CN114058731B

CN114058731B - 一种用于区分稻瘟菌来源的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN114058731B
Application number: CN202111440358.2A
Authority: CN
Inventors: 王一; 李成云; 吴奇; 刘立娜; 浦鑫; 马婵
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: CN114058731A

Abstract

本发明公开了一种用于区分稻瘟菌来源的分子标记及其应用，所述分子标记物的序列为SEQ ID NO.1。本发明可以通过该分子标记进行分子检测快速鉴定来源籼型水稻或粳型水稻的稻瘟菌，所筛选的特异性引物可对区分稻瘟菌籼、粳稻来源进行良好分型，检测方法简单易行，准确率高达100％。本发明方法为未知水稻亚种来源的稻瘟菌寄主鉴定提供指导作用，为研究稻瘟菌寄主专化性机制、稻瘟病预测预报和水稻主栽品种布局提供方法依据。

Description

一种用于区分稻瘟菌来源的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于区分稻瘟菌籼、粳水稻来源的分子标记及其应用，属于分子生物学领域。

背景技术

稻瘟病是威胁全球水稻生产的重要病害，稻瘟菌作为其致病菌位列十大植物病原真菌首位。根据地理和气候等因素，栽培稻主要分为籼稻和粳稻两类。在我国，黑龙江、辽宁等北方地区主栽粳稻，湖南、江苏等南方区为籼稻区。由于主栽稻籼、粳亚种的差异，造成了稻瘟菌群体对籼、粳稻亚种侵染能力的分化。粳稻来源的稻瘟菌只能侵染粳稻，不能侵染籼稻；而籼稻来源的稻瘟菌既可以侵染籼稻也可以侵染粳稻。关于籼稻、粳稻的抗病性，籼稻区菌侵染籼稻的发病率高于籼稻区菌侵染粳稻的发病率，粳稻区菌侵染粳稻的发病率高于粳稻区菌侵染籼稻的发病率。籼稻的整体抗性明显的好于粳稻。籼稻与粳稻对稻瘟病的抗性能力存在着较大的差异，无论是籼稻还是粳稻，它们对来源于不同生态区的稻瘟病菌都表现着更好的抗性。即籼稻对粳稻区菌表现出更强的抗性能力，而粳稻对籼稻区菌比对粳稻区菌表现出更强的抗性能力。稻瘟菌遗传资源丰富，变异速度快，菌株多样性程度高，通过形态学观察是无法区分菌株的籼、粳寄主来源，只能根据的感病水稻的籼、粳亚型区分。但是，这种区分方式是以寄主发病为前提，已经造成了重要损失。

目前，稻瘟菌对籼、粳稻的分化机制仍不清楚，主要集中在无毒基因方面的研究。在云南元阳地区，由于特殊的水稻栽培方式，形成了特有的稻瘟菌与水稻互作模式。当地的粳稻菌株含有无毒基因AvrPia，籼稻中含有相应的抗性基因Pia造成了籼稻对粳稻来源的稻瘟菌产生抗性。但是，在其他地区，对无毒基因检测并不能准确鉴定稻瘟菌籼、粳寄主的来源。前期通过基因组学研究发现，籼、粳来源的稻瘟菌株中各自含有特殊的遗传位点，可以作为区分稻瘟菌籼、粳稻来源的分子标记。

在中国，有很多地区既适合种植籼稻，也适合种植粳稻，通过分子检测的手段监测稻瘟菌的籼、粳来源，区分不同来源稻瘟病菌，及时地更换田间种植的水稻籼粳品种，可以减少稻瘟病的发生，降低农药的使用和减轻农民防治稻瘟病成本，提高收入，从而达到持久且稳定控制稻瘟病的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种区分稻瘟菌籼粳来源的分子标记及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种区分稻瘟菌来源的分子标记物，其序列为SEQ IDNO.1，其所编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的分子标记位于稻瘟菌基因组第6染色体3112864bp-3112917bp位，所述的分子标记的长度为54bp。

进一步地，所述的分子标记所对应的特异性引物为：

正向引物：5’-CTTCAGGTGCCACACGGGCG-3’

反向引物：5’-TTCGCTTGAATGTGGAGGCT-3’。

本发明还提供利用上述分子标记及特异性引物来区分稻瘟菌籼粳来源的方法，其包括以下步骤：

1)提取待检稻瘟菌DNA，

2)利用权利要求2所述的引物对步骤1)中的DNA序列进行扩增，

3)对步骤2)得到的扩增产物进行测序，判定扩增产物的序列是否缺失所述的分子标记的序列。

进一步地，所述的步骤3)的扩增产物的序列中缺失所述的分子标记序列时，该稻瘟菌来源为籼稻；当该扩增产物的序列存在所述的所述的分子标记序列时，该稻瘟菌来源为粳稻。

本发明还保护利用所述的分子标记在水稻稻瘟病菌来源鉴定方面的应用。

本发明还保护用于鉴定稻瘟菌籼、粳来源的的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物对。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明可以通过分子检测快速鉴定来源籼型水稻或粳型水稻的稻瘟菌，特异性引物用于区分稻瘟菌从籼、粳稻来源进行良好分型，检测方法简单易行，准确率高，达到100％。

利用该分子标记及方法可对粳籼来源的稻瘟病菌的群体结构进行检测鉴定，从而对同一生境下、多寄主品种的稻瘟病菌进行准确的鉴定和分析，了解不同来源稻瘟病菌的致病性，可以进一步地了解稻瘟病菌株的侵染规律，研究稻瘟病菌变异动态和规律，更好地为研究稻瘟菌寄主专化性机制、稻瘟病预测预报和水稻主栽品种布局以及有效培育抗性品种提供基础和方法依据。

附图说明

图1为本发明分子标记WL-XJ-12序列的位置图

图2为利用本发明分子标记和特异性引物验证来源不同籼粳水稻的稻瘟菌的序列测序结果的图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1分子标记的获得

利用二代基因组测序方法对采自云南粳稻和籼稻种植区的各10株稻瘟菌进行全基因组测序，将测序结果与稻瘟菌参考基因组70-15进行对比，获得菌株SNP信息。使用Paml4.9c程序计算测序菌株中受到籼粳寄主来源的正选择信号相关候选基因。对候选基因在籼、粳来源的稻瘟菌群体中进行比对发现，第6染色体3112864bp-3112917bp位缺失时，稻瘟菌都采集自籼稻，当第6染色体3112864bp-3112917bp位存在时，稻瘟菌都采集自粳稻。该WL-XJ-12序列的缺失与区分稻瘟菌来源籼、粳稻的相关，其序列如SEQ ID NO.1所示。

对WL-XJ-12序列在稻瘟菌参考基因组进行比对，确定其位于第6染色体的3112864bp-3112917bp位，所在的基因序号为2677414，编码稻瘟菌胆碱酯酶(cholinesterase)，如图1所示。根据关联分析发现：如果稻瘟菌中WL-XJ-12序列缺失，说明稻瘟菌来源自籼稻；如果WL-XJ-12序列存在时，包含该序列的稻瘟菌来源粳稻。因此，该序列可以作为区分稻瘟菌来源籼、粳稻的分子标记。

实施例2利用该分子标记验证稻瘟菌籼粳来源

1.籼粳水稻种植区稻瘟菌的分离、培养

采集籼、粳水稻种植区的稻瘟病发病叶片，保湿黑暗培养24小时后，将叶片病斑部位孢子涂在2％水琼脂培养基(琼脂2g，蒸馏水100ml)。在显微镜下使用接种针挑取单胞置于新的PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml)。将单胞培养24小时后，在显微镜下观察孢子是否萌发，培养基是否污染，萌发且没有被污染的孢子再培养7天，用于菌株的DNA提取。共获得60个来源不同籼、粳稻病斑的稻瘟菌样品(已知水稻品种)，具体信息见表1。

表1稻瘟菌样品采集信息

2.稻瘟菌DNA的提取

使用灭菌的牙签单孢分离的稻瘟菌菌丝转移至含有石英砂的1.5ml离心管中，使用研钵棒将菌丝组织细胞磨碎。在离心管中加入500μl 1％CTAB提取液，充分震荡后，置于65℃水浴锅中，水浴1小时。水浴完成后，静置至室温，加入500μl氯仿异戊醇混合液(体积比：25:1)，震荡混匀后，12000rpm离心10分钟后，吸200μl上清液移至新的1.5ml离心管中，加入200μl异丙醇，震荡混匀后，离心2分钟，转速为12000rpm。离心完成后，弃上清，加入75％乙醇溶液，12000rpm离心2分钟后，弃上清，再加入75％乙醇溶液12000rpm离心2分钟后，弃上清。将含有DNA的离心管放在超净工作台上，吹无菌风。待离心管完全干燥后，加入50μl超纯水，溶解DNA，保存在4℃冰箱，用于后续目的片段扩增。

3、WL-XJ-12序列的扩增

在WL-XJ-12序列两侧设计特异性引物(正向引物：5’-CTTCAGGTGCCACACGGGCG-3’；反向引物：5’-TTCGCTTGAATGTGGAGGCT-3’)，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4如示，利用PCR方法，扩增含有WL-XJ-12序列的片段。PCR反应液成分如下表2。

表2 PCR反应液成分

成分	体积(微升)
		正向引物(10μM)	1
反向引物(10μM)	1
		模板	1
10×buffer	5
		2.5mMdNTPs	4
DNAPolymerase	1
		Nuclease-freewater	37
Totalvolume	50

PCR反应条件如下：

4、扩增片段的测序

使用Sanger测序方法对扩增片段进行测序。测序结果中，所述的步骤3)的扩增产物的序列中缺失所述的分子标记序列时，该稻瘟菌来源为籼稻；当该扩增产物的序列存在所述的所述的分子标记序列时，该稻瘟菌来源为粳稻。测序结果见图2和表3。

表3 WL-XJ-12序列验证稻瘟病菌来源测序结果表

结果发现：利用本发明分子标记和特异性引物鉴定60个样品的稻瘟病菌来源与采集地所种植的水稻籼粳一致，鉴定成功率达100％。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南农业大学

<120> 一种用于区分稻瘟菌来源的分子标记及其应用

<130> 12

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacatgcgga tgagggctct cgacttgccg ggcaggggag acgcgatgaa gggg 54

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asn Met Arg Met Arg Ala Leu Asp Leu Pro Gly Arg Gly Asp Ala Met

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttcaggtgc cacacgggcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcgcttgaa tgtggaggct 20

Claims

1.一种区分稻瘟菌籼粳来源的分子标记片段，其DNA序列为SEQ ID NO.1，其所编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的分子标记片段，其特征在于，所述的分子标记片段位于稻瘟菌基因组第6染色体3112864bp-3112917bp位，所述的分子标记片段的长度为54 bp。

3.根据权利要求1或2所述的分子标记片段，其特征在于，所述的分子标记片段所对应的特异性引物为：

正向引物：5’- CTTCAGGTGCCACACGGGCG-3’

反向引物：5’- TTCGCTTGAATGTGGAGGCT-3’。

4.一种区分稻瘟菌籼粳来源的方法，其包括以下步骤：

1）提取待检稻瘟菌DNA，

2）利用权利要求2所述的引物对步骤1）中的DNA序列进行扩增，

3）对步骤2）得到的扩增产物进行测序，判定扩增产物的序列是否缺失所述的分子标记片段的序列。

5.根据权利要求4所述的区分稻瘟菌籼粳来源的方法，其特征在于：所述的步骤3）的扩增产物的序列中缺失所述的分子标记片段的序列时，该稻瘟菌来源为籼稻；当该扩增产物的序列存在所述的分子标记片段序列时，该稻瘟菌来源为粳稻。

6.根据权利要求1-3任一权利要求所述的分子标记片段在水稻稻瘟病菌来源鉴定方面的应用。

7.用于鉴定稻瘟菌籼、粳来源的的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物对。