CN105255998A - 一种快速检索病原物特异性检测靶标的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检索病原物特异性检测靶标的方法。本发明的快速检索病原物特异性检测靶标的方法在基因组水平快速查找新型病原生物的物种特异基因，能够在较短的时间内建立病新型原物的特异地分子诊断，适用于突发疫病、新型变异病原物等病理学特征未知、传播途径未知等人们研究不深入的病原物的快速检测与诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种快速检索病原物特异性检测靶标的方法。
背景技术
病原物是能够引起植物或者动物病害的生命体的统称。但是，目前对于病原生物的诊断方法单一、效率低、特异性较差。所以，建立病原生物尤其是新变异的病原物的特异性检测靶标的筛选是快速、高效实现病原物的诊断和防治的基础。
对于家蚕微粒子病的检测可以追溯到1870年，巴斯德创立了母蛾镜检法检测家蚕微孢子，100多年来，此方法一直沿用至今，是生产上用于检测的传统方法。但是该方法较为复杂、对于操作者经验要求较强，并且不同人操作存在误差较大。因此，目前对于该病的检测研究热点主要集中在寻找一种更简单、更快速的检测方法。到目前为止家蚕微孢子虫的检测经历了以下几个阶段：显微镜检、分子生物学检测、免疫学检测。近年来，逐步还发展了其针对微孢子虫种间孢壁蛋白抗原性的不同而开展的一系列免疫学检测方法。但是，由于免疫学检测方法的确立试验周期较长、经济成本较大，因此，在一定程度上制约了该法的推广应用。不过，随着分子生物学技术的发展，2004年家蚕微孢子虫全基因组测序完成，并绘制了框架图，微粒子病的检测开始进入了分子生物学阶段，利用PCR技术或LAMP技术检测微粒子病的方法始见报道。尽快PCR检测试剂盒存在研究周期较短、投入成本低等诸多优点，但是，由于现有技术中没有一种统一的靶基因确定办法，因此，目前市场上现存的PCR检测试剂盒存在灵敏度、特异性较差的问题。那么，尽快建立一种特异性较好、针对性较强的靶基因检索方法就成为微粒子病检测工作的重中之重。
发明内容
本发明的目的之一是为解决目前对于病原生物的诊断方法单一、效率低、特异性较差的难题，提供一种快速检索病原物特异性检测靶标的方法。
本发明提供一种快速检索病原物特异性检测靶标的方法，包括以下步骤：
采集新型病原生物的样本，提取其基因组，构建基因组文库；
通过NCBI的已发布的基因组信息，基于看家基因座位的保守性，进行染色体或者scaffold逐一对齐，同时进行共线性分析；
检索出基因座位不保守的基因，并且通过比较基因组学分析确定其与GenBank库中不具有同源的基因序列作为候选基因；
将候选基因在目的病原物基因组数据中进行检索，确定其上下游基因保守性，并单独建库；
对候选基因进行克隆、测序、比对分析，并检测基因的表达情况；
将验证正确，并且能够正常转录的基因确定为分子诊断的靶基因；
收集多种形态各异的具有同一寄主的病原微生物，并将候选基因进行PCR检测，验证其特异性。
进一步的，将特异性好的靶标基因制成PCR快速检测试剂盒，或者制成免疫检测试剂盒。
本发明的有益效果在于：本发明的快速检索病原物特异性检测靶标的方法在基因组水平快速查找新型病原生物的物种特异基因，能够在较短的时间内建立新型病原物的特异性分子诊断，适用于突发疫病、新型变异病原物等病理学特征未知、传播途径未知等人们研究不深入的病原物的快速检测与诊断。
附图说明
图1所示为本发明实施例中32号Scaffold上的一端特异基因组区域的共线性分析图。
图2所示为本发明实施例中NbPolk和NbOPI两个编码基因的RT-PCR验证图。
图3所示为本发明实施例中六种家蚕病原微生物分离株的PCR检测图。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例
本发明的快速检索病原物特异性检测靶标的方法，包括以下步骤：
采集新型病原生物的样本，提取其基因组，构建基因组文库；
通过NCBI的已发布的基因组信息，基于看家基因座位的保守性，进行染色体或者scaffold逐一对齐，同时进行共线性分析；
检索出基因座位不保守的基因，并且通过比较基因组学分析确定其与GenBank库中不具有同源的基因序列作为候选基因；
将候选基因在目的病原物基因组数据中进行检索，确定其上下游基因保守性，并单独建库；
对候选基因进行克隆、测序、比对分析，并检测基因的表达情况；
将验证正确，并且能够正常转录的基因确定为分子诊断的靶基因；
收集多种形态各异的具有同一寄主的病原微生物，并将候选基因进行PCR检测，验证其特异性。
进一步的，将特异性好的靶标基因制成PCR快速检测试剂盒，或者制成免疫检测试剂盒。
目前，该发明已应用于家蚕微粒子病的病原检测上。
具体实施举例：
分离采集重庆地区的家蚕微粒子病蚕，提取其totalRNA，并进行全基因组测序。此后，对家蚕微孢子虫(NosemabombycisCQ1)全基因组4,479个基因进行比较基因组学分析，通过与其他已发布的其他微孢子虫基因组信息，包括Encephalitozoonromaleae,Encephalitozoonintestinalis,Encephalitozoonhellem,Encephalitozoonbieneusi,Nosemacerannae,Vittaformacorneae,Edhazardiaaedis,Antonosporalocustae,Vavraiaculicisfloridiensis,Trichomonashominis,Nematocidasp1等从人、猫、兔、蜜蜂、按蚊、果蝇等寄主中分离得到的微孢子虫逐一比较，获得了82个家蚕微孢子虫孤儿基因(orphangene)，为家蚕微孢子虫独有，并且在GenBank中不存在同源序列及基因家族信息。
如图1所示，对NCBI能够检索到的近缘物种，于GenBank中下载其基因组序列，左侧为六种已知基因组数据的微孢子虫进化关系，右侧为案例中通过共线性分析得到的感染家蚕的病原微生物特异的靶标基因。其中每一列为同源基因及其在基因组中的座位，横线表示基因组拼接情况及基因间隔距离。将候选基因在目的病原物基因组数据中进行检索，确定其上下游基因保守性，并单独建库；密码子偏好性显示，这些基因倾向使用UCG(Ser)和CCG(Pro)两类密码子。通过对这82个基因所在scaffold的GC分布特征调查，结果筛选到4个为新近插入基因，对这四个基因进行GeneOntology(GO)功能分类显示，他们主要参与DNA修复和细胞凋亡通路的功能基因，将这类基因单独建库。
分别设计候选基因的上下游特异引物，进行T克隆，并测序。将测序结果匹配度≥98％的基因作为候选。同时，以家蚕微粒子病蚕totalRNA为模板进行候选基因的表达情况分析，并确定其转录时期，将感病中后期稳定表达的基因作为候选靶标基因。
如图2所示，分别提取病蚕幼虫期1-10天，成虫期(因其为变态发育，故分别取蛹、蛾、卵时期)的totalRNA，取前面分析得到的候选基因的特异引物进行转录分析，结果显示，分别与家蚕、病原物的对照相比，这两个基因均在感染后持续、稳定转录，适合作为候选靶标基因。后经测序验证完全匹配，故将验证正确的候选基因单独艰苦，并确定为分子诊断的靶基因。
如图3所示，选用患6种不同病的家蚕为模板，利用候选基因库中的靶标基因特异引物进行PCR扩增，结果显示GENEI、geneII、geneⅣ特异性最好，可以组装试剂盒。
目前，将其进行家蚕微粒子病LAMP检测试剂盒制备，其中GeneI和GeneIV特异性较好，灵敏度达1×105个病原物。
本发明是基于对一种感染家蚕的病原微生物——家蚕微孢子虫为研究对象获得的一种可推广、应用性强的研究方法。
此外，该法确立后，对于解决已完成基因组测序的未知病原物、或者快速变异的病原微生物的快速检测提供了一种行之有效的方法。
本发明的快速检索病原物特异性检测靶标的方法在基因组水平快速查找新型病原生物的物种特异基因，能够在较短的时间内建立新型病原物的特异地分子诊断，适用于突发疫病、新型变异病原物等病理学特征未知、传播途径未知等人们研究不深入的病原物的快速检测与诊断。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
Claims (2)
1.一种快速检索病原物特异性检测靶标的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采集新型病原生物的样本，提取其基因组，构建基因组文库；
通过NCBI的已发布的基因组信息，基于看家基因座位的保守性，进行染色体或者scaffold逐一对齐，同时进行共线性分析；
检索出基因座位不保守的基因，并且通过比较基因组学分析确定其与GenBank库中不具有同源的基因序列作为候选基因；
将候选基因在目的病原物基因组数据中进行检索，确定其上下游基因保守性，并单独建库；
对候选基因进行克隆、测序、比对分析，并检测基因的表达情况；
将验证正确，并且能够正常转录的基因确定为分子诊断的靶基因；
收集多种形态各异的具有同一寄主的病原微生物，并将候选基因进行PCR检测，验证其特异性。
2.如权利要求1所述的快速检索病原物特异性检测靶标的方法，其特征在于，还包括将靶基因制成PCR快速检测试剂盒或免疫检测试剂盒的步骤。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160120 |