CN105175548A - 重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，属于生物技术领域，具体涉及一种重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，即将含有重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞上清依次经过亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、脱盐层析得到高质量的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白。本发明具有成本低、目的蛋白纯度高、工艺过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。
Description
技术领域
本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及一种重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，属于生物技术领域。
背景技术
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)通过与特异性受体-血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)结合刺激新生血管的形成。在肿瘤生长过程中，VEGFs数量激增，与血管生成抑制因子之间的调节失衡，极大地促进了内皮细胞的分裂增殖和迁移，提高血管通透性，为肿瘤的生长和转移提供良好的微环境。
重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白(VEGF-Trap)是重组融合蛋白，包含人VEGFR特异性结构域VEGFR-1的第二结构域、VEGFR-2的第三结构域以及IgG1的Fc部分。VEGF-Trap是特异性拮抗剂结合并抑制血液中及血管外的游离的VEGF及P1GF。VEGF-Trap可用于治疗老年黄斑变性(AMD)等眼内血管疾病及肿瘤。目前国外已上市重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白为Aflibercept，商品名分别为EYLEA及ZALTRAP，分别用于治疗老年黄斑变性(AMD)及肿瘤。
重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白属于融合蛋白，结构较为复杂，其二硫键和糖基化位点较多，其中含有较多的碱性电荷异构体，给下游纯化工作带来很大困难。
发明内容
本发明提供一种适宜规模化扩大生产的、快速、高效的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白(VEGF-Trap)的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。
本发明将含有重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白上清依次经过亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、脱盐层析及除病毒纳滤得到高质量的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白原液。
本发明的技术方案如下，具体步骤为：
亲和层析
(1)用含盐的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗；
(2)用pH值3.0～4.5的平衡缓冲液对步骤(1)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活；
阴离子交换层析
(3)用含盐的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗；
(4)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
阳离子交换层析
(5)用含盐的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含盐的平衡缓冲液进行平衡；
(6)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
(7)用含盐的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含盐的平衡缓冲液进行平衡；
(8)用含0.35～0.6mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
脱盐层析
(9)用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液对脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后经过除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
本发明所采用的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清在纯化之前先进行澄清过滤，除去细胞培养液中的菌体等成分。
本发明各个步骤所用的平衡缓冲液为本领域常用的缓冲体系，具有成本低等特点，本发明对各个步骤所用平衡缓冲液的浓度和pH值进行了合理的设计，结合其它条件，达到了很好的纯化效果。步骤(1)、(3)至(9)所用的平衡缓冲液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为10～40mmol/L，pH值为5.5～8.0。
优选地，本发明步骤(5)至(6)中所述平衡缓冲液的pH值为5.5～6.5，步骤(7)至(8)中所述平衡缓冲液的pH值为6.5～7.5。
根据本发明的技术方案，步骤(1)、(3)至(9)中所述的盐选自Na2SO4、NaCl、(NH4)2SO4；优选地，步骤(1)、(3)至(6)、(9)中所述的盐优选为NaCl；步骤(7)、(8)中所述的盐优选为(NH4)2SO4。
在步骤(1)至(2)的亲和层析过程中，亲和层析介质选自rProteinAFastFlow、Mabselect或MabselectSure，该过程主要用于捕获细胞培养液中的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白，同时除去少量杂质蛋白，上样和冲洗结束后采用pH值3.0～4.5的平衡缓冲液对其进行洗脱，所用的pH值3.0～4.5的平衡缓冲液选自醋酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为10～40mmol/L。
为了去除其中可能潜在的病毒，本发明步骤(2)中采用浓度为0.1～1mol/L的磷酸或柠檬酸调节pH值至3.0～4.0进行病毒灭活。
为了去除含有的碱性蛋白异构体及少量宿主蛋白、DNA、蛋白A残留、色素等，对亲和层析后获得的蛋白液进一步进行步骤(3)至(4)的阴离子交换层析，阴离子交换层析介质选自QSephroseFastFlow、DEAESepharoseFastFlow、CaptoQ，该步骤中通过添加盐来增加离子强度，所用的盐选自Na2SO4或NaCl，优选NaCl，冲洗时添加的盐浓度为0.02～0.06mol/L，洗脱时添加的盐浓度为0.1～0.2mol/L。
为了去除剩余的碱性电荷异构体、聚体及少量宿主蛋白、DNA残留等，对阴离子交换层析后获得的洗脱蛋白液进一步进行步骤(5)至(6)的阳离子交换层析，阳离子交换层析介质选自SPSepharoseFastFlow、CMSepharoseFastFlow或CaptoS，该步骤中的平衡缓冲液pH值优选5.5～6.5，该步骤中通过添加盐来增加离子强度，所用的盐选自Na2SO4或NaCl，优选NaCl，洗脱时添加的盐浓度为0.1～0.2mol/L。
虽然经过上述层析，其中的色素、杂质蛋白得到了去除，但是为了保证最终产品的质量，本发明采用步骤(7)至(8)的疏水作用层析进一步去除其中的聚体、少量的色素、碱性电荷异构体以及微量残留，疏水作用层析介质选自PhenylSepharsoe6FastFlow、ButylSepharose4B或ButylSepharose4FastFlow，该步骤中的平衡缓冲液pH值优选6.5～7.5，该步骤中通过添加盐来增加离子强度，所用的盐选自(NH4)2SO4、Na2SO4或NaCl，优选(NH4)2SO4，洗脱时添加的盐浓度为0.35～0.6mol/L。
为了去除疏水层析后蛋白液中的高浓度盐，本发明最后采用步骤(9)的脱盐层析进行缓冲液置换，所用的层析介质为SephadexG-25Fine或SephadexG-25Medium或SephadexG-25coarse，该步骤中平衡时添加的盐选自Na2SO4或NaCl，优选NaCl，浓度为0.02～0.06mol/L。
为了进一步去除其中可能潜在的病毒，脱盐后进行除病毒纳滤及超滤浓缩得到高纯度的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白原液。
本发明的优选技术方案之一为：
(1)用含1mol/LNaCl的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含1mol/LNaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗；
(2)用pH值3.0～4.5的平衡缓冲液对步骤(1)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活；
阴离子交换层析
(3)用含1mol/LNaCl的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗；
(4)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
阳离子交换层析
(5)用含1mol/LNaCl的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行预平衡，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡；
(6)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
(7)用含0.9mol/L(NH4)2SO4的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含0.9mol/L(NH4)2SO4的平衡缓冲液进行平衡；
(8)用含0.35～0.6mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
脱盐层析
(9)用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液对脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后经过除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
本发明所获得的目的蛋白原液采用SEC-HPLC方法检测，纯度可以达到99.2％以上。
综上所述，本发明首先采用亲和层析捕获重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白，同时除去少量杂质蛋白，然后利用阴离子交换层析、阳离子交换层析去除其中的碱性电荷异构体、少量聚体、色素和微量残留，达到初步纯化的目的，然后选择疏水作用层析进一步去除其中的聚体、色素和微量残留，达到精纯化的目的，最后脱盐层析去除工艺中的高浓度盐，五个层析过程依次作用，相互补充，最终制得高质量的产品，经检测，本发明制备的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的SEC-HPLC分子筛纯度为99.2％以上。本发明的一个特点是在步骤(3)、(4)、(6)、(8)、(9)的冲洗和洗脱时采用了不同范围的低浓度盐(≤0.6mol/L)，有利于除去碱性电荷异构体、杂质蛋白等，并且本发明所述的制备工艺具有快速、简便、规模易放大，适合大规模生产等特点。
附图说明
图1为SEC-HPLC液相分析实施例1纯化后的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯度图谱，纯度为99.5％。
具体实施方式
以下通过实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应作为本发明的限制。
本发明的方法包括顺序使用含有重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清澄清过滤，亲和层析，阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、脱盐层析来纯化重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白。本发明中所述的层析介质均可市场购买获得，例如阴离子交换层析柱QSephroseFastFlow(5.0×30cm)，购自GE公司。
实施例1
一种纯化重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的方法，其具体步骤为：
亲和层析
(1)用1000mL含有1mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对rProteinAFastFlow亲和层析柱(5.0×20cm)进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含有1mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液进行冲洗，再用浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行冲洗；
(2)用浓度为20mmol/L、pH值为4.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对步骤(1)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后用浓度为1mol/L的磷酸调节pH值至4.0进行病毒灭活；
阴离子交换层析
(3)用1200mL含有1mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液对阴离子交换层析柱QSephroseFastFlow(5.0×30cm)进行预平衡，再用浓度为20mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用浓度为20mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液进行冲洗，再用含有0.06mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液进行冲洗；
(4)用含有0.2mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
阳离子交换层析
(5)用200mL含有1mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH值为6.5的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对SPSepharoseFastFlow阳离子交换层析柱(2.6×20cm)进行预平衡，再用浓度为20mmol/L、pH值为6.5的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用浓度为20mmol/L、pH值为6.5的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液进行平衡；
(6)用含有0.15mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH值为6.5的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
(7)用250mL含有0.9mol/L(NH4)2SO4的浓度为20mmol/L、pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对ButylSepharose4FastFlow疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含有0.9mol/L(NH4)2SO4的浓度为20mmol/L、pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液进行平衡；
(8)用含有0.5mol/L(NH4)2SO4的浓度为20mmol/L、pH值为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
脱盐层析
(9)用含有0.04mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为6.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对SephadexG-25Medium脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后将收集的蛋白液进行除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
所获得的目的蛋白原液采用SEC-HPLC方法检测，纯度可以达到99.5％。
实施例2
一种纯化重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的方法，其具体步骤为：
亲和层析
(1)用1000mL含有1mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对Mabselect亲和层析柱(5.0×20cm)进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含有1mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液进行冲洗，再用浓度为10mmol/L、pH值为5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行冲洗；
(2)用浓度为10mmol/L、pH值为3.0的醋酸平衡缓冲液对步骤(1)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后用浓度为0.5mol/L的柠檬酸调节pH值至3.0进行病毒灭活；
阴离子交换层析
(3)用1200mL含有1mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.0的Tris-HCl平衡缓冲液对阴离子交换层析柱CaptoQ(5.0×30cm)进行预平衡，再用浓度为10mmol/L、pH值为7.0的Tris-HCl平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用浓度为10mmol/L、pH值为7.0的Tris-HCl平衡缓冲液进行冲洗，再用含有0.05mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.0的Tris-HCl平衡缓冲液进行冲洗；
(4)用含有0.15mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
阳离子交换层析
(5)用200mL含有1mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对CaptoS阳离子交换层析柱(2.6×20cm)进行预平衡，再用浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液进行平衡；
(6)用含有0.1mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
(7)用250mL含有0.9mol/L(NH4)2SO4的浓度为20mmol/L、pH值为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对ButylSepharose4B疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含有0.9mol/L(NH4)2SO4的浓度为20mmol/L、pH值为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液进行平衡；
(8)用含有0.35mol/L(NH4)2SO4的浓度为20mmol/L、pH值为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
脱盐层析
(9)用含有0.02mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为5.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对SephadexG-25Fine脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后将收集的蛋白液进行除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
所获得的目的蛋白原液采用SEC-HPLC方法检测，纯度可以达到99.3％。
实施例3
一种纯化重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的方法，其具体步骤为：
亲和层析
(1)用1000mL含有0.9mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对MabselectSure亲和层析柱(5.0×20cm)进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含有0.9mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液进行冲洗，再用浓度为30mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行冲洗；
(2)用浓度为40mmol/L、pH值为4.5的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对步骤(1)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后用浓度为0.1mol/L的磷酸调节pH值至3.5进行病毒灭活；
阴离子交换层析
(3)用1200mL含有0.9mol/LNaCl的浓度为30mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液对阴离子交换层析柱DEAESepharoseFastFlow(5.0×30cm)进行预平衡，再用浓度为30mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCl平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用浓度为30mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCl平衡缓冲液进行冲洗，再用含有0.02mol/LNaCl的浓度为30mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCl平衡缓冲液进行冲洗；
(4)用含有0.1mol/LNaCl的浓度为30mmol/L、pH值为8.0的Tris-HCl平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
阳离子交换层析
(5)用200mL含有0.9mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对CMSepharoseFastFlow阳离子交换层析柱(2.6×20cm)进行预平衡，再用浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液进行平衡；
(6)用含有0.2mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
(7)用250mL含有1mol/L(NH4)2SO4的浓度为20mmol/L、pH值为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对PhenylSepharsoe6FastFlow疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含有1mol/L(NH4)2SO4的浓度为20mmol/L、pH值为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液进行平衡；
(8)用含有0.6mol/L(NH4)2SO4的浓度为20mmol/L、pH值为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
脱盐层析
(9)用含有0.06mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对SephadexG-25coarse脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后将收集的蛋白液进行除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
所获得的目的蛋白原液采用SEC-HPLC方法检测，纯度可以达到99.2％。
Claims (10)
1.一种重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：其具体步骤为：
亲和层析
(1)用含盐的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗；
(2)用pH值3.0～4.5的平衡缓冲液对步骤(1)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活；
阴离子交换层析
(3)用含盐的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗；
(4)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
阳离子交换层析
(5)用含盐的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含盐的平衡缓冲液进行平衡；
(6)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
(7)用含盐的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含盐的平衡缓冲液进行平衡；
(8)用含0.35～0.6mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
脱盐层析
(9)用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液对脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后经过除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
2.一种重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：其具体步骤为：
(1)用含1mol/LNaCl的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含1mol/LNaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗；
(2)用pH值3.0～4.5的平衡缓冲液对步骤(1)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活；
阴离子交换层析
(3)用含1mol/LNaCl的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗；
(4)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
阳离子交换层析
(5)用含1mol/LNaCl的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行预平衡，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡；
(6)用含0.1～0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
(7)用含0.9mol/L(NH4)2SO4的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含0.9mol/L(NH4)2SO4的平衡缓冲液进行平衡；
(8)用含0.35～0.6mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
脱盐层析
(9)用含0.02～0.06mol/L盐的平衡缓冲液对脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后经过除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
3.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤(1)、(3)至(9)中所述的平衡缓冲液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为10～40mmol/L，pH值为5.5～8.0。
4.根据权利要求3所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤(5)至(6)中所述平衡缓冲液的pH值为5.5～6.5，步骤(7)至(8)中所述平衡缓冲液的pH值为6.5～7.5。
5.根据权利要求1所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤(1)、(3)至(9)中所述的盐选自Na2SO4、NaCl或(NH4)2SO4。
6.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的pH值3.0～4.5的平衡缓冲液选自醋酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为10～40mmol/L。
7.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的病毒灭活采用浓度为0.1～1mol/L的磷酸或柠檬酸调节pH值至3.0～4.0进行病毒灭活。
8.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤(1)、(2)中所述的亲和层析，其介质选自rProteinAFastFlow、Mabselect或MabselectSure。
9.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤(5)、(6)中所述的阳离子交换层析，其介质选自SPSepharoseFastFlow、CMSepharoseFastFlow或CaptoS。
10.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤(7)、(8)中所述的疏水作用层析，其介质选自PhenylSepharsoe6FastFlow、ButylSepharose4B或ButylSepharose4FastFlow。
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