CN101955953A - 葡萄糖氧化酶突变基因及其表达和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了葡萄糖氧化酶突变基因及其表达和应用。本发明将葡萄糖氧化酶基因通过密码子优化、GC含量改变等方式，改变了272个碱基，将GC含量由55.54％降为48.44％，得到葡萄糖氧化酶突变基因，其碱基为SEQ ID NO.2所示。本发明将葡萄糖氧化酶突变基因转入到毕赤酵母中进行表达，试验结果表明，相比于突变前，葡萄糖氧化酶突变基因在毕赤酵母中的分泌表达量有显著提高，与国内外部分研究比较，本发明葡萄糖氧化酶突变基因的最终表达量达到较高的表达水平，为进一步工业化扩大生产奠定了基础。葡萄糖氧化酶酶学性质测定表明，采用本发明葡萄糖氧化酶突变基因所表达的重组葡萄糖氧化酶蛋白具有良好的热稳定性和较高酶活力。
Description
技术领域
本发明涉及葡萄糖氧化酶基因，尤其涉及密码子优化后的葡萄糖氧化酶突变基因，本发明还涉及该葡萄糖氧化酶突变基因在制备葡萄糖氧化酶中的应用，属于葡萄糖氧化酶的制备领域。
背景技术
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD)学名为β-D-葡萄糖氧化还原酶(EC1.1.3.4)，它能专一地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢(Pluschkell S，Hellmuth K and Rinas U，Kinetics of glucose oxidase excretion by recombinant Aspergillus niger.Biotechnology and bioengineering，1996，51：215-220.)。GOD广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域(Bankar SB，Bule MV，Singhal RS，et al.，Glucose oxidase-An overview.Biotechnol Adv，2009)。
GOD在食品工业中主要作用在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。目前，许多国家已将GOD作为公认的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中，例如：用于酒类除氧、蛋白脱糖、食品包装、果蔬及制品的保鲜等(Malherbe D，Du Toit M，Cordero Otero R，et al.，Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in Saccharomyces cerevisiae and its potential applications in wine production.)。
GOD还可作为绿色面粉改良剂及添加剂逐渐替代化学添加剂在面粉及制品的改良行业中发挥重要作用。溴酸钾在焙烤业中已有八十多年的应用历史，它作为氧化剂成功地赋予焙烤制品所必需的面筋强度及弹性，但是溴酸钾对人体具有很大的危害作用，所以有必要寻找一种安全的、可以替代溴酸钾功能的添加剂。葡萄糖氧化酶在氧化过程中产生的过氧化氢能够氧化面筋蛋白中的巯基，形成二硫键，进而改善面团的网络结果，增强了面团弹性。能够起到化学添加剂(溴酸钾等)相同的效果，同时避免了化学添加剂对人体造成的损害。目前已经在小麦粉和玉米粉中通过添加葡萄糖氧化酶而提高了面粉的筋力，改善了面包等食品的手感和形状，提高了产品质量(中国专利申请公开号：CN 1748515A；发明名称：一种含有葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的抗冻发酵冷冻面团及其生产方法)。
在医药方面，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H2O2，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗(Vodopivec M，Berovi M，Jan ar J，et al.，Application of Convective Interaction Media disks with immobilised glucose oxidase for on-line glucose measurements.Analytica Chimica Acta，2000，407：105-110.)。
近几年，GOD作为一种新型的酶饲料添加剂，已被农业部列为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一开始在畜牧、饲料行业上应用。在饲料中添加葡萄糖氧化酶能够清除牲畜肠道上皮细胞大量自由基，保护肠道上皮细胞的完整。葡萄糖氧化酶通过不断的催化葡萄糖生成葡萄糖酸，降低胃肠道的pH值，偏酸性环境有利于益生菌的生长增殖，从而抑制了病原微生物的存活，提高了牲畜的自身免疫力。除此之外，由于葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖过程中会产生过氧化氢，当过氧化氢积累到一定浓度时，可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、弧菌等病原菌的生长繁殖，并且这种抑菌作用不会产生菌体抗药性。随着葡萄糖氧化酶制备提纯工艺的不断发展完善，使用成本的不断降低，葡萄糖氧化酶将在饲料行业中发挥越来越重要的作用(李焰，葡萄糖氧化酶饲养肉鸡效果试验.龙岩师专学报，2004，22：77-78.)。
GOD的应用已扩展到纺织品行业。纺织品在生产过程中需要用到大量的双氧水，即过氧化氢，葡萄糖氧化酶在作用过程中产生的过氧化氢可以用于纺织工业的漂白处理。采用具有高回收率的固定化的葡萄糖氧化酶生产过氧化氢，过氧化氢浓度可达3.5g/L，处理时不需添加双氧水稳定剂，处理后织物手感柔软、丰满。并且处理后固定化葡萄糖氧化酶可以回收，再用到下批产品的处理中，因而可以有效降低纺织工业的生产成本，并提高纺织物的品质。中国作为纺织品生产和消费大国，葡萄糖氧化酶在此行业中的应用具有很好的前景(中国专利申请公开号：CN 1884682A，陈坚，阎贺静，堵国成，华兆哲，发明名称：一种应用葡萄糖氧化酶制剂的棉织物酶法煮炼的方法)。
GOD在生物界分布广泛，最先于1904年在黑曲霉和灰绿青霉中发现，目前研究的葡萄糖氧化酶主要来源于霉菌类微生物和昆虫体内，在细菌如弱氧化醋酸菌中也存在(Murray FR，Llewellyn DJ，Peacock WJ，et al.，Isolation of the glucose oxidase gene from Talaromyces flavus and characterisation of its role in the biocontrol of Verticillium dahliae.Curr Genet，1997，32：367-375.)。但其工业上一般采用黑曲霉和青霉属菌株作生产菌。但黑曲霉和青霉菌天然菌株在发酵过程中会产生过氧化氢酶，纤维素酶，淀粉酶等其他多种副产物(Frederick K，Tung J，Emerick R，et al.，Glucose oxidase from Aspergillus niger.Cloning，gene sequence，secretion from Saccharomyces cerevisiae and kinetic analysis of a yeast-derived enzyme.Journal of Biological Chemistry，1990，265：3793.)，大量的杂蛋白对后期的分离纯化工作造成很大的困难，也增加了成本。此外，天然霉菌生产过程中酶蛋白的生物合成受葡萄糖的诱导和高浓度葡萄糖的分解代谢产物的阻遏，而发酵过程中产生的GOD能氧化培养基中的葡萄糖生成葡萄糖酸，葡萄糖酸对酶的合成也具有抑制作用。为了解决这一问题，近年来利用基因工程菌重组表达葡萄糖氧化酶受到研究人员的青睐。Whittington H在酿酒酵母中表达了来源于黑曲霉的GOD基因，获得了具有生物学活性的葡萄糖氧化酶(Whittington H，Kerry-Williams S，Bidgood K，et al.，Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in A.niger，A.nidulans and Saccharomyces cerevisiae.Curr Genet，1990，18：531-536.)；母敬郁等采用瑞氏木霉表达了黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因，产量为25U/ml(母敬郁，王峤，杨纯中，瑞氏木霉表达黑曲霉葡萄糖氧化酶.，生物工程学报，2006，22：82-86.)；周亚凤和张先恩等人将黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中进行了重组表达，诱导后发酵液酶活为30-40U/ml(Zhou YF，Zhang XE，Liu H，et al.，Cloning and expression of Aspergillus niger glucose oxidase gene in methylotrophic yeast.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2001，17：400-405.)；Silvia Crognale也在毕赤酵母中成功表达青霉来源的葡萄糖氧化酶，产量为50U/ml(Silvia Crognale，Valentina Pulci and Brozzoli V，Expression of Penicillium variabile P16 glucose oxidase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme.Enzyme and Microbial Technology 392006，1230-1235)。从上述文献可知，虽然目前采用基因工程的手段实现了葡萄糖氧化酶的异源表达，表达量在原始菌株基础上得到了提高，特别是利用毕赤酵母异源分泌表达GOD具有高细胞密度发酵、蛋白可分泌到胞外表达，且杂蛋白少；具有翻译后加工修饰系统，糖蛋白的免疫原性较低；遗传和表达稳定性好等优点(Macauley-Patrick S，Fazenda M，McNeil B，et al.，Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.Yeast，2005，22：249-270.)，但分泌表达量均较低，通常在50-100U/ml，这就造成酶制剂价格昂贵，限制了其广泛使用。
通常提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达有密码子优化、mRNA结构改造、GC含量调整等策略。其中，优化外源基因的密码子是主要的手段(聂东宋，梁宋平.外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略.，吉首大学学报.2001，22，(3)，40-44)。
所谓密码子优化即是：由于密码子的简并性，每个氨基酸对应的密码子可以有多个。研究发现物种具有密码子偏爱性，即不同物种对密码子的使用频率是不同的，有些密码子甚至从来不使用，那些不经常使用甚至从不使用的密码子称为稀有密码子或非偏爱型密码子。非偏爱型密码子形成的原因主要是细胞内缺乏识别这些密码子的tRNA。对于不同的表达系统如毕赤酵母和大肠杆菌，其密码子偏好性是不同的。若外源基因含有较多的宿主菌非偏爱型密码子，尤其是连续出现的话，将会严重影响其在宿主菌中的表达量。为了消除稀有密码子对蛋白表达量的影响，可采用对异源基因的密码子进行优化来实现，即在不改变外源基因氨基酸序列的情况下，将外源基因中的稀有密码子替换为宿主常用的密码子。该方法具有简单易行，重复性好的特点，得到了广泛的使用(Sharp P，Tuohy T and Mosurski K，Codon usage in yeast：cluster analysis clearly differentiates highly and lowly expressed genes.Nucleic Acids Research，1986，14：5125.)。
不同来源的酶蛋白外源基因经密码子优化后其在毕赤酵母中的表达量提高程度差别很大，例如：Teng等通过优化β-1，3-1，4葡聚糖酶的密码子组成，使其在毕赤酵母中的表达量提高10倍(Teng D，Fan Y，Yang YL，et al.，Codon optimization of Bacillus licheniformis beta-1，3-1，4-glucanase gene and its expression in Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74：1074-1083)；Chang将来源于假丝酵母的脂肪酶密码子进行优化后，在毕赤酵母中的表达量提高4.6倍(Chang SW，Lee GC and Shaw JF，Codon optimization of Candida rugosa lip1 gene for improving expression in Pichia pastoris and biochemical characterization of the purified recombinant LIP1 lipase.J Agric Food Chem，2006，54：815-822.)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服葡萄糖氧化酶基因在宿主细胞中表达时所存在的分泌表达量较低的缺陷，将葡萄糖氧化酶基因的密码子进行优化并降低其GC含量，得到一种分泌表达量有显著提高的葡萄糖氧化酶突变基因。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种葡萄糖氧化酶突变基因，其碱基序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明将克隆获得的点青霉葡萄糖氧化酶基因在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除等影响因素，按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对葡萄糖氧化酶基因序列进行改造，共改变了272个碱基，涉及96个氨基酸，GC含量由55.54％降为48.44％，优化后的葡萄糖氧化酶突变基因在毕赤酵母中的分泌表达量有显著提高。
含有葡萄糖氧化酶的突变基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的宿主细胞也当然属于本发明的保护范畴之列；优选的，所述重组表达载体是重组真核表达载体，更优选为重组毕赤酵母表达载体；所述的宿主细胞优选为酵母细胞，更优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。
本发明还提供了一种制备葡萄糖氧化酶的方法，包括：将SEQ ID NO.2所示的葡萄糖氧化酶突变基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶，即得。
上述方法中，所述的重组表达载体优选为重组真核表达载体，更优选为重组毕赤酵母表达载体；所述的宿主细胞优选为酵母细胞，更优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。
本发明将点青霉(Penicillium notatum)来源的葡萄糖氧化酶基因(SEQ ID NO.1)经密码子优化、GC含量改变等综合改造，得到葡萄糖氧化酶突变基因(SEQ ID NO.2)。本发明将葡萄糖氧化酶突变基因转入到毕赤酵母中进行表达，试验结果表明，相比于突变前，葡萄糖氧化酶突变基因在毕赤酵母中的分泌表达量有显著提高，与国内外部分研究比较，本发明葡萄糖氧化酶突变基因的最终表达量达到较高的表达水平，为进一步工业化扩大生产奠定了基础。葡萄糖氧化酶酶学性质测定表明，本发明葡萄糖氧化酶突变基因所表达的重组葡萄糖氧化酶蛋白具有良好的热稳定性和较高的酶活力。
附图说明
图1GOD原基因密码子使用频率。
图2改造后的GOD-M基因密码子使用频率。
图3葡萄糖氧化酶优化基因分段合成及酶切位点示意图。
图4酵母重组表达质粒pPIC9-GOD和pPIC9-GOD-M的构建图。
图5酵母转化子的PCR鉴定电泳图(1：阴性对照，2-11：转GOD的PCR结果；12-21：转GOD-M的PCR结果；M：marker)。
图6平板法筛选有葡萄糖氧化酶活性的酵母转化子。
图7转GOD和GOD-M酵母菌株3升发酵罐中葡萄糖氧化酶酶活结果。
图8发酵罐中葡萄糖氧化酶经甲醇诱导不同时间内的表达量(M：蛋白分子量marker；1-9：甲醇诱导24、36、48、60、72、84、96、108、120h发酵液)。
图9葡萄糖氧化酶酶活标准曲线。
图10葡萄糖氧化酶最适pH曲线。
图11葡萄糖氧化酶pH稳定性曲线。
图12葡萄糖氧化酶最适温度曲线。
图13葡萄糖氧化酶热稳定性曲线。
图14金属离子及化学试剂对酶活性的影响。
图15葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖双倒数曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
说明：以下具体实施例中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)。
实施例1葡萄糖氧化酶基因的优化设计及合成
1.1菌株和质粒
点青霉(Peniciliium notatum)，由发明人本实验室保存；
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株TOP10和克隆载体pSP72购自北京全式金生物技术有限公司；基因小片段由北京奥科生物技术公司合成。
1.2葡萄糖氧化酶基因的优化设计
首先对从点青霉(Penicillium notatum)中克隆获得的葡萄糖氧化酶原始基因的序列进行分析(基因的克隆请参考：李卓夫(硕士论文)，葡萄糖氧化酶基因的克隆及高效表达.长春理工大学，2008)，在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除等影响因素，按照巴斯德毕赤酵母的偏爱密码子对葡萄糖氧化酶基因序列进行改造。
点青霉来源的葡萄糖氧化酶原基因全长1815bp，共编码604个氨基酸和一个终止密码子。其中前54个碱基编码的18个氨基酸为信号肽序列，在毕赤酵母中表达时需去除自带的信号肽序列，以表达载体pPIC9上的α因子为信号肽。因此去除自身信号肽的葡萄糖氧化酶基因(GOD)由1761个碱基组成，编码586个氨基酸和一个终止密码子(SEQ ID NO.1)。在不改变氨基酸序列的前提下对GOD基因进行优化后的葡萄糖氧化酶基因(GOD-M)序列(SEQ ID NO.2)，共改变了272个碱基，涉及96个氨基酸，GC含量由55.54％降为48.44％。(表1)。GOD基因优化前后的密码子使用情况如图1、2所示。
表1葡萄糖氧化酶基因优化前后GC含量的变化
1.3密码子优化后的葡萄糖氧化酶基因(GOD-M)的合成
1.3.1寡聚核苷酸小片段的设计和合成
将设计好的GOD-M基因双链分为A、B、C、D、E、F、G 7个大片段，每个大片段约为300bp左右，然后将每大段的正义链和反义链又分为大约50-60bp的若干小段，其中两条链的各个小段之间约有20-30bp相互重叠配对的区域，并且在各个大段之间选择合适的酶切位点以利于基因的合成(表2)。寡聚核苷酸小片段由北京奥科生物技术公司合成(图3)。
表2优化的葡萄糖氧化酶7大片段序列
1.3.2寡聚DNA大片段的拼接
1)A片段包括16个寡聚核苷酸小段，将各小段用去离子水溶解，使其终浓度为20μmol/L。
2)将各个寡聚核苷酸小片段进行磷酸化处理。磷酸化体系如下：
寡聚核苷酸片段 2μL
T4寡聚核苷酸磷酸激酶 2U
(T4PNK)
10×缓冲液 1μL
ATP(1μmol/ml) 1μL
去离子水 4μL
共10μL，37℃水浴保温1h
3)将16段经过磷酸化处理后的寡聚核苷酸小片段合并到一个EP管中，共160μl，将混合物置于95℃水浴中进行变性处理，变性5min后，将变性样品取出，自然冷却进行退火，待温度降至室温后，退火步骤结束，将退火产物置于-20℃保存备用。
4)将其它6个大段按照上述步骤分别进行合成。
按照A(XhoI、PvuII双酶切)、B(PvuII、SphI双酶切)、C(SphI、PstI双酶切)、D(PstI、XbaI双酶切)、E(XbaI、BamHI双酶切)、F(BamHI、KpnI双酶切)、G(KpnI、ClaI双酶切)7个片段设计的酶切位点(如图3所示)，对所用克隆载体pSP 72分别进行酶切处理，酶切消化完全后，胶回收酶切后载体片段，用于与各大片段进行连接。
1.3.3寡聚DNA片段与载体的连接与转化
将寡聚核苷酸退火产生的各大片段分别与相对应的酶切后载体片段进行连接，核苷酸片段与载体的摩尔比为5∶1，连接体系如下：
核苷酸片段 0.5μmol
载体片段 0.1μmol
T4DNALigase 1μL
10×缓冲液 1μL
补水至 10μL
16℃连接8h后取出连接产物
将酶连体系加入到50μl Top10大肠杆菌感受态细胞中，42℃热击转化，涂布含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板，倒置于37℃培养箱培养过夜。待LB平板中转化子长出后，挑取转化子培养并提取质粒通过PCR反应鉴定阳性克隆。PCR体系如下：
菌液 1μL
dNTP(2.5μmol/mL each) 1.5μL
上游通用引物T7(10μmol/L) 0.5μL
下游通用引物SP6(10μmol/L) 0.5μL
10×缓冲液 2μL
Taq DNA聚合酶 0.5μL
补水至 20μL
PCR扩增程序如下：
95℃预变性 10min
95℃变性 45s
55℃退火 30s
72℃延伸 90s
30个PCR循环后，继续72℃延伸5min，取出PCR样品，电泳检测，阳性克隆送往北京三博远志生物技术公司进行序列测定。
1.3.4GOD-M基因全长拼接
将A，B，C，D，E，F，G 7个大片段分别连接在克隆载体pSP72上，并转化大肠杆菌TOP10，经过测序鉴定，将序列正确的亚克隆分别命名为pSP72-A、pSP72-B、pSP72-C、pSP72-D、pSP72-E、pSP72-F、pSP72-G.。分别提取7个亚克隆的质粒按照顺序(A-B-C-D-E-F-G)依次将DNA回收片段全部连接到克隆载体pSP72上，经测序鉴定正确的含有GOD-M基因全长的克隆命名为pSP72-GOD-M。
实施例2葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母菌株的构建和筛选
2.1菌株和质粒
Top10大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；
表达载体pPIC9和毕赤酵母受体菌株GS115为Invitrogen公司产品。
带有原始葡萄糖化酶基因的质粒pBluescriptSK-GOD及带有改造后葡萄糖化酶基因的质粒pSP72-GOD-M为本发明人实验室构建。
2.2培养基及其他溶液
YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含1.5％琼脂粉)，108℃灭菌15min。
10×YNB(酵母无氨基酸氮源)：134g YNB固体溶于1L去离子水，过滤灭菌，4℃保存；
500×生物素：生物素20mg/10omL水，过滤灭菌，4℃保存。
10×葡萄糖：200gD-葡萄糖溶于1000mL水，过滤灭菌，4℃保存。
MD培养基：YNB13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4×10-4g/L，琼脂糖20g/L。
MM培养基：YNB13.4g/L，甲醇0.5％，生物素4×10-4g/L，琼脂糖20g/L。
BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10ml/L，用pH6.0磷酸盐缓冲液配制。
BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇5mL/L，用pH6.0磷酸盐缓冲液配制。
1mol/L山梨醇：将182.1g D-山梨醇溶于1L水中，过滤灭菌，4℃保存。
Basal salts(发酵培养基)：KH2PO410g/L，NH4H2PO4100g/L，K2SO436.4g/L，MgSO4·7H2O 29.7g/L，Ca2SO41.86g/L，KOH 3.0g/L。
发酵中所用的微量盐溶液(PTM)：硫酸铜6.0g/L、碘化钠0.08g/L、硫酸锰3.0g/L、钥酸钠0.2g/L、硼酸0.02g/L、氯化钻0.5g/L、氯化锌20g/L、硫酸亚铁65g/L、生物素0.25g/L、硫酸5ml/L；过滤灭菌，4℃保存。
邻联茴香胺溶液：0.1g邻联茴香胺，溶于10ml甲醇，为储存液，4℃保存，实验前取0.1ml储存液，溶于12ml的0.1mol/L，pH 6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中。
平板筛选显色液：
溶液I：邻联茴香胺储存液(0.1g邻联茴香胺，溶于10ml甲醇，4℃保存)
溶液II：18％葡萄糖(18g葡萄糖溶于100ml去离子水中)；
溶液III：90U/ml的辣根过氧化物酶；
将10ml的1％的琼脂糖溶化后加入2ml溶液II，200μl溶液I和400μl溶液III即为显色液(现用现配)。
2.3葡萄糖氧化酶酵母重组表达载体的构建
分别提取pBluescriptSK-GOD、pSP72-GOD-M和pPIC9质粒，并分别用EcoRI和NotI对这三个重组质粒进行双酶切处理，分别将未改造的葡萄糖氧化酶基因GOD及经优化改造的GOD-M和表达载体pPIC9酶切产物进行回收及连接，通过酶切和测序对阳性克隆进行鉴定，由此分别构建了酵母重组表达载体pPIC9-GOD和pPIC9-GOD-M(图4)。
2.4葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达
分别用BglII酶切重组表达质粒pPIC9-GOD和pPIC9-GOD-M，使质粒线性化，按照毕赤酵母表达手册分别将这两个表达质粒转化毕赤酵母宿主菌GS115。以每板200μL菌液量涂布于MD平板上，28℃培养至长出转化子。随机各挑选10个克隆子提取基因组，利用CTAB法提取基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，分别以未改造基因GOD的特异引物(5’TCAATCTGGGCGGCAGTCGG)及改造基因GOD-M的特异引物(5’GCATGCACGGTTCCGTCAGT)与载体上的通用引物5’AOX(TACGTAATGAAGCTCCTCTCTGTTGCT)进行PCR扩增检测，目的条带大小约为1kb(图5)。由图5初步得出转化子的阳性率比较高，约为95％以上。
2.5产葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母在摇床水平的筛选
首先采用平板筛选方法对转化子进行初筛。用无菌牙签将MD平板上长出来的转化子，复制到具有编号的MM平板上，同时复制在具有相同编号的MD平板上，将MM复制平板和MD复制平板置于28℃培养箱培养，培养24h后，将MD复制平板取出置于4℃冰箱保存，取出MM平板后，将显色液倾倒于MM板上，室温10-20min即可显色，阳性菌株在平板上可显示棕色，据此确定阳性率及葡萄糖氧化酶毕赤酵母表达菌株(图6)。随后对平板初筛的转化子进行复筛。用无菌牙签将初筛具有酶活的相应克隆挑到10mL BMGY培养基中摇床培养48h(28℃，200rpm)，然后离心(6000rpm，8min)，弃去培养基上清，加入5mL BMMY，摇床培养(28℃，200rpm)，期间每隔24h补加0.5％甲醇，诱导60h后离心(6000rpm，8min，4℃)，收集上清液测定酶活力。复筛结果进行再次重复试验，确认酶活力。
分别筛选测定了转GOD和GOD-M的酵母转化子各800个发现，转GOD的800个酵母转化子中平均约有30％的转化子具有葡萄糖氧化酶的活性，且转GOD的酵母转化子酶活普遍较低，其中最高的53#转化子在摇床大筛分泌表达的酶活也只有10.8U/ml，而转GOD-M的800个酵母转化子中约有35％的转化子有酶活，其中约有65％的转化子的酶活高于未改造基因(GOD)53#的活性，最高的DG16#的酶活是53#的3.2倍(表3)。
表3部分转葡萄糖氧化酶改造基因酵母的酶活测定结果
2.6葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母的发酵
以未进行基因改造的葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母菌53#为对照菌株，将复筛实验中比对照菌株酶活显著提高的2株转GOD-M的毕赤酵母重组菌株DG16#和DG19#进行实验室3升发酵罐水平诱导产酶发酵。
分别将53#、DG16#和DG19#酵母转化子用无菌牙签挑到40ml YPD培养基中，摇床培养(28℃，200rpm)48h后，转接到200ml YPD培养基中，摇床培养(28℃，200rpm)24h作为发酵种子菌液，接种于3升发酵罐中。
发酵罐参数设置为pH5.5，温度30℃，搅拌速率为1000rpm，通气量为200，初始接种量为200ml菌液，当溶氧下降至最低，然后又开始上升到100％时，开始补糖(400ml的40％葡萄糖+10mlPTM盐)，补糖8-10h后，开始混饲(100ml的40％葡萄糖+4mlPTM盐+18ml甲醇)，混饲4h后，开始流加甲醇(500ml甲醇+12.5mlPTM盐)诱导产酶，诱导期间通过调节甲醇的补加流速，将发酵罐内溶氧水平控制在25％-50％之间，开始诱导后，每隔12h取发酵样品测定菌体湿重和样品酶活并留样，酶活随着诱导时间的延长而增加，当酶活开始下降时，停止发酵，下罐，将发酵液离心(10000rpm，10min，4℃)，收集上清酶液。从3升小试水平发酵结果可知，转原基因GOD的酵母转化子53#在甲醇诱导132h后葡萄糖氧化酶的活性为130U/ml，而转全基因改造的两个酵母转化子DG16#和DG19#的酶活诱导132h后则分别达到了614U/ml和582U/ml，转化子DG16#在3升发酵罐水平甲醇诱导132h后的酶活是对照53#的4.7倍(图7)。
由此可见，点青霉来源的葡萄糖氧化酶经密码子优化、GC含量改变等综合改造后显著提高了该酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量。与国内外部分研究比较，本实验得到的葡萄糖氧化酶最终表达量达到较高的表达水平，为进一步工业化扩大生产奠定了基础(表4)。
表4文献报道葡萄糖氧化酶的产量
实施例3葡萄糖氧化酶酶学性质测定
3.1葡萄糖氧化酶样品的浓缩
毕赤酵母表达的葡萄糖氧化酶在发酵液上清中的含量占到总蛋白的90％以上，因此将发酵液上清通过超滤浓缩就可以用于后期性质测定(图8)。先将发酵液上清10000rpm离心10min，去除菌体沉淀，上清酶液采用PALL公司切向流膜过滤系统进行浓缩，首先采用0.1μm微滤膜进行过滤，以除去上清酶液中残留的细胞碎片和可能存在的杂质，收集滤过液。然后将滤过液再经过截留分子量为10kDa的超滤膜进行过滤，弃去滤过液，得到浓缩的酶液用于酶学性质的测定。
3.2葡萄糖氧化酶酶活测定方法
3.2.1标准曲线的制作
参照SIGMA Glucose(GO)Assay Kit，稍加改进。以sigma公司葡萄糖氧化酶标准品做标准曲线。将葡萄糖氧化酶标准品稀释成0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4U/ml，在试管中加入2.5ml邻联茴香胺溶液，加入0.3ml的18％D-葡萄糖，加入0.1ml90U/ml辣根过氧化物酶溶液，35℃保温2min，加入0.lml稀释好的葡萄糖氧化酶标准品，反应3min后加入2ml的2mol/L硫酸终止反应，在540nm下测定反应液吸光值。见表5.
表5葡萄糖氧化酶标准曲线的绘制
根据葡萄糖氧化酶标准品实验结果，以葡萄糖氧化酶标准品酶活力为纵坐标，以OD540的吸光值为横坐标，做酶活力标准曲线，如图9所示，
根据标准曲线的结果，得出葡萄糖氧化酶活单位的计算公式为：
酶活性(U/ml)＝(4.3769x-0.3034)×N
x：OD540吸光值；
N：样品稀释倍数。
3.2.2葡萄糖氧化酶活性的测定
试管中加入2.5ml邻联茴香胺溶液，03ml的18％葡萄糖，0.1ml的90U/ml过氧化物酶，35℃保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.1ml(每隔10s加一个)，反应3min后，加入2M硫酸终止反应(同样是每个10s加一个)，取出试管，测OD540的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。
3.3葡萄糖氧化酶的最适pH和pH稳定性
在不同pH的缓冲液下测定葡萄糖氧化酶的活性，如图10，从图中可以看出，葡萄糖氧化酶的最适pH为6.2，在pH4.0-7.0之间酶活力能够保持在60％以上。
在不同pH条件下处理酶液1h后，在最适pH下测定酶液的剩余活力，以酶活最高数据计100％，计算相对活力，从图11可以看出，葡萄糖氧化酶在pH4.0-7.0之间基本稳定，酶活力保持在80％以上，经pH 3.0处理后酶活力也能保持在60％以上。说明该葡萄糖氧化酶的酸耐受性比较好，而pH 7.5的时候酶活只有24％，到pH 8.0的时候酶活性完全丧失。
3.4葡萄糖氧化酶的最适温度和温度稳定性
从图12可以看出，葡萄糖氧化酶的最适反应温度为35℃，且30-50℃之间反应时酶活力均在80％以上。
在50℃保温2h后，酶活力依然保留70％以上，表明葡萄糖氧化酶具有较好的热稳定性(图13)。
3.5金属离子和部分化学试剂对酶活性的影响
在酶促反应体系中加入不同金属离子或化学试剂，终浓度为1m mol/L，以未加金属离子和化学试剂的酶促反应为对照，活力计为100％。结果如图14所示，常见的金属离子和化学试剂对酶活性没有大的影响，酶活力基本不变，但SDS对酶活力的影响比较大，从图中可以看出，当酶促反应体系中有1mmol/L的SDS存在时，剩余酶活力只有40％左右。
3.6酶促反应动力学
用不同浓度葡萄糖作为底物，在pH6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，35℃测定相对应的反应速度，按照双倒数作图法(Lineweaver-Burk)，如图15所示。图中横轴截距的负倒数即为酶的Km值，经计算葡萄糖氧化酶的Km值为83.21mmol/L，Vmax为2170μmol/min/mg。
Claims (10)
1.一种葡萄糖氧化酶突变基因，其特征在于：其碱基为SEQ ID NO.2所示。
2.含有权利要求1所述葡萄糖氧化酶突变基因的重组表达载体。
3.按照权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是重组真核表达载体。
4.按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述重组真核表达载体是重组比赤酵母(Pichia pastoris)表达载体。
5.含有权利要求2-4任何一项所述重组表达载体的宿主细胞。
6.按照权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为酵母细胞。
7.按照权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述的酵母细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。
8.权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变基因在制备葡萄糖氧化酶中的应用。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：将权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的重组表达载体为重组真核表达载体，优选为毕赤酵母表达载体；所述的宿主细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)。
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