CN105228635A - Faecalibacterium prausnitzii HTF-F（DSM 26943）在抑制炎症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药，尤其是免疫学和胃肠病学。具体的，本发明涉及益生菌及其提取物，用于治疗诸如炎性肠病的炎性失调的治疗用途。本发明提供了一种组合物，该组合物包含作为活性成分的Faecalibacterium？prausnitzii菌株HTF-F(DSM？26943)或其含有细胞外聚合物基质(EPM)的提取物，以及可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。本发明还提供了一种抗炎性组合物，该抗炎性组合物包含从F.prausnitzii菌株HTF-F提取的EPM，及其制备方法。

Description

Faecalibacterium prausnitzii HTF-F（DSM 26943）在抑制炎症中的应用

技术领域

本发明涉及一种药物，特别涉及免疫学和胃肠病学。具体的，本发明涉及益生菌及其提取物用于治疗炎性失调(诸如炎性肠病和与微生物群失衡相关的疾病)的治疗用途。本发明还提供了抗炎性(益生菌)组合物，例如功能性食物、营养物或药物组合物，以及生产它们的方法，以及促使肠道内的益生菌生存的途径。

背景技术

炎性肠病(IBD)是胃肠道的慢性炎性失调，其特征有腹泻、血便、腹痛和体重下降。IBD是起因未知的慢性复发性炎症。IBD包括两种主要的病情：溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(Crohn’sdisease，CD)。UC主要影响大肠或结肠的粘膜层。相比之下，CD被定义为透壁的肉芽肿性炎症，可涉及小肠和大肠的几段。UC和CD由在遗传易感性宿主体内针对肠道微生物群的异常炎性T细胞应答所驱动。微生物群在多样性和组成中的极大变化与UC和CD相关(Seksik,Rigottier-Goisetal.2003；Macfarlane,Blackettetal.2009)。在IBD患者的排泄物微生物群中已经观察到拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门的出现率降低，而变形菌门和放线菌门的出现率增加(Frank,StAmandetal.2007)。尤其是，Faecalibacteriumprausnitzii(普氏粪杆菌)，厚壁菌门中的一员并且是健康人类结肠中最丰富的种类之一(Flint,Scottetal.2012)，而在IBD患者的微生物群中不足(Sokol,Seksiketal.2009)。与缓解期患者体内相比，来自回肠活检的粘膜相关的F.prauznitzii计数在患活动性疾病的CD患者体内较低(Sokol,Pigneuretal.2008)。

据报道，F.prausnitzii是抗炎性细菌，因为它具有诱导人类外周血单核细胞(PBMC,(Sokol,Pigneuretal.2008))中大量的IL-10以及树突细胞的能力。进一步地，据报道，使用F.prausnitzii的培养上清液处理Caco-2细胞降低了IL-1β诱导的NF-κB的活化和IL-8的分泌。这归功于分泌到培养基中的一种还未被鉴定出的因子(Sokol,Pigneuretal.2008)。此外，已经示出给予F.prausnitzii菌株A2-165及其培养上清液，可在小鼠中预防2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎(Sokol,Pigneuretal.2008)。这一模型被认为与CD类似，因为所产生的粘膜性炎症在IFN-γ、TNF-α和IL-12的过量产生下由1型T辅助细胞(Th1)应答介导。

本发明人认识到，需要更多的F.prausnitzii菌株用于炎性失调的预防和/或治疗中。他们的目的特别在于鉴定一种比在现有技术中使用的菌株A2-165(DSMZ17677)更有效的菌株。进一步的目标是提供具有抗炎性特性的细菌提取物。为了实现这一目的，评价了F.prausnitzii的不同菌株及其提取物在小鼠葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎模型中抑制炎症的能力。

令人惊奇的是，发现F.prausnitzii菌株HTF-F的活细胞以及在其中分离的细胞外聚合物基质(EPM)具有很强的免疫调节性质。申请人于2013年3月1日将该菌株保藏在德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，DSMZ)，登记号为DSM26943。之前，菌株HTF-F作为从健康人类供体获得的几种新的分离物之一已经在Lopez-Silesetal.(2012)中已经进行了报道。基于对16SrRNA的序列分析，发现它属于遗传谱系II。但是，在本领域的现有技术中还没有报道或暗示菌株HTF-F的治疗应用，更不用说它在IBD中具有很强的抗炎性效果了。

重要的是，本发明发现HTF-F的抗炎性效果比菌株A2-165更有效，这部分是因为HTF-F的EPM的免疫调节性质。EPM的免疫调节效果至少部分通过在抗原递呈细胞中产生细胞因子IL-12和IL-10的TLR2依赖性调节来介导。还观察到，菌株HTF-F进行细胞间聚集并且在液体培养基中形成致密的生物膜，而菌株A2-165不会。不希望受到理论束缚的情况下，生物膜可为体内的细菌定植提供一些优势。尤其是，EPM可保护细菌免受氧化应激，因此可存在于靠近肠道上皮处，而肠道上皮是经由其向内扩散的氧的主要来源，优于产生较少EPM的菌株。这会帮助在接近结肠壁处递送丁酸盐和其它抗炎性产物。所有这些特征使得F.prausnitzii菌株HTF-F成为强有力的益生菌，以治疗结肠炎和其它炎性肠道疾病。因此，F.prausnitziiHTF-F及其EPM都有利地用于处置IBD和相关的炎性疾病中的治疗。

发明内容

相应地，在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括作为活性成分的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F或其含有细胞外聚合物基质的提取物，和可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。该组合物，例如，是药物组合物、食物组合物或营养物组合物。本发明还提供用作药剂的F.prausnitzii菌株HTF-FDSM26943(下文也称作“HTF-F”)和/或其含有细胞外聚合物基质的提取物。例如，HTF-F或含有细胞外聚合物基质的HTF-F提取物有利地用于治疗或预防哺乳动物受试者胃肠道的炎性失调的方法中。这在下文中例示为小鼠结肠炎模型中的临床参数的减小。

本发明还提供了一种治疗或预防与哺乳动物受试者的胃肠道炎性失调相关的症状的方法，该方法包括给予有效量的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F或其含有EPM的提取物。

根据本发明，Faecalibacteriumprausnitzii菌株可以是存活细胞的形式。或者，它们是非存活细胞的形式。还设想是存活细胞和非存活细胞的混合物。通常益生菌以存活细胞的形式使用。但是，也可延伸至非存活细胞，诸如被杀死的培养物或含有由益生菌表达的有益因子的组合物。这可包括热杀死的微生物，或通过暴露于改变的pH或经压力或γ辐照杀死的微生物。细胞可被加入到药物中。与存活细胞相比，使用非存活的细胞，特别在考虑到它的氧敏性时，产品制备更加简单且储存需求的限制少很多。

在具体的方面，例如通过直肠内递送，将活的细菌或EPM直接给予到胃肠道内。非细菌递送的其它选择包括不依赖于肠道的途径，包括系统性递送(诸如通过腹腔内注射)。在本发明的优选实施方式中，细菌的一种或多种经纯化的、不会在宿主细胞内引发炎性应答的抗炎性组分例如，经口、皮下或局部地给药。

考虑到它的强抗炎性效果，本发明发现它在涉及不想要的炎性应答的各种病理学中的应用。炎症可被归类为急性炎症或慢性炎症。急性炎症是身体对有害刺激的初始应答，并且通过增强血浆和白血球(特别是粒细胞)从血液中向受伤组织中的移动来实现。生化事件的一系列步骤传送了炎性应答并且使其成熟，这涉及局部脉管系统、免疫系统和在受伤组织内的各种细胞。长期炎症(也称为慢性炎症)导致在炎症位点处存在的细胞类型发生渐进式改变，并且特征是来自炎性过程的组织同时发生破坏和愈合。

在一个实施方式中，炎性疾病是炎性肠胃失调，优选选自由炎性肠病、克罗恩氏病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、乳糜泻、感染性结肠炎(例如由艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)引起)、溃疡性结肠炎、其它肠道相关疾病，及它们的任意组合组成的组。或者，炎性疾病是炎性自身免疫性疾病，其中异型性增生-平衡的微生物群和低级的粘膜炎症与疾病(诸如糖尿病(I型和II型)、哮喘和特应性疾病)的病原学或发作相关。

在另一方面，菌株HTF-F和包含它们的组合物用作患有与肠道微生物群失衡相关的症状或失调，或具有发展成这些症状或失调的风险增加的人的预防性或治疗性试剂。肠道微生物群组成已与代谢综合征(例如肥胖、II型糖尿病、心血管疾病和非酒精性脂肪性肝炎)的几个标志相关联。越来越多的证据表明，肠道微生物群促使低级炎症的发作，该低级炎症的特征是经由与肠道屏障功能障碍相关的机制引起这些代谢失调。目前，已经示出，肠内分泌细胞和内源性大麻素系统控制肠道通透性和代谢性内毒素血症。而且，在此背景下使用具有益生元性质的不易消化的碳水化合物的定向营养干预已经在临床前研究中示出了有希望的结果，尽管人类干预研究是进一步研究的根据。因此，本发明的组合物有利地用于建立或维持平衡的肠道微生物群。进一步地，在肥胖和II型糖尿病的背景下，HTF-F可用于改变作为治疗靶点的肠道微生物群。

人们越来越认识到肠道微生物群与能量稳态和炎症及其在肥胖相关失调的发病机理中的作用之间的关系。肥胖动物模型将改变的微生物群组成通过以下几种机制与宿主体内的肥胖的发展、胰岛素耐受性和糖尿病关联起来：由饮食增加的能量收集，脂肪组织和肝脏中的改变的脂肪酸代谢和组成，肠肽YY和胰高血糖素样肽(GLP)-1分泌的调节，脂多糖toll样受体4轴的活化，以及GLP-2对肠道屏障完整性的调节。

在优选的实施方式中，菌株HTF-F或其含有抗炎性试剂的提取物用于保护大肠或结肠的粘膜层或治疗对大肠或结肠的粘膜层所造成的伤害。

优选地，要经受治疗的受试者是人类受试者，例如是已知患有或怀疑患有溃疡性结肠炎的人类受试者。但是，本发明还可应用于兽医学。例如，还可提供Feacalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F或其提取物用于家畜或农畜的治疗应用。

F.prausnitzii菌株HTF-F或其提取物优选增加受试者体内抗炎性细胞因子的产生，和/或减少受试者体内一种或多种促炎性细胞因子的产生。例如，抗炎性细胞因子是IL-10或TGFβ。在一个实施方式中，促炎性细胞因子依赖于TLR2信号传导，所述细胞因子优选是IL-12p70。

我们还描述F.prausnitzii菌株HTF-F或其提取物用于制备预防和/或治疗不期望的炎症活性的抗炎性生物治疗试剂，或用于制备预防和/或治疗不期望的炎症活性的抗炎性生物治疗试剂。所述菌株可通过对抗来自胃肠道的促炎性微生物和从胃肠道排除促炎性微生物来起作用。

细菌或提取物经配制，以治疗有效量给予受试者，这依赖于例如受试者的类型、疾病严重程度和给药途径。典型地，细菌的治疗有效量是约10exp6CFU/天至10exp11CFU/天，优选10exp7CFU/天至10exp10CFU/天。

可经由任何适当的给药途径给予细菌。例如，可以经口摄取的形式将本发明的特定的Faecalibacteriumprausnitzii菌株给予动物(包括人类)。在食物组合物或营养物的情况中，细菌可简单地添加到传统食品(fooditem)或食物补充剂中。示例性的药物制剂包括胶囊、微囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂、锭剂、丸剂、栓剂、混悬剂和糖浆剂。在另一实施方式中，所述组合物是向动物(包括人类)进行直肠给药的形式，例如作为直肠栓剂或灌肠剂。适当的制剂可通过使用常规有机和无机添加剂的通常采用的方法来制备。药物组合物中的活性成分的量可为显示出期望治疗效果的水平。

所述组合物可含有任何有用的其它成分，诸如已知支持有益细菌的生长或维持，以便以有益的方式改变胃肠微生物群落的成分。这样的成分被称为“益生元”。已知的益生元的典型实例是低聚糖，诸如低聚果糖和菊粉。合生素指：以协同的方式将益生菌和益生元组合在一起的营养补充剂。

上述抗炎性效果所需的F.prausnitzii细菌对氧极度敏感，并且在暴露于环境空气超过几分钟就不能存活下来。因此，迄今为止，除了它们的有希望的治疗应用外，还没有描述含有存活的F.prausnitzii的益生菌组合物。

本发明的具体方面涉及一种合生素组合物，该合生素组合物包含与以下物质混合的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F：核黄素、核黄素磷酸盐或其生理学上可接受的盐，和半胱氨酸。本发明发现上述混合物令人惊奇地使这些细菌在制造、储存和/或消耗的过程中暴露于环境空气时受到很好的保护。例如，它可经受环境空气暴露达至少24h，并且在模拟的胃肠液中稳定达至少2h。而且，当与食品(例如奶或乳酸菌饮料)混合时，本发明的合生素制剂可稳定至少2h。优选使用核黄素。

基于所述组合物的总干重，核黄素、核黄素磷酸盐或其生理上可接受的盐以至少0.05％、优选至少1％、更优选至少2％的量存在。例如，基于所述组合物的总干重，可含有0.05％至10％、优选1％～10％，如2％～10％或0.05％～0.25％。基于所述组合物的总干重，半胱氨酸优选以至少0.05％的量存在。适于使用高至2％的半胱氨酸含量。例如，基于所述组合物的总干重，所述组合物可含有0.1％～1.5％、0.5％～1％或0.05％～0.2％的半胱氨酸。

所述组合物可进一步包含一种或多种益生元，优选低聚糖，更优选低聚果糖、果胶和/或菊粉或菊粉型低聚果糖，它们的量优选是基于所述组合物的总干重的2％～10％。其它适当的成分包括填充剂，该填充剂的量优选是基于所述组合物的总干重的40％～65％。

当然，所述组合物可含有其它有用的成分，包括其它益生元和/或益生菌。有用的益生菌优选选自由乳酸菌、双歧杆菌或其混合物组成的组。益生菌可以是具有已证实的益生菌特征的任何乳酸菌或双歧杆菌。例如，它们还可促进双歧杆菌肠道微生物群的发展。在一些情况中，它们还可辅助保护F.prausnitzii免受氧的影响。适当的其他益生菌可选自由双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)和酵母属(Saccharomyces)，或它们的混合物组成的组，具体为选自由长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、布拉酵母菌(Saccharomycesboulardii)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，或它们混合物组成的组，优选选自由约氏乳杆菌(NCC533；CNCM1-1225)、长双歧杆菌(NCC490；CNCM1-2170)、长双歧杆菌(NCC2705；CNCM1-2618)、乳双歧杆菌(2818；CNCM1-3446)、副干酪乳杆菌(NCC2461；CNCM1-2116)、鼠李糖乳杆菌GG(ATCC53103)、鼠李糖乳杆菌(NCC4007；CGMCC1.3724)、屎肠球菌SF68(NCIMB10415)，和它们的混合物组成的组。在一个实施方式中，其它益生菌包括食品级细菌，所述食品级细菌可以是重组的非致病性食品级细菌，用作抗炎性分子的递送载剂。参见例如WO2011/086172及其中引用的参考文件。有用的生长基质包括纤维二糖和乳果糖。所述制剂可含有填充物和增量剂(extender)，诸如麦芽糖糊精或普鲁兰多糖(pullulan)。在一个方面，所述组合物包括含菌株HTF-F的厌氧细菌的聚生体。这些厌氧细菌为HTF-F提供了必要的养分，如糖、氨基酸、乙酸盐和如核黄素的维生素，以促使和提高它的生长。例如，双歧杆菌和梭菌群IV和XIVa的成员适于与菌株HTF-F组合使用。

在另一特定的方面，本发明提供了一种包含从Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F提取的细胞外聚合物基质的组合物，及其在治疗中的应用，尤其作为抗炎性试剂的应用。本发明还提供了一种生产这样的抗炎性提取物的方法。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：a)收获F.prausnitzii菌株HTF-F的活细胞并且将细胞重悬在适当的缓冲液中，该适当的缓冲液优选是PBS；b)涡旋重悬的所述细胞，优选持续至少3分钟，以允许细胞结合的EPM溶解在缓冲液中；c)通过离心使所述细胞成团并且收获上清液；d)向所述上清液中添加约4体积的冰冷的乙醇，以使所述细胞外聚合物基质(EPM)沉淀；e)使用乙醇清洗沉淀的EPM；并且f)接着进行冻干(任选)。在使用之前，(冻干的)沉淀物可以期望的浓度复原在任何适当的载剂中。例如，溶解在诸如PBS的盐水中。

本发明的提取物能够调节至少一种免疫调节性的细胞因子的产生。在一个实施方式中，它在体外系统中诱导抗炎性细胞因子产生的增加，和/或一种或多种促炎性细胞因子产生的减小。例如，所述提取物在体外使用人类单核细胞来源的树突细胞(HMDC)或小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC)进行测试，其中这些细胞任选地经L.plantarum刺激。替代的测定包括利用来自人类血液的外周血单核细胞或结肠培养物的测定，例如细胞因子的产生可在培养的获自经DSS处理的小鼠的结肠片段中测量。

在一个实施方式中，所述提取物增加了抗炎性细胞因子IL-10的产生。在另一实施方式中，所述提取物减小了一种或多种促炎性细胞因子，如IL-12、IL-17和/或IFNγ的产生。促炎性细胞因子(例如IL-12p70)的降低可依赖于TLR2信号传导。在优选的实施方式中，所述提取物诱导抗炎性细胞因子的生产，并且降低促炎性细胞因子。

本发明还提供了一种治疗或预防与哺乳动物受试者的胃肠道的炎性失调相关的症状的方法，该方法包括给予F.prausnitzii菌株HTF-F或其含EPM的抗炎性提取物。胃肠道失调选自由炎性肠病、克罗恩氏病、肠易激综合征、乳糜泻、感染性结肠炎、溃疡性结肠炎，及它们的任意组合组成的组。优选地，要被治疗的受试者是人类受试者。给予受试者治疗有效量的F.prausnitzii菌株HTF-F，典型的，其中细菌的治疗有效量为约10exp6CFU/天至10exp11CFU/天。在具体的实施方式中，所述细菌作为上述合生素组合物的一部分给予，该合生素组合物包含与以下物质一起配制的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F的活细胞：核黄素、核黄素磷酸盐或其生理学上可接受的盐，和半胱氨酸。

附图说明

图1：a)在厌氧条件下，F.prausnitzii菌株HTF-F和A2-165在YCFAG培养基中的生长和生物膜的形成。i和ii)分别是摇动之前和之后的F.prausnitziiA2-165；iii和iv)分别是在摇动之前和之后的F.prausnitziiHTF-F。b)F.prausnitziiA2-165(左图)和HTF-F(右图)的革兰氏染色。

图2：通过透射电子显微镜对F.prausnitziiHTF-F的EPM的检测。F.prausnitziiHTF-F(a)拥有散开且不规则的表层(箭头)，该表层较薄，但与猪链球菌(S.suis)野生型菌株的荚膜多糖(CPS)(箭头，S.suiswt，左图b)类似，并且该荚膜多糖(CPS)在S.suisCPS缺失突变体(没有cps的S.suis，右图b)中不存在。

图3：F.prausnitziiHTF-F的EPM的TLR信号传导的性质。NF-κB的活化使用在表达TLR2/1、TLR2/6、TLR5和TLR4的HEK293细胞系中的发光报告分子来测量，通过从测量值减去培养基对照值来计算相对值。误差棒代表SEM，n＝6。

图4：在与F.prausnitziiA2-165(3位供体)、F.prausnitziiHTF-F(3位供体)、L.plantarum(5位供体)、L.plantarum+EPM(5位供体)、EPM(3位供体)或未经刺激(5位供体)一起孵育48h之后，人类不成熟树突细胞(hDC)中的细胞因子的分泌和表面标记物的表达。a)IL-10和IL-12p70在hDC的上清液中测量。误差棒代表SEM，*表示与经L.plantarum处理的样品相比p<0.05。b)CD83⁺(左图)和CD86⁺(右图)的hDC的百分比。误差棒代表SEM，**表示p<0.01，n.s.表示与对照相比无显著性差异。

图5：通过定量RT-PCR确定的hDC中的相对基因表达水平。从与L.plantarum(黑)、L.plantarum+EPM(深灰)、EPM(浅灰)孵育6h和20h之后的hDC或未经刺激的细胞(白)中提取RNA，并且计算IL-12p70相对于看家基因GAPDH的表达水平的表达水平。误差棒代表SEM，n＝3，***表示与经L.plantarum处理的样品相比p<0.001。

图6：经DSS处理的小鼠的疾病活动指数(DAI)、结肠组织损伤得分和临床评价。小鼠在8天中不经处理(白)或经DSS处理，并且直肠内给予PBS(黑)、EPM(蓝)或F.prausnitzii菌株HTF-F(红)或菌株A2-165(绿)。在实验终止时评价DAI、组织得分和结肠长度(分别是a、b和c)。小鼠的体重(d)在实验自始至终都测量，体重值表示为在给予DSS之前的第0天测量的初始值的百分比。误差棒代表SEM，n＝10，*表示与接受DSS+PBS的对照结肠炎小鼠相比p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图7：未经处理或经DSS处理的小鼠的降结肠的组织切片图：a)结肠炎对照，经PBS-DSS处理的小鼠(损伤3～3.5级)；b)经HTF-F-DSS处理的小鼠(损伤1～2.4级)；c)经A2-165-DSS处理的小鼠(损伤2～3.7级)；d)经EPM-DSS处理的小鼠(损伤2.8～3.8级)；e)未经处理的小鼠(损伤0级)。

图8：从在8天中未经处理(白)，或经DSS处理并且经直肠内给予PBS(黑)、EPM(蓝)或F.prausnitzii菌株HTF-F或菌株A2-165(HTF-F为红色，A2-165为绿色)的小鼠的肠系膜淋巴结(MLN，左图)和脾脏(右图)分离的Foxp3⁺CD4⁺T细胞的百分比。

图9：小鼠BMDC中的细胞因子的分泌。a)在与L.plantarum、L.plantarum+EPM、EPM和未经刺激的DC孵育之后，测量BMDC上清液中的IL-10和IL-12p70。b)除了在孵育期间包含抗TLR2的封闭抗体(抗TLR2Ab，深灰色柱)或同种型对照(同种型Ab，浅灰色柱)之外，在BMDC与图a)中相同的样品孵育之后，测量IL-10和IL-12p70。误差棒代表SEM(n＝3)，***表示与经L.plantarum处理的样品相比p<0.001，*表示p<0.01，n.s.无显著性差异。

图10：来自经DSS处理的小鼠的结肠培养物中的细胞因子的分泌。小鼠在8天中不经处理(白)，或经DSS处理并且直肠内给予PBS、EPM或F.prausnitzii菌株HTF-F或A2-165。细胞因子在从小鼠分离的结肠片段的48h培养物的上清液中测量。误差棒代表SEM，n＝5，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图11：来自两位不同供体的人类不成熟树突细胞(hDC)在与L.plantarum、L.plantarum+EPM、L.plantarum+来自未培养的细菌培养基的提取物(对照EPM)、EPM、来自未培养的细菌培养基的提取物(对照EPM)或未经刺激(2位供体)孵育48h之后，IL-12p70的分泌。来自F.prausnitziiHTF-F的EPM减弱了IL-12的分泌。这种效果在使用来自未培养的培养基的对照提取物中没有观察到。EPM提取物、来自未培养的培养基的对照提取物和培养基对照不诱导IL-12的分泌或其它细胞因子(未示出)。这些结果示出EPM的效果不是由未培养的培养基的组分产生的。

具体实施方式

实验部分

材料和方法：

动物

BALB/c小鼠在传统条件下饲养。两月龄的雌性小鼠用于这些研究，并且在每次实验前后都测量它们的体重。动物实验得到了捷克共和国科学院微生物研究所的伦理委员会的批准。

细菌菌株和培养条件

F.prausnitzii菌株HTF-F和A2-165已经在其它文件进行了描述(Barcenilla,Prydeetal.2000；Duncan2002；Lopez-Siles,Khanetal.2012)，并且维持在厌氧条件下，37℃，酵母提取物、酪蛋白胨、脂肪酸和葡萄糖培养基(YCFAG，描述在(Lopez-Siles,Khanetal.2012)上。菌株HTF-F于2013年3月1日保藏在德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，DSMZ)中，登记号为DSM26943。

YCFA培养基(每100ml)由酪蛋白胨(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、NaHCO₃(0.4g)、半胱氨酸(0.1g)、K₂HPO₄(0.045g)、KH₂PO₄(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH₄)₂SO₄(0.09g)、MgSO₄·7H₂O(0.009g)、CaCl₂(0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯高铁血红素(1mg)、生物素(1微克)、钴胺素(1微克)、对氨基苯甲酸(3微克)、叶酸(5微克)和吡哆胺(15微克)组成。此外，包含(终浓度)下面的短链脂肪酸(SCFA)：乙酸盐(33mM)；丙酸盐(9mM)；异丁酸盐、异戊酸盐和戊酸盐(每种1mM)。半胱氨酸在煮沸之后添加到培养基中，并分配到亨盖特管(Hungatetube)，同时使用CO₂冲洗该管。在高压灭菌之后，添加硫胺素和核黄素的经过滤消毒的溶液，以达到每种的终浓度为0.05微克/ml。

对于EPM的产生，将F.prausnitzii菌株培养在YCAG培养液中，该YCAG培养液具有与YCFAG培养基相同的组成，但是除了乙酸盐之外，所有的短链脂肪酸都没有。L.plantarumWCFS1培养过夜，直至在37℃在deMan,RogosaSharpe培养液(MRS,Merck,Darmstadt,Germany)中到达稳定期。通过在4℃，3300g离心15min收获细菌，在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中冲洗，重悬在含20％甘油的PBS中并储存在-80℃，直至使用。对于BMDC测定，在37℃，MRS中生长过夜的L.plantarumWCFS1使用如前所述的1％甲醛-PBS灭活(Schabussova,Hufnagletal.2012)。通过荧光原位杂交(FISH)或相差显微镜量化细菌。厌氧细菌的所有缓冲液和培养基都通过不含氧的氮冲洗30分钟来去氧。

F.prausnitzii细胞外聚合物基质的分离和染色

如前所述的，提取结合细胞的EPM(Ricciardi,Parenteetal.1998)。通过在3300g离心15min回收250ml24h龄的F.prausnitzii培养物，在PBS中清洗，然后进行离心步骤。通过涡旋5min，将预清洗的细胞团悬浮在8mlPBS中，以使细胞结合的EPM溶解。随后通过在18400g离心10min(4℃)，使细胞成团。然后，小心的收获上清液，并且将该上清液添加到4体积冰冷的纯乙醇中以沉淀EPM。在3300g离心30min后，使用70％的乙醇清洗EPM沉淀团，然后冻干并储存在-20℃。为了进一步的实验，将冻干的EPM组分以期望的浓度溶解在PBS中。在经革兰氏染色之后，通过肉眼观察，示出EPM没有细菌污染。TLR测定(在下面的部分中进行了描述)示出了EPM没有污染MAMP。

TLR信号传导的测定

TLR测定使用稳定表达人类TLR2/6、TLR2/1、TLR4或TLR5(Invivogen,Toulouse,France)且经报告质粒(pNiFTY,Invivogen)转染的人胚肾细胞(HEK293)进行，该报告质粒(pNiFTY,Invivogen)含有在NF-κB启动子控制下的荧光素酶基因。表达不同的TLR和pNiFTY的HEK293细胞与以下物质孵育：EPM(1.2％v/v)、TLR激动剂，针对TLR2/6的Pam2CSK4(Invivogen)、针对TLR2/1的Pam3CSK4(Invivogen)、针对TLR5的鞭毛蛋白(Invivogen)和针对TLR4的LPS，或作为对照的培养基。在孵育6小时之后，将所述培养基替换成Brightglow(Promega)，并且使用SpectramaxM5(MolecularDevices)测量发光。作为阴性对照，在相同条件下测试不表达TLR但包含pNiFTY的HEK293细胞，没有示出任何荧光素酶活性。对于TLR报告细胞系的灵敏度限度在独立的实验中，使用针对每一种纯化的激动剂的剂量系列来确定。这些报告细胞系的检测限度经确定，为：Pam2CSK4(TLR2)2ng/ml，鞭毛蛋白(TLR5)8ng/ml并且LPS(TLR4)50pg/ml；MAMP存在的浓度低于我们在体外测定中不会活化免疫细胞的浓度，并且如预期的，EPM不活化hDC或小鼠的BMDC(图4和图9)。

人类DC的测定

该研究得到了瓦赫宁恩大学(WageningenUniversity)伦理委员会的批准，并且根据赫尔辛基宣言(DeclarationofHelsinki)进行。从奈梅亨(Nijmegen)(荷兰)的Sanquin血库获得血液供体的血沉棕黄色层。在样品收集之前，已经获得了书面的知情通知书。在人类单核细胞来源的DC(hDC)与F.prausnitziiA2-165(来自3位供体的hDC)、F.prausnitziiHTF-F(来自3位供体的hDC)、L.plantarum(来自5位供体的hDC)、EPM(来自3位供体的hDC)或L.plantarum与EPM一起(来自5位供体的hDC)孵育之后，EPM的免疫调节性质通过测量表面标记物的表达和分泌在上清液中的细胞因子来进行研究。细菌以细菌:DC比率为10:1来使用，EPM为1.2％v/v。根据制造商的方案，使用FicollPaquePlus密度梯度(GEHealthcare,DiegemBelgium)从健康供体的血沉棕黄色层中分离单个核的细胞。在离心之后，收集单个核的细胞，并且使用CD14特异性抗体涂敷的磁性微珠(MiltentyiBiotec,Leiden,TheNetherlands)，通过阳性选择CD14⁺细胞来分离单核细胞。在IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCFS,R&DSystems,Minneapolis,MN)的存在下，CD14⁺细胞在完全培养基中培养6天，以分化成不成熟的单核细胞来源的DC。在第6天，将细胞以10⁶个细胞/孔接种在24孔板中，并且在存在或不存在从F.prausnitzii分离EPM(1,2％v/v)的情况下使用L.plantarum(细菌:DC，10:1)进行处理，或不进行处理。在共孵育48小时之后，收集上清液用于细胞因子的测量。

在培养期和刺激的过程中，将DC培养在补充有10％FCS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Sigma,St.Louis,MO)的RosewellParkMemorialInstitute(洛斯维·帕克纪念研究所，RPMI)1640培养基(Invitrogen)中，并且没有观察到细菌生长。在第6天和第8天，通过测量CD83和CD86的表面表达来测定CD14⁺细胞的活化和成熟状态，并且使用膜联蛋白V(AnnexinV)和碘化丙啶(PI)测量细胞活力。细胞经CD83、CD86特异性的荧光缀合的单克隆抗体、它们的同型相配的对照，以及膜联蛋白V和PI(BDBiosciences,Breda,TheNetherlands)进行染色，并且在流式细胞仪(FACSCantoII,BD)上进行分析。CD86和CD83在不成熟或未经处理的DC上低水平表达，并且在刺激之后高表达。在第6天和第8天，细胞活力在60％和80％之间(未示出)。

RNA分离和实时qPCR

按照制造商的说明书，使用RNAeasyMiniKit(Qiagen,Venlo,TheNetherlands)从hDC中分离总RNA。根据制造商的说明书，使用500ng分离的总RNA和Q-script(Quantabioscience,Gaithersburg,MD)进行cDNA分析。将cDNA稀释在无核酸酶的水中，终体积为100μl，并且储存在-20℃，直至使用。使用PRIMER3软件(RozenandSkaletsky,2000)设计IL-10(正向5’-GTGATGCCCCAAGCTGAGA-3’，反向5’-CACGGCCTTGCTCTTGTTTT-3’)，IL-12p40(正向5’-CTCTGGCAAAACCCTGACC-3’，反向5’-GCTTAGAACCTCGCCTCCTT-3’)，IL-1β(正向5’-GTGGCAATGAGGATGACTTGTTC-3’，反向5’-TAGTGGTGGTCGGAGATTCGTA-3’)，TNF-α(正向5’-CTGCTGCACTTTGGAGTGAT-3’，反向5’-AGATGATCTGACTGCCTGGG-3’)，及参照基因GAPDH(正向5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，反向5’-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’)和β-肌动蛋白(正向5’-TTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’，反向5’-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’)的引物。使用GoTaqqPCRmastermix(Promega)进行定量RT-PCR(qPCR)，简单地将5μlcDNA(20x稀释液)、正向和反向引物(每一种300nM)添加到7μlqPCRmastermix中，并且添加脱矿质水至终体积为14μl。在Rotorgene6000实时循环仪(Qiagen)进行qPCR反应(2min95℃，95℃15s、60℃60s进行40个循环)。使用Rotor-gene分析软件V5.0的对比定量方法分析原始数据，并且将基因的相对表达水平确定为靶基因相对于参照基因的比率，用以下等式根据Pfaffl(Pfaffl2001)描述的ΔCt方法进行计算：比率＝(E_目标)Ct_目标(对照-样品)/(E_参照)Ct_参照(对照-样品)。其中，E是扩增效率，并且Ct是信号超过预定阈值所需的PCR循环的次数。双内部参照基因(GAPDH和β-肌动蛋白)并入到所有qPCR实验中，相对于任一基因进行标准化之后结果是类似的。对于每一样品，都包括不经逆转录酶处理的对照，并且对照中没有观察到高于背景水平的扩增。对于每次运行中的每一基因都包括无模板的对照，并且对照中没有观察到高于背景水平的扩增。通过检查解链温度和每一熔解曲线图确保扩增的特异性。通过测序，对每一模板的产物进行至少一次检查。

小鼠的BMDC测定

如前所述(Lutz,Kukutschetal.1999)，制备来自BALB/c小鼠的小鼠BMDC。简单来讲，将从股骨和胫骨分离的骨髓细胞以2×10⁵个细胞/ml接种在细菌皮氏平皿中的RPMI1640培养基中，该RPMI1640培养基含有10％胎牛血清(FBS)、150μg/ml庆大霉素和20ng/ml小鼠rGM-CSF(Sigma-Aldrich,USA)。在第3天和第6天添加新鲜的培养基，并且在培养第8天使用BMDC。其中表明，BMDC(10⁶个细胞/ml)与浓度为10μg/ml的抗TLR2抗体(InvivoGen,USA)或对照的同型抗体IgG2a(eBioscience,USA)在37℃孵育1小时，然后在使用L.plantarum、EPM、或L.plantarum与EPM一起刺激20h。L.plantarum以细菌:DC比率为10:1使用，EPM为1.2％v/v。经刺激的BMDC培养物上清液储存在-20℃，直至使用。对于细胞表面标记物的分析，培养之后收集BMDC，且与抗小鼠的CD16/CD32抗体(eBioscience,USA)在冰上预孵育5min，然后使用抗小鼠的FITC缀合的CD11c、APC缀合的MHCII和PE缀合的CD40、CD80或CD86单克隆抗体(eBioscience,USA)在4℃染色30min。样品数据在FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson,USA)上获取，并且使用FlowJo软件7.6.2(TreeStar,USA)进行分析。

细胞因子的分析

使用细胞因子珠阵列(Cytokinebeadarrays，BD)和流式细胞仪(FACSCantoII,BD)测定hDC培养上清液中的细胞因子的浓度。在hDC研究中，检测的限度如下：IL-1β7.2pg/ml，IL-103.3pg/ml，TNF3.7pg/ml，和IL-12p701.9pg/ml。根据制造商的说明书，使用Ready-Set-Go！kit(eBioscience,USA)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定培养上清液中的小鼠IL-10。使用匹配的抗体对(BDPharmingen,USA)测量IL-12p70的水平。

细菌或EPM的直肠内给药，及急性溃疡性结肠炎的诱导

10只小鼠的实验组及对它们的各种处理示于表1中。来自组2、3、4和5中的小鼠接受任意饮用水的2.5％DSS(分子量40kDa；ICNBiomedicals,Ohio,USA)达1个星期。来自未经处理的对照组1的小鼠仅接受饮用水。暴露于DSS和在DSS处理的8天期间，来自组3和组4的小鼠直肠内(经由管道)分别接受日剂量为100μlPBS中的2至3x10⁹CFU的F.prausnitziiHTF-F和A2-165达十天。暴露于DSS之前和在DSS处理的8天期间，来自组5的小鼠直肠内接受日剂量为100μlPBS中的50μgEPM达十天。来自结肠炎对照组的小鼠直肠内接受100μlPBS。在处死小鼠之后测量或评定下面的临床症状：粪便的硬度，直肠脱垂，直肠出血和结肠的长度。采集降结肠用于髓过氧物酶的测定、mRNA的分离、组织学评定和肠片段的培养。

表1：DSS诱导的结肠炎实验组

疾病活动指数

根据Cooperetal.(Cooper,Murthyetal.1993)测量的疾病活动指数(DAI)是体重下降、大便软硬度和出血合计得分除以3。急性临床症状是腹泻和/或严重的血便。将得分解释在表2中。

表2：DAI的评分(根据Cooperetal.1993进行了修改)

*正常大便，良好成形的小球；松散的大便，不粘附在肛门上的浆状并且半成形的大便；腹泻，粘附在肛门上的液体状大便。

对结肠损伤的组织学评价

将结肠组织在卡诺氏液(Carnoy’sfluid)中固定30min，转移至96％乙醇中并且包埋在石蜡中。切割5mm石蜡包埋的切片，并且使用苏木精和伊红(H&E)及阿尔新蓝(AlcianBlue)进行染色，并且使用核固红(NuclearFastRed)(Vector,Burlingame,CA)进行后染以显示黏蛋白的产生。使用配备有OlympusCamediaDP70数码相机的OlympusBX40显微镜检验样品，并且使用OlympusDP-软件分析图像。根据Cooperetal.(Cooper,Murthyetal.1993)评价各结肠片段中的表面上皮的损伤度、隐窝变形(cryptdistortion)和黏蛋白产生。

实施例1：F.prausnitzii菌株HTF-F的表型特征和细胞外聚合物基质的纯化

尽管F.prausnitzii菌株HTF-F和A2-165都在固体琼脂上形成具有粘液样外表的菌落，但仅菌株HTF-F在液体培养中形成粘液样生物膜(图1a)。这种表型通常与细胞外多糖和细胞间聚集蛋白的产生相关联(FlemmingandWingender2010)。菌株HTF-F的EPM通过革兰氏染色来显露(图1b)，并且在透射电子显微镜中观察为弥散且不规则的表面层(图2a，箭头)，与猪链球菌(Streptococcussuis)的荚膜多糖(CPS)类似(图2b，(Meijerink,Ferrandoetal.2012))。对由菌株HTF-F产生的结合细胞的EPM进行分离、浓缩并且过滤，以去除可能的细菌污染。EPM产量为约2.5x10¹¹个细菌产生1.2mg/ml的EPM。针对人类TLR2、TLR2/6、TLR4和TLR5的基于荧光素酶的TLR信号传导的测定示出，微生物相关联的分子模式(MAMP)不以影响体外免疫细胞活化的量存在(图3)。这通过如下事实得到了证实：在与hDC孵育之后，EPM不诱导活化或细胞因子的分泌(图4b)。

实施例2：F.prausnitziiHTF-F的EPM减小了经L.plantarum活化的hDC中的促炎性IL-12p70的转录和产生

在体外使用人类单核细胞来源的DC(hDC)测试了F.prausnitziiA2-165、HTF-F和EPM的免疫调节性质。选择DC，是因为它们是最重要的抗原呈递细胞之一，具有刺激位于粘膜位点的初始T细胞(naiveTcell)并且驱动免疫应答的能力。

与L.plantarum(图4a)和其它乳酸菌(未示出)相比，hDC与F.prausnitzii菌株A2-165和HTF-F的孵育诱导了大量的IL-10和少量的IL-12p70。在hDC与菌株HTF-F孵育之后所产生的IL-10的量低于与菌株A2-165孵育之后所产生的IL-10的量(图4a)。但是，该差异并不显著。此外，体内的保护效果更复杂，可能依赖于额外的因素，尤其依赖于菌株的存活和繁殖。

与未经处理的hDC(图4b)相比，EPM单独对活化和成熟标记物的表达及细胞因子的表达没有影响，证实了不具备TLR信号传导的活性(图3)。因此，EPM在hDC培养中与L.plantarum组合，以研究它是否会调节细胞因子的产生。与L.plantarum组合时，EPM降低了促炎性IL-12p70的分泌，但对由L.plantarum引发的IL-10、IL-1β或TNF-α没有影响(图4a，IL-1β和TNF-α没有示出)。这不是因为EPM对hDC成熟和活化的影响，如对共刺激分子CD83和CD86(图4b)的测量所证明的。因此，EPM对炎症刺激物(诸如L.plantarum)具有免疫调节效果(示于图4b、图5和图11中)。

为了研究IL-12p70的分泌的降低是否是由于转录调节造成的，对从与L.plantarum、L.plantarum与EPM组合、仅EPM孵育之后6h和20h的hDC，或未经刺激的hDC提取的IL-10、IL-12、IL-1β和TNF-α的mRNA进行了定量RT-PCR。添加EPM对经L.plantarum刺激的hDC中的IL-1β、TNF-α或IL-10的转录没有显著影响，但是在20h时，IL-12的转录物水平显著减小了约2倍(图5)。

实施例3：F.prausnitzii和菌株HTF-F的EPM减轻了DSS-结肠炎的临床症状

使用DSS诱导的结肠炎模型，在小鼠中评价F.prausnitzii菌株A2-165、HTF-F和EPM的潜在的保护效果。将细菌或EPM直肠内给予小鼠，十天之后进行DSS暴露并且在超过8天的时间段中每天持续给予，其中在饮用水中给予DSS以诱导结肠炎。通过测量疾病活动指数(DAI)、结肠的组织学损伤得分、体重和结肠长度，评价每组中的各只小鼠的结肠炎的严重程度。根据Cooperetal.(Cooper,Murthyetal.1993)的等级(0～4)，测定在DSS处理之后的DAI和组织学结肠损伤得分。

尽管得分高于未经处理的小鼠(图6a)，但是与结肠炎对照小鼠相比，给予F.prausnitziiA2-165、HTF-F和EPM显著减小了DAI，其中结肠炎对照小鼠直肠内接受PBS和在饮用水中给予DSS。

组织学结肠损伤得分在未经处理的小鼠中是0级(图6b和图7a)。与结肠炎对照小鼠相比，给予F.prausnitziiHTF-F显著减小了结肠损伤得分(分别为1.65级和3.2级，图6b、图7c和图7b)，而与结肠炎对照小鼠相比，给予F.prausnitziiA2-165和EPM没有显著影响结肠损伤得分(分别为2.8级和3.3级，图6b、图7d和图7e)。

与未经处理的小鼠相比，结肠长度在所有经DSS处理的组中都降低了，但是与结肠炎对照小鼠(图6c)相比，经F.prausnitziiHTF-F处理的组具有显著较长的结肠，这表明结肠炎严重程度的降低。

小鼠的体重在DSS处理期间自始至终都测量，并且与处理之前的体重进行对比。在未经处理的小鼠中，体重从第5天至第8天增加约5％(图6d)。但是，在结肠炎对照小鼠中，体重从第5天至第8天减小约5％(图6d)。与结肠炎对照小鼠相比，在给予F.prausnitziiHTF-F、A2-165或EPM的小鼠中，体重的减小被延迟了一天。在给予F.prausnitziiHTF-F、A2-165或EPM的小鼠中，体重从第6天至第8天的减小在2％至4％之间，并且对于F.prausnitziiHTF-F和EPM来说，体重减小低于结肠炎对照组(图6d)。

总之，本实施例证明了F.prausnitzii菌株A2-165、形成生物膜的菌株HTF-F以及从菌株HTF-F分离的EPM都能减轻DSS诱导的结肠炎的临床症状。重要的是，菌株HTF-F比菌株A2-165更有效地抑制炎症，并且与其它处理相比，菌株HTF-F对结肠损伤得分和结肠长度具有显著影响(图6)。仅给予纯化的EPM就减小了DAI，表明它有助于菌株HTF-F的保护效果并且可能负责菌株HTF-F所引起的比A2-165强的保护。

实施例4：F.prausnitzii和EPM对DSS处理的小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏中的Foxp3表达的效果

为了研究Foxp3⁺调节性T细胞(Tregs)在减轻DSS诱导的结肠炎中的潜在作用，我们通过荧光激活细胞分选法(FACS)测量了CD4⁺T细胞的数量，其中CD4⁺T细胞分离自表达细胞内Foxp3的肠系膜淋巴结(MLN)和脾脏。与未经处理的小鼠相比，DSS处理没有显著影响MLN或脾脏中的Foxp3⁺CD4⁺T细胞的水平。与未经处理的小鼠相比，给予F.prausnitzii也对Foxp3⁺CD4⁺T细胞没有效果。但是，给予EPM诱导了MLN中的Foxp3⁺CD4⁺T细胞较小但显著的增加，但在脾脏中没有这种效果(图8)。

实施例5：EPM的免疫调节效果是TLR2依赖的

为了研究EPM对hDC产生IL-12p70的抗炎性效果是否对在DSS诱导的结肠炎中观察到的保护效果有贡献，我们对小鼠骨髓来源的DC(BMDC)进行了体外实验，其中小鼠骨髓来源的DC(BMDC)在有或没有EPM的情况下，使用L.plantarum进行刺激。和使用hDC所发现的一样，EPM的存在使经L.plantarum刺激的小鼠BMDC降低了促炎性IL-12p70的分泌。引人注目的是，EPM还增加了在经L.plantarum刺激的BMDC中的IL-10的产生，其中所诱导的IL-10的产生的水平比在经L.plantarum刺激的hDC中高很多。这些效果不是由EPM单独诱导细胞因子的分泌造成的(图9a)。此外，通过在该测定中包括TLR2封闭抗体或相同的同种型的不相关抗体，我们测试了EPM的免疫调节效果是否依赖于TLR2信号传导。EPM对经L.plantarum刺激的BMDC产生IL-12p70和IL-10的效果，在存在TLR2封闭抗体时被抑制，但在存在所述同种型抗体时没有被抑制。和EPM自身不诱导TLR2信号传导(图3)一样，导致IL-12p70转录降低和IL-10产生增加的机制也通过L.plantarum依赖于TLR2信号传导(图9b)。

之前，通过在诱导结肠炎之前和期间每日胃内给药，F.prausnitziiA2-165及其上清液示出减轻了小鼠的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)结肠炎(Sokoletal.2008)。在Sokoletal.的研究中，与结肠炎对照组相比，经F.prausnitziiA2-165或其上清液处理的小鼠的结肠具有降低量的IL-12p70和升高量的IL-10。这符合由F.prausnitziiA2-165与小鼠BMDC、hDC(图4)和人PBMC的体外培养诱导的相对大量的IL-10(Sokol,Pigneuretal.2008)。IL-10是维持肠内内稳态的基础(Geuking,Cahenzlietal.2011；VeenbergenandSamsom2012)。IL-10由粘膜固有层中的DC，以及Foxp3⁺和Foxp3^-T细胞分泌。通过DC的IL-10分泌对于在肠道炎症过程中维持功能性Foxp3⁺Tregs是重要的(Murai,Turovskayaetal.2009)。IL-10还抑制促炎性细胞因子，诸如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-12的产生。此外，IL-10示出具有通过消除IL-23产生，来控制对转移的微生物的促炎性应答的作用(Manuzak,Dillonetal.2012)。然而，与F.prausnitziiA2-165和菌株HTF-F一起培养的DC在体外所产生的IL-10的差异不能解释HTF-F所示的更好的保护，因为它没有产生与A2-165相比显著不同的量的IL-10。

F.prausnitzii在结肠中产生的丁酸盐也可有助于在实验结肠炎模型中所观察到的抗炎性效果，因为最近已经示出经口给予丁酸钠减轻了实验UC中的炎症(Vieira,Leoneletal.2012)。微生物产生的丁酸盐被认为对于结肠健康及预防结直肠癌来说是重要的，这是因为它用作上皮细胞的能量来源且用作氧化应激和炎症的调节因子的用途(Hamer,Jonkersetal.2008)。此外，已经报道了丁酸盐灌肠剂在治疗UC中是有效的(Hamer,Jonkersetal.2010)。

体外测定表明，EPM的抗炎性机制不是因为MAMP的污染或DC的活化。但是，当EPM和L.plantarum一起添加作为hDC的炎症刺激物时，与单独的L.plantarum相比，EPM减小了IL-12p70的产生，并且对IL-10、IL-1β和TNF-α的产生没有效果(图4)。在小鼠BMDC的IL-12p70产生中也观察到EPM具有类似效果(图9)，但是与hDC相反，IL-10被显著增加。EPM对IL-12p70产生的效果出现在转录水平(图5)，这暗示EPM参与细胞的信号传导。这种机制依赖于TLR2信号传导，尽管EPM自身在报告因子测定中并不诱导TLR2信号传导，或如在合成的TLR2激动剂的情况中活化hDC或小鼠BMDC(图9)。所述机制可能涉及EPM中的碳水化合物结构与C型凝集素受体之间的相互作用，其中一些C型凝集素受体已知调节应答于TLR激动剂的细胞因子的产生。在DSS结肠炎模型中，给予EPM但不给予F.prausnitzii增加了MLN中的Foxp3⁺T细胞的数量。

实施例6：F.prausnitziiHTF-F减小了来自结肠培养物的IFN-γ和IL-17的分泌

将预称重的结肠片段在24孔平底板(Nunc,Roskilde,Denmark)中的富含10％牛血清白蛋白的RPMI培养基中在5％CO₂和95％空气和37℃下培养48h，。收获培养上清液，根据制造商的说明书，通过MILLIPLEXMAP小鼠细胞因子/趋化因子平板(MILLIPLEXMAPMouseCytokine/ChemokinePanel，Millipore,USA)分析它们的细胞因子的含量，并且使用Bio-Plex系统(Bio-RadLaboratories,USA)进行分析。

与未经处理的对照相比，DSS处理显著增加了结肠培养物质中的细胞因子的分泌。如图10中所示，与给予PBS相比，直肠内给予F.prausnitziiHTF-F和EPM诱导了IFN-γ分泌的减少，并且F.prausnitziiHTF-F诱导了IL-17分泌的减少。

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PCT/RO/134表

Claims (17)

1.一种药物、营养物或食物组合物，包括作为活性成分的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F，以及可接受的载剂、稀释剂或赋形剂；其中Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F于2013年3月1日以登记号DSM26943保藏在DSMZ。

2.根据权利要求1所述的组合物，包括Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F(DSM26943)的存活细胞。

3.根据权利要求1所述的组合物，包括Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F(DSM26943)的非存活细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，进一步包含一种或多种益生元，优选低聚糖，更优选低聚果糖、果胶和/或菊粉。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，进一步包含一种或多种益生菌，优选选自由双歧杆菌属、乳酸菌属、链球菌属和酵母属，及它们的混合物所组成的组。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，所述组合物是食物组合物、食物补充剂或营养物。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，所述组合物是药物组合物，优选配制成经口摄取的形式，优选为胶囊、微囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂、锭剂、丸剂、混悬剂或糖浆剂的形式。

8.F.prausnitzii菌株HTF-F(DSM26943)，用作药剂。

9.F.prausnitzii菌株HTF-F(DSM26943)，用于治疗或预防与哺乳动物受试者胃肠道炎性失调和/或微生物群失衡相关症状的方法中。

10.用于根据权利要求9所述的供使用的F.prausnitzii菌株HTF-F，其中，所述受试者是人类。

11.用于根据权利要求9所述的供使用的F.prausnitzii菌株HTF-F，其中，所述受试者是家畜或农畜。

12.用于根据权利要求8至11中任一项所述的供使用的F.prausnitzii菌株HTF-F，其中，所述细菌配制为以治疗有效的量给予受试者，优选其中所述细菌的治疗有效的量为约10exp6CFU/天至10exp11CFU/天。

13.用于根据权利要求8至12中任一项所述的供使用的F.prausnitzii菌株HTF-F，其中，所述胃肠道失调选自由炎性肠病、克罗恩氏病、肠易激综合征、乳糜泻、感染性结肠炎、溃疡性结肠炎，及它们的任意组合组成的组。

14.一种生产抗炎性组合物的方法，包括以下步骤：

a)收获Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F(DSM26943)的活细胞并且将所述细胞重悬在适当的缓冲液中，所述适当的缓冲液优选是PBS；

b)涡旋重悬的细胞至少3分钟，以使与细胞结合的细胞外聚合物基质(EPM)溶解在所述缓冲液中；

c)通过离心使所述细胞成团并且收获上清液；

d)向所述上清液中添加约4体积的冰冷的乙醇，以使所述EPM沉淀；

e)用乙醇清洗沉淀的EPM；

f)任选地，接着进行冻干。

15.一种合生素组合物，包括与以下物质一起配制的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F(DSM26943)的活细胞：(1)基于所述组合物的总干重，至少0.05％的核黄素、核黄素磷酸盐或其生理学上可接受的盐，和(ii)半胱氨酸，优选以基于所述组合物的总干重的至少0.05％的量存在。

16.根据权利要求15所述的合生素组合物，进一步包括菊粉或菊粉型低聚果糖、果胶，优选基于所述组合物的总干重，其含量为2％～10％。

17.Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F(DSM26943)在生产抗炎性组合物中的应用。