CN104140951B - 一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：a.制备人成纤维样细胞饲养层：取人成纤维样细胞，接种至培养皿上,10毫克/毫升丝裂霉素C提前处理3个小时，去除丝裂霉素C；b:重编程体细胞，生成人诱导多能干细胞，并将人诱导多能干细胞移植于步骤a中制备的饲养层中培养。采用本发明技术方案，免除了异源细胞和异源蛋白对诱导多能干细胞的影响，同时转录效率高，不影响诱导多能干细胞的分化能力，且培养代数多，维持寿命长，在临床上具有巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法。
背景技术
胚胎干细胞是一类全能性干细胞，有潜力分化成各种组织器官的多种类型的细胞。近些年来，利用基因“重新编程”技术处理成体细胞，如皮肤成纤维细胞或血液细胞，可以让它们获得如同胚胎干细胞一样全能性。这一技术称作诱导多能干细胞(iPS)技术，产生的全能性细胞称作iPS细胞。iPS细胞具有广泛的医学应用价值，特别是给再生医学领域的临床应用带来了新的希望。因为iPS技术可用病人自身体细胞经体细胞重编程来培育全能性干细胞，然后应用这些全能性干细胞的衍生细胞进行临床治疗。这样不但避免了使用胚胎干细胞的伦理问题，而且获得具有患者自身遗传背景的细胞，规避了免疫排斥问题。
目前,大多数iPS细胞系都被养在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。使用MEF作为饲养层细胞可保证干细胞未分化状态和进行扩增。使用MEF也能提供较高的体细胞重编程效率。然而，使用MEF具有潜在的问题，包括非人异种因子污染和动物病原体的传播的风险。这些问题会在临床应用监管机构审阅使用iPS细胞衍生细胞时成为重要障碍。尽管iPS细胞的异种因子污染问题现在还没有报道过，但这种情况却存在于人胚胎干细胞上。人类胚胎干细胞在MEF上长时间培养后，可以在干细胞表面检测到异种因子唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的表达。这一发现已引起了临床上对注射胚胎干细胞或其子代细胞是否会引起免疫反应的关注。
为了减少异种因子污染，许多实验室在诱导iPS细胞时会将亲代细胞同时作为饲养层细胞。人类成纤维细胞，脂肪细胞，和羊水细胞都被试用过。虽然把亲代细胞当做饲养层可以避免异种因子污染，但由于亲代细胞数目不足，无法大规模应用于iPS细胞的长期维持和扩增。这将会影响到iPS细胞在细胞治疗中的应用。2010年，Christian等用人皮肤成纤维细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞，可以维持诱导多能干细胞的生长，但是其维持时间较短，培养代数仅7代。公开号为CN102161980的专利申请公开了以人骨髓间充质干细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞，可以维持诱导多能干细胞的生长，但是维持时间仍然较短，培养代数仅14代，并且，该饲养层采用含胎牛血清的培养基培养得到，含有异源蛋白，用于临床应用仍然存在潜在风险。申请公布号CN103589686A(申请公布日2014.02.19)公开了以人脐带间充质干细胞(hUCMSC)作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法。但人脐带间充质干细胞体外长期培育的能力仍有限，平均寿命(培养代数)为约30代，而且长期培养的人脐带间充质干细胞经常发生基因突变，所以临床治疗通常只用第3到第5代的人脐带间充质干细胞。
另一种方法不使用饲养层细胞，而是使用使用细胞外基质(ECM)-或以合成物质为基础的培养系统来进行iPS细胞的建立和维持。但是使用这些培养系统时，体细胞重编程效率通常很低，无法产生较多的iPS细胞群落进行筛查。iPS细胞长期在无饲养层细胞上培养时还会遇到基因组不稳定，核型异常的问题。这一问题已经在人类胚胎干细胞上观察到。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明旨在建立一种基于人体细胞的无异种因子污染的饲养层细胞系统，本发明利用人诱导多能干细胞直接培育人成纤维样细胞(FLC)，然后进一步应用FLC来生成和扩增人类iPS细胞，本发明具体采用如下技术方案来解决上述技术问题：
一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，包括以下步骤：
a.制备人成纤维样细胞饲养层：取人成纤维样细胞，接种至培养皿上用10毫克/毫升丝裂霉素C提前处理3个小时，去除丝裂霉素C；
b.培养：重编程体细胞，生成人诱导多能干细胞，并将人诱导多能干细胞移植于步骤a中制备的饲养层中培养。
优选的，在上述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法中，所述步骤a中人成纤维样细胞采用如下方法生成：
a1：使用人包皮成纤维细胞重编程得到人诱导多能干细胞5.9细胞系；
a2：在基质胶上维持培养5.9细胞系7天；
a3：使用1毫克/毫升分散酶于37℃环境下消化5-7分钟后进行传代培养，培养液为1，培养液每天更换；
a4：当培养于基质胶中的5.9细胞系达到80％满时，去除1培养基后用1×PBS清洗两次，然后直接添加人成纤维样细胞培养基使5.9细胞系开始定向分化，前四天每天更换培养基，之后每2天更换一次；
a5：诱导6～12天后将长满的细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化，并以1×106个/孔的浓度把细胞接种在基质胶预处理的6孔板上；当细胞再次长满时，将细胞消化并以2×105个/孔的浓度接种到0.1％明胶预处理的6孔板中；
a6：在明胶处理过的的平板上培养3-5天后细胞形态逐渐均一，即为人成纤维细胞样。
优选的，在上述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法中,所述步骤b中的人诱导多能干细胞采用如下方法生成：
b1:取1×104人包皮成纤维细胞，采用杆状病毒介导的锌指核酸酶在第一天和第八天两次转染，将ZFN基因和OSKM基因同时转入细胞，使得OSKM基因特异性地整合到人包皮成纤维细胞的AAVS1位点，细胞培养液为FibroGROTM-LS完全培养基；
b2：使用200微克/毫升G418药筛10天后，将存活的细胞转移到人成纤维样细胞饲养层上形成细胞群落，得到人诱导多能干细胞。
优选的，在上述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法中，所述步骤b1中，表达ZFN基因和OKSM基因的杆状病毒每个细胞的感染复数为100。
优选的，在上述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法中，所使用的5.9细胞为60次连续传代的细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
采用本发明的设计，使用人诱导多能干细胞分化形成的人成纤维样细胞作为饲养层来培育人诱导多能干细胞，免除了非人异种因子污染和动物病原体的传播的风险，同时由于人诱导多能干细胞可在体外无限期培育，因此使用本发明的方案的饲养层细胞也能无限期的大量制备，相对于其他饲养层细胞，本发明的方法既保证了体细胞重编程生成的效率，又克服了现有技术饲养层细胞维持寿命短，培养代数少的问题，本发明的技术方案在人诱导多能干细胞的临床应用上具有巨大潜能。
附图说明
图1为本发明实施例1 5.9细胞在经不同实验条件在显微镜下形态及对比；
图2为本发明实施例2诱导多能干细胞全能型的验证及重编程效率；
图3为本发明实施例3人成纤维样细胞作为饲养层扩增全能干细胞的优势；
图4为本发明实施例3人成纤维样细胞不影响全能干细胞分化能力；
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明，但是本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1饲养层的制备
由人包皮成纤维细胞(HFFs)重编程得到的人类iPS细胞5.9细胞系为现有技术，在此不做详细介绍，在本发明中5.9细胞系被用作培育FLC的来源。5.9细胞系先在基质胶上维持培养7天，然后用1毫克/毫升分散酶(StemCellTechnologies公司)在37℃消化5～7分钟后进行传代培养。培养液1(StemCell Technologies公司)每天更换。在该实验中，我们用了三种不同的方法把5.9细胞系诱导分化成FLC。FLC的诱导培养基包括DMEM(ThermoScientific公司)，10％胎牛血清(Thermo Scientific公司)和0.1mM非必需氨基酸(NEAA)(Invitrogen公司)。
方法A：用0.1毫克/毫升的分散酶将人iPS细胞在37℃中消化分离20～30分钟，然后转移至超低吸附细胞培养板(Corning公司)上形成拟胚体(Embryoidbody,EB)。拟胚胎的培养基含有80％的DMEM/F12(Invitrogen公司)，20％的knockout血清替代品(Invitrogen公司)，2mM L-谷氨酰胺(PAN Biotech公司)，0.1mM的β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich公司)，0.1mM的非必需氨基酸和青霉素/链霉素(PAN Biotech公司)。将拟胚体培养5天后转移到0.1％明胶预处理的6孔细胞培养板中，并将培养液更换为FLC的诱导培养基。由拟胚胎向外长出的单个细胞一直被维持在明胶预处理的板子上，细胞长满时才进行传代培养。FLC培养基每2～3天更换一次，并用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen公司)消化细胞进行传代。
方法B：在37℃将5.9细胞系用1毫克/毫升分散酶消化5到7分钟，手动分离5.9细胞系并将其转移到0.1％明胶预处理的6孔板中，培养基同于方法A中的FLC的诱导培养基。
方法C：当培养于基质胶的5.9细胞系达到80％时，去除1培养基后用1×PBS清洗两次，然后直接添加FLC培养基使5.9细胞系开始定向分化。前四天每天更换培养基，之后每2天更换一次。诱导6～12天后将长满的细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化，并以1×106个/孔的浓度把细胞接种在基质胶预处理的6孔板上。当细胞再次长满时(通常为5天)，将细胞消化并以2×105个/孔的浓度接种到0.1％明胶预处理的6孔板中。在明胶处理过的的平板上培养3至5天后细胞形态逐渐均一，为成纤维细胞样形态。成功诱导的FLCs每3～4天可进行一次传代培养，而且可以将FLC冻存于液氮中，冻存液为FLC培养基加上10％的二甲基亚砜(Sigma公司)。
诱导FLC所用的克隆5.9是已超过60次连续传代的细胞。本发明中先采用了标准的形成拟胚体方法使克隆5.9细胞形成拟胚体，然后将拟胚体接种到明胶预处理的六孔板上，分化培养液是Chen等人报道的FLC培养基(方法A)。在拟胚体接种后的第二天单细胞开始出现，大概5天后就能在拟胚体周围形成放射状的单层细胞。成纤维样细胞在第7天就能观察得到，但是它们增殖比较缓慢，通常需要4～5周才能扩增成均一的成纤维样细胞群(图1A)。把克隆5.9的细胞群落直接转移到明胶预处理的六孔板上，无需拟胚体的形成而直接进行诱导分化(方法B)。iPS细胞群落在转移后就立即分化，而且在开始分化的前几天有严重的细胞死亡现象。(图1B)类似于拟胚体介导的细胞分化方法A，使用方法B时FLC的总产率不仅不高，而且需要长的分化时间(4～5周)才能形成形态均一的细胞群。
第三个方法(方法C)是直接将克隆5.9的细胞群落的培养基由1替换为FLC培养基，让接种在基质胶预处理的培养板上细胞群落直接分化。分化的细胞迅速扩增至覆盖整个培养板，并且在第5天形成大量的细胞团，很多细长的成纤维样细胞在第一周就能观察到。(图1C)将这些细胞重新接种到基质胶预处理的培养板上，一周后再转移到明胶预处理的培养板上(第14天)。在明胶预处理的板子上，成纤维细胞样细胞迅速富集成为形态均一的细胞群,整个过程大概需要3至4周。概述图1D总结了方法C。从图中可以看出，iPS细胞代数较老的细胞(60代以上)比代数年轻的iPS细胞(约第30代)更快分化成FLC，前者是3周和后者是4周。三种不同方法诱导产生的FLC在形态上没有明显的差异，但第三种方法得到的细胞有较好的存活能力和增殖能力，因而有较高的诱导效率，此方法被用于以下的实验。
实施例2培养人诱导多能干细胞
在使用FLC为饲养层细胞用于体细胞重编程前,需要用10毫克/毫升丝裂霉素C(Millipore公司)提前处理FLC 3个小时。用于重编程的体细胞是人包皮成纤维细胞(HFFs，Millipore公司)，本发明使用杆状病毒介导的锌指核酸酶(ZFN)将ZFN基因和OSKM基因(Oct4，Sox2，Klf4和c–Myc)同时转入细胞，使得OSKM基因特异性地整合到HFFs的AAVS1位点。携带有ZFN基因和OSKM基因的杆状病毒在第1天和第8天两次转染1×104的HFFs，细胞培养液为FibroGROTM-LS完全培养基(Millipore公司)。表达ZFN基因和OSKM基因的杆状病毒每个细胞的感染复数(MOI)分别为100和50。经过200微克/毫升G418药筛10天后，存活的细胞被转移到FLC饲养层上形成细胞群落。铺有MEF或基质胶处理过的细胞培养板用作对照组。
该体细胞重编程技术方法采用以杆状病毒转染为基础的ZFN技术，将OSKM基因特异性插入到人类19号染色体上的AAVS1位点(19q13.3-qter)。同一批号的HFF细胞将在不同的饲养层上进行重编程诱导，涉及到的有FLC饲养层，MEF饲养层以及基质胶饲养层。经杆状病毒转染和药物筛选后，存活的HFF细胞分别被接种到不同的饲养层直到细胞集落形成。无论使用哪种饲养层，ESC样集落最早要在转染后的第20天左右才出现。再培养一周后，就可以观察到细胞形态紧凑，边缘清晰的集落，而且大多数的集落AP染色结果呈阳性(图2A)。通过数AP-阳性集落的数目来计算HFF细胞在不同饲养层上的重编程效率(图2B)。当杆状病毒感染复数为50时，HFF细胞在FLC，MEF和基质胶上的重编程效率分别为1.25％，2.58％和0.13％。但当病毒感染复数增加到100时，FLC上的重编程效率(14.7％)是MEF上的(5.6％)2.6倍。
通过基因组DNA PCR扩增，检测八个随机挑选的iPS细胞克隆在AAVS1位点上的特异性整合。两对PCR引物分别设计在了整合基因表达框的两端。所有检测的克隆都在AAVS1位点有基因的特异性地整合(图2C)。实时定量PCR分析结果证明这些克隆相比于起始的HFF细胞都有经典的胚胎干细胞标志基因Nanog，Oct4，和Sox2的高水平表达(图2D)。当把iPS细胞接种于超低附着板并在拟胚体分化培养基中培养时，细胞能自发形成球形拟胚体(图2E)。而且三个胚层标志基因的表达，外胚层Pax6，中胚层α-MHC为和内胚层AFP在拟胚体中都有明显提高，与之相反在未分化的iPS细胞中却几乎检测不到这些基因的表达(图2E)，这说明了在FLC上建立的iPS细胞具有全分化潜能。
实施例3人成纤维样细胞对人诱导多能干细胞的影响
为了检测人iPS细胞衍生的FLC对人类全能性干细胞生长的影响，本发明测量了新生成的人iPS细胞和人胚胎干细胞H1细胞群落的直径和日增长率。将这些细胞群落在FLC或MEF上至少培养5代后才开始测量。测量时分别在接种后的第2天和第5天后选取十个细胞群落拍照，然后在图片上测量细胞群落的直径大小。细胞群落生长速率根据以下公式进行计算：(第5天的细胞群落直径-第2天的细胞群落直径)/3天。细胞群落的全能性干细胞标志基因的表达水平分析则通过定量qPCR。培养在基质胶或1上的细胞群落被则作为对照。
为了检测衍生的FLC对人类干细胞全能性的影响，新生成的人iPS细胞和人胚胎干细胞H1被用来形成拟胚体。在此之前要将细胞群落在FLC或MEF上至少培养5代，得到的拟胚体将用实时定量PCR进行表达分析。
为了检测新生成的人iPS细胞形成畸胎瘤的能力，将Accutase(Millipore公司)消化好的1×106个iPS细胞与0.5×106个丝裂霉素预处理的HFF混合且重悬于50微升的PBS中。先将细胞重悬液与50μl未稀释的预冷好的基质胶(Becton Dickinson公司)混合，然后才注射进5周龄的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的后腿。两个月后取出畸胎瘤，然后用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成5微米切片，并用苏木精和曙红染色。所有动物实验都依照新加坡实验动物研究国家咨询委员规定的实验动物护理和使用原则进行。
通过上述实验可以发现，两种不同饲养层上培养的干细胞的集落形态是一致的：扁平且紧凑，集落边缘清晰(图3A)。但是不论是人类iPS细胞系还是人类胚胎干细胞细胞系，培养在FLC上的集落都要比MEF上的大。为了量化具体的差异，从各个组随机选取十个细胞克隆，然后在细胞接种后的第5天测量细胞集落直径大小。当把iPS细胞和H1人类胚胎干细胞细胞系培养在FLC上时，细胞集落明显大于培养在MEF上(图3B)。同时测量第2天的细胞集落大小并用第5天与第2天之间细胞集落直径差来计算细胞集落的平均增长率。实验结果再次证明了FLC优越的促生长效果(图3B)。另外一组平行实验，即将iPS细胞和H1人类胚胎干细胞细胞系在FLC，MEF，以及胶质膜上培养5代，然后提取RNA用实时定量PCR分析多能性标记基因的表达。结果表明不同的培养基系统之间没有显著差异，除了培养在FLC和MEF上的iPS细胞的Nanog的表达水平上高于培养在基质胶上的细胞(图3C)。研究结果表明相比于MEF，FLC是维持人类全能性干细胞扩增的一个更好的选择。
进一步的，本实施例检测了iPS细胞和H1人类胚胎干细胞细胞系在灭活的FLC和MEF上培养10代后的分化潜能。此检测通过用收集到的细胞来形成体外拟胚体(图4A)。拟胚体的三个胚层标记基因的表达水平用实时定量RT-PCR进行测定，所检测的六个不同标记基因包括NELF，Pax6，α-MHC，PPAR_r，AC133，和AFP。大多数标记基因的表达水平在FLC和MEF上培养的细胞之间没有显著差异，除了FLC上培养的H1拟胚体的AFP和iPS细胞拟胚体的Pax6的表达量相比于MEF上的细胞都有所增加(图4B)。
本实施例同时进行了动物实验以检测iPS细胞系在体内的分化能力。将iPS细胞注射进NOD/SCID小鼠的后腿6周后，可以观察到畸胎瘤的形成。注射后的第8周，畸胎瘤被取用于组织学检查分化程度。图4C显示在畸胎瘤内同时存在三个胚层细胞，从而证实了建立并在维持在FLC上的iPS细胞仍具分化的全能性。
采用本发明的设计，使用人诱导多能干细胞分化形成的人成纤维样细胞作为饲养层来培育人诱导多能干细胞，免除了非人异种因子污染和动物病原体的传播的风险，同时由于人诱导多能干细胞可在体外无限期培育，因此使用本发明的方案的饲养层细胞也能无限期的大量制备，相对于其他饲养层细胞，本发明的方法既保证了体细胞重编程生成的效率，又克服了现有技术饲养层细胞维持寿命短，培养代数少的问题，本发明的技术方案在人诱导多能干细胞的临床应用上具有巨大潜能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.制备人成纤维样细胞饲养层：取人成纤维样细胞，接种至培养皿上
用10毫克/毫升丝裂霉素C提前处理3个小时，去除丝裂霉素C；
所述步骤a中人成纤维样细胞采用如下方法生成：
a1：使用人包皮成纤维细胞重编程得到人诱导多能干细胞5.9细胞系；
a2：在基质胶上维持培养5.9细胞系7天；
a3：使用1毫克/毫升分散酶于37℃环境下消化5-7分钟后进行传代培养，培养液为培养液每天更换；
a4：当培养于基质胶中的5.9细胞系达到80％满时，去除培养基后用1×PBS清洗两次，然后直接添加人成纤维样细胞培养基使5.9细胞系开始定向分化，前四天每天更换培养基，之后每2天更换一次；
a5：诱导6～12天后将长满的细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化，并以1×106个/孔的浓度把细胞接种在基质胶预处理的6孔板上；当细胞再次长满时，将细胞消化并以2×105个/孔的浓度接种到0.1％明胶预处理的6孔板中；
a6：在明胶处理过的平板上培养3-5天后细胞形态逐渐均一，即为人成纤维细胞样；
b.培养：重编程体细胞，生成人诱导多能干细胞，并将人诱导多能干细胞移植于步骤a中制备的饲养层中培养。
2.根据权利要求1所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法,其特征在于,所述步骤b具体包括如下步骤：
b1:取1×104人包皮成纤维细胞，采用杆状病毒介导的锌指核酸酶在第一天和第八天两次转染，将ZFN基因和OSKM基因同时转入细胞，使得OSKM基因特异性地整合到人包皮成纤维细胞的AAVS1位点，细胞培养液为FibroGROTM-LS完全培养基；
b2：使用200微克/毫升G418药筛10天后，将存活的细胞转移到人成纤维样细胞饲养层上培养形成细胞群落，得到人诱导多能干细胞。
3.根据权利要求2所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述步骤b1中，表达ZFN基因和OKSM基因的杆状病毒每个细胞的感染复数为100。
4.根据权利要求1所述的一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所使用的5.9细胞为60次连续传代的细胞。
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