KR102169794B1 - 신규한 피칼리박테리움 프로스니치 균주 eb-fpdk11 및 그의 용도 - Google Patents
신규한 피칼리박테리움 프로스니치 균주 eb-fpdk11 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 피칼리박테리움 프로스니치 균주 EB-FPDK11 및 그의 용도에 관한 것으로, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 조성물을 섭취하면 염증성 질환, 간질환 또는 대사성 질환을 예방, 개선 및 치료하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 신규한 피칼리박테리움 프로스니치 균주 EB-FPDK11 및 그의 용도 에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)는 유산균을 비롯해 몸 속에서 유익한 효과를 나타내는 모든 균을 의미하는 것으로, 장뿐만 아니라 면역질환 등 다양한 신체 기능에 관여한다. 한동안 프로바이오틱스의 먹이가 되는 식이섬유, 즉 프리바이오틱스(prebiotics)를 함께 복용하면 효과가 더 좋다는 연구가 주목 받았다. 최근에는 프로바이오틱스가 내놓는 대사산물인 포스트바이오틱스가 치료제나 질병 진단에 효율적이라는 주장이 주목 받고 있으며, 더불어 파마바이오틱스 또한 주목 받고 있다. 파마바이오틱스(pharmabiotics)는 의약을 뜻하는 '파마슈티컬'과 생균이라는 '프로바이오틱스'의 합성어로 질환 케어를 위해 의료용으로 사용 가능한 인체 마이크로바이옴을 일컫는 것으로, 프로바이오틱스와 포스트바이오틱스 이 두 가지를 모두 포함한다.
한편, 피칼리박테리움속(Faecalibacterium) 세균은 장내의 점액층에 늘 존재하는 편성 혐기성 간균으로서, 인간에 있어서 보유율 및 보유수가 모두 높으며, 장내 세균총의 주요한 구성 균종이다.
이러한 배경하에 본 발명자들은 인체에 해롭지 않은 균주를 이용하여 질환을 고칠 수 있는 기술을 개발하기 위해 노력한 결과, 우수한 항염증 효과 및 지방축적 억제 효과를 나타내는 피칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) 균주를 동정하였고, 이로부터 간질환 및 대장염 등의 치료에 적합하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 수탁번호 KCCM12621P인 피칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) EB-FPDK11 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 염증성 질환, 간질환 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 염증성 질환, 간질환 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 수탁번호 KCCM12621P인 피칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) EB-FPDK11 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 균주는 16S rRNA가 서열번호 1인 피칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) EB-FPDK11 균주를 제공하는 것이다.
상기 피칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)는 인간의 장내 세균총을 구성하는 세균들 중에서 가장 풍부하게 존재하는 세균의 하나로 운동성이 없는 후벽세균이다. 산소에 매우 민감하여 극소량의 산소가 있어도 자라지 않는다는 특징을 가지고 있다.
본 발명의 다른 양상은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 용어 "배양액"은 배양이 완료된 이후의 조성물을 지칭하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 배양액은 균체를 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다. 따라서 상기 배양액은 배양 상등액, 배양 상등액이 제거된 조성물, 또는 이들을 농축한 조성물을 포함할 수 있다. 상기 배양액의 조성은 통상의 피칼리박테리움 프로스니치 배양에 필요한 성분뿐 아니라, 피칼리박테리움 프로스니치의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
또한, 균주의 상태는 액상상태 또는 건조상태일 수 있으며, 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질환의 총칭으로, 예를 들어, 염증성 피부질환, 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환, 간염, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 기관지염, 관절염, 관절 세포 동맥염, 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 염증성 피부질환, 대장염, 만성 기관지염, 간염, 골관절염 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다
본 발명의 또 다른 양상은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 간질환은 간섬유증 또는 간경화증, 급성 또는 만성 간염, 지방간 또는 간암을 포함하며 바람직하게는 지방간 또는 간염일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 비알콜성 지방간염일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 간질환 예방 또는 치료는 간의 무게가 비정상적으로 증가되는 것을 억제하는 것일 수 있고, 비장의 길이 및 무게가 비정상적으로 증가되는 것을 억제하는 것일 수 있다. 또한 중성지방, 콜레스테롤, GOT, GPT의 농도를 조절하거나 비정상적으로 증가하는 것을 억제하는 것일 수 있고, 간 세포의 지방방울(fat droplet) 생성, 간의 섬유화 및 α-SMA 발현을 억제하는 것일 수 있다. 그러나 예방 및 치료 효과가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양상은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 대사성 질환은 고지혈증, 당뇨병, 통풍, 치매, 비만, 고혈압, 저혈당, 고콜레스테롤혈증, 혈색소증, 유전분증, 포르피린증 일 수 있고 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병을 포함할 수 있다. 바람직하게는 비만일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양이어야 한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 및 패치의 형태로 제형화하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전부, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 양상은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 간질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 상기 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물을 포함하는 식품 조성물 또는 그의 유효 성분, 또는 그의 생리학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 언급한 바와 같이 식품 보조 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함할 수 있다.
상기 천연 탄수화물은 예를 들어, 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 다이사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드를 포함할 수 있으며, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜을 포함할 수 있이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 또는 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 적절하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태로 제조될 수 있다. 본 명세서에서 용어, "건강기능식품(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 상기 기능(성) 식품이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품 조성물은 염증성 질환, 간질환 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 식품 조성물은 프로바이오틱스 제제의 형태로 제조될 수 있다.
상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11, 상기 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11 균주의 배양액, 파쇄물 또는 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 조성물을 섭취하면 염증성 질환, 간 질환 또는 대사성 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 있다.
도 1은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 현미경으로 관찰한 것이다.
도 2는 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 FP-특이성 프라이머로 PCR 후 전기영동한 결과이다.
도 3은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 ERIC-1, ERIC-2 및 (GTG)5 프라이머로 PCR 후 전기영동한 결과이다.
도 4는 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11의 16rRNA 염기서열을 이용하여 작성한 계통수이다.
도 5은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 용혈현상 여부를 확인한 것이다.
도 6은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 단쇄지방산을 분석한 그래프이다.
도 7은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 염증 사이토카인 IL-8 mRNA 발현을 확인한 그래프이다.
도 8는 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 항염증 사이토카인 IL-10 농도를 확인한 그래프이다.
도 9은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 지방축적 억제 정도를 확인한 사진 및 그래프이다.
도 10은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11 배양액의 지방축적 억제 정도를 확인한 사진 및 그래프이다.
도 11는 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11 처리시 지방분화 유도 후 지방세포 분화에 관여하는 유전자들의 발현 정도를 비교 및 확인한 그래프이다.
도 12은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 무게와 식이섭취량을 비교한 그래프이다.
도 13는 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 내당능을 비교한 그래프이다.
도 14는 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 간의 무게 및 모양을 비교한 그래프이다.
도 15은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 비장의 무게 및 모양을 비교한 그래프이다.
도 16은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 혈중 지질생화학적 지표를 분석하여 비교한 그래프이다.
도 17은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 간을 H&E 염색을 통해 지방방울형성을 확인한 결과이다.
도 18는 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 콜라겐 침착량을 비교한 결과이다.
도 19은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 간을 α-SMA를 통해 손상도를 비교한 결과이다.
도 20은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 간의 중성지방과 총콜레스테롤을 비교한 결과이다.
도 2는 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 FP-특이성 프라이머로 PCR 후 전기영동한 결과이다.
도 3은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 ERIC-1, ERIC-2 및 (GTG)5 프라이머로 PCR 후 전기영동한 결과이다.
도 4는 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) EB-FPDK11의 16rRNA 염기서열을 이용하여 작성한 계통수이다.
도 5은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 용혈현상 여부를 확인한 것이다.
도 6은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 단쇄지방산을 분석한 그래프이다.
도 7은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 염증 사이토카인 IL-8 mRNA 발현을 확인한 그래프이다.
도 8는 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 항염증 사이토카인 IL-10 농도를 확인한 그래프이다.
도 9은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11의 지방축적 억제 정도를 확인한 사진 및 그래프이다.
도 10은 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11 배양액의 지방축적 억제 정도를 확인한 사진 및 그래프이다.
도 11는 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11 처리시 지방분화 유도 후 지방세포 분화에 관여하는 유전자들의 발현 정도를 비교 및 확인한 그래프이다.
도 12은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 무게와 식이섭취량을 비교한 그래프이다.
도 13는 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 내당능을 비교한 그래프이다.
도 14는 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 간의 무게 및 모양을 비교한 그래프이다.
도 15은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 비장의 무게 및 모양을 비교한 그래프이다.
도 16은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 혈중 지질생화학적 지표를 분석하여 비교한 그래프이다.
도 17은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 간을 H&E 염색을 통해 지방방울형성을 확인한 결과이다.
도 18는 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 콜라겐 침착량을 비교한 결과이다.
도 19은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 간을 α-SMA를 통해 손상도를 비교한 결과이다.
도 20은 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스에서 피칼리박테리움 프로스니치(F. prausnitzii) 표준균주 및 EB-FPDK11를 투여한 마우스의 간의 중성지방과 총콜레스테롤을 비교한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 피칼리박테리움 프로스니치 (
Faecalibacterium prausnitzii
) EB-FPDK11 균주 분리 및 동정
1.1. 피칼리박테리움 프로스니치 시료 확보 및 분리
건강한 한국인(여성, 9세, BMI 15.5)의 분변으로부터 피칼리박테리움 프로스니치를 분리하기 위하여, Martin의 방법에 따라 YBHI 배지 [Brain-heart infusion medium supplemented with 0.5% w/v yeast extract (Difco), 0.1% w/v D-cellobiose, 0.1% w/v D-maltose]를 이용하여 배양한 후 EOS(Extremely Oxygen Sensitivity) 균종을 선별한 뒤 분리하였다.
1.2. 현미경 관찰
분리된 균주가 피칼리박테리움 프로스니치 균주인지 여부를 확인하기 위해서, 분리된 균주를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 표준균주인 피칼리박테리움 프로스니치 DSM 17677T 균주인 A와 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주를 1000배의 배율로 확대한 B 모두 모양이 막대형 세포로 곧은 또는 굽은 형태로 비슷한 형태를 나타내는 것을 확인하였다.
1.3. PCR 분석
피칼리박테리움 프로스니치 균주인지 여부를 확인하기 위해서, 분리된 균주를 하기 표 1의 FP-특이성 프라이머(서열번호 2 및 서열번호 3)를 사용하여 PCR 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 2와 같이 양성 대조군 균주인 피칼리박테리움 프로스니치 DSM17677T와 유사한 밴드로 결과값이 나온 것을 확인할 수 있었다.
| 서열번호 | Designation | Direction | Sequence (5’→3’) | Amplicon size |
| 서열번호 2 | FP1 | Forward | ACT CAA CAA GGA AGT GA | 192 bp |
| 서열번호 3 | FP2 | Reverse | CAG AGG TAG GCG GAA TT |
1.4. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 분석
상기와 같이 분리된 균주가 이미 보고된 동종의 표준균주와 비교하여 상이한지 여부를 확인하기 위해서, 분자 타이핑의 일종인 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석을 실시하였다. 이를 위해 균체로부터 추출한 gDNA(genomic DNA)를 대상으로 하기 표 2의 universal primer(서열번호 4 내지 서열번호 6)를 이용하여 DNA를 증폭한 후 1% 아가로스 겔에서 90분 동안 전기영동 하였으며, 도 3과 같이 UV transilluminator를 이용하여 DNA 분절 패턴을 비교하였다.
| 서열번호 | Designation | Direction | Sequence (5' →') |
| 서열번호 4 | ERIC-1 | Forward | ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C |
| 서열번호 5 | ERIC-2 | Reverse | AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G |
| 서열번호 6 | (GTG)5 | Forward/Reverse | GTG GTG GTG GTG GTG |
도 3에서 패턴 비교 결과, 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주는 표준균주인 DSM 17677T와 일부 유사하지만 상이한 밴드 패턴을 보이고 있어, 표준균주 피칼리박테리움 프로스니치 DSM 17677T와 종은 같지만, 다른 균주인 것을 확인하였다.
1.5. 16S rRNA BLAST
분리된 균주가 피칼리박테리움 프로스니치 균주인지 여부를 확인하기 위해서, 16S rRNA 염기서열을 분석한 후 BLAST 하여 확인한 결과, 피칼리박테리움 프로스니치 종과 99% 이상 일치하였으며, 이러한 결과들을 토대로 분리된 균주를 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주로 명명하고, 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12621P를 부여 받았다.
1.6. 16s rRNA 염기서열을 이용한 계통수(phylogenetic tree) 분석
상기 균주의 동정 결과, 현재 알려져 있는 균주들에 대해서 비슷한 균주는 존재하지만 정확하게 일치하는 결과는 얻지 못하여 계통수 분석을 하였다. 분리된 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 전장 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 위하여, 하기 표 3의 27F(서열번호 7) 및 1492R(서열번호 8) 프라이머를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭한 후 3730xl DNA Analyzer(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 이와 같이 얻은 EB-FPDK11 균주 및 표준균주를 포함하여 이미 공표된 동종의 다른 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 이용하여 Maximum Likelihood method에 따라 도 4와 같은 계통수를 작성하였다.
| 서열번호 | Designation | Direction | Sequence (5' →') | Amplicon size |
| 서열번호 7 | 27F | Forward | AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG | 1,465 bp |
| 서열번호 8 | 1492R | Reverse | GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
실시예 2: 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 특성 분석
2.1. 항균제 감수성 확인
피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 항균제 감수성을 파악하기 위하여 Clinical & Laboratory Standard Institute (CLSI) 가이드라인의 액체배지 미량 희석법에 따라 혐기성균용 항균제 (piperacillin-tazobactam, ceftizoxime, chloramphenicol, clindamycin, meropenem, moxifloxacin, metronidazole, ciprofloxacin)에 대한 최소저해농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)를 확인하였다.
|
Antimicrobial
Agents |
MIC a Breakpoints (μg/mL) | QC | Test strains | |||
| S | I | R | ATCC 29741 b | DSM 17677T | EB-FPDK11 | |
| PTZ | ≤32/4 | 64/4 | ≥128/4 | 8/4 | >256/4(R) | >256/4(R) |
| CTZ | ≤32 | 64 | ≥128 | 16 | 64 (I) | 128 (R) |
| CHL | ≤8 | 16 | ≥32 | 8 | 64 (R) | 8 (S) |
| CLI | ≤2 | 4 | ≥8 | 4 | ≤0.125 (S) | ≤0.125 (S) |
| MEM | ≤4 | 8 | ≥16 | 0.5 | >64 (R) | >64 (R) |
| MXF | ≤2 | 4 | ≥8 | 8 | 16 (R) | 32 (R) |
| MTZ | ≤8 | 16 | ≥32 | 2 | 4 (S) | 0.5 (S) |
| CIP | ≤1 | 2 | ≥4 | >32 | 32 (R) | 16 (R) |
PTZ : Piperacillin-tazobactam, CTZ : ceftizoxime (3rd gen), CHL : chloramphenicol, CLI : clindamycin, MEM : meropenem, MXF : moxifloxacin (4th gen), MTZ : metronidazole, CIP : ciprofloxacin (2nd gen), a MIC : minimal inhibitory concentration, b Bacteroides thetiotaomicron ATCC 29741
확인 결과, 상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주는 피페라실린-타조박탐(PTZ), 세프티족심(CTZ), 메로페넴(MEM)과 플루오로퀴놀론 계열의 항생제인 목시프록사신(MXF)과 시프로플록사신(CIP)에 내성을 나타냈으며, 클로람페니콜(CHL), 클린다마이신(CLI)과 메트로니다졸(MTZ)에는 감수성을 나타내었다. 표준 균주(DSM 17677T)와 비교하면, 클로람페니콜(CHL) 항생제에서 큰 차이를 보였다.
2.2. 용혈활성(hemolytic activity) 확인
피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 안전성 검증을 위해 용혈활성 보유 여부를 평가하였다. 이를 위하여 YBHI 배지 [Brain-heart infusion medium supplemented with 0.5% w/v yeast extract (Difco), 0.1% w/v D-cellobiose, 0.1% w/v D-maltose)에 1.5% w/v bacto-agar와 5% w/v defbrinated sheep blood를 첨가하여 제조한 혈액 한천 배지를 이용하여 균주를 배양한 뒤 콜로니 주변으로 용혈현상 여부를 관찰하였다. 양성 대조군으로 β-hemolysis를 일으키는 Streptococcus pyogenes ATCC 19615와 비교하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주와 표준균주 DSM 17677T는 모두 콜로니 주변이 투명해지는 부분이 없어 병원성과 관계된 β-hemolysis를 일으키지 않는다는 것을 확인하였다.
2.3. 기능성 대사체(단쇄지방산) 분석
분리된 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 기능성 대사체 확인을 위해 배양액에 함유된 단쇄지방산(SCFA, short chain fatty acids)의 함량을 가스크로마토그래피로 분석하였다. 이를 위하여 YBHI 배지 [Brain-heart infusion medium supplemented with 0.5% w/v yeast extract (Difco), 0.1% w/v D-cellobiose, 0.1% w/v D-maltose)에 균주를 24시간 배양한 후 12,000 Х g 에서 5분간 원심분리하여 상층액을 회수하였으며, 상층액은 0.2μm 실린지 필터를 이용하여 여과한 뒤 분석에 사용하였다. FFAP column (30 m Х 0.320mm, 0.25μm phase)이 장착된 가스크로마토그래피 (Agilent 7890N)를 이용하였으며, 조건은 표 5와 같이 설정하였다.
| Flow | H2: 40 mL/min, Air: 350 mL/min |
| Injector temp. | 240℃ |
| Detector temp. | 250℃ |
| Oven temp. | 40℃(hold 2 min) →65℃/ 10 min (hold 2 min) →240℃/ 10 min (hold 5 min) |
| Injection vol. | 2μL |
| Split ratio | 20:1 |
기능성 단쇄지방산을 분석한 결과, 도 6의 그래프에서 확인되는 바와 같이, 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주는 아세테이트를 소비하고 뷰티레이트를 생성한다는 것을 확인하였다.
실시예 3: 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 항염증 효능 확인
3.1. HT-29 장상피세포에서 항염증 효능 평가
염증성 장질환에서 염증 반응 조절에 사이토카인이 관여하므로, 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주를 투여하여 사이토카인의 유전자 발현 변화를 확인하였다. 실험관 실험으로 항염증 효능평가 실험을 하기 위해, 인간유래 대장상피세포인 HT-29 세포 (ATCC® HTB-38™, USA)를 배양하였다. 10% FBS (fetal bovine serum, Hyclone, USA), 10 μg/ml 젠타마이신을 첨가한 McCoy's 5A modified media (Gibco, USA)를 기본 배양 배지로 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터 (NUAIRE, USA)에서 배양하였다. 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주가 HT-29세포에서 LPS로 유도된 염증성 사이토카인인 IL-8 유전자의 발현을 억제하는지 확인하기 위해서 하기 표 6의 프라이머(서열번호 9 내지 12)를 이용하여 실시간 PCR을 진행하였다.
| 서열번호 | 타깃 | 프라이머 서열 |
| 서열번호 9 | GAPDH | F: 5'- GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG-3' |
| 서열번호 10 | GAPDH | R: 5'- ATA CCA GGA AAT GAG CTT GAC AAA-3' |
| 서열번호 11 | IL-8 | F: 5'- TTT TGC CAA GGA GTG CTA AAG A-3' |
| 서열번호 12 | IL-8 | R: 5'- AAC CCT CTG CAC CCA GTT TTC -3' |
TRI 시약(Sigma, USA)을 이용하여 총 RNA를 추출하였고 cDNA 합성을 위해서 1μg의 RNA를 M-MLV cDNA 합성 키트 (Enzynomics, Korea)로 cDNA를 추출하였다. 실시간 PCR은 Quant Studio 3 real time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다.
염증성 사이토카인의 유전자 발현은 SYBR Green TOPrealTM qPCR 2X PreMIX (Enzynomics, Korea)를 사용하였고, internal standard로는 GAPDH를 사용하였다. PCR의 조건은 pre-incubation (for UDG)은 50℃에서 4분, 95℃에서 10분, 그리고 40 싸이클은 95℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 수행하였다. 데이터는 QuantStudio Design & Analysis Software v1.4.3에 내장되어 있는 프로그램을 이용하여 delta CT방법으로 분석하였다.
모든 실험으로 얻어진 결과는 통계프로그램 GraphPad Prism 7 (GraphPad software Inc, USA)을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준 편차로 계산되었고, 각 군 간의 차이는 one-way ANOVA, Tukey's test를 이용하였고, p값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 일부 결과에서는 AUC (area under curve)를 계산하였다.
그 결과, 도 7에서 나타내는 바와 같이, HT-29 세포에 LPS (100μg/ml)를 6시간 동안 단독 처리하였을 때, 대표적인 염증 사이토카인인 IL-8의 발현이 정상군에 비해 증가하였다. 반면에 LPS를 처리한 군에 비해 LPS와 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주의 배양액(10%, v/v)을 함께 처리한 군에서는 IL-8의 발현이 감소하였고, 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주 배양액을 함께 처리한 군에서는 LPS와 A2-165 표준균주 처리군 대비하여 IL-8의 발현을 더욱 감소시킨다는 결과가 나왔다. 따라서 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주 배양액은 염증성 사이토카인 IL-8을 감소시킨다는 것을 확인하였다.
3.2. 마우스 골수 유래 수지상세포에서 항염증 효능평가
항염증 반응을 관찰하기 위해 수지상세포(Dendritic cells, DC)의 사이토카인의 분비를 확인하였다. 마우스 골수 유래 수지상세포(bone marrow derived dendritic cells, BMDC)를 이용하여 균주의 항염증 효능을 평가하기 위해 BMDC 세포를 분리하였다. 0.5 ml 마이크로튜브에 18G 니들을 이용하여 구멍을 뚫은 다음 6주령 C57BL/6 마우스의 대퇴골과 경골을 분리하여 1.5ml 침전관에 담은 후 10,000 Х g에 15초 동안 원심분리를 하였다. PBS를 이용하여 1.5 ml 침전관에 담긴 펠렛을 3번 세척한 후, 펠렛을 RPMI-1640 (10% FBS, 1% P/S, media, 1X mercaptoethanol, 20 μg GM-CSF) 배지를 넣고 150 mm 배양 접시에 배양하였다. 다음날 100 ml 패트리접시로 BMDC를 옮겨 배양을 하고 5일째 되는 날 배양액 10 ml을 15 ml 코니칼 튜브(conical tube)에 옮겨 담은 후, 1,000 Х g에 15분 동안 원심분리하여, 상층액을 제거하고 BMDC media 10 ml을 첨가하여 패트리접시에 넣어주었다. 6~7일째 BMDC를 실험에 사용하였다. 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 항염증 효능 분석을 위해 대표적인 항염증 사이토카인인 IL-10의 분비를 mIL-10 ELISA (Invitrogen, USA)로 분석하였다.
BMDC 세포에 LPS (100 μg/ml), E. coli, 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주, EB-FPDK11 균주를(107 cfu/ml, 10% v/v) 1시간 동안 항생물질이 없는 배지에 처리 후, 페니실린/스트랩토마이신 항생제를 넣은 배지로 교체한 뒤, 24시간 배양하고 배지를 1,000 Х g 원심분리하여 상층액을 이용해 IL-10의 분비를 ELISA로 측정하였다.
도 8과 같이, LPS와 E. coli를 처리하였을 때는 IL-10의 분비가 정상군과 차이 없이 비슷한 수준을 나타내었다. 반면에 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주를 처리한 군은 정상군에 비해 IL-10의 분비양이 현저히 증가하였다. 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주 처리군에서는 A2-165 표준균주 처리군 대비하여 IL-10의 발현이 유의미한 수준으로 더욱 증가하였다. 따라서 피칼리박테리움 프로스니치 균주를 처리시 항염증 사이토카인 IL-10이 현저히 증가되는 것을 확인하였다.
실시예 4: 지방축적 억제 효과 확인
지방축적과 비만 관련 바이오마커의 발현이 본 발명의 균주의 투여에 의해서 영향을 받는지 여부를 조사하였다.
4.1. 지방분화 세포를 이용한 oil red-O 염색
3T3-L1 세포에서 지방세포 분화 및 지방 생성에 본 발명의 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주가 미치는 영향을 알아보기 위하여 Oil Red-O(ORO) 염색실험을 수행하였다. 우선 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화시키기 위해 24 well plate에 2 Х 104/well의 세포를 분주하였다. 10% BS를 포함한 DMEM 배지에서 4일 동안 배양한 후 세포가 플레이트에서 포화상태로 되면 분화용 배지[DMEM, 10% Fetal Bovine Serum, 0.5mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma I5879) 1μM 덱사메타손 (Sigma D4902, FW392.5), 10 mg/ml insulin]로 교체하고 시료(피칼리박테리움 프로스니치의 균주 또는 배양액) 50 μl(1 Х 107/well)를 처리한 후 37℃ 5% CO2 조건에서 2일 간 배양하였다. 이후 인슐린 배지(10% FBS, 10 mg/ml insulin)로 이틀마다 교체하여 8일 동안 동일 조건에서 배양하였다. 피칼리박테리움 프로스니치의 균주와 배양액을 배지를 교환할 때마다 동시에 처리해 주었다. 균주와 균주 배양액(107 cfu/ml)은 10% v/v로 세포에 처리하였다.
Oil Red-O 염색법은 분화된 3T3-L1 세포에 Oil Red-O 시약으로 염색하여 세포내 생성된 지방을 측정하는 방법이다. 마우스 지방전구세포인 3T3-L1 세포 (한국세포주은행, KOREA)를 배양하였다. 10% FBS (fetal bovine serum, Hyclone, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Welgene, KOREA)를 기본 배양 배지로 이용하여 37℃ 5% CO2 인큐베이터 (NUAIRE, USA)에서 배양하였다. 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11균주가 지방세포인 3T3-L1에서 인슐린(1 μg/ml), IBMX (0.5 mM), 덱사메타손 (1 μM) 으로 10일 동안 지방 분화를 유도한 후, 배양액을 PBS로 3번 세척하여 배양액을 제거하고, 10% 포르말린 (Sigma, USA)을 첨가하여 Oil Red-O (Oil red O, Sigma, USA) 용액을 세포와 1시간 동안 반응시키고 증류수로 세척하여 지방구를 염색하였다.
세포 염색이 끝난 후 40% 이소프로판올(Duksan, KOREA)로 3번 세척 후 건조하여 세포 내 지방의 크기를 광학현미경으로 관찰하였다. 이소프로판올을 첨가하여 Oil Red-O 용액으로 염색된 지방구 시료를 녹여내고, Spectrophotometer (Epoch, BioTek, USA)를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 측정하였다.
도 9에 나타나는 바와 같이, 3T3-L1 세포의 분화과정 중에 본 발명의 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주를 처리한 결과, 대조군에 비해서 지방축적을 억제시켰다. 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주를 처리하였을 때, 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주 처리군에 대비하여 유의미하게 더욱 지방축적을 억제시키는 것을 확인하였다.
도 10에서도 마찬가지로 3T3-L1 세포의 분화과정 중에 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주의 배양액을 처리한 결과, 대조군에 비해서 현저하게 지방축적을 억제시켰다. 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 배양액을 처리하였을 때, 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주 배양액 처리군에 대비하여 유의미하게 더욱 지방축적을 억제시켰다.
실험 결과, 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주 및 배양액보다 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주 및 배양액이 3T3-L1 세포의 지방 분화 억제 효과가 우수함을 확인하였다.
4.2. 바이오마커 유전자 발현에 대한 효능 평가
균주의 지방세포 분화 억제에 대한 효과를 확인하기 위해서, 하기 표 7에 기재된 유전자 특이적 프라이머(서열번호 13 내지 24)를 이용하여 실시간 PCR을 진행하여 지방세포로 분화 단계에서 지방세포의 분화와 성숙에 관여하는 전사인자인 C/EBPα (CCAAT/enhancer binding protein alpha), 지방합성 유전자 aP2 (adipocyte protein 2), FAS (fatty acid synthase), ACC1 (acetyl-coenzyme A-carboxylase), LPL (lipoprotein lipase) 유전자의 mRNA 발현을 분석하였다.
| 서열번호 | 타깃 | 프라이머 서열 |
| 서열번호 13 | GAPDH | F: 5'-GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG-3' |
| 서열번호 14 | GAPDH | R: 5'-ATA CCA GGA AAT GAG CTT GAC AAA-3' |
| 서열번호 15 | C/EBPα | F: 5'-AGC AAC GAG TAC CGG GTA CG-3' |
| 서열번호 16 | C/EBPα | R: 5'-TGT TTG GCT TTA TCT CGG CTC-3' |
| 서열번호 17 | aP2 | F: 5'-AGT GAA AAC TTC GAT GAT TAC ATG AA-3' |
| 서열번호 18 | aP2 | R: 5'-GCC TGC CAC TTT CCT TGT G-3' |
| 서열번호 19 | FAS | F: 5'-AGG GGT CGA CCT GGT CCT CA-3' |
| 서열번호 20 | FAS | R: 5'-GCC ATG CCC AGA GGG TGG TT-3' |
| 서열번호 21 | ACC1 | F: 5'-CCT CCG TCA GCT CAG ATA CA-3' |
| 서열번호 22 | ACC1 | R: 5'-TTT ACT AGG TGC AAG CCA GAC A-3' |
| 서열번호 23 | LPL | F: 5'-TTG CCC TAA GGA CCC CTG AA-3' |
| 서열번호 24 | LPL | R: 5'-ACA GAG TCT GCT AAT CCA GGA AT-3' |
구체적으로, 총 RNA는 제조사의 지침에 따라 TRI 시약(Sigma, USA)을 이용하여 세포 단층으로부터 추출하고, cDNA는 M-MLV cDNA 합성 키트 (Enzynomics, Korea)를 이용하여 총 RNA 1 μg으로부터 합성하였다. PCR 반응은 Quant Studio 3 real time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. PCR의 조건은, pre-incubation은 50℃에서 4분, 95℃에서 10분, 그리고 40 싸이클은 95℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 수행하였다. 데이터는 QuantStudio Design & Analysis Software v1.4.3에 내장되어 있는 프로그램을 이용하여 delta CT방법으로 분석하였다.
도 11과 같이, 지방분화 유도 후 지방세포 분화에 관여하는 유전자들인 C/EBPα, aP2, FAS, ACC1, LPL의 증가한 발현을 100%로 수치화 하였을 때 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주 및 EB-FPDK11 균주의 배양액을 처리한 군에서는 C/EBPα, aP2, FAS, ACC1, LPL의 발현이 현저히 감소하였다. 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주와 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주는 모두 3T3-L1 세포의 지방 분화 관련 유전자의 발현 억제 효과가 우수함을 확인하였다.
실시예 5: 비알콜성 지방간염 효과 확인
5.1. 비알콜성 지방간염 동물모델 제작
동물실험은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 Animal use and Care Protocol 을 준수하여 진행하였다. 실험동물은 8주령 수컷 마우스 C57BL/6 (그룹당 9 마리)을 구입하여 일주일 동안 적응기간을 가진 후, 12주간 사육이 진행되었고, 사육환경은 일정한 온도(22℃)와 상대습도 (40~60%)를 유지하며 12시간 주기로 명암을 조절하면서 1주간 적응시켰다.
비알콜성 지방간염을 유도하기 위해, 실험식이(NASH)로 16주간 고지방사료 (60 kcal% fat; Research Diets Inc, NJ, USA)와 과당(Fructose) 30%를 첨가한 음용수에 섭취하도록 하였으며, 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
실험 마우스들을 무작위로 하기 표 8과 같이 5개 그룹으로 나누었다.
| 실험군 I (Normal) | 정상 식이 정상 대조군 |
| 실험군 II (HFD) | 실험식이 공급 비알콜성 지방간염 유도군 |
| 실험군 III (silymarin) | 실험식이 공급 비알콜성 지방간염 유도 후, 실리마린(30mg/kg) 투여군 |
| 실험군IV | 실험식이 공급 비알콜성 지방간염 유도 후, 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주 투여군 |
| 실험군V | 실험식이 공급 비알콜성 지방간염 유도 후, 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주 투여군 |
실험군 III, IV, V의 경우에는, 실험식이에 의해서 비알콜성 지방간염 유도 8주 후부터 실리마린(30mg/kg), 피칼리박테리움 프로스니치 생균을 1x108 CFU/150μl PBS (25% 글리세롤, 0.05% 시스테인/ PBS) 농도로 매일 경구 투여하였다.
정상 마우스(Normal)에는 10% fat 사료를 섭취하도록 하였다. 양성 대조군으로 비알콜성 지방간 개선에 도움을 줄 수 있는 기능성 원료로 알려진 실리마린과 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주를 투여하였다. 이때 정상군과 실험식이군은 투여에 따른 스트레스 등의 영향을 배제하기 위해 이와 동일한 양의 인산완충식염수 (25% 글리세롤, 0.05% 시스테인/PBS)를 매일 경구 투여하였다.
5.2. 체중 및 먹이섭취 변화
비알콜성 지방간염 유도 실험 수행 16주 후, 실험군의 체중의 변화를 측정하여, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12를 참조하면, 실험식이로 비알콜성 지방간염을 유도한 전체 그룹 동물의 체중은 정상식이군 대비 체중이 증가되었다. 실리마린과 피칼리박테리움 프로스니치 균주를 투여한 8주를 기점으로 16주까지의 체중 증가를 질량(g)과 백분율(%)로 계산했을 때, 실리마린과 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주투여 군에서 비알콜성 지방간염 유도그룹 대비 다소 체중증가가 감소된 것을 관찰되었으나 유의적인 감소를 나타내는 것은 확인할 수 없었다. 체중 증가의 경우 그 증가량이 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 투여 그룹에서 백분율로 계산했을 때, 정상식이군 대비 가장 적게 증가한 것으로 관찰되었다. 식이섭취양 및 칼로리의 경우 실험식이로 비알콜성 지방간염을 유도한 그룹 사이에서는 차이가 크게 나지 않았다.
5.3. 내당능 변화 (OGTT, oral glucose tolerance test)
피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 투여가 내당능에 미치는 효과를 확인하기 위해서, 실험 수행 16주 후, 마우스를 18시간 금식시킨 상태에서 포도당 (glucose 2 g/kg)을 경구로 투여하였다. 포도당 투여 직전과 투여 후 30, 60, 90, 및 120분 후에 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 혈당측정기로 측정하여, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 의하면, 포도당 투여 직전 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주를 투여한 군에서 투여군 중 혈당이 가장 감소한 경향을 나타내었다. 포도당 투여 30분 후, 모든 투여군에서 정상식이군보다 혈당이 증가하지만, 120분간 혈당 곡선아랫면적(AUC)을 계산한 결과 60분, 90분, 120분으로 시간이 지날수록 실리마린과 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주, EB-FPDK11 균주 투여군에서 비알콜성 지방간염 유도군 대비하여 유의하게 혈당이 현저히 감소하였다. 이러한 연구 결과로 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 구강 투여가 비알콜성 지방간염의 유도로 낮아진 혈당조절 능력을 완화시키며, 내당능을 높여줄 수 있음을 확인하였다.
5.4. 지방간염 관찰 및 조직 무게 변화
실험 종료 시에 CO2로 마취한 상태에서 간과 비장을 적출하여 생리 식염수로 세척하고 수분을 제거한 후 중량을 측정하고 이들의 크기와 색깔을 육안적으로 관찰하였다.
도 14을 참조하면, 정상식이군의 간 조직의 경우, 선홍빛의 건강한 간의 형태를 나타낸 반면, 실험식이로 비알콜성 지방간염을 유도한 그룹의 간에서는 지방축적으로 인해 색깔도 탁해지고 원래의 선홍색을 잃어버린 것으로 관찰되었다. 그러나 실리마린, 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주와 EB-FPDK11 균주를 투여한 그룹에서는 정상식이군에 가까운 선홍빛의 간 형태를 보였다. 간 무게 측정의 경우 정상식이군 대비 비알콜성 지방간염 유도 그룹과 실리마린 투여그룹에서 무게증가가 관찰되었다. 그러나 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 투여그룹의 간 조직의 무게는 가장 정상군과 비슷한 수치를 나타내며, 비알콜성 지방간염 유도 그룹과 대비하였을 때 유의미하게 무게 차이를 보였다. 도 14의 결과를 통해서 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 투여그룹이 정상식이군과 유사한 형태 및 무게를 나타낸다는 점을 확인하였다. 따라서 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주가 비알콜성 지방간염을 완화시킬 수 있다는 결론을 도출할 수 있었다.
비장의 경우, 도 15에 나타나듯 길이와 무게가 정상식이군 대비 비알콜성 지방간염 유도 그룹에서 각각 증가하였다. 간조직과 마찬가지로 실리마린과 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주를 처리한 그룹의 비장의 길이도 정상식이군 대비 증가하였지만, 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주를 투여한 그룹에서는 비장 길이 증가 수치가 유의미성이 없는 정도로 낮은 것으로 관찰되었다. 비장의 무게는 비알콜성 지방간염 유도군보다 그 수치가 낮은 것을 확인하였다.
5.5. 혈중 지질생화학적 지표 분석
18시간 금식시킨 후 각 실험동물로부터 혈액을 채취한 후, 분리한 혈청(serum)으로 지질 함량의 지표인 중성지방(triglyceride, TG), 총콜레스테롤(total cholesterol, TC), 간 기능의 지표인 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase), GPT(glutamic pyruvic transaminase)를 측정하여 도 16으로 나타냈다. 지질조성 지표인 TG, TC, GOT, GPT 농도는 모두 아산제약에서 구입한 개별 측정 키트를 사용하여 정량 하였다.
중성지방의 경우 비알콜성 지방간염 유도 그룹에서는 유의미하게 증가한 것을 확인하였다. 그러나 실리마린과 EB-FPDK11 균주를 투여한 그룹에서는 비알콜성 지방간염 유도 그룹에 비해 중성지방이 유의미하게 감소하였다. 총콜레스테롤의 경우, 비알콜성 지방간염 유도 그룹과 A2-165 표준균주 처리 그룹은 정상군 대비 높은 수준을 보였다. 그러나 EB-FPDK11 균주를 처리하였을 때, 비알콜성 지방간염 유도 그룹과 A2-165 표준균주를 처리한 그룹 대비하여 총 콜레스테롤의 수준이 현저히 감소하였다. 간세포 손상 정도를 나타내는 GOT 농도는 비알콜성 지방간염 유도 그룹대비 모든 투여그룹에서 감소한 것을 관찰하였고, GPT 농도는 실리마린과 EB-FPDK11 균주 투여그룹에서만 유의미하게 감소한 것을 관찰하였다. 혈중 지질 생화학적 지표 분석을 통해 비알콜성 지방간염과 밀접한 관계가 있는 중성지방, 총콜레스테롤, GOT, GPT의 농도가 EB-FPDK11 균주 투여로 인해 감소되는 것을 확인하였다.
5.6. 간조직 내 지방간염 병리학적 심화도 분석
EB-FPDK11 균주의 투여가 비알콜성 지방간염 완화에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 간 조직 절단면의 hematoxylin & eosin(H&E) 염색과, 간섬유화를 측정할 수 있는 sirius red 염색, 간손상시 발현되는 alpha-smooth muscle actin(α-SMA)의 발현을 염색하여 관찰하였다. 마우스에서 분리한 간 조직을 약 5μm로 조직 절편으로 만든 후 파라핀으로 포매하고 각각의 염색을 통해 형태학적 변화의 차이를 관찰하였다. 각각의 염색을 통한 간 손상의 정도는 Image J 프로그램을 통해 positive area를 백분율(%)로 환산하여 나타내었다.
도 17과 같이, 마우스의 간 조직을 H&E 염색을 통해 조직을 분석한 결과 정상군은 간세포 조직의 촘촘한 정상 형태로 지방방울(fat droplet)없는 것으로 관찰되었다. 그러나, 비알콜성 지방간염을 유도한 마우스의 간 조직에서는 정상군에 비해 지방방울의 형성이 다수로 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. 지방방울의 형성은 모든 투여 그룹에서 비알콜성 지방간염 유도 그룹대비 감소된 것을 관찰하였으며 실리마린과 EB-FPDK11 균주 투여군에서 더욱 촘촘한 형태로 지방방울이 감소된 것을 확인하였다.
도 18과 같이, 마우스의 간 조직을 Sirius red 염색을 통해 콜라겐 침착량을 분석하였다. 간의 콜라겐 침착량은 섬유화 정도를 반영하는 민감한 지표로 알려져 있다. 본 실험에서 정상군 대비 비알콜성 지방간염 유도군, 실리마린 투여군, 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주 투여군 모두에서 간 섬유화가 증가하였다. 그러나, 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주 투여군의 경우 비알콜성 지방간염과 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주 투여군 대비 콜라겐 생성이 유의미하게 억제되어 간의 섬유화로 인한 간손상이 현저히 억제된 것을 확인하였다.
또한 마우스의 간 조직을 α-SMA 의 발현 염색을 통해 간 손상의 정도를 관찰한 결과, 도 19에서 확인하는 바와 같이, 모든 투여그룹에서 비알콜성 지방간염 유도군 대비 α-SMA 의 발현이 감소되어 간손상이 억제된 것으로 관찰되었으며, 실리마린과 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주 투여군의 경우 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165 표준균주 투여군 대비 α-SMA 의 발현이 더욱 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.
5.7. 간조직내 중성지방 및 총콜레스테롤 분석
마우스의 간조직 내 지질 추출물로 중성지방과 총콜레스테롤을 분석하였다. 간조직 30mg에 PBS를 120μl 넣고 호모게나이저를 이용하여 분쇄 후, Chloroform 320 μl와 MeOH 160 μl를 넣어 혼합물을 만들었다. 상기 혼합물을 상온에서 하룻동안 쉐이킹 인큐베이터로 섞어준 후 2000 rpm으로 원심분리하고 상층액만 따로 분리하여 용매를 증발시켰다. 그 후 상기 용매를 증발시킨 상층액을 1 ml의 isopropanol로 녹인 후, TG, TC 측정키트(아산제약, 한국)를 사용하여 마우스의 전체 간 무게 대비로 환산하여 정량하였다.
그 결과, 도 20의 그래프와 같이 간조직 내 중성지방의 경우 비알콜성 지방간염 유도 그룹에서 유의미하게 증가한 것을 확인하였다. 그러나 실리마린, 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165, 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주를 투여한 그룹에서는 중성지방이 유의미하게 감소하였다. 간조직 내 총콜레스테롤의 경우에도, 비알콜성 지방간염 유도 그룹에서 정상군 대비 높은 수치을 보였다. 그러나 실리마린, 피칼리박테리움 프로스니치 A2-165, 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주를 투여하였을 때, 비알콜성 지방간염 유도군 대비 간조직 내 총콜레스테롤의 수준이 현저히 감소하였다.
간조직 내 지질축적의 분석 결과, 실리마린과 더불어 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주의 섭취가 중성지방과 콜레스테롤의 생성을 가장 많이 억제하였고, 비알콜성 지방간염 개선 효능이 있다는 것을 확인하였다.
간조직의 분석 결과, 전체적으로 피칼리박테리움 프로스니치 EB-FPDK11 균주 투여군에서 비알콜성 지방간염으로 인해 유도된 간손상과 지방간염의 진행이 가장 억제된 것을 확인하였다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Faecalibacterium prausnitzii EB-FPDK11 16S rRNA
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgcgc ctaacacatg caagtcgaac gagcgagaga gagcttgctt 60
tctcgagcga gtggcgaacg ggtgagtaac gcgtgaggaa cctgcctcaa agagggggac 120
aacagttgga aacgactgct aataccgcat aagcccacag gtcggcatcg accagaggga 180
aaaggagcaa tccgctttga gatggcctcg cgtccgatta gctagttggt gaggtaacgg 240
cccaccaagg caacgatcgg tagccggact gagaggttga acggccacat tgggactgag 300
acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc 360
tgatgcagcg acgccgcgtg gaggaagaag gtcttcggat tgtaaactcc tgttgttgag 420
gaagataatg acggtactca acaaggaagt gacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480
aaaacgtagg tcacaagcgt tgtccggaat tactgggtgt aaagggagcg caggcgggaa 540
gacaagttgg aagtgaaatc tatgggctca acccataaac tgctttcaaa actgtttttc 600
ttgagtagtg cagaggtagg cggaattccc ggtgtagcgg tggaatgcgt agatatcggg 660
aggaacacca gtggcgaagg cggcctactg ggcaccaact gacgctgagg ctcgaaagtg 720
tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacacc gtaaacgatg attactaggt 780
gttggaggat tgaccccttc agtgccgcag ttaacacaat aagtaatcca cctggggagt 840
acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagca gtggagtatg 900
tggtttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaagtct tgacatccct tgacgaacat 960
agaaatgtgt tttctcttcg gagcaaggag acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttactgtca gttactacgc 1080
aagaggactc tggcaggact gccgttgaca aaacggagga aggtggggat gacgtcaaat 1140
catcatgccc tttatgactt gggctacaca cgtactacaa tggcgttaaa caaagagaag 1200
caagaccgcg aggtggagca aaactcagaa acaacgtccc agttcggact gcaggctgca 1260
actcgcctgc acgaagtcgg aattgctagt aatcgtggat cagcatgcca cggtgaatac 1320
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gccgggggga cccgaagtcg 1380
gtagtctaac cgcaaggagg acgccgccga aggtaaaact ggtgattggg gtg 1433
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP1 Forward
<400> 2
actcaacaag gaagtga 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP2 Reverse
<400> 3
cagaggtagg cggaatt 17
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERIC-1 Forward
<400> 4
atgtaagctc ctggggattc ac 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERIC-2 Reverse
<400> 5
aagtaagtga ctggggtgag cg 22
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> (GTG)5 Forward/Reverse
<400> 6
gtggtggtgg tggtg 15
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 27F Forward
<400> 7
agagtttgat cmtggctcag 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 8
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Forward
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gacatcaaga aggtggtgaa gcag 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Reverse
<400> 14
ataccaggaa atgagcttga caaa 24
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<210> 19
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<220>
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<400> 19
aggggtcgac ctggtcctca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> FAS Reverse
<400> 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACC1 Forward
<400> 21
cctccgtcag ctcagataca 20
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
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<400> 22
tttactaggt gcaagccaga ca 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LPL Forward
<400> 23
ttgccctaag gacccctgaa 20
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LPL Reverse
<400> 24
acagagtctg ctaatccagg aat 23
Claims (7)
- 수탁번호 KCCM12621P인 피칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii) EB-FPDK11 균주.
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 비알콜성 지방간염, 간섬유증, 간경화증, 급성 또는 만성 간염, 지방간 또는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 고지혈증, 비만, 고혈압 또는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 비알콜성 지방간염, 간섬유증, 간경화증, 급성 또는 만성 간염, 지방간 또는 간암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 고지혈증, 비만, 고혈압 또는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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