mol Biol,2010,585:83-92.；Song ZH,et al.Efficient generation of hepatocyte-like cells from humaninduced pluripotent stem cells.Cell Res,2009,19(11),1233-1242.]。在神经干细胞细胞分化方面，iPS细胞与ES细胞也取得了一定的研究成果[Kim DS,et al.Robustenhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardlessof their innate difference in differentiation propensity.Stem Cell Rev,2010,6(2):270-281.]。
神经干细胞是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。神经干细胞具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新，从而为神经组织提供大量的功能性细胞，在多种神经系统疾病方面具有着重要的应用价值和研究意义。但是，神经干细胞的来源十分有限：从神经组织中进行原代分离，在很大程度上受到组织来源的限制；由其他种类成体干细胞分化而来的神经前体细胞，在功能上又存在着一定的限制性，这主要是由于成体干细胞本身分化能力有限，难以完全再生功能性神经干细胞。所以，开发神经干细胞的来源一直是神经科学亟待解决的问题。
ES和iPS技术的建立，为神经干细胞的再生开发了新的研究方向，这两种细胞自我更新能力较强，且具有高度的分化能力，目前，已有多个课题组建立了ES和iPS细胞向神经干细胞分化的技术方法，例如：EB诱导法，PA6细胞共培养法等[Bain G,et al.Embryonicstem cells express neuronal properties in vitro.Dev Biol.1995,168(2):342-357.；Okabe S,et al.Kang HC,et al.Behavioral improvement after transplantationof neural precursors derived from embryonic stem cells into the globallyischemic brain of adolescent rats.Brain&development.2010,32(8):658-668.]。但是，何种方法较为适合该技术的临床化发展，目前尚无定论。
开发神经干细胞的新来源仍是目前神经科学亟待解决的问题。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。
依据本发明的一方面，本发明提供一种分化培养基，所述分化培养基能够将ES细胞和/或iPS细胞诱导为神经干细胞，所述分化培养基为包含1％的N2添加剂的常规培养基，所述常规培养基为以下至少一种：RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、高糖DMEM培养基和α-MEM培养基。
本发明的这一分化培养基，为只添加有1％的N2添加剂的常规培养基，就能将ES细胞和/或iPS细胞快速高效、经济简便地诱导为神经干细胞。获得的神经干细胞能够用于神经损伤的修复及神经系统疾病的治疗。
依据本发明的另一方面，本发明提供上述本发明一方面的分化培养基在制备神经干细胞的用途。利用该分化培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，能够高效稳定地将ES细胞和/或iPS细胞诱导为神经干细胞。
依据本发明的又一方面，本发明提供一种制备神经干细胞的方法，该方法通过利用上述本发明一方面的分化培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，来获得所述神经干细胞。
本发明的这一制备神经干细胞的方法，利用本发明一方面的分化培养基即利用只含有1％的N2添加剂的常规培养基，就能将ES细胞和/或iPS细胞快速高效、经济简便地诱导为神经干细胞。利用该方法获得的神经干细胞，能够用于神经损伤的修复及神经系统疾病的治疗。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示本发明的一个实施例中的iPS细胞向神经干细胞诱导分化过程中各阶段的形态结构。
图2显示本发明的一个实施例中的iPS细胞向神经干细胞诱导分化过程中各阶段的多能性基因及神经干细胞标记基因表达变化的qPCR结果。
图3显示了根据本发明的一个实施例，制备神经干细胞时，iPS细胞向神经干细胞诱导分化第7天的神经干细胞标记基因表达的免疫荧光结果。
图4显示了根据本发明的一个实施例的iPS细胞向神经干细胞诱导分化第7天的神经干细胞标记基因表达的流式细胞仪检测结果。
具体实施方式
根据本发明的一个实施方式提供的一种分化培养基，所述分化培养基能够将ES细胞和/或iPS细胞定向诱导分化为神经干细胞，所述分化培养基为包含1％的N2添加剂的常规培养基，所述常规培养基为以下至少一种：RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、高糖DMEM培养基和α-MEM培养基。
该实施方式中的分化培养基，为只添加有1％的N2添加剂的常规培养基，就能将ES细胞和/或iPS细胞快速高效、经济简便地诱导为神经干细胞。获得的神经干细胞能够用于神经损伤的修复及神经系统疾病的治疗。
所称的N2添加剂(N2Supplement)，是由转铁蛋白、胰岛素、黄酮体、腐胺和亚硒酸钠组成的。N2添加剂可以自己配制，例如预先配制包含转铁蛋白、胰岛素、黄酮体、腐胺和亚硒酸钠，并使各组分的浓度均为1mM的N2添加剂，作为母液存储备用。也可以购买市售产品，参照其产品说明书的介绍，按本发明该实施方式的比例添加，配制出该实施方式中的分化培养基。
根据本发明的一个较佳实施例，所述分化培养基为包含1％的N2添加剂的RPMI1640培养基。RPMI是洛斯维.帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)的缩写。RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号，含有10％胎牛血清。RPMI1640培养基可以通过购买市售产品或者自己配置来获得。只包含1％的N2添加剂的RPMI1640培养基，经发明人多次试验证明，该体系适用于神经干细胞的诱导。
根据本发明的实施例，所述分化培养基为包含1％的N2添加剂的常规培养基，所述常规培养基为以下至少一种：RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、高糖DMEM培养基和α-MEM培养基，例如，所称的常规培养基可以为其中的一种，也可以是两种、三种或全部四种的混合。所称的分化培养基为只包含1％的N2添加剂的常规培养基。
根据本发明的另一个实施方式，提供上述任一实施例中的分化培养基在制备神经干细胞的用途。利用该分化培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，能够高效稳定地将ES细胞和/或iPS细胞诱导为神经干细胞。
根据本发明的又一个实施方式提供的一种制备神经干细胞的方法，该方法通过利用上述任一实施例中的分化培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，来获得所述神经干细胞。
该实施方式中的制备神经干细胞的方法，利用上述任一实施例中的分化培养基即利用只含有1％的N2添加剂的常规培养基，就能将ES细胞和/或iPS细胞快速高效、经济简便地诱导为神经干细胞。利用该方法获得的神经干细胞，能够用于神经损伤的修复及神经系统疾病的治疗。
根据本发明的实施例，该实施方式中的ES细胞和/或iPS细胞来自人，分别可表示为hES和hiPS。
不同于已知的神经干细胞诱导培养基和诱导技术，本实施方式的方法未加入复杂的信号通路抑制剂，也未采用已知的条件培养基，仅在常规培养基中加入一种N2Supplement，即可将人ES细胞和/或iPS细胞诱导为具有神经干细胞特性的细胞，而且诱导过程快速，方法稳定。
iPS来自重编程的体细胞，本实施方式对重编程体细胞的类型和重编成方式不作限制。例如，iPS细胞来自但不限于重编程的以下至少一种细胞：皮肤成纤维细胞、牙周膜干细胞、牙髓干细胞和尿液细胞。根据本发明的一个实施例，考虑安全性及应用性，iPS细胞为尿液细胞来源的非整合型细胞。
根据本发明的实施例，在利用上述任一实施例中的分化培养基培养ES细胞和/或iPS细胞之前，包括：利用以下至少一种培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，以获得所述ES细胞和/或iPS细胞：mTeSRTM1培养基、E8培养基和KSR条件培养基。mTeSRTM1培养基、E8培养基和KSR条件培养基均可通过常规市售获得。
根据本发明的实施例，所述利用以下至少一种培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，以获得所述ES细胞和/或iPS细胞，包括：在包被有基质胶的培养皿上培养所述ES细胞和/或iPS细胞，当所述ES细胞和/或iPS细胞生长至覆盖培养皿底部的60-70％时，消化所述ES细胞和/或iPS细胞，获得干细胞单细胞。根据本发明的较佳实施例，所述基质胶为I型胶原；和/或，利用Accutase酶消化所述ES细胞和/或iPS细胞。利于方便快速的获得ES细胞和/或iPS细胞及其单细胞。
根据本发明的实施例，所述利用上述任一实施例中的分化培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，以获得所述神经干细胞，包括：利用含有10μM ROCK抑制剂的所述分化培养基重悬所述干细胞单细胞，以0.75-1.0×105个细胞/mL的密度接种在培养板内；每两天利用所述分化培养基对所述培养板中的细胞进行一次换液，直至获得所述神经干细胞。该条件是发明人经过多次调整尝试、试验验证确定的，利于高效的将ES细胞和/或iPS诱导成神经干细胞。
根据本发明的一个较佳实施例，所称的ROCK抑制剂选择市售的Y-27632，利于干细胞的存活以及启动进入神经干细胞诱导程序。
根据本发明的一个实施例，用含有10μM Y-27632的分化培养基重悬后，将干细胞单细胞悬液以1.5-2.0×105个细胞/孔接种至6孔板中培养，以开始及实现诱导。
下面详细描述本发明的实施例。实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，单数型“一个”，和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。
在本文中，除非另有说明，所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，例如其以0.1的增量变动(+)或(-)。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。
本文中，所述的“诱导多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与人ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态等方面也与人ES细胞非常相似。
本文中，所述的术语“诱导重编程”是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子通过非整合型质粒导入体细胞，从而诱导体细胞去分化成为多能性干细胞。将所述多能性因子导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，采用电穿孔法进行质粒转染。
下述实施例，所用的分化培养基组分及其工作浓度优选为：N2Supplement:1重量％，以RPMI1640为基础培养基配置。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》，第3版(2002)，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著；《现代分子生物学实验方法》(F.M.Ausubel等人编著(1987))；《酶学方法》(Academic Press，Inc.)；《PCR2：实用方法》，M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995)；《抗体》，Harlow和Lane编著，(1988)；《动物细胞培养实验室手册》，R.I.Freshney编著，(1987)；《干细胞手册》，卷2，W.French Anderson等人编著。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规市售试剂材料。
实施例一
人ES细胞和iPS细胞的常规培养
材料：H1人胚胎干细胞(H1-ES细胞)，尿液细胞来源的诱导多能干细胞(UC-iPS细胞)。
培养基：mTeSRTM1培养基(STEMCELL catalog#05850)。
方法步骤：
H1-ES细胞和UC-iPS细胞多能性的常规维护培养，需用Metrigel(BD catalog#354277)包被培养板，再接种细胞，用mTeSRTM1培养基进行培养；约4-6天传代一次，可使用2mg/ml的Dispase酶(Gibco catalog#17105-041)进行消化。
实施例二
材料：H1人胚胎干细胞(H1-ES细胞)，尿液细胞来源的诱导多能干细胞(UC-iPS细胞)
试剂：添加有N2Supplement(Gibco#17502-048)的RPMI1640培养基(Gibcocatalog#21870-076)，其中，该培养基含有1重量％的N2Supplement；Y-27632(Sigmacatalog#Y0503)；Accutase(Sigma catalog#A6964)；牛I型胶原(BD catalog#354231)。Y-27632/ROCK inhibitor。
方法步骤：
将生长至覆盖培养皿底部60-70％的H1-ES细胞或UC-iPS细胞用Accutase消化3-5min，吹打为单细胞，接种在I型胶原包被的6孔板中，接种密度为1.5-2.0×105cells/孔，用分化培养基进行培养，于培养基中加入Y-27632(此后换液不需加Y-27632)，终浓度为10μM，此后隔日全量换液，培养7天可见典型神经花环样结构形成。
需要说明的是，显微镜下观察到的胚胎干细胞的形态，以及其向神经干细胞方向诱导分化过程中的形态变化和分化结果，均与人诱导多能干细胞基本相同，在此，主要以人诱导多能干细胞为例进行说明。
培养过程中的细胞形态学变化如图1所示：分化之前，UC-iPS细胞呈克隆样生长；诱导分化第1天，消化后的单细胞会贴壁，并呈现小克隆样生长；诱导分化第3天，克隆不再贴壁，处于悬浮状态呈球状生长；在诱导分化的第5天，悬浮的细胞再次贴壁，形态可见明显改变；诱导分化7天后，贴壁细胞出现典型的神经花环样结构，初步表明神经干细胞(NSCs)形成，花环结构采用机械法分离纯化后，可呈球状悬浮生长(图中标尺为200μm)。由此可见，本方法无需EB(拟胚体)过度，只需要简单的分化培养，即可将人ES或iPS细胞分化为神经干细胞。
在分化过程中，各个阶段的多能性基因以及神经干细胞标记基因的表达变化如图2所示：在分化过程中，多能性基因表达逐渐下调，神经干细胞标记基因的表达程度逐渐升高，大多数神经干细胞标记基因在分化后第7天达到最高的表达水平；但是Sox2既是多能性基因又是神经干细胞标记基因，在整个分化过程中，变化趋势不大。
对分化第7天的神经干细胞，我们进行了神经干细胞标记分子的蛋白水平的分析，免疫荧光及流式细胞仪检测结果分别如图3和图4所示。
从图3的免疫荧光结果可见：iPS细胞分化后第7天形成的神经干细胞明显表达神经干细胞标记基因(Nestin、Pax6和Sox1)。图中左侧一栏为荧光显微镜下观测到的荧光染色结果，中间一栏为对应视野的细胞核DAPI染色结果，右侧一栏为前二者的合成图，图中标尺为50μm。
从图4流式细胞仪检测结果可见，iPS细胞分化后第7天形成的神经干细胞Nestin的表达效率在90％以上，Pax6的表达效率接近80％，由此说明本方法的分化效率较高。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种制备神经干细胞的方法，其特征在于，利用分化培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，以获得所述神经干细胞，
在利用分化培养基培养ES细胞和/或iPS细胞之前，包括：
利用以下至少一种培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，以获得所述ES细胞和/或iPS细胞：mTeSRTM1培养基、E8培养基和KSR条件培养基，所述利用以下至少一种培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，以获得所述ES细胞和/或iPS细胞，包括：
在包被有基质胶的培养皿上培养所述ES细胞和/或iPS细胞，当所述ES细胞和/或iPS细胞生长至覆盖培养皿底部的60-70％时，消化所述ES细胞和/或iPS细胞，获得干细胞单细胞，
其中，所述分化培养基为仅添加有1％的N2添加剂的常规培养基，所述常规培养基为以下至少一种：RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、高糖DMEM培养基和α-MEM培养基，
其中，所述基质胶为I型胶原，
其中，所述ES细胞为H1人胚胎干细胞。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述ES细胞和/或所述iPS细胞来自人。
3.权利要求1的方法，其特征在于，所述iPS细胞来自重编程的以下至少一种细胞：皮肤成纤维细胞、牙周膜干细胞、牙髓干细胞和尿液细胞。
4.权利要求1的方法，其特征在于，利用Accutase酶消化所述ES细胞和/或iPS细胞。
5.权利要求1的方法，其特征在于，所述利用所述分化培养基培养ES细胞和/或iPS细胞，以获得所述神经干细胞，包括：
利用含有10μM ROCK抑制剂的所述分化培养基重悬所述干细胞单细胞，以0.75-1.0×105个细胞/mL的密度接种在培养板内；
每两天利用所述分化培养基对所述培养板中的细胞进行一次换液，直至获得所述神经干细胞。
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