CN108315301B - 一种诱导神经干细胞的无血清培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型诱导神经干细胞的无血清培养基，该培养基包括神经干细胞诱导培养基、神经干细胞增殖培养基和神经元分化培养基；其中神经干细胞诱导培养基由动物基础培养基N2G21和神经诱导化合物PD98059、JW55组成，神经干细胞增殖培养基由动物基础培养基N2G21和生长因子OsrbFGF组成，神经元分化培养基为N2G21基础培养基。该培养基设计科学、配方简单，与现在技术相比，使用纯化学分子替代蛋白质信号拮抗物，使用非动物源性的生长因子来替换传统的动物源性的生长因子，利用人源多能干细胞培养得到能自我更新、分化为神经元细胞的神经干细胞，并且使用该培养基制备的神经干细胞在临床上安全性更高。

Description

一种诱导神经干细胞的无血清培养基及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种诱导神经干细胞的无血清培养基及其应用。

背景技术

神经退行性疾病是目前常见的老龄化疾病，治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默症(AD)等疾病。世界卫生组织统计，2050年我国神经退行性疾病患者将超过3000万，预期医疗费用将超过1万亿。目前主要以药物去补充或刺激脑内不足的左旋多巴、神经核团毁损术或脑深部电刺激手术等治疗方法，但均不能达到很好的疗效，并且会带来“异动症”或是“药效波动”等严重影响生活质量的不良反应。

除神经退行性疾病之外，脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是常见的一种神经系统创伤性疾病，据国外统计SCI患者一生的治疗康复费用平均达75万美元以上，美国每年对SCI患者的花费超过60亿美元。我国的患病率更是高于欧美发达国家，昂贵的治疗费用，长时间的康复治疗以及劳动力的丧失给个人及家庭带来的巨大影响，也给社会带来沉重的负担。

神经退行性疾病和脊髓损伤的治疗难点在于中枢神经系统的神经细胞具有不可再生性，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。目前药物研发仍然处于基础探索阶段。目前，神经干细胞的移植是最为有效的一种治疗方式。神经干细胞(NSCs)是一种成体干细胞，具有自我更新和分化为终端神经细胞的能力，例如神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同神经细胞类型。目前，神经干细胞的异体移植已经在临床上取得了一定的效果。部分临床试验采取神经细胞系移植方法，但现存的神经细胞系资源有限，且在建系过程中存在很多不稳定因素；而异体神经细胞由于体外传代不易，且异体神经干细胞由于伦理限制以及获得技术不便，这些因素都进一步阻碍了以上疾病的临床推进。近年来，诱导多能干细胞技术(iPSC)的开展取得了很大的进展，利用这类细胞进行定向分化可以获得多种类型的成体细胞。因此，使用包括iPSC在内的全能干细胞或者多能干细胞作为原材料进行神经细胞诱导分化可以作为临床治疗的新思路，大大拓展了神经细胞在临床医学上的应用潜力。

从多能干细胞到神经干细胞，目前应用最为广泛的诱导方法有两种，第一种方法首先将细胞聚合成团形成拟胚体，之后细胞进一步被诱导成为神经干细胞，这种方法使用的培养基使用的动物源性的生长因子制约了神经干细胞在临床上的使用。第二种为SMAD途径双重抑制法(Chambers et al.,2009)，该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经细胞(Fasano et al.,2010)，其原理是通过抑制BMP和TGFB途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生，该方法不使用滋养细胞，但是仍然需要使用动物源性的细胞因子或者蛋白质信号途径拮抗物，不能用于临床使用。

为了达到更加安全有效的临床效果，急需开发一种安全、高效的神经干细胞诱导培养基，能够推进临床试验的展开。

发明内容

针对目前现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种诱导神经干细胞的无血清培养基及其应用。该培养基设计科学、配方简单，与现在技术相比，使用纯化学分子替代蛋白质信号拮抗物，使用非动物源性的生长因子来替换传统的动物源性的生长因子，利用人源多能干细胞培养得到能自我更新、分化为神经元细胞的神经干细胞，并且使用该培养基制备的该神经干细胞在临床上安全性更高。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明首先提供了一种诱导神经干细胞的无血清培养基，所述培养基包括神经干细胞诱导培养基、神经干细胞增殖培养基和神经元分化培养基；

其中神经干细胞诱导培养基由动物基础培养基和神经诱导化合物组成；所述动物基础培养基为N2G21基础培养基；所述神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059终浓度为4～10μM，JW55终浓度为4～8μM；

神经干细胞增殖培养基由动物基础培养基和生长因子组成；所述动物基础培养基为N2G21基础培养基；所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，生长因子终浓度为10～25ng/ml；

神经元分化培养基为N2G21基础培养基。

进一步地，所述N2G21基础培养基配方如下：

进一步地，待培养/或扩增的细胞为人源多能干细胞。

进一步地，所述人源多能干细胞为诱导多能干细胞。

基于上述的培养基，本发明还提供了一种诱导神经干细胞的无血清培养基的应用，所述诱导神经干细胞的无血清培养基应用于培养人源诱导型神经干细胞，所述人源诱导型神经干细胞是由诱导多能干细胞制备的。

最后，本发明提供了一种制备诱导神经干细胞的试剂盒，所述试剂盒由神经干细胞诱导培养基、神经干细胞增殖培养基和神经元分化培养基组成；

其中神经干细胞诱导培养基由动物基础培养基和神经诱导化合物组成，所述动物基础培养基为N2G21基础培养基；所述神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059终浓度为4～10μM，JW55终浓度为4～8μM；

所述神经干细胞增殖培养基由动物基础培养基和生长因子组成；所述动物基础培养基为N2G21基础培养基；所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，生长因子终浓度为10～25ng/ml；

所述神经元分化培养基为N2G21基础培养基。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明所提供的培养基，不含血清，适用于用人源多能干细胞培养神经干经胞，包括但不局限于诱导多能干细胞。

(2)本发明所提供的培养基使用纯化学分子替代蛋白质信号拮抗物，使用非动物源性的生长因子来替换传统的动物源性的生长因子，从而实现了无血清无动物源性的神经干细胞诱导培养方法，解决了动物源性培养方法制约神经干细胞在临床上的使用问题。

(3)本发明提供的培养基具有安全、高效的特征，在神经细胞基础培养基的基础上，通过使用不同的小分子抑制剂的组合，实现人源多能干细胞进行无滋养细胞无血清的化学因子诱导，使诱导干细胞定向分化为神经干细胞。并且本发明的培养基培养的神经干细胞具有分化为神经元的能力，不仅能够用于神经系统疾病的药物筛选，同时也能作为临床研究和临床治疗的材料，因此具有巨大的经济效应和社会效应。

(4)使用本发明的培养基可以直接用来培养诱导型神经干细胞，无需使用滋养层细胞，因而得到的细胞不受其它细胞的污染，解决了长久以来滋养细胞污染的问题，在临床上更安全。

附图说明

图1为人诱导多能干细胞培养扩增神经干细胞时，不同源性重组FGF对细胞增殖的影响曲线。

图2为本发明的培养基使人源诱导型神经干细胞诱导产生皮质神经元的结果图。

其中图2a为细胞诱导第1天的图，2b为细胞诱导第21天的图，2c为神经干细胞传代培养的图，2d为神经干细胞传代诱导50天形成皮质神经元。

图3为在本发明的培养基中，从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中SOX1、PAX6、OCT3/4、NANOG的表达水平变化示意图。

图4为免疫荧光实验鉴定的从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中蛋白标记的结果图。

其中图4a表示诱导前诱导多能干细胞表达Oct4；图4b表示诱导神经干细胞表达Pax6及Sox2；图4c表示诱导神经干细胞表达Tuji和PSD95；图4d表示诱导神经干细胞分化末期表达Tuji和VGlut1。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所提供的诱导神经干细胞的无血清培养基，包括神经干细胞诱导培养基、神经干细胞增殖培养基和神经元分化培养基；其中神经干细胞诱导培养基由N2G21动物基础培养基和神经诱导化合物组成，神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059终浓度为4～10μM，JW55终浓度为4～8μM；神经干细胞增殖培养基由N2G21动物基础培养基和生长因子组成，生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，生长因子终浓度为10～25ng/ml；神经元分化培养基为N2G21基础培养基。神经细胞诱导培养基、神经干细胞增殖培养基和神经元分化培养基中所用到的N2G21基础培养基配方如下：

本发明所提供的培养基适合用于培养/或扩增的细胞人源多能干细胞，包括但不局限于诱导多能干细胞。该培养基使用纯化学因子诱导及植物来源的生长因子相结合的方法，模拟胚胎发育早期神经产生的信号途径，不使用动物血清，并且化学成分明确，能让人源多能干细胞(包括iPSC在内的全能干细胞或者多能干细胞)作为原材料进行神经细胞诱导分化，且得到的神经干细胞的标志物的表达水平显著上调。本发明所提供的培养基培养的神经干细胞能很好的分化成神经元细胞，且经移植后可以恢复原有的功能。

本发明还提供了一种诱导神经干细胞的无血清培养基的应用，所述诱导神经干细胞的无血清培养基应用于培养人源诱导型神经干细胞，该人源诱导型神经干细胞是由诱导多能干细胞制备的。

最后，本发明提供了一种制备诱导神经干细胞的试剂盒，所述试剂盒由神经干细胞诱导培养基、神经干细胞增殖培养基和神经元分化培养基组成；其中神经干细胞诱导培养基由N2G21动物基础培养基和神经诱导化合物组成，所述神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059终浓度为4～10μM，JW55终浓度为4～8μM；所述神经干细胞增殖培养基由N2G21动物基础培养基和生长因子组成，所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，生长因子终浓度为10～25ng/ml；所述神经元分化培养基为N2G21基础培养基。

实施例1：人诱导多能干细胞培养扩增神经干细胞

1、培养基的配制

表1神经干细胞诱导培养基

表2神经干细胞增殖培养基

表3神经元分化培养基

培养基配制好后，混合均匀，封口于4℃冰箱保存，2周内需使用完毕。

2、人多能干细胞传代培养：

首先使用1μg/mL的层粘蛋白Laminin(STEMCELL Technologies)包被T25培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育至少1小时；人诱导多能干细胞在TeSRTM-e8培养基中培养，使用0.05％trypsin/EDTA，在37度孵育5分钟进行消化；将消化完成后的人诱导多能干细胞重悬于TeSRTM-e8培养基中，按照2x10⁶每板的细胞数量接种于事前备好的LamininT25培养瓶中培养12小时。

3、人多能干细胞诱导培养

移出上述的TeSRTM-e8培养基并更换为无血清神经干细胞诱导培养基(见表1)，然后在无血清神经干细胞诱导培养基中利用人多能干细胞定向诱导培养神经干细胞，每两天更换新的无血清神经干细胞诱导培养基，培养18-21天；培养约18天后可以观察到均匀分布的神经干细胞花环状结构产生。神经干细胞诱导培养条件为37℃，5％二氧化碳。

4、神经干细胞的扩增培养

人多能干细胞定向诱导培养成神经干细胞完成后，移出无血清神经干细胞诱导培养基，之后用0.05％trypsin/EDTA在37℃处理S2中获得的神经干细胞5分钟，使用DMEM终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照1:6的比例重新接种于T25培养瓶中，使用神经干细胞扩增培养基(见表2)进行神经干细胞扩增培养；细胞扩增培养条件为37℃，5％二氧化碳。

本发明的培养基使用纯化学因子诱导及植物来源的生长因子相结合，在培养基中不添加滋养细胞和动物血清，模拟胚胎发育早期神经产生的信号途径，并且化学成分明确，解决了动物源性培养方法和滋养细胞污染的问题，大大拓展了神经干细胞在临床上的使用。

实施例2：不同源性重组FGF对人源神经干细胞增殖的影响实验

取实施例1中经诱导培养的神经干细胞，按照5×10⁴每孔的细胞数量进行接种，并设置三组平行重复(三组的平均值作为数据进行计算)，使用两种神经干细胞扩增培养基分别扩增培养，其中第一种培养基包括N2G21基础培养基和植物来源的人碱性生长因子OsrbFGF(表2)，第二种包括N2G21基础培养基和含有动物源性的人碱性生长因子GDNF。细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳。分别在24小时，48小时及72小时取样，细胞增殖使用CyQuant kit(Invitrogen)进行，数据读取使用SpectraMax i3 Multi-Mode MicroplateReader，细胞增殖情况如图1所示。

图中曲线1表示诱导的神经干细胞在含植物来源的人碱性生长因子OsrbFGFCyquant的培养基中的扩增情况，曲线2表示诱导的神经干细胞在含动物源性的人碱性生长因子GDNF的培养基中的扩增情况，Cyquant试验表明植物源性生长因子与动物源性生长因子在促进细胞增殖上无显著差异，使用植物源性生长因子也能促进诱导的人源诱导型神经干细胞增殖。

实施例3：多能干细胞来源的神经干细胞体外诱导为皮质神经元实验

采用本发明的培养基培养的人源诱导型神经干细胞能够诱导为皮质神经元。

1.神经干细胞体外诱导为皮质神经元

将4x10⁴个实施例1中的诱导神经干细胞接种于D型多聚赖氨酸包被的24孔板中，使用本发明的神经分化培养基(见表3)进行培养，培养期间每隔两天换液一次。细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳。持续培养14天，皮质神经元开始形成(如图2所示)。

2.结论

分化结果如图2所示，图2中a为细胞诱导第1天的图，b为细胞诱导第21天的图，c为神经干细胞传代培养的图，d为神经干细胞传代诱导50天形成皮质神经元，结果表明iNSCs可以维持自我更新并分化成为皮质神经元。

实施例4：Q-PCR检测从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中的转录变化

分别取实施例1中的神经干细胞诱导前的iPSC、诱导完成后使用神经干细胞扩增培养基扩增2周后的神经干细胞，作为两种材料进行分析。通过Q-PCR检测从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中SOX1、PAX6、OCT3/4、NANOG的转录变化情况。

两种细胞的总RNA使用RNeasy Mini or Micro Kit(QIAGEN)进行抽提，1mg RNA用SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)合成cDNA。用SYBRPremix Ex Taq(TaKaRa)和Thermal Cycler Dice Real Time System(TaKaRa)来进行Quan-titative PCR的标记和反应，beta-Actin用来作为内参。所有数据用delta-Ctmethod进行分析。用鉴定神经干细胞标志物SOX1、PAX6、OCT3/4、NANOG的编码基因的引物序列如表4所示。

表4 SOX1、PAX6、OCT3/4、NANOG的引物序列

SOX1-F	gcggaaagcgttttcttg
		SOX1-R	taatctgacttctcctccc
PAX6-F	gcggagttatgatacctacacc
		PAX6-R	gaaatgagtcctgttgaagtgg
OCT3/4-F	atcttcaggagatatgcaaagcaga
		OCT3/4-R	tgatctgctgcagtgtgggt
NANOG-F	acctcagctacaaacaggtgaa
		NANOG-R	aaaggctggggtaggtaggt

以神经干细胞诱导前的iPSC标志物的表达量作为1，计算诱导完成后使用神经干细胞扩增培养基扩增2周后的神经干细胞标志物和iPSC标志物的相对表达倍数；以Q-PCR检测结果如图3所示，图3表明，通过本发明的方法利用人源多能干细胞培养的人源诱导神经干细胞，显著上调了细胞的神经干细胞标志物(SOX1、PAX6)的表达水平，同时，iPSC标志物(OCT3/4、NANOG)的表达量显著下降。

实施例5：免疫荧光实验鉴定从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中的蛋白标记(神经干细胞标志物的免疫荧光染色)

分别取实施例1中的神经干细胞诱导前的iPSC、诱导完成后使用神经干细胞扩增培养基扩增2周后的神经干细胞，作为两种材料进行如下免疫荧光染色鉴定：采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用0.1％Triton X-100透化处理5分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％Triton X-100的DPBS缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后加入用DPBS缓冲液稀释的抗体，37℃孵育2小时，用DPBS缓冲液清洗三遍后拍照。抗体使用细节如表5所示。

表5神经干细胞标志物的免疫荧光染色使用的抗体

抗体	购自	稀释倍数
			Tuji	Abcam	1:500
Pax6	Abcam	1:300
			Sox2	Abcam	1:150
PSD95	Abcam	1:1000
			VGlut	Abcam	1:500
Oct4	Abcam	1:250

照片见图4，标尺为100μm，图4a表示诱导前诱导多能干细胞表达Oct4；图4b表示诱导神经干细胞表达Pax6及Sox2；图4c表示诱导神经干细胞表达Tuji和PSD95；图4d表示诱导神经干细胞分化末期表达Tuji和VGlut1。

综合以上结果表明，本发明的培养基可使诱导多能干细胞制备神经干细胞，并且制备的神经干细胞能够分化为表达神经标记的神经元细胞。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉睿健医药科技有限公司

<120> 一种新型诱导神经干细胞的无血清培养基及其应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcggaaagcg ttttcttg 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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taatctgact tctcctccc 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcggagttat gatacctaca cc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaaatgagtc ctgttgaagt gg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atcttcagga gatatgcaaa gcaga 25

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<212> DNA

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tgatctgctg cagtgtgggt 20

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acctcagcta caaacaggtg aa 22

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aaaggctggg gtaggtaggt 20

Claims (5)

1.一种诱导神经干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基包括神经干细胞诱导培养基、神经干细胞增殖培养基和神经元分化培养基；

其中神经干细胞诱导培养基由动物基础培养基和神经诱导化合物组成；所述动物基础培养基为N2G21基础培养基；所述神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059终浓度为4～10μM，JW55终浓度为4～8μM；

神经干细胞增殖培养基由动物基础培养基和生长因子组成；所述动物基础培养基为N2G21基础培养基；所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，生长因子终浓度为10～25ng/ml；

神经元分化培养基为N2G21基础培养基；所述N2G21基础培养基配方如下：

2.根据权利要求1所述的一种诱导神经干细胞的无血清培养基，其特征在于，待培养/或扩增的细胞为人源多能干细胞。

3.根据权利要求2所述的一种诱导神经干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述人源多能干细胞为诱导多能干细胞。

4.如权利要求1-3中任一项所述的一种诱导神经干细胞的无血清培养基的应用，其特征在于，所述诱导神经干细胞的无血清培养基应用于培养人源诱导型神经干细胞，所述人源诱导型神经干细胞是由诱导多能干细胞制备的。

5.一种诱导神经干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由神经干细胞诱导培养基、神经干细胞增殖培养基和神经元分化培养基组成；

其中神经干细胞诱导培养基由动物基础培养基和神经诱导化合物组成，所述动物基础培养基为N2G21基础培养基；所述神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059终浓度为4～10μM，JW55终浓度为4～8μM；

所述神经干细胞增殖培养基由动物基础培养基和生长因子组成；所述动物基础培养基为N2G21基础培养基；所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，生长因子终浓度为10～25ng/ml；

所述神经元分化培养基为N2G21基础培养基；所述N2G21基础培养基配方如下：