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CN105209611B - 新型葡糖氧化酶变体 - Google Patents

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CN105209611B CN201480023331.5A CN201480023331A CN105209611B CN 105209611 B CN105209611 B CN 105209611B CN 201480023331 A CN201480023331 A CN 201480023331A CN 105209611 B CN105209611 B CN 105209611B
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Abstract

本文提供的技术涉及具有改进性质的新型微生物葡糖氧化酶变体，更具体地涉及具有葡糖氧化酶活性作为其主要酶活性的多肽；涉及编码所述葡糖氧化酶的核酸分子；含有该核酸的载体和宿主细胞和用于生产该葡糖氧化酶的方法；包括所述葡糖氧化酶的组合物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品饲料加工的方法、用于测量临床样品和生物反应器中的游离葡萄糖的方法和开发微型生物燃料电池的方法。

Description

新型葡糖氧化酶变体
技术领域
本文提供的技术涉及具有改进性质的微生物葡糖氧化酶的新变体，更具体地涉及具有葡糖氧化酶活性作为其主要酶活性的多肽；涉及编码所述葡糖氧化酶的核酸分子；含有该核酸的载体和宿主细胞和用于生产该葡糖氧化酶的方法；包括所述葡糖氧化酶的组合物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品饲料加工的方法、用于测量临床样品和生物反应器中的游离葡萄糖的方法和开发微型生物燃料电池的方法。
背景技术
葡糖氧化酶(β-D-葡萄糖:氧1-氧化还原酶；EC 1.1.2.3.4)通过利用分子氧作为电子受体催化β-D-葡萄糖氧化成葡糖酸，同时产生过氧化氢。微生物葡糖氧化酶近来因其在化学、药物、食品、饮品、临床化学、生物技术和其它工业领域的多样化应用而备受关注。近年来对葡糖氧化酶在生物传感器中的新应用的需求增强。葡糖氧化酶已从各种微生物来源中分离。
黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖氧化酶被用在例如食品加工和制药工业中，并且用作医学诊断领域中免疫测定和生物传感器的组分。该酶还用于制造可为生物医学植入物如生物传感器和胰岛素泵供能的微型生物燃料电池。这些装置的输出受到葡糖氧化酶在阳极室内性能的限制。
特别地，生物燃料电池领域中涉及三种酶学性质：(1)从电极向酶的电子转移速率(固有酶活性)；(2)酶在生理条件(pH 7.4和5mM葡萄糖)下的活性；和(3)酶的热稳定性。
WO89/126675记载了重组体系中从黑曲霉生产葡糖氧化酶，WO2008/079227 A1涉及赋予了改进的储存稳定性的从黑曲霉获得的葡糖氧化酶组合物。已公开了不同来源的葡糖氧化酶，包括海藻类如角叉菜(Chondrus crispus)(US 7544795,US 6924366)、丝状真菌如枝孢菌属(Cladosporium spp.)(WO 95/29996,WO 1998/020136,US 5834280)和黄蓝状菌(Talaromyces flavus)(US 6054318)。WO2012/017008 A1公开了与野生型葡糖氧化酶相比具有改变的酶促效率的黑曲霉葡糖氧化酶的变体。
然而，获得具有针对众多应用的性质改进的葡糖氧化酶将是非常有利的。
发明内容
根据本公开的改进的葡糖氧化酶可用于包括从食品和饮品中除去氧、生成过氧化氢用于防腐、临床样品和生物反应器中游离葡萄糖的测定以及微型生物燃料电池的开发在内的诸多应用。因此多种工业过程能够受益于根据本公开的葡糖氧化酶的改进变体的使用。
第一方面，本公开的实施方案提供具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包括在对应于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基T30、I94、A162位置处的变异，和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、V106、V293或E310位置处的至少一个或多个其它变异，和其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少具有至少80％的最小序列同一性百分比和/或同源性百分比。
在另一方面，本公开的实施方案涉及选自由下述组成的组的核酸分子：
a)编码根据权利要求1至15任一项所述的多肽的核酸分子；
b)编码其中一个或多个氨基酸残基被保守性取代的根据权利要求1至15任一项所述的多肽的核酸分子；
c)作为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14所示核酸分子的部分、变体、衍生物或片段的核酸分子；
d)或任意核酸分子a)-c)的互补体。
在另一方面，本公开的实施方案涉及包括根据本公开的核酸分子的载体，并涉及转化、转导或转染有所述载体的宿主细胞。
还在另一方面，本公开的实施方案提供具有葡糖氧化酶活性的多肽的生产方法，所述方法包括下列步骤：(a)在适合的培养基中在适合的条件下培养根据本公开的宿主细胞以产生具有葡糖氧化酶活性的多肽；(b)得到所述产生的多肽，和任选地(c)加工所述多肽。
在另一方面，本公开的某些实施方案涉及包括根据本公开的多肽的组合物，特别涉及食品组合物、药物组合物、诊断组合物或化妆品组合物。
还在另一方面，某些实施方案提供样品中葡萄糖的测定方法，其中将样品与根据本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽接触放置，并测定被葡糖氧化酶氧化的葡萄糖的量。
另外，某些实施方案有关于样品中葡萄糖的测定装置和试剂盒，其包括根据本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽和电子介质(electron mediator)。
此外，某些实施方案涉及酶电极，其具有固定化在电极上的根据本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽。
另外，某些其它实施方案有关于测定葡萄糖的酶传感器，其包括根据本公开的酶电极作为工作电极。
在另一方面，实施方案涉及使用根据本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽用于食品加工。
特别地，在本公开的另一方面的实施方案中，有关于经修饰的葡糖氧化酶，其包括在来自黑曲霉的天然存在的野生型葡糖氧化酶的氨基酸序列中在相对于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)编号为556和537或37的位置处的至少三个氨基酸残基的取代，和至少在对应于氨基酸残基556和537或者37和106位置处的取代，和其中所述经修饰的葡糖氧化酶具有比野生型酶高的固有活性。
在详细说明本公开之前，要理解的是，本公开不限于所记载的装置的特定构成要件或所记载的方法的工序，因为这些装置和方法是可以更改的。还 要理解的是，本文所用术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不意欲受其限制。必须注意的是，如说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文中有明确规定，否则单数形式的"一个/一种"("a"、"an")和"所述/该"("the")包括单个和/或多个参照对象。还要理解的是，如果参数范围以数值限定给出，该范围视为包括这些极限值。
附图说明
图1为示出根据本公开的GOx变体在pH5.5下的酶动力学的图。
图2为示出根据本公开的GOx变体在pH7.4下的酶动力学的图。
具体实施方式
本文公开的是葡糖氧化酶(β-d-葡萄糖:氧1-氧化还原酶EC 1.1.2.3.4)的酶变体，特别是包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型黑曲霉葡糖氧化酶的变体，和编码所述葡糖氧化酶变体的核酸分子，可用于包括食品加工和药品制造等工业应用，以及医学诊断领域中免疫测定和生物传感器的组分。酶变体还可用于制造可为生物医学植入物如生物传感器和胰岛素泵供能的微型生物燃料电池。
特别地，根据本公开的葡糖氧化酶变体与野生型和亲本葡糖氧化酶相比显示改进的催化效率和/或改进的稳定性能如热稳定性和/或pH稳定性。这些特性使其在工业和诊断应用中特别有用。
一般而言，本公开有关于具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包括在对应于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基T30和I94位置处的变异，和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、A162、V106、V293或E310位置处的至少一个或多个其它变异，和其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其变体、修饰型、同源物、融合蛋白、功能等价物和片段至少具有至少80％的最小序列同一性百分比和/ 或同源性百分比。
例如，根据本公开的同源多肽包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13具有至少70％或优选至少80、85％、90％、95％、97％或99％的序列同一性百分比且包括在对应于氨基酸残基T30和I94位置处的变异和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、A162、V106、V293或E310位置处的至少一个或多个其它变异的任意活性葡糖氧化酶。
本公开披露了一种葡糖氧化酶，其具有衍生自SEQ ID NO：1示出的氨基酸序列或其变体、修饰型、同源物、融合蛋白、功能等价物和片段的氨基酸序列，在对应于氨基酸残基T30和I94位置处和在选自与M556、R537、R37、A162、V106、V293或E310结构上对应或氨基酸序列同源的位置组中的一个或多个位置处的变异。
如本文所使用的，"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可互换使用，且所有这类的命名都包括子代。因此，词语"转化子"或"转化细胞"包括原代受试细胞和由其产生的培养物，而不考虑传代的次数。还要理解的是，所有子代由于有意或非有意突变而可能在DNA含量上并不能完全一致。与原始转化细胞中筛选出的具有相同功能的突变子代包括在内。
如本文所使用的术语"互补"指两个核酸序列之间的关系。一个核酸序列如果能够与第二个核酸形成二倍体，则其与第二个核酸序列互补，其中二倍体的各残基形成鸟苷-胞苷(G-C)或腺苷-胸苷(A-T)碱基对或等同的碱基对。等同的碱基对可包括除鸟苷、胞苷、腺苷或胸苷以外的核苷或核苷类似物。
如本文所使用的短语"对应于……的位置"意指使用Vector NTI的AlignX软件(获自Invitrogen；参见Lu,G.和Moriyama,E.N.(2004)Vector NTI,a balanced all-in-onesequence analysis suite.Brief Bioinform 5,378-88)在默认参数下查询氨基酸序列中与参考氨基酸序列中的氨基酸残基相比对的氨基酸残基的位置。因此，"对应于SEQ ID NO:X示出的氨基酸序列的Y位置的位置处的氨基酸(AA)残基"意指当使用Vector NTI的AlignX在默认参数下将待查 询的氨基酸序列与SEQ ID NO:X比对时，待查询的氨基酸序列中与SEQ ID NO:X的氨基酸Y比对的氨基酸残基。应当注意的是，此术语也包括SEQ ID NO:X的氨基酸Y本身。本公开的突变葡糖氧化酶显示增加的氧化酶活性，同时基本上保留和/或增加酶稳定性，特别是热稳定性。
如本文使用的"活性"或"催化活性"定量描述了在规定反应条件下给定底物的转化。术语"残效"定义为特定条件设置下酶催化活性与不同条件设置下催化活性之比。术语"比活"或"固有活性"定量描述了在规定反应条件下相对于酶量的催化活性。特别地，氧化酶活性描述了葡糖氧化酶利用氧作为电子受体催化葡萄糖氧化生成葡糖酸内酯的酶促活性。例如，氧化酶活性可用本公开实施例中记载的测定方法来测定(参见实施例7)。如前所述，本文使用的葡糖氧化酶的"活性"可涉及其催化氧化反应D-葡萄糖+O2→葡糖酸内酯+H2O2的能力的测量，并可表示为反应产物生成的速率。例如葡萄糖氧化酶活性可表示为每单位时间或每单位葡糖氧化酶(如浓度或重量)所生成的产物的量(葡糖酸内酯和/或H2O2)。
根据本公开通过GOx变体改进的活性特别是固有活性(比活)，而且还是一般活性。如本文所使用的"Kcat"意指高浓度底物(饱和条件)下的反应速度除以酶浓度(每酶单位)。"Km"定义为酶达到最大速度时的底物浓度，但其与非饱和底物条件下、也就是低葡萄糖浓度下的反应速度相关。"Kcat/Km"是特异性常数并总结了2种性质。在有利的实施方案中，根据本公开所有改进的GOx变体与野生型变体相比示出提高的kcat和更好的km(以及相应的kcat/km)。
根据本发明的术语"酶"意指完全或主要由蛋白质或多肽组成的、不同程度特异性催化或促进一种或多种化学或生物化学反应的任何物质。术语"酶"还可指催化性多核苷酸(如RNA或DNA)。
术语"氧化反应"通常指参与氧加成到底物形成含氧的(oxygenated)或氧化底物或产物的化学或生物化学反应。氧化反应典型地伴随还原反应(因此术语"氧化还原(redox)"反应针对的是氧化和还原)。化合物在接受氧或失去电子时被"氧化"。如上所述，葡糖氧化酶典型地将伯醇基团催化氧化成醛。
术语"葡糖氧化酶"或"GOx"特指将β-D-葡萄糖催化氧化成D-葡糖酸-1,5-内酯(D-葡萄糖+O2→葡糖酸内酯+H2O2)的蛋白质，D-葡糖酸-1,5-内酯接着可水解成葡糖酸。因此，葡糖氧化酶为一种酶。另外，术语"具有葡糖氧化酶活性的多肽"是指具有之前提到的活性的多肽。葡糖氧化酶因此为通过将氧从来源或供体加成、插入、供给或转移至底物来催化氧化反应的氧化酶类的成员。此类酶还称为氧化还原酶类(oxidoreductases)或氧还酶类(redox enzymes)，并包括加氧酶、氢化酶或还原酶、氧化酶和过氧化酶。就这一点而言，术语"氧供体"、"氧化试剂"和"氧化剂"指的是在氧化反应中向底物供氧的物质、分子或化合物。典型地，氧供体被还原(接受电子)。氧供体的实例没有限定，包括分子氧或双氧(O2)和过氧化物，过氧化物包括烷基过氧化物如过氧化叔丁基等，最优选过氧化氢(H2O2)。过氧化物为具有彼此键合的两个氧原子的任意化合物。
根据本公开的核酸分子编码具有改进的动力学性质和/或稳定性、特别是酶在葡萄糖生成葡糖酸内酯和H2O2反应中的热稳定性的、衍生自来自黑曲霉的葡糖氧化酶(GOx)(SEQ ID NO:1)的多肽或其片段。来自黑曲霉的葡糖氧化酶为良好性质的蛋白质，其形成二聚体，大小为160kDa，且晶体已被解析(Hecht HJ等人，Crystal structure of glucoseoxidase from Aspergillus niger refined at 2.3Angstrom resolution.Journal ofMolecular Biology 1993:229(1)153-172)。
术语"葡糖氧化酶变体"、"经修饰的葡糖氧化酶"或"葡糖氧化酶突变体"是指例如通过定点或随机突变、插入、缺失、重组和或使葡糖氧化酶与对应的野生型葡糖氧化酶的氨基酸序列不同的任何其它蛋白质工程方法得到的任何葡糖氧化酶。根据本公开的术语"野生型葡糖氧化酶"、"野生型酶"、或"野生型"描述了具有自然界中发现的氨基酸序列的葡糖氧化酶或其片段。
如本文所使用的术语"亲本葡糖氧化酶"、"亲本"或"亲本GOx"是指包括SEQ IDNO:3(含有在对应于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基T30V、I94V和A162T位置处的取代)的氨基酸序列的葡糖氧化 酶，或包括含有在对应于氨基酸残基T30V和I94V位置处的取代的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的葡糖氧化酶。
如本文所使用的术语"衍生物"，作为根据所要求保护的序列之一的核酸分子，是指具有与靶核酸序列类似的结合特性的核酸分子。
术语"表达克隆"是指以可操作连接的方式含有期望的编码序列和调控序列的DNA序列，以使转化有这些序列的宿主能够产生所编码的蛋白质。术语"表达系统"是指转化有表达克隆的宿主。为了有效转化，表达克隆可包括在载体上；然而，相关的DNA也可整合到宿主染色体中。
术语"融合蛋白"包括衍生自通过在C-和/或N-末端共价融合其它氨基酸序列而得的根据本公开的经修饰的葡糖氧化酶的所有蛋白质。其它氨基酸序列的来源和组成为来自任何活体或病毒的自然物质、或非自然物质。特别地，融合蛋白可为由其生产方法或其结构限定的"重组"多肽。关于重组多肽的生产方法，重组多肽通过涉及使用重组核酸技术的方法制得。关于结构，重组多核苷酸或多肽含有来自不同来源的序列。特别地，包括由生成包括彼此并不是自然连续的或可操作地连接的两个以上的片段的序列所制得的多肽。因此，例如，通过用任何非天然存在的载体转化细胞制得的产物包括在内。
术语"功能片段"或"有效片段"意指根据本公开的葡糖氧化酶变体的、保留大致相同的改进酶促功能或效果和/或相同的热稳定性的片段或部分。
术语"基因"是指包括产生可回收的生物活性多肽或前体所必须的控制和编码序列的DNA序列。
根据本公开的术语"同源多肽"或"同源物"包括与包括功能片段或有效片段在内的根据本公开的葡糖氧化酶的序列同一性为至少70％或优选至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的任意酶。
术语"核酸分子的同源物"是指核酸分子，其序列与根据所要求保护的序列之一的核酸分子相比具有一个或多个核苷酸添加、删除、置换或其它化学修饰，无论何种情况，同源物保留实质上与后者相同的酶促和/或稳定性质。
与本公开相关的术语"宿主细胞"包括含有如上所述的核酸分子或表达 载体的任何细胞，且用于异源生产具有本文限定的特殊性质的酶，或者用于本公开的方法中。
术语"分离的"描述了任何分子从其天然来源分离。
术语"修饰型"或"变体"意指酶已从其原始形式(亲本/野生型，wt)进行了修饰但至少保留了与野生型酶相同的酶的功能特性。
本文所使用的术语"修饰"或"变异"是指例如在氨基酸序列中的特定位置取代、插入或删除氨基酸残基以及多肽上特定位置的磷酸化、乙酰化、棕榈酰化、甲基化、硫酸化、糖基化、脂化、异戊二烯化、法尼基化、连接脂肪酸部分、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)和/或泛素化，或其组合。在有利的实施方案中，变异为取代。
术语"突变"是指单个或多个核苷酸的置换或替换、一个或多个三联体/密码子的插入或缺失、不同基因之间的同源或异源重组、其它编码序列在编码序列各端的融合、或其它编码序列的插入，或者这些方法的任意组合，这产生编码期望蛋白质的多核酸序列。因此，术语"突变"还指由经一种或多种上述变化修饰的多核酸序列编码的多肽序列中的所有变化。氨基酸残基根据下表1缩写为单字母或三字母代码。
术语"核酸分子"或"核酸"意欲表示cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA、肽核酸(PNA)或LNA来源的任意单链或双链核酸分子。
如本文所述的术语"寡核苷酸"定义为包括两个以上的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。准确的大小将依赖于多种因素，而这反过来也依赖于寡核苷酸的最终的功能或用途。寡核苷酸可通过任意适合的方法制备，包括例如适当序列的克隆和限制，以及通过诸如磷酸三酯法、二乙基亚磷酰胺(diethylphosphoramidite)法和固相支持法等方法的直接化学合成。合成方法的综述详见Goodchild J,Bioconjug.Chem.(1990)165-187。
术语"质粒"、"载体体系"、"载体"或"表达载体"意指能够体内或体外表达的构建体。在本公开的背景下，这些构建体可用于将编码酶的基因导入宿主细胞。
关于两个氨基酸或多核苷酸序列的"序列同一性百分比"是指当最佳化比对序列时两个序列中同一的残基的百分比。因此，80％的氨基酸序列同一性意指两个最佳化比对的多肽序列中80％的氨基酸是同一的。同一性百分比可例如通过借助于比对序列直接比较两个分子之间的序列信息、计算两个比对序列之间准确的匹配数、除以较短序列的长度、并将结果乘以100来确定。容易获得的计算机程序可用于辅助分析，例如ALIGN,Dayhoff,M.O.("Atlas of Protein Sequence and Structure",M.O.Dayhoff编辑,Suppl.3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,DC)，其改编Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法来分析肽(Advances in Appl.Math.2:482-489)。确定核苷酸序列同一性的程序可获自Wisconsin序列分析软件包(Wisconsin Sequence AnalysisPackage)第8版(购自Genetics Computer Group,Madison,Wl)，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，其同样依赖于Smith和Waterman算法。利用制造商推荐的默认参数5容易地利用这些程序，并且记载于上文提及的Wisconsin序列分析软件包。适于确定序列相似度的算法的实例为BLAST算法，其记载于Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
术语"多核苷酸"对应于任意长度和任意序列的任意遗传物质，包括单链和双链DNA和RNA分子，包括调控元件、结构基因、基因簇、质粒、整个基因组及其片段。
多核苷酸或多肽中的术语"位置"是指分别在多核苷酸或多肽序列中特定的单个碱基或氨基酸残基。
术语"严格条件"涉及探针将与其靶序列杂交而不与其它序列杂交的条件。严格条件为序列依赖性并且在不同环境下将不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。
一般而言，选择严格条件为在规定的离子强度和pH下低于特定序列的热力学熔点(Tm)约5℃。Tm为50％的与靶序列互补的探针以平衡状态与靶序列 杂交时的温度(规定的离子强度、pH和核酸浓度)。(由于靶序列一般过量存在，在Tm下，50％的探针以平衡状态被占据)。典型地，严格条件为其中在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M的Na离子、典型地约0.01至1.0M的Na离子(或其它盐)并且对于短探针(如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃和对于长探针温度为至少约60℃下的那些条件。添加去稳定剂(destabilizing agents)如甲酰胺也可实现严格条件。
如本文使用的术语"热稳定酶"、"热稳定葡糖氧化酶"或"热稳定多肽"是指对热稳定且在暴露于高温之后保持高活性的酶。通过将酶在60℃、无底物下温育在50mM的醋酸盐缓冲液(pH 5.5)中并使用ABTS测定来测量周期时间的等分试样(periodic aliquots)的残效，确定根据本公开的葡糖氧化酶突变体或变体的热稳定性("thermal stability"或"thermo stability")(参见实施例8)。
术语"核酸分子的变体"此处是指与根据所要求保护的序列之一的核酸分子的结构和生物学活性实质上相似的核酸分子。
表1：氨基酸缩写
突变或变异使用下列命名法描述：位置；取代的一个(或多个)氨基酸残基。根据该命名法，例如20位的丙氨酸残基取代为甘氨酸残基表示为20G。当给定位置处的氨基酸残基被两个或多个可选的氨基酸残基取代时，这些残基由逗号或斜线分隔。例如，20位的丙氨酸被甘氨酸或谷氨酸取代表示为20G/E，或20G,20E。
此外，也可使用下列命名法：蛋白质骨架中的氨基酸残基；位置；取代的一个(或多个)氨基酸残基。根据该命名法，例如20位的丙氨酸残基取代为甘氨酸残基表示为Ala20Gly或A20G，或20G。同一位置中丙氨酸的删除示为Ala20*或A20*。其它氨基酸残基(如甘氨酸)的插入表示为Ala20AlaGly或A20AG。连续的一段氨基酸残基(如，20位的丙氨酸和21位的甘氨酸)的删除表示为Δ(Ala20-Gly21)或Δ(A20-G21)。当序列与用于编号的亲本蛋白质相比含有缺失时，此类位置中的插入(如删除的20位中的丙氨酸)表示为*20Ala或*20A。多个突变由多个加号或斜线分隔。例如，20和21位将丙氨酸和谷氨酸分别取代为甘氨酸和丝氨酸的两个突变表示为A20G+E21S或A20G/E21S。当本文鉴定了适合于修饰的位置而没有建议任何具体的修饰时，应理解为任意氨基酸残基都可取代存在于该位置的氨基酸残基。因此，例如当提到20位丙氨酸修饰但没有具体化时，应理解的是，丙氨酸可被删除或被取代为任意其它氨基酸残基(即，R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V任一种)。
术语"保守性突变"或"保守性取代"分别是指本领域技术人员将会考虑第一次突变为保守的氨基酸突变。此背景下的"保守性"意指在氨基酸特性类似的氨基酸。如果例如突变导致特定位置的非脂族氨基酸残基(如Ser)被脂族氨基酸残基(如Leu)取代，那么同一位置取代有不同脂族氨基酸(如Ile或Val)便称作保守性突变。另外，氨基酸特性包括残基大小、疏水性、极性、电荷、pK值和本领域已知的其它氨基酸特性。因此，保守性突变可包括如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等取代。由此衍生的氨基酸组因结构性原因可能是保守的。这些组可以以维恩图(Livingstone CD.和Barton G.J.(1993)的形式描 述"Protein sequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis ofresidue conservation"Comput.Appl Biosci.9:745-756；Taylor W.R.(1986)"Theclassification of amino acid conservation"J.Theor.Biol.119；205-218)。保守性取代可例如根据下表进行，下表描述了将氨基酸分组的普遍接受的维恩图。
表2:氨基酸分组的维恩图
还要理解的是，本公开包括源于公开的多核苷酸的所有分子及其在本申请中记载的通过与遗传编码的氨基酸序列相比经翻译后加工的所有变体。这些翻译后修饰包括，但不限于，N末端序列如前导序列和/或前序列(pro-sequences)的蛋白水解裂解、C末端延伸的蛋白水解去除、N-和/或O-糖基化、脂化、酰化、脱酰胺化、焦谷氨酸形成、磷酸化和/或其它，或者其任意组合，它们在由天然宿主或任意适合的表达宿主生产/表达期间发生。这些翻译后修饰对本文所探究的酶的生理或酶学特性可能具有或可能没有影响。
如上所述，本公开有关于具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包括在对应于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基T30、I94位置处的变异，和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、A162、V106、V293或E310位置处的至少一个或多个其它变异，且其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少具有至少80％的最小序列同一性百分比。
在有利的实施方案中，所述多肽至少包括在对应于氨基酸残基T30、I94、A162位置处的变异和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、V106、V293或E310位置处的至少一个或多个变异。
在另一有利的实施方案中，所述多肽包括至少在对应于氨基酸残基T30、 I94、A162位置处的变异和至少在氨基酸残基M556位置处的变异，特别组合有在对应于如SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的氨基酸残基R537位置处的变异。
在有利的实施方案中，所述多肽包括至少在对应于氨基酸残基T30、I94、A162位置处的变异和至少在氨基酸残基R37位置处的变异，特别组合有在对应于如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸残基R37和V106位置处的变异。
在有利的实施方案中，所述多肽包括至少在对应于氨基酸残基T30、I94、A162位置处的变异和至少在氨基酸残基V106位置处的变异和/或至少在对应于如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸残基V293位置处的变异。
在有利的实施方案中，所述多肽包括至少在对应于氨基酸残基T30、I94、A162位置处的变异和至少在对应于如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸残基E310位置处的变异。
在前述的根据本公开的葡糖氧化酶中，所述变异为选自由T30V、I94V、R37K、V106I、A162T、V293I、E310D、R537K和M556V、或其组合组成的组的取代。
与野生型酶相比具有改进的葡糖氧化酶活性的多肽的优选实例包括选自由下述组成的组的取代：
a)M556V、R537K、T30V、I94V
b)M556V、R537K、T30V、I94V、A162T
c)M556V、R537K、R37K、V293I、E310D、T30V、I94V、A162T
d)M556V、R37K、V106I、T30V、I94V、A162T
e)R37K、V106I、T30V、I94V、A162T。
表3示出了根据本公开的有利的突变葡糖氧化酶变体的列表，包括在对应于SEQID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸残基位置处的变异。
表3：SEQ ID NO:1中的有利取代
本公开的有利实施方案有关于具有葡糖氧化酶活性的多肽，所述多肽包括选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13组成的组的氨基酸序列，特别是包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽，其中，相对于野生型酶和亲本GOx，多肽具有改进的葡糖氧化酶活性(kM、kcat和/或kcat/kM)和/或改进的热稳定性。
在有利的实施方案中，根据本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽在pH5.5下的活性比亲本GOx提高至少1.2、至少1.4、至少1.5、至少1.6或至少1.7倍和/或在pH5.5下的活性比亲本GOx提高至少1.2、至少1.4、至少1.5、至少1.6或至少1.7。
在另一有利实施方案中，根据本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽在pH7.4下的活性比野生型GOx提高至少3、至少3.5和至少4倍和/或比野生型GOx提高至少2.5、至少3、至少4、至少5或至少5.8倍。
本公开还有关于包括上述变异的多肽，特别是氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少具有85％、至少90％、至少93％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的最小序列同一性百分比。
本公开的实施方案还包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13中示出的任意葡糖氧化酶的变体，特别是具有葡糖氧化酶活性的包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽，和与序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13中示出的各葡糖氧化酶变体相比具有至少50％、至少60％、 至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性百分比。
本公开进一步的实施方案为选自由下述组成的组的核酸分子：
e)编码根据本公开的多肽的核酸分子；
f)编码其中一个或多个氨基酸残基被保守性取代的根据本公开的多肽的核酸分子；
g)作为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14所示核酸分子的变体、同源物、衍生物或片段的核酸分子；
h)能够在严格条件下与任意核酸分子a)-c)杂交的核酸分子；
i)能够在严格条件下与任意核酸分子a)-d)的互补体杂交的核酸分子；
j)与任意酸分子a)-e)具有至少95％的序列同一性且编码具有改进的葡糖氧化酶活性和/或热稳定性的多肽的核酸分子；
k)与任意酸分子a)-e)具有至少85％的序列同一性且编码具有改进的葡糖氧化酶活性和/或热稳定性的多肽的核酸分子；
I)或任意核酸分子a)-g)的互补体。
在本公开的一个实施方案中，与野生型GOx或亲本GOx酶相比葡糖氧化酶显示特别改进的热稳定性且同时改进或保留固有活性。这些特性使其在食品加工或其它工业或诊断应用中特别有用。
本公开进一步的实施方案为包括编码根据本公开的葡糖氧化酶变体的核酸分子的载体、表达克隆和宿主细胞。
进一步的实施方案为用于制备根据本公开的葡糖氧化酶变体的方法，所述方法包括培养转化、转导或转染的宿主细胞并从培养物中分离修饰的葡糖氧化酶。
因此，本公开还包括含有编码突变的葡糖氧化酶的多肽的载体、转染有该载体的宿主细胞、和通过培养转化子、从培养物收集并纯化突变的葡糖氧化酶来制备本发明的突变的葡糖氧化酶的方法。
本公开还包括样品中葡萄糖的测定方法，其通过将样品与本公开的葡糖 氧化酶与样品接触放置，并测定被葡糖氧化酶氧化的葡萄糖的量。在另一方面，本公开提供样品中葡萄糖的测定装置，其包括本公开的葡糖氧化酶和电子介质。
测定装置可具有与任意常规、商购可得的用于监测血糖水平的测量电流的生物传感器试验条类似的结构。此类装置的一个实例具有位于绝缘基板上的两个电极(工作电极和参比电极或对电极)、试剂端口和样品接收器。试剂端口含有本公开的突变的葡糖氧化酶和介质。当将样品如血样添加到样品接收器时，样品中含有的葡萄糖将与葡糖氧化酶反应产生电流，这指示样品中葡萄糖的量。例如由WO 2004/113900和US 5,997,817已知适用于酶底物测定的电化学传感器的典型实例。作为电化学传感器的可选方案，可使用光学检测技术。典型地，此类光学装置基于发生在包括酶、电子介质和指示剂的试剂体系中的颜色变化。颜色变化可使用荧光、吸附或发光测量来定量。由例如US 7,008,799、US 6,036,919和US 5,334,508已知适用于酶底物测定的光学装置的典型实例。
还在另一方面，本公开提供样品中葡萄糖的测定试剂盒，其包括本公开的葡糖氧化酶和电子介质。
葡萄糖测定用试剂盒可使用本公开的酶来构建。除了本公开的葡糖氧化酶以外，试剂盒还包含测定所必须的缓冲液、适合的介质和必要时的诸如过氧化物酶等酶类、校准曲线制备用葡萄糖标准液以及使用说明。本发明的葡糖氧化酶可以各种形式提供，例如为冷冻干燥试剂或者为适当储存液中的溶液。
另一方面，本发明提供具有固定化在电极上的本发明葡糖氧化酶的酶电极。
另一方面，本公开提供用于测定葡萄糖的酶传感器，其包括本公开的酶电极作为工作电极。在有利的实施方案中，传感器为一次性传感器。
样品中葡萄糖的浓度可通过测量酶反应生成的电子的量来确定。本领域中已记载了各种传感器体系，包括基于碳电极、金属电极和铂电极的体系。 本公开的突变的葡糖氧化酶固定化在电极上。固定用手段的实例包括交联、包埋于大分子基质中、用透析膜包覆、光学交联聚合物、导电聚合物、氧化还原聚合物、或其任意组合。
当使用设置有固定化酶的碳电极、金电极或铂电极在电流测量体系中进行测定时，其作为工作电极与对电极(例如铂电极)和参比电极(例如Ag/AgCl电极)一起使用。将电极插入含有介质的缓冲液并保持在预定的温度下。将预定的电压施加至工作电极，接着添加样品并测量增加的电流。用于测定的介质的实例包括铁氰化钾、二茂铁、锇衍生物、钌衍生物、吩嗪硫酸甲酯、亚硝基苯胺衍生物等。通常还可使用含有一个工作电极和一个对电极或假参比电极的所谓的双电极体系。
另外，可使用碳电极、金电极或铂电极在电流测量体系中使用固定化电子介质来测定葡萄糖。酶与大分子基质中的电子介质(例如铁氰化钾、二茂铁、锇衍生物或吩嗪硫酸甲酯)一起借助吸附或共价结合固定化在电极上来制备工作电极。将其与对电极(例如铂电极)和参比电极(例如Ag/AgCl电极)一起插入缓冲液中，并保持在预定温度下。将预定电压施加至工作电极，接着添加样品并测量增加的电流。
如上所述，本公开的一个实施方案有关于具有葡糖氧化酶活性的多肽的生产方法，所述方法包括下列步骤：(a)在适合的培养基中在适合的条件下培养包括编码根据本公开的葡糖氧化酶变体的核酸分子的宿主细胞以产生具有葡糖氧化酶活性的多肽；(b)得到所述产生的多肽，和任选地(c)加工所述多肽。
为了生产葡糖氧化酶，编码该酶的DNA可由公开的序列化学合成或从含有该基因的宿主细胞中直接获得(例如通过cDNA文库筛选或PCR扩增)。葡糖氧化酶基因可通过标准分子克隆技术包含在表达盒中和/或克隆于适合的表达载体中。此类表达和或载体通常含有辅助起始和终止转录的序列(例如启动子和终止子)，并可含有选择性标记物。盒还可包括正负链mRNA，且它们的表达可包括或可不包括mRNA翻译前的扩增步骤。要表达的葡糖氧化酶基 因可含有或可不含有特定的蛋白质结构域，例如具有各种特异性的聚合物结合结构域(例如，糖类结合结构域)。表达盒或载体可导入适合的表达宿主细胞，接着宿主细胞表达对应的葡糖氧化酶基因。特别适合的表达宿主为细菌表达宿主属，包括埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠杆菌(E.coli))、假单胞菌属(Pseudomonas)(如荧光假单胞菌(P.fluorescens)或施氏假单胞菌(P.stutzerei))、变形杆菌属(Proteus)(如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、罗尔斯通菌属(Ralstonia)(如富养罗尔斯通氏菌(R.eutropha))、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(如肉葡萄球菌(S.carnosus))、乳球菌属(Lactococcus)(如乳酸乳球菌(L.lactis))、和芽孢杆菌书(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))。还特别适合的是酵母表达宿主如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。特别适用的是真菌表达宿主例如金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、曲霉属(Aspergillus)(如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans))或里氏木霉(Trichoderma reesei)。还适用的是哺乳动物表达宿主，例如小鼠(如NSO)、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO))或幼仓鼠肾(baby hamster kidney,BHK)细胞系，转基因哺乳动物体系例如兔、山羊或牛，其它真核宿主例如昆虫细胞或植物，或病毒性表达体系例如噬菌体M13、T7或λ，或真核病毒如杆状病毒。
葡糖氧化酶基因可通过多种转化方法导入表达宿主细胞，所述转化方法包括，但不限于，电穿孔，脂质辅助转化或转染("脂转染")，化学介导的转染(如CaCl和/或CaP)，醋酸锂介导的转化(如宿主细胞原生质体的)，生物射弹(biolistic)"基因枪"转化，PEG-介导的转化(如宿主细胞原生质体)，原生质体融合(如使用细菌或真核原生质体)，脂质体介导的转化，根癌农杆菌、腺病毒或其它病毒或噬菌体转染或转导。
目标蛋白质可分泌至细胞外或细胞周质间隙或者细胞内表达。任选地，在细胞内表达酶变体之后，或者使用例如如上所述的那些信号序列分泌到细胞周质间隙之后，可使用渗透(permeabilisation)或裂解步骤将葡糖氧化酶释放至上清液中。膜屏障的破坏可因使用机械手段如超声波、压力处理(弗氏压碎器)、开孔、或使用消化膜的酶如溶菌酶或酶混合物而受到影响。作为进一步的可选方案，编码葡糖氧化酶的基因通过使用适当的无细胞表达体系来无细胞表达，例如，为此目的使用来自大肠杆菌(Escherichia coli)细胞的S30提取物，或者商购可得的体系(如Roche Applied Science,Inc.的CECF技术)。在无细胞体系中，目标基因典型地在启动子的辅助下转录，但连接形成环状表达载体是可选的。在无细胞体系中，也可外部添加或在不转录和翻译下生成RNA。用于所有上述表达体系的体外表达和实施的表达构建体的构造也在本领域技术人员的能力范围内。
如上所述，葡糖氧化酶蛋白质可在多种表达体系中表达，且相应地必须选择适当的下游加工和纯化步骤。在本公开的有利实施方案中，葡糖氧化酶变体在细菌宿主中表达，且蛋白质分泌至周质或细胞外间隙。表达葡糖氧化酶变体的细胞通过任何本领域技术人员所公知的方法例如但不限于低温贮藏液(cryo stock)来保藏。表达生物体的培养根据标准发酵法以适当体积制备。在优选的实施方案中，从低温贮藏液接种蛋白质表达的培养物，且在适合的容器中相继增加培养物体积。在优选的实施方案中，细胞在发酵罐中生长，且任选地控制生长条件如pH、温度、氧和/或营养素供给。纯化的第一步包括使用几种技术如沉降、微滤、离心或絮凝中的一种或多种从上清液分离细胞。在优选的实施方案中，适用的方法为微滤。如果细胞内表达，细胞进行处理，结果从细胞内间隙释放蛋白质。这些处理可包括例如加压、酶促、渗透压休克、冷冻、超声或其它处理，从而产生细胞提取物，其可以进行进一步的纯化，或可以不进行。
在本公开的有利的实施方案中，蛋白质分泌至上清液，且任选的纯化步骤包括通过超滤浓缩上清液。进一步由上清液或浓缩的上清液的蛋白纯化可 利用包括下述的几种方法中的一种或多种进行：提取或分级法例如硫酸铵或乙醇或酸沉淀，或层析法，包括但不限于离子交换、疏水相互作用、羟磷灰石、通过凝胶过滤的粒径分级、磷酸纤维素或凝集素层析和亲和层析、或其任意组合。在更优选的方法中，亲和性标记蛋白通过金属螯合剂亲和层析纯化，从而获得高纯度蛋白质。
在本公开的另一有利实施方案中，上清液或通过超滤来部分纯化的上清液或浓缩和/或二次过滤(diafiltrated)的上清液通过下述几种技术方法中的任一种干燥：所述技术方法例如，但不限于，喷雾干燥、冷冻干燥、回流式蒸发(down-draught evaporation)、薄层蒸发、离心蒸发、输送器干燥或其任意组合。
在本公开进一步有利的实施方案中，使用例如但不限于流化床干燥、输送器干燥、喷雾干燥或转鼓干燥或其任意组合等方法将包括表达的葡糖氧化酶变体的发酵的细胞悬浮液作为整体干燥。
由此生产的目标多肽可通过本领域已知的方法回收、进一步纯化、分离、加工和/或修饰。例如，多肽可通过包括但不限于离心、过滤、超滤、提取或沉淀等常规步骤从营养培养基中回收。进一步的加工步骤如纯化步骤可通过本领域已知的各种程序来进行，所述工艺包括但不限于，层析(如离子交换、亲和、疏水、聚焦层析和尺寸排阻)、电泳程序(如制备式等电聚焦)、差别溶解(如硫酸铵沉淀)或提取。此外，分离和纯化的目标多肽可进一步加工，例如配制成组合物，特别是食品组合物、药物组合物、诊断组合物或化妆品组合物。
下文的序列比对中，编码黑曲霉的野生型葡糖氧化酶的氨基酸序列(SEQ IDNO.l)表示为wt(顶行)，亲本葡糖氧化酶(SEQ ID NO.3)表示为具有取代T30V-I94V-A162T，本公开的葡糖氧化酶变体A21(SEQ ID NO.5)表示为具有取代T30V-I94V-R537K-M556V，本公开的葡糖氧化酶变体A2(SEQ ID NO.7)表示为具有取代T30V-I94V-A162T-R537K-M556V，本公开的葡糖氧化酶变体F5(SEQ ID NO.9)表示为具有取代T30V-R37K-I94V-A162T-V293I-E310D- R537K-M556V，本公开的葡糖氧化酶变体F91(SEQ ID NO.11)表示为具有取代T30V-R37K-I94V-V106I-A162T，和本公开的葡糖氧化酶变体F9(SEQ ID N0.13)表示为具有取代T30V-R37K-I94V-V106I-A162T-M556V。
方法和实施例
在下列实施例中，提供本公开的材料和方法，包括确定通过这些方法获得的酶的催化性和稳定性。应理解的是，这些实施例仅用于说明目的，且不应解释为以任意方式限制本公开。为了全部目的将本文引用的所有公布、专利和专利申请以其全部内容引入于此以作参考。
实施例1：定点诱变
使用QuickChange多定点诱变试剂盒(Agilent Technologies,USA)和大肠杆菌XL10Gold超感受态细胞建立葡糖氧化酶变体。合成定点引物(Eurofins MWG Operon,Germany)并在置于pCTCON2载体中且包括c-myc标签的GOx序列的不同位置退火。
PCR混合物包括400pg/μL的模板DNA、200nM的引物和其余的来自突变试剂盒的成分。反应加热至95℃1min，接着95℃1min、55℃1min和65℃16.5min，共30个循环，接着65℃最终延伸20min。然后37℃使用Dpnl消化反应产物，并且直到使用之前保存在4℃。
根据突变试剂盒中的说明将由PCR获得的单链DNA导入超感受态细菌并使用Macherey-Nagel质粒DNA试剂盒(Düren,Germany)分离质粒DNA。
实施例2：酿酒酵母(S.cerevisiae)EBY 100细胞的转化
使用2.5小时、42℃的热休克步骤将质粒DNA导入酿酒酵母EBY 100(由Gietz RD和Schiestl RH,Nature protocols 2007,2:31-4记载)。27℃、160rpm下在YNB-CAA葡萄糖培养基中培养细胞48小时，接着通过在相同条件下转移至YNB-CAA Gal/Raf培养基将诱导表达GOx 16-18小时。
实施例3：琼脂板ABTS测定
酿酒酵母细胞在27℃下生长3天，影印铺板至YNB-CAA Gal/Raf培养基上并再培养1天。混合2％琼脂和等体积的含333mM葡萄糖、1.75U/mL HRP和7mM ABTS的ABTS溶液来制备分析培养基。将其倒在琼脂细胞平板上。菌落周围观察到具有GOx活性的绿色晕圈。
实施例4：MTP ABTS测定
培养酿酒酵母细胞(如Bulter T等人,Directed Enzyme Evolution Screeningand Selection Methods,Arnold FH,Georgiou G(编辑)Humana Press:Totowa,NewJersey,2003所述)并将5-μL的等分试样转移至新鲜MTP用于具有下列修正的ABTS测定(如Zhu Z等人,Biosensors&Bioelectronics 2006,21:2046-51；Baron AJ等人,J.Biol.Chem.1994,269:25095-25105；Sun L等人,Protein Eng Des Select 2001,14:699-704)。
将细胞重悬在70μL的PBS中并测定OD600，接着添加70μL的ABTS溶液并且每20秒测量405nm下的动力学，共10分钟。各培养采取两种策略，一个使用4mM含250mM葡萄糖和1U/mLHRP的ABTS溶液，一个除了仅含5mM葡萄糖以外，含有与之相同的组分。各标准化用微滴定板中包括三种野生型克隆。对于各次测量，计算线性区域的斜率并标准化为各孔细胞的OD600。
实施例5：DNA分离和毕赤酵母中的重复克隆(recloning)
从酿酒酵母突变体中提取DNA(如Singh MV和Weil PA,Analytical Biochemistry2002,307:13-17中所述)，并使用适当的限制酶(New England Biolabs GmbH,Germany)将GOx序列转移至pICZalpha A(Invitrogen,Germany)的Xhol/Xbal位点。制备组分毕赤酵母(P.pastoris)KM71H细胞(Invitrogen,Germany)并转化(参见Becker DM和Guarente L,Methods Enzymol 1991,194:182-187)，选择代表各突变体的表现最好的克隆。
实施例6：蛋白质纯化
根据Invitrogen的建议，发酵4天后，使用Beckman Coulter Avanti J26XP离心机(Krefeld Germany)在11,000×g下离心10分钟使细胞成团。收集上清并 通过0.22-μmPTFE滤器(Carl Roth GmbH,Germany)过滤并使用含10-kDa膜的Viva Flow 50体系(Sartorius AG,Germany)浓缩滤液至5-10mL。在4℃下用10mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)将浓缩液透析过夜并使用(GE Healthcare Europe GmbH,Germany)上样至20-mL Fast Flow DEAE琼脂糖柱(GE Healthcare Europe GmbH,Germany)。使用pH6的从10至250mM磷酸盐缓冲液的线性梯度经30个柱体积纯化蛋白质。使用ABTS测定我们试验了50-mL级分，并收集具有单独的GOx活性峰的那些，并使用10-kDa超滤柱(Sartorius AG,Germany)浓缩至5mL。
实施例7：使用ABTS测定的动力学分析
在2.5至260mM的葡萄糖浓度、pH 5.5和7.4下使用三重MTP ABTS测定来确定各GOx变体的动力学特性。计算各次测量在线性区域上的斜率并拟合成米氏方程(Michaelis-Menten)曲线，从而确定KM和kcat值。还构建Lineweaver-Burk、Eadie-Hofstee和Hanes-Woolf图，并识别除去异常值。通过测量280nm下的吸光度来确定kcat值(1.5mg/mLGOx的吸收被认为相当于基于序列的1AU，使用ProtParam计算)。
作为对照，使用包括SEQ ID NO.3的氨基酸序列(含有在对应于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基T30V、I94V和A162T处的取代)的亲本GOx。编码亲本GOx的核酸示于SEQ ID NO:4。
研究酶的动力学参数，使所得数据能够拟合成米氏方程。所有GOx突变体具有比野生型酶更高的固有活性(在pH 5.5下试验)，但在pH 7.4下区别更显著。突变体的改进的动力学常数总结于表4。表现最好的突变体为A2，其KM低1.5倍，kcat高2.6倍，得到在pH 5.5下整体4倍提高，和pH7.4下5.8倍提高。
表4-与野生型相比的突变酶的活性
如上所述，所有选择的突变体具有比野生型酶更高的固有活性(在pH 5.5下试验)，但在pH 7.4下区别更显著。最佳的突变体(A2)在pH5.5下活性高四倍，在pH7.4下活性高5.8倍，表明这对于开发意欲在人体中操作的微型生物燃料电池是理想的。
图1示出通过使用ABTS测定所确定的动力学常数，其中150μL的反应体积，0.5cm的光通路，使用PBS缓冲液pH 7.4，1U/mL HRP和4mM ABTS。葡萄糖浓度从2.5变化至260mM。每20秒测量405nm下的动力学，共10分钟。计算线性区域上各次测量的斜率。将数据使用Origin 8(OriginLab Corporation,Northampton)拟合至米氏方程曲线并确定KM和kcat。
图2示出通过使用ABTS测定确定的动力学常数，其中150μL的反应体积，0.5cm的光通路，使用50mM醋酸钠缓冲液pH 5.5，1U/mL HRP和4mM ABTS。葡萄糖浓度从2.5变化至260mM。每20秒测量405nm下的动力学，共10分钟。计算线性区域上各次测量的斜率。将数据使用Origin 8(OriginLab Corporation,Northampton)拟合至米氏方程曲线并确定KM和kcat。
实施例8：使用二茂铁甲醇的动力学分析
如Zhu等人所记载的制备二茂铁甲醇(氧化态)并使用1M KOH或1M HCl将pH调整至用于活性测定的相应pH。纯化的葡糖氧化酶变体用于确定在氧存在下二茂铁甲醇的KM和kcat。各次测量在MTP中重复进行三次，使用400mM葡萄糖并在0.22-10mM范围内变化二茂铁甲醇ox的浓度。在pH 5.5、7.4和8下进行测量。625nm下监测反应动力学。使用这些测量，通过借助最小二乘法使用非线性回归将米氏方程模型拟合至数据来确定KM和kcat。为了计算kcat，由280nm下的吸光度测量酶浓度(吸收1.5mg/mL的GOx被认为相当于基于序列的1AU，使用ProtParam计算)。识别除去异常值。二茂铁甲醇的动力学参数总结于表5。
由于kcat在用于单个突变体试验的pH值之间是相当的，但KM在高pH值下低得多，因此，对于高pH值特异性常数大幅改进。对于各pH值突变体和野生型的KM值是相当的，因此表明突变体对葡萄糖亲和性的增加不会不利地影响对二茂铁甲醇的亲和性。在氧的存在下，介质仍能够与氧竞争。
表5-与野生型相比突变酶使用二茂铁甲醇作为底物的活性
与野生型变体相比所有突变体示出更高的对介质的活性。突变体A2仍为最佳突变体，其对二茂铁甲醇的活性改进高达10倍。
实施例9：使用N,N-二甲基-对亚硝苯胺(NDMA)的动力学分析
通过在适当缓冲液(磷酸盐缓冲液pH 7.4或醋酸盐缓冲液pH 5.5)中添加化学品来制备N,N-二甲基对亚硝苯胺(NDMA)溶液。该氧化的N,N-二甲基对亚硝苯胺用于与前述纯化的GOx突变体的动力学测量。为此，确定GOx与介 质的反应速度来改变介质浓度。在饱和葡萄糖浓度、528nm下监测NDMA还原。使用400mM葡萄糖并在0.46至15.33mM之间改变NDMA浓度、在pH 5.5和7.4下确定KM和kcat。所有测量在MTPs中进行三次。将所得pH 5.5和7.4下的NDMA的动力学数据拟合至米氏方程曲线。作为定量对照和为了识别和除去异常值，还绘制Lineweaver-Burk、Hanes-Woolf和Eadie-Hofstee曲线。NDMA的动力学数据示于表6。
表6-与野生型相比突变酶使用N,N-二甲基-对亚硝苯胺作为底物的活性
由于这是针对FM的情况，对于野生型酶以及突变体，NDMA可与氧竞争。在较高pH下对介质的亲和性也增加，这通过降低KM值来显示。野生型酶和F91示出在两种pH试验下均比其它变体低的KM值，表明未存在于F91和野生型酶但存在于所有其它变体中的突变体M556V，增加了KM值。对于FM并未观察到这一点。突变体的特异性常数与野生型酶相比提高5倍(F91)至8倍(A2)。
实施例10：热稳定性
通过在60℃、无底物下将酶温育在50mM的醋酸盐缓冲液(pH 5.5)中确定GOx突变体的热稳定性(参见Bhatti HN，Saleem N，Food Technol.Biotechnol.47(3)331-335，2009，47：331-335)并使用ABTS测定来测量周期时间的等分试样的残效。相对于时间0时的100％活性在不同时间点绘制表示残效百分比的A(t)值，如下所示根据指数方程确定失活速率常数(kd)：
A(t)＝e-kd*t
通过将A(t)视作相当于0.5A(0)来计算热稳定性的半衰期(half times)。
根据本公开，所有GOx突变体的热稳定性都大于野生型酶(参见表7)。在此情况下，表现最好的突变体是F9-1，其中60℃的半衰期是野生型酶的两倍长。
表7-与野生型相比突变酶的热稳定性
t1/2(min)
亲本 9.00
野生型 10.50
A2 11.74
A21 13.86
F5 11.74
F9 15.75
F91 19.80
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Claims (17)

1.一种具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包括选自由SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13组成的组的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
4.一种核酸分子，其选自由下述组成的组：
a)编码根据权利要求1至3任一项所述的多肽的核酸分子；
b)或核酸分子a)的互补体。
5.一种载体，其包括根据权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其转化、转导或转染有根据权利要求5所述的载体。
7.一种具有葡糖氧化酶活性的多肽的生产方法，其包括下列步骤：(a)在适合的培养基中在适合的条件下培养根据权利要求6所述的宿主细胞以产生具有葡糖氧化酶活性的多肽；(b)得到所述产生的多肽，和任选地(c)加工所述多肽。
8.一种组合物，其包括根据权利要求1至3任一项所述的多肽。
9.根据权利要求8所述的组合物，其为食品组合物、药物组合物、诊断组合物或化妆品组合物。
10.一种样品中的葡萄糖的测定方法，其包括使所述样品与根据权利要求1至3任一项所述的具有葡糖氧化酶活性的多肽接触，并测定被所述葡糖氧化酶氧化的葡萄糖的量。
11.一种样品中的葡萄糖的测定装置，其包括根据权利要求1至3任一项所述的具有葡糖氧化酶活性的多肽和电子介质。
12.一种样品中的葡萄糖的测定试剂盒，其包括根据权利要求1至3任一项所述的具有葡糖氧化酶活性的多肽和电子介质。
13.一种酶电极，其具有固定化在所述电极上的根据权利要求1至3任一项所述的具有葡糖氧化酶活性的多肽。
14.一种用于测定葡萄糖的酶传感器，其包括根据权利要求13所述的酶电极作为工作电极。
15.根据权利要求14所述的酶传感器，其中所述传感器为一次性传感器。
16.根据权利要求1至3任一项所述的具有葡糖氧化酶活性的多肽在食品防腐中的用途。
17.一种经修饰的葡糖氧化酶，其包括选自由SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13组成的组的氨基酸序列。
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