CN105237365B - 樟芝固态培养菌丝体的萃取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种樟芝固态培养菌丝体的萃取物及其在制备抗肺癌细胞转移药物中的应用，该樟芝固态培养菌丝体的萃取物为2,3,6‑Trimethoxy‑4‑methylphenol，又称利得1号(Leader1)，该Leader1能有效抑制肺癌肿瘤细胞的运动、迁徙及侵袭的能力，进而达到抗肺癌细胞转移的效果，可展现优异的抗肺癌细胞转移的生理活性与作用机制。
Description
技术领域
本发明有关于一种樟芝固态培养菌丝体的萃取物，同时还关于该樟芝固态培养菌丝体的萃取物在制备抗肺癌细胞转移药物中的应用。
背景技术
肿瘤的生成会经由个人的行为、年龄、饮食、生活习惯、遗传以及环境所造成，根据卫生署的数据显示，恶性肿瘤依然为十大死亡原因之首，而通常导致癌症病人致死的原因，都是因为肿瘤的转移，所以，如何能有效地控制肿瘤细胞并且抑制其转移，对治疗癌症是非常重要的策略之一。
樟芝(Antrodia cinnamomea；Syn.Antrodia camphorata and Taiwanofunguscamphorata)是非常珍贵的药用真菌。在许多科学研究中已证实，樟芝菌丝体的甲醇抽出物与热水萃取物、子实体的甲醇萃取物、乙醇萃取物与乙酸乙酯萃取物具有优异的抗发炎活性，而也有部分研究指出樟芝的菌丝体与子实体含有一些环烷类的化合物，该些化合物具有抗癌的能力，然而关于樟芝及其所含的环烷类化合物参与抗癌转移的作用机制与生理活性，仍有待更进一步的了解。故，一般无法符合使用者于实际使用时所需。
发明内容
本发明的主要目的在于，克服已知技术所遭遇的上述问题并提供一种樟芝固态培养菌丝体的萃取物及其应用，该萃取物可抑制肺癌肿瘤转移的产生，而展现优异的抗癌转移。
为达以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种樟芝固态培养菌丝体的萃取物，该萃取物按以下列步骤获取：
(A1)提供一干燥的樟芝固态培养菌丝体；
(B1)将该干燥的樟芝固态培养菌丝体于25-40℃下以10倍体积的95％体积浓度的乙醇萃取。
本发明采用的另一种技术方案是：一种樟芝固态培养菌丝体的萃取物，该萃取物按下列步骤获取：
(A2)提供一干燥的樟芝固态培养菌丝体；
(B2)将该干燥的樟芝固态培养菌丝体于25-40℃下以10倍体积的95％体积浓度的乙醇萃取以获得一乙醇萃取物；
(C2)真空浓缩该乙醇萃取物以获得一浓缩产物；
(D2)利用100％体积浓度的乙酸乙酯与水将该浓缩产物分层化以获得一乙酸乙酯萃取物。
上述干燥樟芝固态培养菌丝体的干燥方式为冷风干燥。
本发明同时提供上述提及的萃取物在制备抗肺癌细胞转移药物中的应用。所述萃取物通过抑制肺癌细胞移行作用或侵袭作用以抗肺癌细胞转移。
所述萃取物通过降低磷酸化丝氨酸激酶、基质金属蛋白酶中的明胶分解酶、及增加钙黏附分子E、金属蛋白酶抑制剂的表现以抑制该肺癌细胞的移行作用与侵袭作用。
本发明提及的上述萃取物的分子为2,3,6-Trimethoxy-4-methylphenol(2,3,6-三甲氧基-4-甲基苯酚)，其结构式如下：
本发明还提供一种抗肺癌细胞转移的方法，是使受测对象与上述的萃取物或2,3,6-Trimethoxy-4-methylphenol(2,3,6-三甲氧基-4-甲基苯酚)接触。
综上述，本发明的樟芝固态培养菌丝体的萃取物具有抗肺癌细胞转移的功效，更明确地，本发明揭露樟芝固态培养菌丝体的萃取物于抗肺癌细胞转移的生理活性与作用机制，可制备成抗肺癌细胞转移药物。
附图说明
图1是本发明樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1示意图。
图2是本发明樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的细胞存活率示意图。
图3是本发明樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的细胞伤口愈合能力的表现量示意图。
图4A及图4B是本发明樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的细胞移行能力的表现量示意图。
图5是本发明樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的细胞侵袭能力的表现量示意图。
图6A及图6B是本发明樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的表现量示意图。
图7是本发明樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞中纤溶酶原激活物的能力的表现量示意图。
图8A及图8B是本发明樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞转移的相关蛋白酶及蛋白表现能力的表现量示意图。
具体实施方式
本发明是关于一种樟芝固态培养菌丝体的萃取物及其应用，该萃取物抑制肺癌细胞转移的产生，而展现优异的抗癌转移功能。该樟芝固态培养菌丝体的萃取物为2,3,6-Trimethoxy-4-methylphenol(2,3,6-三甲氧基-4-甲基苯酚)，又称利得1号(Leader 1)。
癌细胞转移的过程，包括了细胞的黏附(adhesion)、侵入(invasion)以及迁移(migration)。癌细胞的转移需要基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)来分解细胞外基质(Extracellutar Matrix,ECM)，并且产生上皮-间质细胞转换(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)；同时癌细胞转移相关的蛋白会大量地表现，促使癌细胞转移的发生。
肿瘤坏死基因(Tumor necrosis factor,TNF)是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白(cytokine)。其中肿瘤坏死基因-α(TNF-α)主要由单核-巨噬细胞分泌。许多先前的研究中指出TNF-α会促进肺癌细胞的浸润及转移。据此，当运用时，本发明是以TNF-α诱导A549肺癌细胞以做为本发明于樟芝固态培养菌丝体参与抗肺癌细胞转移的角色探讨的模型。
以下实施例仅举例以供了解本发明的细节与内涵，但不用于限制本发明的申请专利范围。
实施例1：实验设计
[材料]
本发明所用的樟芝固态培养菌丝体是由中国台湾利得生物科技公司自行培养的菌丝体。胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)购自Gibco BRL(Invitrogen,Grand Island,NY)。二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、盘尼西林(penicillin)、噻唑蓝溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)、吉姆萨(Gimsa)、及酪蛋白(Casein)皆购自Sigma-Aldrich(St Louis,MO)。本发明所用的所有化学药品及溶剂皆为试剂或高效能液相层析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)等级。
[细胞培养]
本发明选用人类肺癌肿瘤A549细胞以进行肿瘤细胞转移实验探讨。关于A549细胞的培养，是首先将生长于培养瓶(75T Flask)的A549细胞，以2×105cells/cm2的接种密度改种于10cm2培养盘(dish)中，并培养于37℃，5％CO2培养箱(incubator)中。所使用的培养液是依据生物资源保存中心(Bioresources Collection and Research Center,BCRC)与美国菌种中心(American Type Culture Collection,ATCC)的建议选用Ham’s F12培养液，并外加10％的胎牛血清。
实施例2：本发明的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1的制备
首先将樟芝固态培养菌丝体以冷风干燥方式干燥，接着在25℃下将2000克前述经冷风干燥的樟芝固态培养菌丝体以10倍体积的95％体积百分比(v/v)的乙醇萃取，以得本发明的乙醇萃取物(ACME)。前述干燥方式可选用所属领域已知的任何干燥方式，而无须加以限定，如冷风干燥。
接着将该乙醇萃取物于真空下(in vaccum)浓缩以获得323.6公克的浓缩产物。所得浓缩产物接着以100％(v/v)的乙酸乙酯与水分层为乙酸乙酯分离部与水溶性层，其中该水溶性层系标记为水溶性分离部(ACME-water)，而该乙酸乙酯分离部即为本发明的乙酸乙酯萃取物(ACME-EA)。
实施例3：Leader 1的分离
将上述实施例2中所得的乙酸乙酯萃取物(ACME-EA)以管柱层析法(columnchromatography)经流动相的浓度梯度中划分为9个次分离部。其中，该管柱层析法所使用的固定相为硅胶(230～400mesh)，流动相为正己烷/乙酸乙酯混合液；该浓度梯度是指依序以正己烷与乙酸乙酯的体积百分浓度比为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、30:70、及0:100的正己烷/乙酸乙酯混合液作为流动相以进行该色层分析法。
接着将前述第4分离部以高效能液相层析仪进行纯化、分离，使用硅胶管柱为固定相，用体积比为77:23的正己烷/乙酸乙酯混合液为流动相，于流速5毫升/分，UV 254nm波长条件下，进一步分离纯化以得其组成成分，并将其含量最高的成分以质谱分析得到其分子量为198.09，并推得分子式为C10H14O4。此成分进一步经核磁共振氢谱及碳谱确认其结构式如下：
请参阅图1所示，证实此化合物为2,3,6-Trimethoxy-4-methylphenol(Leader1)。
实施例4：实施例2的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1抑制肺癌细胞(肺癌细胞株A549)存活率的测试
首先A549肺癌细胞依据上述实施例1所述的细胞培养方法培养，以胰蛋白酶冲洗下后，将细胞以2x105cells/cm2的接种密度至24孔盘中24小时使细胞贴附，如下表1所示，置换含有浓度为0、5、10、20及40μM的Leader 1化合物(加药0μM之组别以DMSO当作控制组)的培养基培养24小时后除去，加入5mg/ml的MTT作用2小时，MTT为水溶性的四氮唑盐(tetrazolium salt)，用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)溶解后呈淡黄色，经由细胞粒腺体内的脱氢酶还原后，MTT的环状结构会被置换成不溶于水的蓝紫色结晶物，再用DMSO将细胞膜及蓝紫色结晶物溶出，用波长570nm测得其吸光值并用sigma plot10.0进行统计作图。
表一
请参阅图2所示，是本发明的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的细胞存活率示意图。如图所示：由实施例2所得的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader1展现了对肺癌细胞存活能力不具影响能力，其在0～40μM的浓度下无差异性，显示其对肺癌细胞不具有细胞毒杀的产生。
实施例5：实施例2的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1抑制肺癌细胞(肺癌细胞株A549)伤口愈合的测试
首先A549肺癌细胞是依据上述实施例1所述的细胞培养方法培养，以胰蛋白酶冲洗下后，将细胞以2x107cells/cm2的接种密度至12孔盘中24小时使细胞贴附，接着在每个孔盘中划下伤口的线，用PBS轻微清洗掉漂浮的细胞，并且加入含有浓度为0、5、10、20及40μM的Leader 1(加药0μM的组别以DMSO当作控制组)的培养基，观察时间点为加药后0、12、24或48小时，并拍照纪录。
请参阅图3所示，是本发明的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的细胞伤口愈合能力的表现量示意图。如图所示：由实施例2所得的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1展现了抑制促进肺癌细胞伤口愈合能力，尤其在40μM的浓度下更显优异。
实施例6：实施例2的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1抑制肺癌细胞(肺癌细胞株A549)移行能力的测试
使用24孔盘透孔套组(24-well transwell kit，Millipore)分析肺癌细胞移行能力。
首先A549肺癌细胞依据上述实施例1所述的细胞培养方法培养，以胰蛋白酶冲洗下后，将细胞以2x105cells/cm2的接种密度至6孔盘中24小时使细胞贴附，接着加入含有浓度为0、5、10、20及40μM的Leader 1(加药0μM的组别以DMSO当作控制组)的培养基24小时后，将细胞以PBS润洗，用胰蛋白酶(tripsin)将细胞打下，装进离心管以1280rpm离心三分钟，移除上清液，用PBS缓慢洗除细胞上残留的血清，再以1280rpm离心3分钟，细胞以2x105cells/cm2的密度加入仅含0.1％胎牛血清的培养基，取200μl注入透孔上层处，下层使用含有20％胎牛血清(可加入或不加入TNF-α诱导)的培养基，放入培养箱中，观察时间点为12或24小时。
将透孔取出，以二次水(ddH2O)缓慢让透孔润过，将上层没有穿透孔隙的细胞以棉花棒去除；再将透孔浸泡于甲醇中固定20分钟后晾干，浸泡于Gimsa中染色20分钟，让透孔浸泡二次水数分钟后晾干，用显微镜观察细胞移行情形并且拍照记录并用sigma plot10.0进行统计作图。
请参阅图4A及图4B所示，是本发明的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的细胞移行能力的表现量示意图。如图所示：由实施例2所得的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1展现了抑制肺癌细胞移行能力，尤其在40μM的浓度下更显优异。
实施例七：实施例2的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1抑制肺癌细胞(肺癌细胞株A549)侵袭能力的测试
使用24孔盘透孔套组分析肺癌细胞侵袭能力。先在透孔上层注入基质胶(Matrigel，3mg/ml-well，BD science)，放入培养箱中24小时使其凝固备用。
首先A549肺癌细胞依据上述实施例1所述的细胞培养方法培养，以胰蛋白酶拆下后，将细胞以2x105cells/cm2的接种密度至6孔盘中24小时使细胞贴附，接着加入含有不同浓度的0、5、10、20及40μM的Leader 1的培养基24小时后，将细胞以PBS润洗，用胰蛋白酶将细胞打下，装进离心管以1280rpm离心3分钟，移除上清液，用PBS缓慢洗除细胞上残留的血清，再以1280rpm离心3分钟，细胞以2x105cells/cm2的密度加入仅含0.1％胎牛血清的培养基，取200μl注入透孔上层处，下层使用含有20％胎牛血清的培养基，放入培养箱中，观察时间点为12或24小时。
将透孔取出，以二次水缓慢让透孔润过，将上层没有穿透孔隙的细胞以棉花棒去除；再将透孔浸泡于甲醇中固定20分钟后晾干，浸泡于Gimsa中染色20分钟，让透孔浸泡二次水数分钟后晾干，用显微镜观察细胞侵袭情形并且拍照记录并用sigma plot 10.0进行统计作图。
请参阅图5所示，是本发明的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的细胞侵袭能力的表现量示意图。如图所示：由实施例2所得的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1展现了抑制促进肺癌细胞侵袭能力，尤其在40μM的浓度下更显优异。
实施例8：实施例2的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1抑制肺癌细胞(肺癌细胞株A549)基质金属蛋白酶能力的测试
以电泳方式对水解酶进行检测，使用明胶酶谱法(gelatin-zymography)分析在肺癌细胞中基质金属蛋白酶(MMP)中明胶分解酶(gelatinases；MMP-2、MMP-9)的酵素活性。
首先A549肺癌细胞依据上述实施例1所述的细胞培养方法培养，以胰蛋白酶拆下后，将细胞以2x105cells/cm2的接种密度至12孔盘中24小时使细胞贴附，接着用PBS润洗两次，加入含有不同浓度的0、5、10、20及40μM的Leader 1的培养基24小时后，置换成含有1％胎牛血清的培养基24小时，取得与细胞培养的培养液(culture medium)，放入微量离心管中以1250rpm离心10分钟，取上清液保存于-20℃。
将等量的上清液混合物加入6倍基质金属蛋白酶染剂(6x MMP dye)至8％梯度电泳胶体孔内(SDS-PAGE，含有明胶1mg/ml)，加入跑胶缓冲液(running buffer)以80V，300mA分离(resolve)至45kD的基质金属蛋白酶标记(MMP marker)到胶的中间时即停止作用。
将胶取下在酶谱复性缓冲液(zymography renaturing buffer)中作用于35rpm，并以室温下作用两次，每次30分钟，待移除其中的SDS后，以酶谱显影缓冲液(zymographydeveloping buffer)作用于35rpm、37℃下20～24小时后移除，利用考马斯亮蓝(coomassieblue R-250)染色30分钟，以二次水浸泡到隔天，然后将胶置入数字影像分析仪(Chemi-smart 3000)受测物版上照相分析并用sigma plot 10.0进行统计作图。
请参阅图确6A及图6B所示，是本发明的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞的基质金属蛋白酶的表现量示意图。如图所示：由实施例2所得的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1对于抑制肺癌细胞中基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的能力，尤其在40μM浓度下更显优异。
实施例9：实施例2的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1抑制肺癌细胞(肺癌细胞株A549)纤溶酶原激活物能力的测试
以电泳方式对水解酶进行检测，使用酪蛋白酶谱法(Casein-zymography)中含有纤溶酶原(plasminogen)来分析在肺癌细胞中尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-typeplasminogen activator,uPA)的酵素活性，尿激酶型纤溶酶原激活物会将纤溶酶原分解成纤溶酶(plasmin)。
首先A549肺癌细胞系依据上述实施例1所述的细胞培养方法培养，以胰蛋白酶拆下后，将细胞以2x105cells/cm2的接种密度至12孔盘中24小时使细胞贴附，接着用PBS润洗两次，加入含有不同浓度的0、5、10、20及40μM的Leader 1的培养基24小时后，置换成含有1％胎牛血清的培养基24小时，取得与细胞培养的培养液，放入微量离心管中以1250rpm离心10分钟，取上清液保存于-20℃。
将等量的上清液混合物加入6倍基质金属蛋白酶染剂至8％梯度电泳胶体孔内(含有纤溶酶原15μl/ml与酪蛋白1mg/ml)，加入跑胶缓冲液以80V，300mA分离至45kD的基质金属蛋白酶标记到胶的中间时即停止作用。
将胶取下在酶谱复性缓冲液中作用于35rpm，并以室温下作用两次，每次30分钟，待移除其中的SDS后，以酶谱显影缓冲液作用于35rpm、37℃下20-24小时后移除，利用考马斯亮蓝染色30分钟，以二次水浸泡到隔天，然后将胶置入数字影像分析仪受测物版上照相分析并用sigma plot 10.0进行统计作图。
请参阅图7所示，是本发明的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞中纤溶酶原激活物的能力的表现量示意图。如图所示：由实施例2所得的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1展现了抑制促进肺癌细胞中纤溶酶原激活物的能力，尤其在40μM的浓度下更显优异。
实施例10：实施例2的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1调控肺癌细胞(肺癌细胞株A549)转移的相关蛋白表现的测试
取得细胞的全蛋白(total protein)后，将等量的蛋白质加入8-10％梯度电泳胶体孔内，以80V、300mA分离240分钟，将已依大小分开的蛋白质以100V，2小时为条件，转渍至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride,PVDF)上后，将二氟乙烯膜以隔绝缓冲液(blocking buffer)作用1小时。其中，该隔绝缓冲液包含10％w/v脱脂奶粉于TBS-T缓冲液中，且该TBS-T缓冲液含有0.1％的Tween 20的TBS缓冲液。
接着将二氟乙烯膜浸泡于肌动蛋白的抗体溶液(actin；Cell signaling)、磷酸化丝氨酸激酶的抗体溶液(p-Akt或protein kinase B；1:1000，Cell signaling)、钙黏附分子E(E-cadherin；1:1000,Cell signaling)、基质金属蛋白酶中的明胶分解酶的抗体溶液(MMP-2,9；1:1000，Santa Cruz)、以及金属蛋白酶抑制剂的抗体溶液(TIMP-1；1:1000，Cellsignaling)，于4℃中反应12-24小时后，回收抗体溶液放回-20℃冰箱，再以0.1％的TBS-T缓冲液清洗3次，以洗除非专一性(non-specific)结合的抗体抗原。
然后将二氟乙烯膜浸泡于带有山葵过氧化酶(horseradish peroxidase)的抗老鼠二级抗体溶液(anti-mouse secondary antibodies)、抗兔子二级抗体溶液(anti-rabbit secondary antibodies)，于室温中反应1-2小时后，回收抗体溶液，以0.1％的TBS-T缓冲液清洗3次，再以化学冷光试剂(Enhanced chemiluminescene regents,ECL)侦测各组荧光强度，并以β-肌动蛋白(β-actin)的表现量作为蛋白的控制对照组，并用sigma plot10.0进行统计作图。
请参阅图8A及图8B所示，是本发明的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1影响肺癌细胞转移的相关蛋白酶及蛋白表现的能力的表现量示意图。如图所示：由实施例2所得的樟芝固态培养菌丝体的萃取物Leader 1展现了抑制促进肺癌细胞转移的相关蛋白酶表现的能力，并促进了抑制肺癌细胞转移的相关蛋白表现的能力，具有显着的差异性。
藉此，本发明提供关于樟芝固态培养菌丝体的萃取物及其应用，该樟芝固态培养菌丝体的萃取物为2,3,6-Trimethoxy-4-methylphenol(Leader 1)，该Leader 1能有效抑制肺癌肿瘤细胞的运动、迁徙及侵袭的能力，进而达到抗肺癌细胞转移的效果，可展现优异的抗肺癌细胞转移的生理活性与作用机制。综上所述，本发明的一种樟芝固态培养菌丝体的萃取物及其应用，可有效改善现有技术中种种缺点，该樟芝固态培养菌丝体的萃取物为2,3,6-Trimethoxy-4-methylphenol(Leader 1)，能有效抑制肺癌肿瘤细胞的运动、迁徙及侵袭的能力，以达到抗肺癌细胞转移的效果，可展现优异的抗肺癌细胞转移的生理活性与作用机制，进而使本发明的产生能更进步、更实用、更符合使用者所须，确已符合发明专利申请的要件，依法提出专利申请。
惟以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围。故，凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范围内。
Claims (8)
1.一种樟芝固态培养菌丝体的萃取物，其特征在于，该萃取物为2,3,6-三甲氧基-4-甲基苯酚，其结构式如下：
2.权利要求1所述樟芝固态培养菌丝体的萃取物的制备方法，其特征在于，该萃取物是按以下列步骤获取：
(A1)提供一干燥的樟芝固态培养菌丝体；
(B1)将该干燥的樟芝固态培养菌丝体于25-40℃下以10倍体积的95％体积浓度的乙醇萃取。
3.权利要求1所述樟芝固态培养菌丝体的萃取物的制备方法，其特征在于，该萃取物是按下列步骤获取：
(A2)提供一干燥的樟芝固态培养菌丝体；
(B2)将该干燥的樟芝固态培养菌丝体于25-40℃下以10倍体积的95％体积浓度的乙醇萃取以获得一乙醇萃取物；
(C2)真空浓缩该乙醇萃取物以获得一浓缩产物；
(D2)利用100％体积浓度的乙酸乙酯与水将该浓缩产物分层化以获得一乙酸乙酯萃取物。
4.如权利要求2或3所述的樟芝固态培养菌丝体的萃取物的制备方法，其特征在于，所述干燥方式为冷风干燥。
5.权利要求1所述的萃取物在制备抗肺癌细胞转移药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述萃取物通过抑制肺癌细胞移行作用以抗肺癌细胞转移。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述萃取物通过抑制肺癌细胞侵袭作用以抗肺癌细胞转移。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述萃取物通过降低磷酸化丝氨酸激酶、基质金属蛋白酶中的明胶分解酶、及增加钙黏附分子E、金属蛋白酶抑制剂的表现以抑制该肺癌细胞的移行作用与侵袭作用。
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