CN110128537B - 一种无糖基化抗pd-1单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents
一种无糖基化抗pd-1单克隆抗体的纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110128537B CN110128537B CN201810135757.XA CN201810135757A CN110128537B CN 110128537 B CN110128537 B CN 110128537B CN 201810135757 A CN201810135757 A CN 201810135757A CN 110128537 B CN110128537 B CN 110128537B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer solution
- washing
- hydrochloric acid
- flow rate
- affinity chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 54
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 47
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 30
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 24
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 23
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 36
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 19
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 14
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 14
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K trisodium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N hydrochloric acid Substances Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 13
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 abstract 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 38
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 11
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 7
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 7
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 3
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 101100463133 Caenorhabditis elegans pdl-1 gene Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229930015717 petunidin Natural products 0.000 description 1
- 235000006384 petunidin Nutrition 0.000 description 1
- QULMBDNPZCFSPR-UHFFFAOYSA-N petunidin chloride Chemical compound [Cl-].OC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(=CC=3C(O)=CC(O)=CC=3[O+]=2)O)=C1 QULMBDNPZCFSPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011165 process development Methods 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及到蛋白纯化技术，具体公开了一种无糖基化抗PD‑1单克隆抗体的纯化方法。亲和层析过程中，引入盐成分，能够显著地改善亲和层析性能，降低蛋白浊度。洗涤和洗脱过程引入甘氨酸‑盐酸缓冲液，可有效减少聚体产生，增加蛋白稳定性。在病毒灭活过程中，加入了糖类物质，起到保护作用从而减少聚体形成，使抗体在低pH灭活下聚体增加变缓。本发明很好的减少了无糖基化抗pd‑1单克隆抗体纯化过程中聚体的形成，保护了蛋白的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及到单克隆抗体纯化技术，具体涉及到一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法。
背景技术
PD-1是一种免疫抑制剂性受体，主要在激活的T细胞及B细胞中，功能是抑制细胞激活，在免疫应答中发挥负调控作用，PD-1的配体PDL-1与PDL-2高表达于肿瘤微环境中，导致肿瘤微环境PD-1通路持续激活，T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞；同时PD-1的信号传导可以抑制B细胞增殖、分化Ig类型转换，在建立和维护外周自身耐受中起重要作用。
抗PD-1单抗是针对PD-1的一种抗体蛋白，该抗体能特异性地与PD-1结合，阻断PDL-1与PD-1相结合部分，恢复T细胞功能，对肿瘤生长具有显著抑制作用，在治疗肿瘤方面具有很好的靶向潜能。针对这一优势，开发研制了一种重组人源化抗PD-1单克隆抗体，其上糖基化修饰被敲除。过去多年的抗体研究都强调糖基化对抗体功能的重要性，但带糖基化的抗体免疫原性和蛋白折叠凳也会存在很多不确定性，增加了工艺开发的难度。目前部分研究者发现无糖基化后的抗体开发比较稳定，均一性提高，且能降低抗体在体内引起的炎症及细胞毒性，同时抗体的Fc片段更灵活，更易与FcyRs结合。然而构建的无糖基化的抗PD-1单克隆抗体由于去除糖基化而对胰蛋白酶等的敏感性显著增加，结构灵活性增强，在低pH情况下更容易有聚体形成的趋势，易聚集沉淀，急需一种纯化方法来解决蛋白聚集问题。
从重组表达的宿主中提取单克隆抗体，柱层析是关键。结合在柱上的蛋白可以通过调节流动相的类型、pH和浓度来被洗脱下来，在这些过程中，存在蛋白浓度或表面密度过高的情况，从而导致聚体形成以及蛋白的异质性。层析中的亲和层析通常有很高的配基密度高，更易在柱表面或柱上部形成高蛋白密度，且亲和层析通常用于粗纯对回收率要求较高，洗脱pH较低，蛋白易沉淀，更易产生聚体，故更需在纯化过程中减少聚体的产生，提高蛋白稳定性。抗体纯化过程中病毒灭活多采用低pH病毒灭活，在低pH条件下，目的蛋白容易产生聚体，这些聚体的产生大大威胁了抗体的稳定性，对临床用药也存在潜在威胁，因此很有必要提供一种抗体纯化方法来减少这些聚体的产生。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种可有效减少聚体产生的无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，该方法可有效减少聚体产生，提高抗PD-1单抗的稳定性和回收率。本发明的技术方案如下：
一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，包括亲和层析和病毒灭活步骤。
优选地，该方法具体包括如下步骤：
(1)对细胞培养液上清进行亲和层析：平衡、上样、洗涤、洗脱过程；
(2)收集步骤(1)洗脱流出液加入糖类物质，搅拌至完全溶解；
(3)将步骤(2)所得样品调pH进行低pH病毒灭活。
优选地，所述步骤(1)中亲和层析过程，平衡过程采用缓冲液平衡，缓冲液为含盐的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液(0.02mol/L，pH7.0～7.4)；洗涤过程包括三步，第一步平衡缓冲液复平衡，第二步所用的洗涤缓冲液为含盐的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.0～8.5)；第三步洗涤所用的洗涤缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH4.5～5.5)；洗脱缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.7～3.1)。
优选地，所述的盐为氯化钠，氯化钾或氯化铵中的一种，平衡液所述含盐浓度为0.15mol/L，第二步洗涤所述含盐浓度为0.15～0.5mol/L。
优选地，步骤(2)所述的糖类物质选自蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨醇中的一种，优选蔗糖。
优选地，糖类物质的质量与步骤(1)洗脱流出液样品的质量体积比为0.02～0.08:1，其中质量以g计，体积以ml计。
优选地，步骤(3)的操作过程是采用pH调节剂调节pH3.5～3.9，灭活1h，然后再调节至pH6.0～7.0，其中pH调节剂为0.1～1mol/L柠檬酸或磷酸氢二钠。
另外，亲和层析过程，甘氨酸-盐酸缓冲液还可以是组氨酸-盐酸缓冲液。为了得到更高纯度的抗PD-1单抗，在亲和层析和病毒灭活后可进行离子交换层析、超滤等步骤，经过此进一步纯化后，聚体可减少到0.3％以下。
本发明所述的细胞培养液是CHO细胞培养液，需要对其进行深层过滤，深层过滤滤膜和条件不做限制，只要能够得到满足下一步亲和层析的滤出液即可。本发明不对亲和层析填料进行限制，可以是Mabselectsure LX，也可以是Mabselectsure、ProteinA等填料。
本发明在亲和层析过程中，引入盐成分，能够显著地改善亲和层析性能，降低蛋白浊度。洗涤和洗脱过程引入甘氨酸-盐酸缓冲液，甘氨酸作为氨基酸，可以作为蛋白保护剂，在低pH洗涤洗脱条件下，可有效减少聚体产生，增加蛋白稳定性。在病毒灭活过程中，加入了糖类物质，可以减少聚体形成，使抗体在低pH灭活下聚体增加变缓；另外所加入的糖类物质本身就是药用辅料，增大了药用安全性。本发明很好的减少了无糖基化抗PD-1单克隆抗体纯化过程中聚体的形成，保护了蛋白的稳定性。
本发明操作简单，方便易行，安全性高，可使得抗PD-1单抗的纯度达到97％以上，浊度降低到60NTU以下，收率提高到99％以上，且成本低廉，可用于工业化大规模生产。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面通过具体的实施例来进一步说明本发明的技术方案，但这些实施例并不限制本发明。
实施例中所用的原料与耗材均可通过商业途径或公知方法制备获得。本发明实施例中所使用的样品是抗PD-1单克隆抗体是体外哺乳动物细胞发酵表达而得到，动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，单克隆抗体为IgG1类型，其FC片断的三个糖基化位点发生突变。本发明中样品为细胞培养液需通过深层过滤后得到的。
以下实施例亲和层析柱为XK16柱，购自GE公司，填料为：Mabselectsure LX；样品为：通过深层过滤后的细胞培养液上清，其蛋白表达量为4.2g/L，以下实施例亲和层析上柱样品蛋白量为1500mg。柱子载样量为50g/L。CV为30mL，CV表示柱体积。
实施例1
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速5.6ml/min，然后用含0.15mol/L氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤5CV；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH4.5)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共100mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入5g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/L的柠檬酸调节pH至3.5灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.0，取样检测。各步骤中取样检测结果见表1。
表1实施例1各步骤检测结果
实施例2
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钾0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.4)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速5.6ml/min；然后用含0.5mol/L氯化钾的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.3)洗涤5CV；再用的甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH5.0)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.9)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共198mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入3.96g海藻糖，搅拌至完全溶解，用0.1mol/L的柠檬酸调节pH至3.9灭活1h，再用0.5mol/L的磷酸氢二钠调pH至7.0，取样检测。各步骤中取样检测结果见表2。
表2实施例2各步骤检测结果
阳离子层析
填料：P0ROS HS
(a)平衡：用20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(pH6.0,3.0mS/cm)平衡5CV，流速为10ml/min。
(b)上样：病毒灭活步骤后的样品经过深层过滤和0.22um滤膜后，调pH6.0，以40mg/ml的载量上样。
(c)洗涤：先用上述平衡液洗涤3CV，再用20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)洗涤5CV，流速为10ml/min。
(d)洗脱：利用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0，5mS/cm)洗脱，收集流出液记为CEXPro。
阴离子层析
填料：POROS 50PI
(e)平衡：利用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0，5mS/cm)平衡5CV
(f)上样：CEX Pro上样流穿，收集流出液记为AEX Pro。阳离子层析和阴离子层析取样检测结果见表3。
表3实施例2离子交换层析检测结果
以上离子交换层析过程仅用于例证的目的，并不限制本发明后续离子交换过程。
实施例3
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速5.6ml/min，然后用含0.3mol/L氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤5CV，再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH4.5)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸(0.02mol/L，pH2.7)缓冲液进行洗脱，流速5.6ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共94mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入7.52g甘露糖，搅拌至完全溶解，用1mol/L的柠檬酸调节pH至3.6灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表4。
表4实施例3各步骤检测结果
实施例4
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化氨0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.2)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速为5.6ml/min；然后用含0.5mol/L氯化氨的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.5)洗涤5CV；再用组氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH5.0)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用组氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.9)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共210mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入12.6g山梨醇，搅拌至完全溶解，用1mol/L的柠檬酸调节pH至3.9灭活1h，再用0.1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.0，取样检测。各步骤中取样检测结果见表5。
表5实施例4各步骤检测结果
实施例5
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速为5.6ml/min，然后用含0.15mol/L氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤5CV；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH5.5)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共176mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入7.04g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/L的柠檬酸调节pH至3.7灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表6。
表6实施例5各步骤检测结果
实施例6
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.2)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速为5.6ml/min，然后用含0.3mol/L氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.5)洗涤5CV；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH5.0)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH3.1)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共200mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入9.16g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.8mol/L的柠檬酸调节pH至3.7灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.8，取样检测。各步骤中取样检测结果见表6。
表7实施例6各步骤检测结果
对比实施例1
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速为5.6ml/min，然后用Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤5CV；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH5.5)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共189mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入7.44g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/L的柠檬酸调节pH至3.7灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表7。
表7对比实施例1各步骤检测结果
对比实施例2
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.4)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速为5.6ml/min，然后用含Tris缓冲液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤5CV；再用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.01mol/L，pH5.2)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.01mol/L，pH3.8)流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共130mL，取样检测。
病毒灭活
向步骤(4)收集的流出液加入5.20g蔗糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/L的柠檬酸调节pH至3.7灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表8。
表8对比实施例2各步骤检测结果
对比实施例3
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速为5.6ml/min，然后用含0.15mol/L氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤5CV；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH5.5)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共176mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液搅拌均匀，用0.5mol/L的柠檬酸调节pH至3.7灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表9。
表9对比实施例3各步骤检测结果
对比实施例4
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速为5.6ml/min，然后用含0.15mol/L氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤5CV；再用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH5.5)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用甘氨酸-盐酸缓冲液(0.02mol/L，pH2.7)进行洗脱，流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共176mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液加入7.04g乳糖，搅拌至完全溶解，用0.5mol/L的柠檬酸调节pH至3.7灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表10。
表10对比实施例4各步骤检测结果
对比实施例5
亲和层析：
(1)平衡：用含氯化钠0.15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.02mol/L，pH7.4)平衡层析柱5CV，流速10ml/min；
(2)上样：将上述样品进行上样，使抗体蛋白吸附到亲和层析柱上，流速5.6ml/min；
(3)洗涤：上样结束后先用上述平衡缓冲液进行复平衡3CV，流速为5.6ml/min，然后用的Tris缓冲液(0.02mol/L，pH8.5)洗涤5CV；再用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.01mol/L，pH5.2)洗涤3CV，流速10ml/min；
(4)洗脱：用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.01mol/L，pH3.8)流速10ml/min，收集洗脱流出液至基线平稳，共130mL，取样检测。
病毒灭活：
向步骤(4)收集的流出液搅拌均匀，用0.5mol/L的柠檬酸调节pH至3.7灭活1h，再用1mol/L的磷酸氢二钠调pH至6.5，取样检测。各步骤中取样检测结果见表11。
表11对比实施例5各步骤检测结果
阳离子层析
填料：P0ROS HS
(a)平衡：用20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(pH6.0,3.0mS/cm)平衡5CV，流速为10ml/min。
(b)上样：病毒灭活步骤后的样品经过深层过滤和0.22um滤膜后，调pH6.0，以40mg/ml的载量上样。
(c)洗涤：先用上述平衡液洗涤3CV，再用20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)洗涤5CV，流速为10ml/min。
(d)洗脱：利用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0，5mS/cm)洗脱，收集流出液记为CEXPro。
阴离子层析
填料：POROS 50PI
(e)平衡：利用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0，5mS/cm)平衡5CV
(f)上样：CEX Pro上样流穿，收集流出液记为AEX Pro。阳离子层析和阴离子层析取样检测结果见表12。
表12对比实施例5离子交换层析检测结果
以上离子交换层析过程仅用于例证的目的，并不限制本发明后续离子交换过程。
Claims (3)
1.一种无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，包括亲和层析和病毒灭活步骤，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）对细胞培养液上清进行亲和层析：平衡、上样、洗涤、洗脱过程；平衡缓冲液为pH7.0-7.4含盐的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液；所述洗涤过程包括三步洗涤，首先用平衡缓冲液复平衡，然后用pH8.0~8.5含盐的Tris-盐酸缓冲液进行洗涤，再用pH4.5~5.5甘氨酸-盐酸缓冲液进行洗涤；洗脱缓冲液为pH2.7~3.1甘氨酸-盐酸缓冲液；
所述的盐为氯化钠、氯化钾、或氯化铵的一种；平衡缓冲液中含盐浓度为0.15mol/L，第二步洗涤缓冲液含盐浓度为0.15~0.5mol/L；
（2）收集上述洗脱流出液，加入蔗糖，搅拌至完全溶解；蔗糖与洗脱流出液的质量体积比为0.02~0.08:1，其中质量以g计，体积以ml计；
（3）将步骤（2）所得样品调pH进行低pH病毒灭活。
2.根据权利要求1所述的无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述的甘氨酸-盐酸缓冲液替换为组氨酸-盐酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的无糖基化抗PD-1单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，在亲和层析和病毒灭活纯化步骤后，进行离子交换层析进一步纯化使得聚体含量降低到0.3%以下。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810135757.XA CN110128537B (zh) | 2018-02-09 | 2018-02-09 | 一种无糖基化抗pd-1单克隆抗体的纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810135757.XA CN110128537B (zh) | 2018-02-09 | 2018-02-09 | 一种无糖基化抗pd-1单克隆抗体的纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110128537A CN110128537A (zh) | 2019-08-16 |
| CN110128537B true CN110128537B (zh) | 2022-08-26 |
Family
ID=67568061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810135757.XA Active CN110128537B (zh) | 2018-02-09 | 2018-02-09 | 一种无糖基化抗pd-1单克隆抗体的纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110128537B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113845561A (zh) * | 2020-06-28 | 2021-12-28 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | 目的蛋白纯化方法 |
| CN111991571B (zh) * | 2020-08-12 | 2022-04-05 | 湖州师范学院 | 一种柱上低pH病毒灭活的方法 |
| CN113336847B (zh) * | 2021-02-03 | 2022-08-23 | 上海莱馥医疗科技有限公司 | 一种抗pd-1抗体 |
| CN113980092B (zh) * | 2021-12-09 | 2024-05-14 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种蛋白质亲和纯化方法 |
| CN115353561A (zh) * | 2022-09-29 | 2022-11-18 | 武汉佳惟达生物科技有限公司 | 一种抗体的纯化方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105175548A (zh) * | 2015-08-13 | 2015-12-23 | 齐鲁制药有限公司 | 重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法 |
| EP3189075A1 (fr) * | 2014-09-05 | 2017-07-12 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Procédé de purification d'un anticorps monoclonal |
| CN107446044A (zh) * | 2016-05-30 | 2017-12-08 | 上海迈泰君奥生物技术有限公司 | 一种纯化抗体的方法及所用缓冲液 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040022792A1 (en) * | 2002-06-17 | 2004-02-05 | Ralph Klinke | Method of stabilizing proteins at low pH |
-
2018
- 2018-02-09 CN CN201810135757.XA patent/CN110128537B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3189075A1 (fr) * | 2014-09-05 | 2017-07-12 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Procédé de purification d'un anticorps monoclonal |
| CN105175548A (zh) * | 2015-08-13 | 2015-12-23 | 齐鲁制药有限公司 | 重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法 |
| CN107446044A (zh) * | 2016-05-30 | 2017-12-08 | 上海迈泰君奥生物技术有限公司 | 一种纯化抗体的方法及所用缓冲液 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Aggregates in Monoclonal Antibody Manufacturing Processes;Marı´a Va´zquez-Rey;《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》;20110731;第108卷(第7期);第1494-1508页 * |
| Elucidation of Acid-induced Unfolding and Aggregation of Human Immunoglobulin IgG1 and IgG2 Fc;Ramil F. Latypov;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20120106;第287卷(第2期);第1381-1396页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110128537A (zh) | 2019-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110128537B (zh) | 一种无糖基化抗pd-1单克隆抗体的纯化方法 | |
| US10246484B2 (en) | Method for purifying recombinant protein | |
| EP3048109A1 (en) | Novel antibody purification method and antibody obtained therefrom, and novel antibody purification method using cation exchanger and antibody obtained therefrom | |
| CN106536565A (zh) | 一种用于纯化TNFR‑Fc融合蛋白的方法 | |
| CN107446044B (zh) | 一种纯化抗体的方法及所用缓冲液 | |
| CN109369806A (zh) | 苏金单抗制品中半胱氨酸化变异体的去除方法 | |
| CN113416243B (zh) | 一种纯化抗体的方法 | |
| JP5984854B2 (ja) | 移動相の調整によって、ポリペプチド単量体、凝集物およびフラグメントを分離するための選択性を向上させた、イオン交換クロマトグラフィー | |
| CN117343163A (zh) | 一种多功能重组抗体的纯化方法 | |
| CN106380519A (zh) | 一种单克隆抗体的纯化方法 | |
| CN104098697A (zh) | 一种重组人源抗人肿瘤坏死因子单克隆抗体的纯化方法 | |
| CN118126110B (zh) | 一种纯化单克隆抗体的方法 | |
| CN110128538B (zh) | 一种纯化抗cd20人鼠嵌合单克隆抗体的方法 | |
| CN112979806A (zh) | 一种抗Her2抗体的制备方法 | |
| EP4421089A1 (en) | Method for purifying fusion protein having igg fc domain | |
| CN114539416B (zh) | 一种双特异性抗体的层析纯化工艺 | |
| CN110724204B (zh) | Fc融合蛋白的纯化方法 | |
| AU2004315196A1 (en) | Process for purifying proteins | |
| CN113150123A (zh) | 一种制备级分离蛋白质电荷异构体的方法 | |
| CN107698676B (zh) | 一种高纯度尿促性素的提取制备方法 | |
| CN118791623A (zh) | 双特异性抗体蛋白的层析纯化方法 | |
| CN117736324B (zh) | 一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法 | |
| EP0084344A2 (en) | Anti-urokinase monoclonal antibodies and process for preparing the same | |
| US20250243240A1 (en) | Method for purifying fusion protein having igg fc domain | |
| CN114539417A (zh) | 一种有效去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |