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CN105368728B - 一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母 - Google Patents

一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，属于微生物技术领域。本发明的所述解脂耶氏酵母于2015年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2015736。本发明的菌株可利用蔗糖等廉价的作碳源，适合高密度发酵，而且解脂耶氏酵母被认为是安全的，可用于食品、SCP等的工业化生产。本发明的菌株在以甘油为唯一碳源，3L发酵罐发酵96h后，葡萄糖氧化酶酶活力达到134U/ml。

Description

一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母
技术领域
本发明涉及一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，属于微生物技术领域。
背景技术
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD，E.C.1.1.3.4)是一种黄素糖蛋白，在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。目前GOD的应用领域不断拓展，国内外市场需求量急剧增加。目前GOD的应用领域不断拓展，国内外市场需求量急剧增加。目前GOD基因已经在毕赤酵母GS115、大肠杆菌、瑞氏木霉等中得到表达，但还未见其在非常规酵母解脂耶氏酵母中进行表达研究，而解脂耶氏酵母被认为是安全的，因此，能用于食品和药物生产上。
解脂耶氏酵母Pold菌系中，编码能水解其它蛋白质的AEP基因被剔除，使得外源蛋白能更好地表达。人们将Pold系改造，生成一系列的派生菌系，如Polh、Polg、Polf。Polh、Polg在Pold系基础上进行改造，只有一个营养缺陷型基因。Polg被改造为适合以pBR322为基础的质粒整合的菌系，Polh将穿梭质粒的细菌部分在整合入酵母前剔除掉，形成酵母框。它们在Pold系的基础上均被剔除了酸性蛋白酶基因，消除了全部蛋白酶活性。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，所述解脂耶氏酵母于2015年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015736。
所述解脂耶氏酵母可利用蔗糖等廉价碳源，适合高密度发酵，而且解脂耶氏酵母被认为是安全的，可用于食品、SCP等的工业化生产。所述解脂耶氏酵母在以甘油为唯一碳源，3L发酵罐发酵96h后，葡萄糖氧化酶酶活力达到134U/ml。
所述解脂耶氏酵母是对申请号为2014106530764(一种重组表达葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其应用)的专利申请中的重组酵母进行诱变得到的。
本发明还提供所述解脂耶氏酵母在生产葡萄糖氧化酶方面的应用。
所述应用是将解脂耶氏酵母种子液体以10％的接种量转接至发酵培养基中，于3L罐上进行发酵培养，甘油补料为30g/l，pH控制5.0，培养温度28℃。
所述发酵培养基按g/L计含有：甘油20，酵母提取物1.32，氯化铵1.32，磷酸二氢钾0.32，无水硫酸镁0.132，维生素B1 3.34×10-4；溶于pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中。
所述发酵培养具体是：Biotron 3L罐罐上培养，装液量1L，接种量为10％，于28℃培养，搅拌转速为600rpm，通气量2.0vvm，pH控制5.0，当溶氧第一次反弹且大于60％时，短时流加30g/L的甘油，甘油流速7.5g/h，培养至发酵结束。
本发明还要求保护所述解脂耶氏酵母在食品或制备药物方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的解脂耶氏酵母，可利用蔗糖等廉价的作碳源，适合高密度发酵。解脂耶氏酵母被认为是安全的，可用于食品、SCP等的工业化生产；
(2)本发明的解脂耶氏酵母发酵生产葡萄糖氧化酶，培养96h的产量可达134U/ml，生产强度可达1.396U/(ml·h)。
生物材料保藏
解脂耶氏酵母，分类学命名为解脂耶氏酵母T2Yarrowia lipolytica T2，于2015年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2015736。
具体实施方式
主要试剂：蛋白胨和酵母粉购自OXIOD公司；SDS-PAGE试剂盒和蛋白质标准分子量购于碧云天生物技术研究所(南通)；其他试剂均为国产分析纯。
所需培养基：YPD培养基(g/L)：葡萄糖20；蛋白胨20；酵母粉10。YNB培养基(g/L)：葡萄糖20；YNB1.7；硫酸铵5。PPB培养基(g/L)：甘油20；酵母提取物1.32；氯化铵1.32；磷酸二氢钾0.32；无水硫酸镁0.132；维生素B13.34×10-4；溶于柠檬酸盐缓冲液pH 6.0中。固体培养基在此基础上添加2％琼脂粉。
Y.lipolytica种子培养条件：从-80℃保藏的工程菌甘油管点至YPD固体培养基，28℃培养过夜，用接种针挑取单菌落接种于用250mL三角瓶装有25mL的YPD液体培养基中，于28℃培养18～24h，转速为200rpm。
Y.lipolytica发酵培养条件：采用PPB培养基，Biotron 3L罐上培养，装液量1L，接种量为10％，于28℃培养，搅拌转速为600rpm，通气量2.0vvm，pH控制5.0。当溶氧第一次反弹且大于60％时，短时流加30g/L的甘油，甘油流速7.5g/h，培养至发酵结束。
酶活测定方法：
酶活力单位定义：在30℃，pH 6.0的条件下，1min从1μmol的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量为一个葡萄糖氧化酶酶活力单位，以U/mL表示。
试管中加入2.5mL邻联茴香胺溶液，0.3mL的18％葡萄糖，0.1mL的100U/ml辣根过氧化物酶，30℃保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL，反应3min后，加入2mol/L硫酸终止反应。取出试管，测OD500的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。
结果表示与计算：
X＝[△A÷(7.5×t×0.1)]×5×n
式中：△A—500nm吸光值；t—测定时间，min；0.1—样品体积，ml；5—终反应体积，ml；7.5—消光系数；n—稀释倍数。
实施例1菌株发酵生产葡萄糖氧化酶
将本发明的解脂耶氏酵母菌在YPD平板上活化培养一定阶段，接种到种子液体培养基YPD中，20h后以10％的接种量转接至发酵培养基PPB中，Biotron 3L罐上培养，装液量1L，接种量为10％，于28℃培养，搅拌转速为600rpm，通气量2.0vvm，pH控制5.0。当溶氧第一次反弹且大于60％时，短时流加30g/L的甘油，甘油流速7.5g/h，培养至发酵结束。其培养96h酶活可达到134U/ml。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1.一种解脂耶氏酵母在生产葡萄糖氧化酶方面的应用，其特征在于，所述应用是将解脂耶氏酵母种子液体以10％的接种量转接至发酵培养基中，于3L罐上进行培养，补料30g/L的甘油，pH控制5.0，培养温度28℃；
所述解脂耶氏酵母于2015年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015736。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基按g/L计含有：甘油20，酵母提取物1.32，氯化铵1.32，磷酸二氢钾0.32，无水硫酸镁0.132，维生素B1 3.34×10-4；溶于pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中。
3.权利要求1所述解脂耶氏酵母在食品或制备药物方面的应用。
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解脂耶氏酵母表达系统研究进展;赵鹤云 等;《生物加工过程》;20080515;第6卷(第3期);第10-16页 *

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