CN105122034A - 用于尿样中粒子分析的流通池、鞘液和自动对焦系统以及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于分析包含粒子的样品的装置、系统、组合物和方法。粒子成像系统或分析仪可包括通过其使包含粒子的尿样流动的流通池，以及捕获图像以用于图像分析的高光学分辨率成像设备。用于自动对焦的对比光栅设置在所述流通池上。所述图像处理器由像素数据对比度评估焦点精确度。定位电机沿着所述光轴移动所述显微镜和/或流通池以用于自动对焦于所述对比光栅靶标。所述处理器随后使显微镜和流通池位移所述对比光栅和所述样品料流之间的已知距离，从而聚焦于所述样品料流。从该位置采集细胞或粒子图像，直至通过输入信号或当检测所述图像数据中的温度变化或焦点不精确度时周期性地再引发自动对焦。

Description

用于尿样中粒子分析的流通池、鞘液和自动对焦系统以及方法

相关专利申请的交叉引用

本申请是提交于2013年3月15日的美国临时专利申请No.61/799,014的非临时申请，并要求该临时专利申请的优先权权益，该临时专利申请的内容以引用的方式并入本文。本申请还涉及均提交于2014年3月17日的美国专利申请No.14/216,562和国际专利申请No.(contrastagent)(造影剂)。这些提交文档中的每一者的内容均以引用方式并入本文。

背景技术

本发明涉及用于粒子分析的系统、分析仪、组合物和方法的领域，所述粒子分析包括使用全部或部分自动化的设备使流体样品诸如尿样中的粒子成像以区分和定量样品中的粒子。本发明还涉及可用于分析来自受试者的尿样中的粒子的粒子和/或细胞内细胞器配向液(intracellularorganellealignmentliquid，PIOAL)、用于制备所述液体的方法、以及使用所述液体检测和分析尿液中粒子的方法。还公开了可用于进行基于图像的尿样分析的组合物和方法。本发明的组合物和方法还可用于对尿液中的粒子进行检测、计数和表征，此类粒子可包含例如细胞、管型、晶体或脂肪体，并且可用于基于图像和形态学的粒子计数、分类、亚分类、表征和/或分析。

尿沉渣分析是最常执行的诊断测试之一以便提供患者健康状态的概况。可从患者身体获得尿样并保存在试管中以用于稍后处理和分析。某些特征沉渣(也称为尿样中的有形成分)的外观可具有临床意义和/或指示受试者中的病理病症。

一般来讲，异常尿液可包含多种有形成分，诸如血细胞、上皮细胞、晶体、管型或微生物。例如，尿样可包含血液学来源的细胞。由于在泌尿生殖系统中从肾小球至尿道的任一点处出血(血尿)，尿液中可存在红血球或红血细胞(RBC)。白血球或WBC、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的存在可具有临床意义。闪光细胞是比重为1.010或更小的低渗尿中可见的一种类型的中性粒细胞。淋巴细胞的存在已被用作移植后肾排斥的早期指示。嗜酸性粒细胞与药物引起的间质性肾炎相关，可存在源自肾或下尿路的黏液丝。

尿样还可以包含上皮来源的细胞。少量的肾上皮细胞(也称为肾小管细胞)可由于正常表皮脱落而存在于健康人体的尿液中。然而，过量肾小管细胞的存在指示存在活动性肾病或肾小管损伤。在存在于尿液中的各种类型上皮细胞(肾、移行或泌尿道、和鳞状)中，肾上皮细胞具有最重要的临床意义。它们与急性肾小管坏死、病毒感染(诸如细胞巨化病毒)和肾移植排斥反应相关。其存在还随发烧、化学毒素、药物(特别是阿司匹林)、重金属、炎症、感染和肿瘤而增加。此外，包涵体的存在可见于病毒感染中，诸如风疹和疱疹，并且特别是对于细胞巨化病毒。

尿液还可以包含移行上皮细胞或泌尿道上皮细胞。移行上皮细胞为内皮被覆于从肾盂至男性尿道的远部以及至女性中膀胱(三角)的基部的尿路的多层上皮细胞。可能难以将其与肾上皮细胞区分开，但其通常更大并且更接近球形。少量的移行细胞存在于健康人体的尿液中。数量增加与感染相关。这些细胞的大团块或薄片可见有移行细胞恶性肿瘤。

尿液还可以包含鳞状上皮细胞。鳞状上皮细胞内被覆在女性的尿道和男性尿道的远侧部分。女性中大量鳞状细胞的存在通常指示存在阴道污染。

尿液还可以包含线索细胞。线索细胞为另一种类型的阴道来源鳞状细胞，可看到其污染尿液沉渣。该鳞状上皮细胞用细菌(阴道加德纳氏菌)覆盖或包覆，其存在指示细菌性阴道炎。

尿液还可以包含椭圆形脂肪体、肾小管脂肪或肾小管脂肪体。这些脂肪体为填充有脂肪或类脂小滴的肾上皮细胞(或巨噬细胞)。脂肪可以为中性脂肪(三甘油酯)或胆固醇；其具有相同临床意义。尿液中存在椭圆形脂肪体指示存在疾病异常，并且不应被忽视。经常看到其在尿液沉渣中具有脂肪管型和脂肪滴并与大量蛋白尿相关，如肾病综合征中所见。

尿液还可以包含微生物，诸如细菌和酵母。正常情况下，尿液为无菌的，或不含细菌。然而，在碱性pH的尿液中通常看到存在某种细菌。相关的沉渣发现可以包括存在WBC(中性粒细胞)和管型(WBC、细胞、颗粒或细菌)。尽管感染最常起因于肠来源的革兰氏阴性杆菌，但感染性生物体也可以为革兰氏阳性球菌。

此外，在尿液中可以看到酵母，特别是由于阴道污染，诸如来自具有酵母感染的女性患者的污染。由于存在尿葡萄糖，因此其还与糖尿病相关。酵母为来自皮肤和环境的常见污染物，并且感染为虚弱和免疫抑制或免疫损害患者中的问题。

传统上，通过在一般实验室中使用显微镜目测对尿液中的沉渣进行分析。利用这些方法，使尿样首先经受离心分离并浓缩。由此获得的沉渣在一些情况下被染色并随后加载到显微镜载片上，并且在显微镜下经受手动测定和计数。

样品制备步骤可以包括通过离心而使尿液沉渣浓缩并且有时应用显微镜法染液提高例如沉渣类型(诸如RBC、WBC和上皮细胞)之间的对比度。在手动计数中，技术人员观察湿法封片载片，从而在各类型的可见细胞之中或使用专业判断通过其外观进行区分，并且对预定区域内不同类型的所观察尿液沉渣的数量进行手动计数。

使用系统进行尿液分析通常在以下文献中有所描述：授予Villa-Real、名称为“CompactSanitaryUrinalysisUnit”(紧凑的卫生验尿单元)的美国专利No.4,473,530；均授予McDonald、名称为“UrineCollectionandAnalysisDevice”(尿液采集和分析设备)的美国专利No.3,894,845和名称为“MicroorganismAnalysisDevice”(微生物分析设备)的美国专利No.3,988,209；授予Schluter、名称为“DeviceforUrinalysis”(用于验尿的设备)的美国专利No.4,973,450；授予Mansour等人、名称为“DetectionandQuantitationofMicroorganisms,LeukocytesandSquamousEpithelialCellsinUrine”(检测和定量尿液中的微生物、白血球和鳞状上皮细胞)的美国专利No.4,622,298；和授予Parker、名称为“MethodandApparatusforPreparationofLiquidsforExamination”(制备检查用的液体的方法和装置)的美国专利No.5,132,232。授予Deindoerfer等人、名称为“MethodofAnalyzingParticlesinaFluidSample”(分析流体样品中粒子的方法)的美国专利No.4,612,614报告了一种通过在扩展区域上方分布样品来分析尿沉渣的方法，所述区域诸如显微镜载片或流通池。Deindoerfer等人报告了使用样品的多个光学静态图像，所述图像被转变成电子图像，其显示于通过视觉可辨别特性的类别排序的阵列中。然而，这些早期开发尿液分析系统中的多者通常缺乏为了所有预期目的而适应所有靶标/受试者所需要的通过量、精确度和/普遍适用性。

为了使尿沉渣测定自动化，可以使用自动化流式显微镜(例如，流式自动显微镜--IrisDiagnostics公司)。利用这些类型的设备，将尿样引入平型流通池而不进行预浓缩并在样品流过流通池时拍摄并保存图像。然而，尿沉渣在其形态上多样化并且许多沉渣受损，并且因此难以实现对以良好精确度拍摄的图像进行测定。特别难的是在没有外部用户验证的情况下以良好精确度测定小尺寸沉渣，诸如红血球(特别是变形红血球)、细菌和晶体。

虽然当前已知的粒子分析系统和方法以及相关医学诊断技术可为医生、临床医生和患者提供实际益处，但还需要进一步改进。本发明的实施例对这些尚未解决的需求中的至少一些提供了解决方案。

发明内容

本发明涉及用于分析包含粒子的制备样品(诸如尿样)的分析仪、系统、组合物和方法。在一些方面，系统包括可为视觉分析仪的分析仪。在一些方面，分析仪包含视觉(例如，成像)分析仪和处理器。在一个方面，本发明涉及自动化粒子成像系统，其中使含有所关注粒子的尿样流过具有观察口的流通池，高光学分辨率成像设备通过该观察口来捕获图像。在一些方面，高光学分辨率成像设备包括相机诸如数码相机。在一个方面，高光学分辨率成像设备包括物镜镜头。

流通池耦合到样品流体源诸如制备的样品，并且耦合到粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)源。系统允许捕获流动的样品中的粒子的聚焦图像。在一些实施例中，图像可用于自动化、高通过量方法以对粒子进行分类和亚分类。

在一个实施例中，分析仪被配置成检测样品中具有一种或多种视觉区别的粒子并对样品中粒子的不同类目或亚类目的精确粒子计数或浓度进行测定。

样品可通过任何常规方法获得，例如尿样采集。样品可来自被认为健康的受试者，例如，作为常规体检或对照组的一部分采集的样品。样品也可来自具有失调、有失调风险或疑似具有失调的受试者。失调可由疾病、遗传异常、感染、损伤或未知原因引起。作为另外一种选择或除此之外，方法可用于在治疗失调的过程期间监测受试者。如果存在对治疗的非响应性的迹象，临床医生可选择替代或辅助治疗。根据受试者的病症和具体失调(如果有的话)，可每日、每周、每月或每年采集一次(或两次、三次等等)样品。样品可通过与本文所述的粒子造影剂组合物接触而制备。

粒子可根据样品而有所差异。粒子可为生物细胞，例如，上皮细胞或血细胞。在一些实施例中，粒子可为感染因子，例如，细菌、原生生物、原生动物、真菌或寄生生物。

在一个方面，本发明的实施例涵盖使用粒子分析系统使粒子成像的方法。在一些情况下，系统被配置用于几何流体聚焦。粒子可包括在体液样品内。示例性方法包括沿着粒子分析仪的流通池的流路注射鞘液；将体液样品以一定流速从样品流体注射管注射到流通池内的流动鞘液中以便提供具有邻近注射管的第一厚度的样品流体料流，所述流通池的流路具有流路尺寸的缩减段，使得样品流体料流的厚度从初始厚度降低到邻近图像捕获位点的第二厚度；通过使具有相对于流通池固定的位置的成像靶标成像来使图像捕获设备聚焦，所述成像靶标和样品流动料流限定沿着成像轴的预定位移距离；以及使用图像捕获设备在流动料流内沿着流通池的图像捕获位点处的成像轴采集适用于粒子表征和计数的来自第一样品的第一多个粒子的聚焦图像，其中使用聚焦步骤和预定位移距离使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。其中流路尺寸的缩减段可由具有近侧厚度的近侧流路部分和具有小于近侧厚度的远侧厚度的远侧流路部分限定。样品流体注射管的下游端可定位在近侧流路部分的远侧。鞘液与血液流体样品之间的速度差连同流路尺寸的缩减段和样品的流速能有效地在四秒或更短时间内将样品中的细胞从样品流体注射管递送到图像捕获位点。在一些情况下，体液样品为尿液流体样品。在一些情况下，图像捕获位点具有约800μm×800μm的视野。在一些情况下，样品流体具有约900μL的体积。在一些情况下，样品流体在约1.5秒内从样品流体注射管的出口行进至图像捕获位点处的成像轴。在一些情况下，流路尺寸的缩减段由流路的相对壁限定，所述相对壁沿着流路径向地向内成角度，总体上关于横向平面对称，所述横向平面平分样品流体料流第一和第二厚度。在一些情况下，流通池被配置成在第一流动方向上在流路中接收来自鞘液源的鞘液，所述第一流动方向垂直于沿着成像位点处的流路的鞘液的第二流动方向。在一些情况下，流通池包括图像捕获设备的自动对焦靶标。在一些情况下，自动对焦靶标可处于相对于流通池的固定位置。在一些情况下，体液样品具有样品粘度，并且鞘液具有与样品粘度不同的鞘液粘度。

在另一个方面，本发明的实施例涵盖执行几何流体聚焦以便使体液样品中的粒子成像的粒子分析系统。示例性系统可以包括：流通池，所述流通池具有被配置用于传递鞘液流的流路；样品流体注射系统，所述样品流体注射系统与流路流体连通并且被配置用于将样品注射到流通池内的流动鞘液中以便提供具有邻近注射管的第一厚度的样品流体料流，所述流通池的流路具有流路尺寸的缩减段使得样品流体料流的厚度从初始厚度降低到邻近图像捕获位点的第二厚度。此外，系统可以包括：图像捕获设备，所述图像捕获设备与图像捕获位点配向以便在流通池的图像捕获位点处使来自样品流体的多个粒子成像；聚焦机构，所述聚焦机构被配置成设定图像捕获设备相对于流通池的焦点状态；成像靶标，所述成像靶标具有相对于流通池固定的位置。成像靶标和样品流动料流可沿着成像轴限定位移距离。系统还可以包括处理器、聚焦模块，所述聚焦模块具有体现机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便操作聚焦机构使用位移距离设定适于粒子表征和计数的图像捕获设备的焦点状态。在一些情况下，样品流体注射系统被配置成递送样品流体，使得样品流体具有约2至4秒范围内穿过流通池的运输时间。在一些情况下，体液样品为尿液流体样品。在一些情况下，图像捕获位点具有约800μm×800μm的视野。在一些情况下，样品流体具有约900μL的体积。在一些情况下，流路尺寸的缩减段由流路的相对壁限定，所述相对壁沿着流路径向地向内成角度，总体上关于横向平面对称，所述横向平面平分样品流体料流第一和第二厚度。在一些情况下，流通池被配置成在第一流动方向上在流路中接收来自鞘液源的鞘液，所述第一流动方向垂直于沿着成像位点处的流路的鞘液的第二流动方向。在一些情况下，流通池包括图像捕获设备的自动对焦靶标。在一些情况下，自动对焦靶标具有相对于流通池的固定位置。在一些情况下，体液样品具有样品粘度，并且鞘液具有与样品粘度不同的鞘液粘度。

在另一个方面，本发明的实施例涵盖使用被配置用于几何流体聚焦的粒子分析系统使体液样品中的粒子成像的方法。粒子可包含在流体样品中，所述流体样品具有样品流体粘度。示例性方法包括：将流体样品注射到流通池内以使得流体样品流体以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动，所述样品流动料流流过流路尺寸的缩减段并横越成像轴；通过使具有相对于流通池固定的位置的成像靶标成像来使图像捕获设备聚焦；以及使用图像捕获设备在流动料流内采集适用于粒子表征和计数的粒子的聚焦图像，其中使用位移距离使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。在一些情况下，体液样品为尿样。

在另一个方面，本发明的实施例涵盖执行几何流体聚焦以便使体液样品中的粒子成像的粒子分析系统。示例性系统可以包括：流通池，所述流通池具有带有注射管的流路以及具有带有从中穿过的成像轴的成像窗口，所述流通池的流路具有流路尺寸的缩减段；流体输入口，所述流体输入口与注射管流体连通，所述流体输入口被配置用于将流体样品注射到流通池中以使得流体样品以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动；图像捕获设备；聚焦机构，所述聚焦机构被配置成设定图像捕获设备相对于流通池的焦点状态；成像靶标，所述成像靶标具有相对于流通池固定的位置，所述成像靶标和样品流动料流限定沿着成像轴的位移距离；处理器；以及聚焦模块，所述聚焦模块具有体现机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便操作聚焦机构使用位移距离设定适于粒子表征和计数的图像捕获设备的焦点状态。在一些实施例中，体液样品为尿样。

在另一个方面，本发明的实施例涵盖使用被配置用于组合式粘度和几何流体聚焦的粒子分析系统使多个粒子成像的方法。粒子可包含在具有样品流体粘度的体液样品中。示例性方法可以包括：使鞘液沿着流通池的流路流动，所述鞘液具有与样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘液粘度；以及将体液样品注射到流通池内的流动鞘液中以便提供被鞘液包围的样品流体料流。方法还可以包括使样品流体料流和鞘液穿过流路尺寸的缩减段流向成像位点，使得与粘度差相关的鞘液和样品流体料流之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用连同与流路尺寸的缩减段相关的鞘液和样品流体料流之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用有效地在成像位点在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态，同时鞘液中的粘度剂保持样品流体料流中细胞的活力，使得在细胞从样品流体料流延伸到流动鞘液中时使细胞的结构和内容物完好无损。另外，方法可以包括在成像位点使多个粒子成像。在一些实施例中，体液样品为尿样。

在又一个方面，本发明的实施例涵盖用于使具有样品流体粘度的体液样品中的多个粒子成像的系统。系统可被配置成与鞘液一起使用，所述鞘液具有与样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘液粘度。示例性系统可以包括：具有流路和样品流体注射管的流通池，所述流路具有流路尺寸的缩减段；与流通池的流路流体连通以便沿着流通池的流路传递鞘液流的鞘液输入口；以及与流通池的注射管流体连通以便将体液样品流注射到流通池内的流动鞘液中的体液样品输入口，以使得当鞘液和样品流体穿过流路尺寸的缩减段流向成像位点时，与粘度差相关的鞘液和样品流体之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用连同与流路尺寸的缩减段相关的鞘液和样品流体之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用在成像位点在所述多个粒子的至少一些中提供靶成像状态，同时鞘液中的粘度剂保持样品流体料流中细胞的活力，使得在细胞从样品流体料流延伸到流动鞘液中时细胞的结构和内容物完好无损。系统还可以包括在成像位点使所述多个粒子成像的成像设备。在一些实施例中，体液样品为尿样。

当结合附图来考虑时通过参考下文的具体实施方式，本发明实施例的上述特征和许多其他特征以及伴随的优点将会变得显而易见和得到进一步地理解。

附图说明

图1是以部分横截面表示的并且未按比例绘制的示意图，示出了用于使用数字图像处理进行样品图像分析的示例性流通池以及自动对焦系统和高光学分辨率成像设备的各操作方面。

图1A和1B示出了根据本发明实施例的光具座布置方式。

图1C是根据本发明实施例的验尿分析仪的框图。

图1D示出了根据本发明实施例的方法的流程图。

图1E描绘了根据本发明实施例的模块系统的各方面。

图2是根据示例性实施例的流通池的透视图。

图3是沿着图2所示的流通池的线3-3的纵向正中截面图。

图3A和图3B根据本发明实施例提供了流通池的附加截面图。

图4示出了根据本发明实施例的成像系统的各方面。

图4A、图4B-1和图4B-2描绘了根据本发明实施例的流通池的各方面。

图4A-1和图4A-2分别描绘了根据本发明实施例的在插管出口和图像捕获位点的流通池内的鞘液(例如PIOAL)包围和样品料流尺度的横截面视图。

图4C-4G、4C-1和4D-1描绘了根据本发明实施例的插管构形的各方面。

图4H示出了根据本发明实施例的插管的一部分。

图4I和4J描绘了根据本发明实施例的流通池。

图4K和4L示出了根据本发明实施例的流过流通池的图像捕获位点的样品料流。

图4K-1和4K-2示出了根据本发明实施例的靶标成像位点。

图4K-3描绘了根据本发明实施例的样品流动料流中的粒子配向的各方面。

图4L-1描绘了根据本发明实施例的流通池的流路内的流体流动料流速度剖面的各方面。

图4M和4N示出了根据本发明实施例的示例性细胞内粒子配向特征。

图4O和4P示出了根据本发明实施例使用PIOAL获得的图像与使用常规鞘液获得的图像之间的比较的图像。

图4Q示出了使用根据本发明实施例的系统和方法获得的所得图像。

图5描绘了根据本发明实施例的与流通池中一种或多种样品流体的注射相对应的时间线。

图6描绘了根据本发明实施例的用于使尿液流体样品中的粒子成像的示例性方法的各方面。

图7和8描绘了根据本发明实施例的存在于流通池的流路内的流动料流应变速率的各方面。

图9A描绘了根据本发明实施例的示例性自动对焦靶标。

图9B示出了根据本发明实施例的捕获图像。

图10和11描绘了根据本发明实施例的示例性自动对焦靶标。

图12A描绘了根据本发明实施例的示例性自动对焦靶标。

图12B示出了根据本发明实施例的自动对焦靶标的中心部分的近距离视图。

图13A、13B和13C描绘了根据本发明实施例的流通池温度传感器的视图。

图13D描绘了根据本发明实施例的流通池气泡移除技术的各方面。

图14A和14B提供了根据本发明实施例的截面侧视图，其示出了聚焦系统和方法的各方面。

图14C描绘了根据本发明实施例的流通池的截面侧视图，其示出了聚焦系统和方法的各方面。

图14D提供了根据本发明实施例的截面侧视图，其示出了聚焦系统和方法的各方面。

图15描绘了根据本发明实施例的自动对焦光栅和聚焦技术的各方面。

图16A和16B示出了根据本发明实施例的聚焦系统和方法的各方面。

具体实施方式

本发明涉及用于分析包含粒子的尿样的分析仪、系统、组合物和方法。在一个实施例中，本发明涉及可以包括视觉分析仪的自动化粒子成像系统。在一些实施例中，视觉分析仪还可以包括便于图像的自动化分析的处理器。示例性尿液粒子可包括尿液沉渣粒子。示例性尿液沉渣粒子可以包括红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片。示例性细胞可以包括红血细胞、白血细胞和上皮细胞。示例性管型可以包括非细胞色素管型、未分类管型(例如，颗粒状管型)。示例性非细胞管型可以包括例如蜡样管型、宽大管型、脂肪管型和晶体管型。示例性细胞管型可以包括例如RBC管型、WBC管型和细胞管型。示例性晶体可以包括例如草酸钙、三磷酸盐、磷酸钙、尿酸、碳酸钙、亮氨酸、胱氨酸、酪氨酸和无定形晶体。示例性非鳞状上皮细胞可以包括例如肾上皮细胞和移行上皮细胞。示例性酵母可以包括例如出芽酵母和带有假菌丝的酵母。示例性尿沉渣粒子还可以包括RBC团块、脂肪、椭圆形脂肪体和滴虫。

根据本发明，提供了包括视觉分析仪的系统以获得包含悬浮在液体中的粒子的样品的图像。系统可用于例如表征生物流体中的粒子，诸如检测和定量红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片，并对这些粒子进行分类和亚分类、计数和分析。还可以想到其他类似用途，诸如表征其他流体中的细胞和粒子。

区分尿样中的尿液沉渣粒子是主题特别适合的示例性应用。样品通过自动化技术制备并作为薄带形样品料流呈递给高光学分辨率成像设备，以在带形样品料流流经视野的同时周期性地成像。粒子(诸如尿液中)的图像可用像素图像数据编程的处理技术完全自动地或以有限的人工辅助而彼此区分、分类、亚分类和计数，以鉴定和计数细胞和/或粒子。除了可以存储并使得就粒子的不寻常或关键特征而言可用的细胞图像之外，输出数据还包括在所记录的样品图像中区分的各特定类目和/或亚类目的细胞或粒子的出现次数。

存在于各图像中的不同粒子的计数可进一步处理，例如用于作为一个整体而累积样品中各区分类目和/或亚类目的细胞计数的准确且统计上显著的比率。用于基于图像(例如，视觉)的辨别的样品可进行稀释，但在稀释的样品中按比例描绘各类目和/或亚类目中的细胞计数的比率，特别是在处理多个图像之后。

验尿–粒子分析系统

现在转到附图，图1示意性地示出了示例性流通池22，所述流通池用于将样品流体传送经过高光学分辨率成像设备24的观察区23，所述高光学分辨率成像设备被配置用于使用数字图像处理使样品流动料流32中的微观粒子成像。流通池22耦合到可经受处理(诸如与粒子造影剂组合物接触并加热)的样品流体源25。流通池22还耦合到一个或多个鞘液或者粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)源27，诸如粘度大于样品流体的粘度的透明甘油溶液。

样品流体被注射通过样品进料管29的远端28的平坦开口，并在一定的点进入流通池22的内部，在所述点处已基本上确立了PIOAL流，从而在带形样品料流的上方和下方(或在其相对侧上)产生稳定和对称的PIOAL层流。样品和PIOAL料流可由精密计量泵提供，该泵使PIOAL与注射的样品流体一起沿着显著变窄的流路移动。PIOAL在流路变窄的区21中包围并压缩样品流体。因此，在区21的流路厚度降低可有助于样品料流32的几何聚焦。样品流体带32被包围并与PIOAL一起被输运到变窄区21的下游，从而在高光学分辨率成像设备24的前方经过或以其他方式穿过高光学分辨率成像设备24的观察区23，在所述成像设备中例如使用CCD48采集图像。处理器18可接收来自CCD48的像素数据作为输入。样品流体带与PIOAL一起流向排放口33。

如此处所示，变窄区21可具有近侧流路部分21a和远侧流路部分21b，近侧流路部分具有近侧厚度PT而远侧流路部分具有远侧厚度DT，使得远侧厚度DT小于近侧厚度PT。样品流体可因此在位于近侧部分21a远侧和远侧部分21b近侧的位置注射通过样品管29的远端28。因此，样品流体可在PIOAL料流被区21压缩时进入PIOAL包围。

具有物镜镜头46的数字高光学分辨率成像设备24沿着与带形样品料流32相交的光轴而定向。物镜46和流通池33之间的相对距离通过操作电机驱动器54而变化，从而在光传感器阵列上分辨和采集聚焦的数字化图像。

本发明提供自动实现高光学分辨率成像设备24的正确工作位置以对带形样品料流32聚焦的技术。流通池结构22可被配置成使得带形样品料流32在限定样品流体的流路的流通池内具有固定且可靠的位置，以PIOAL层之间的薄带形式穿过流通池22中的观察区23。在某些流通池实施例中，PIOAL的流路的横截面在一定点处对称变窄，在该点处将样品插入穿过平坦孔口诸如在孔口具有矩形内腔的管29，或插管。变窄流路(例如，以20:1的比率或以20:1至70:1之间的比率在横截面积上几何变窄)连同PIOAL与样品流体之间的粘度差以及任选地与样品流相比的PIOAL的线速度差配合使样品横截面以约20:1至70:1的比率压缩。在一些实施例中，该横截面厚度比率可为40:1。

在一个方面，流通池22的对称性质以及样品流体与PIOAL的注射方式为两层PIOAL之间的带形样品料流32提供流通池22内的可重复位置。因此，方法变量(诸如样品和PIOAL的特定线速度)不会倾向于使带形样品料流从其在流动中的位置发生位移。相对于流通池22的结构，带形样品料流32位置是稳定且可重复的。

然而，流通池22与光学系统的高光学分辨率成像设备24的相对位置可经历改变并且可受益于不时位置调节以保持高光学分辨率成像设备24与带形样品料流32之间的最佳或所需距离，从而提供带形样品料流32中的被包围粒子的高质量聚焦图像。根据一些实施例，高光学分辨率成像设备24与带形样品料流32之间可存在获得被包围粒子的聚焦图像的最佳或所需距离。可首先通过自动对焦或其他技术使高光学分辨率成像设备24位于离具有相对于流通池22的固定位置的自动对焦靶标44的最佳或所需距离处，从而将光学器件相对于流通池22准确地定位。例如由于初始校准步骤，精确地知道自动对焦靶标44与带形样品料流32之间的位移距离。在对自动对焦靶标44自动对焦后，然后使流通池22和/或高光学分辨率成像设备24在自动对焦靶标44与带形样品料流32之间的已知位移距离内位移。因此，高光学分辨率成像设备44的物镜镜头精确聚焦于包含被包围粒子的带形样品料流32。

本发明的示例性实施例涉及对聚焦或成像靶标44自动对焦，所述靶标44是限定沿着高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备24的光轴的已知位置的高对比度图形。靶标44可具有相对于带形样品料流32的位置的已知位移距离。对比度测量算法可特别地用于靶标特征。在一个例子中，高光学分辨率成像设备24的位置可沿着平行于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备光轴的线而改变，以找到这样的深度或距离，在该深度或距离处，在沿着图像中已知与对比图形的边缘交叉的像素的线出现的各像素亮度值中可发现一个或多个最大差分幅度。在一些情况下，自动对焦光栅沿着平行于光轴的线没有变化，该线也是这样的线，机动化控制器沿着该线操作以调节高光学分辨率成像设备24的位置，从而提供记录的位移距离。

这样，可能不必要自动对焦或依靠于可在不同图像之间变化、就对比度而言不太高度受限定、或可能位于一系列位置的某处的图像内容方面，作为确定供参考的距离位置的基础。由于发现了对于自动对焦靶标44的最佳或所需焦点的位置，高光学分辨率成像设备物镜24与流通池22的相对位置可位移记录的位移距离以为带形样品料流32中的粒子提供最佳或所需焦点位置。

根据一些实施例，高光学分辨率成像设备24可分辨如由穿过照明开口(窗口)43施加的光源42所背光照明的带形样品料流32的图像。在图1中所示的实施例中，照明开口43的周边形成自动对焦靶标44。然而，目标是通过光敏元件阵列上的高光学分辨率成像设备光学器件46，诸如集成电荷耦合设备，来采集带形样品料流32的精确聚焦图像。

高光学分辨率成像设备24及其光学器件46被配置成分辨在距离50处位于焦点内的带形样品料流32中的粒子的图像，所述距离可以是光学系统的尺度、镜头的形状、以及其材料的折射率的结果。在一些情况下，高光学分辨率成像设备24与带形样品料流32之间的最佳或所需距离不会改变，但流通池22与高光学分辨率成像设备及其光学器件46之间的距离可有所改变。高光学分辨率成像设备24和/或流通池22相对于彼此移动得更靠近或进一步分开(例如，通过调节成像设备24与流通池22之间的距离51)，使聚焦点的位置移动到相对于流通池的距离50的末端。

根据本发明的实施例，聚焦靶标44可位于离带形样品料流32的一定距离处，在这种情况下在来自照明源42的光所用的开口43的边缘处直接固定于流通池22。聚焦靶标44位于离带形样品料流32的恒定位移距离52处。通常，位移距离52是恒定的，因为带形样品料流32在流通池中的位置可保持恒定。

示例性自动对焦工序涉及使用电机54调节高光学分辨率成像设备24与流通池22的相对位置以使高光学分辨率成像设备24聚焦于自动对焦靶标44。在该例子中，自动对焦靶标44位于流通池中的带形样品料流32的后面。然后使高光学分辨率成像设备24和/或流通池22朝向彼此移动，直到自动对焦工序确定光敏元件上分辨的图像是自动对焦靶标44的精确聚焦图像。然后操作电机54以使高光学分辨率成像设备24与流通池22的相对位置位移，使得高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流32，也就是通过使高光学分辨率成像设备24和/或流通池22远离彼此精确地移动位移距离52的跨度来进行。

如果聚焦靶标44位于与后照明窗口43对置的前观察口窗口上，则这些移动方向当然会反向。在这种情况下，位移距离将是前观察口(未示出)处带形样品料流32与靶标44之间的跨度。

位移距离52等于沿着高光学分辨率成像设备24的光轴的带形样品料流32与自动对焦靶标44之间的距离，其可在工厂校准步骤中确定。通常，一旦确定，位移距离52就不会变化。热膨胀变化和振动可导致高光学分辨率成像设备24和流通池22的精确位置相对于彼此改变，从而需要自动对焦过程的再引发。但对靶标44的自动对焦提供相对于流通池22固定从而相对于带形样品料流32固定的位置参照。同样，位移距离是恒定的。因此，通过对靶标44自动对焦并使高光学分辨率成像设备24和流通池22位移所述位移距离的跨度，结果是高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流32。

根据一些实施例，聚焦靶标被提供为围绕照明开口43印刷或施加的高对比度圆形。替代聚焦靶标构形在本文别处讨论。当在靶标44的焦点中采集方形或矩形图像时，照明中心周围出现高对比度边界。在开口的内部边缘处搜寻获得图像中的最高对比度的位置使高光学分辨率成像设备自动对焦于靶标44的工作位置。根据一些实施例，术语“工作距离”可指物镜与其焦平面之间的距离并且术语“工作位置”可指成像设备的焦平面。图像的最高对比度量度是处于这样的位置处：最亮白色和最暗黑色测量像素沿着穿过内部边缘的一条线彼此相邻。最高对比度量度可用于评估成像设备的焦平面是否处于相对于靶标44的所需位置中。也可使用其他自动对焦技术，诸如对相邻像素之间的幅度差值进行积分及寻找差值的最高总和。在一种技术中，在涵盖靶标44的任一侧上的工作位置的三个距离处计算差值总和并将所得值与特征曲线匹配，其中最佳距离位于曲线上的峰值处。相关地，示例性自动对焦技术可涉及在不同位置采集流通池靶标的图像并分析图像以使用在靶标的图像最清晰时最大的度量来找到最佳焦点位置。在第一步骤(粗调)期间，自动对焦技术可操作以从在2.5μm间隔采集的一组图像找到初步最佳位置。从该位置处自动对焦技术可随后涉及在0.5μm间隔采集第二组图像(细调)并计算靶标上的最终最佳焦点位置。

在一些情况下，聚焦靶标(自动对焦光栅)可位于将出现样品的视区的周边。还可能的是，聚焦靶标可由位于视野中的对比形状(诸如图15中所描绘)限定。通常，自动对焦靶标安装在流通池上或者牢牢附接在相对于流通池的固定位置中。在由对自动对焦靶标的图像的对比度最大化作出响应的检测器所控制的定位电机的作用下，装置自动对焦于靶标而非带形样品料流。然后通过使流通池和/或高光学分辨率成像设备相对于彼此位移所述位移距离(已知为自动对焦靶标与带形样品料流之间的距离)，使高光学分辨率成像设备的工作位置从自动对焦靶标位移到带形样品料流。因此，带形样品料流出现在采集的数字图像中的焦点中。

为了通过数据处理技术区分粒子类型，诸如红和白血细胞的类目和亚类目，有利的是记录具有足够分辨率和清晰度以展示将一种类目或亚类目与其他区分开的方面的微观像素图像。本发明的目标是便于如所述的自动对焦技术。

在实践实施例中，装置可基于例如图1A所示并如图1B中放大的光具座布置方式，其具有照射到安装在万向载体55中的流通池22上的照明源42，对由高光学分辨率成像设备24获得的图像中的流通池22的内容物进行背光照明。流通池载体55安装在电机驱动器上以便可精确地朝向和远离高光学分辨率成像设备24移动。万向载体55也允许流通池相对于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的光学观察轴的精确配向，以使得带形样品料流在正交于带形样品料流成像的区中的观察轴的平面中流动，也就是在如图1中所描绘的照明开口43与观察口57之间流动。聚焦靶标44可有助于万向载体55的调节，例如以建立正交于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的光轴的带形样品料流的平面。

因此，载体或流通池保持器55提供流通池22例如相对于图像捕获设备24或图像捕获设备物镜的位置和取向的非常精确的线性和角度调节。如此处所示，载体55包括两个枢轴点55a、55b以有利于载体和流通池相对于图像捕获设备的角度调节。角度调节枢轴点55a、55b位于相同平面中并且以流通池通道(例如，在图像捕获位点)为中心。这允许在不引起流通池位置的任何线性平移的情况下调节角度。载体55可围绕枢轴点55a的轴线或围绕枢轴点55b的轴线或围绕这两条轴线旋转。此类旋转可由处理器和流通池移动控制机构控制，诸如由图4中所描绘的处理器440和流通池控制机构442控制。

返回参照图1B，可以看出图像捕获设备24和载体55(连同流通池22)中的任一者或两者可沿着三维中的各条轴线(例如，X、Y、Z)旋转或平移。因此，用于调节图像捕获设备的焦点的示例性技术可包括实施图像捕获设备24围绕成像轴的轴向旋转，例如使设备24围绕轴线X旋转。还可通过流通池22和/或载体55围绕沿着成像轴延伸的轴线，例如围绕轴线X，并在成像设备的视野内的轴向旋转来实现焦点调节。在一些情况下，焦点调节可包括图像捕获设备的顶端旋转(例如，围绕轴线Y的旋转)。在一些情况下，焦点调节可包括流通池的顶端旋转(例如，围绕轴线Y或围绕枢轴点55a的旋转)。如此处所描绘，枢轴点55a对应于沿着流通池的流路并在流通池的流路内延伸的Y轴。在一些情况下，焦点调节可包括图像捕获设备的倾斜旋转(例如，围绕轴线Z的旋转)。在一些情况下，焦点调节可包括流通池的倾斜旋转(例如，围绕轴线Z或围绕枢轴点55b的旋转)。如此处所描绘，枢轴点55b对应于横穿流路和成像轴的Z轴。在一些情况下，可通过实施流通池的旋转(例如围绕轴线X)使得该旋转以图像捕获设备的视野为中心而使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。可实施本文所述的三维旋转调节以便考虑分析仪系统的一个或多个部件中的位置漂移。在一些情况下，可实施三维旋转调节以便考虑分析仪系统的一个或多个部件中的温度波动。在一些情况下，分析仪系统调节可包括使成像设备24沿着轴线X平移。在一些情况下，分析仪系统调节可包括使载体55或流通池22沿着轴线X平移。

根据一些实施例，用于获得包含悬浮于液体中的粒子的样品的图像的视觉分析仪包括流通池22，其耦合到样品源25并耦合到鞘液或PIOAL材料源27，如图1中所描绘。如图3的剖面图中可以看出，流通池22限定在流动方向(图3中从右到左或者图1中从底部到顶部)对称地变窄的内部流路。流通池22被配置成引导被PIOAL包围的样品流32穿过流通池中的观察区，即在观察口57后面。

再次参照图1，具有物镜镜头46的数字高光学分辨率成像设备24沿着与带形样品料流32相交的光轴而定向。物镜46和流通池33之间的相对距离通过操作电机驱动器54而变化，从而在光传感器阵列上分辨和采集聚焦的数字化图像。

自动对焦光栅44具有相对于流通池22固定的位置，位于离带形样品料流32的平面位移距离52处。在所示实施例中，自动对焦光栅(靶标44)在高光学分辨率成像设备24采集的图像中可见的位置处直接施加到流通池22。在另一个实施例中，靶标如果未以一体化方式直接施加到流通池的主体，则可承载于相对于流通池22和其中的带形样品料流32牢牢固定在适当位置的部件上。

光源42可为稳定源或可为在操作高光学分辨率成像设备光敏元件时闪光的频闪灯，所述光源被配置成照明带形样品料流32并且还有助于靶标44的对比度。在所描绘的实施例中，照明来自背光照明。

图1C提供了框图，示出了示例性验尿分析仪的另外方面。如此处所示，分析仪100c包括耦合的至少一个数字处理器18以操作电机驱动器54并分析如在相对于靶标自动对焦光栅44的不同焦点位置处采集的来自光敏元件阵列的数字化图像。处理器18被配置成测定自动对焦光栅44的焦点位置，即自动对焦于靶标自动对焦光栅44并且从而确定高光学分辨率成像设备24与自动对焦光栅44之间的最佳距离。这可通过图像处理步骤来实现，诸如施加算法以评估第一距离处图像中的对比度水平，该算法可施加到整个图像或至少自动对焦光栅44的边缘。处理器使电机54运动到另一个位置并评估该位置或边缘处的对比度，并且在两次或更多次迭代后测定使自动对焦光栅44上的焦点的精确度最大化(或如果已移动到该位置，则将优化焦点的精确度)的最佳距离。处理器依赖于自动对焦靶标自动对焦光栅44与带形样品料流之间的固定间距，处理器18然后控制电机54将高光学分辨率成像设备24移动到正确距离以聚焦于带形样品料流32。更具体地讲，处理器操作电机以使高光学分辨率成像设备与带形样品料流32之间的距离位移所述位移距离52(例如如图1所描绘)，带形样品料流从靶标自动对焦光栅44位移所述位移距离52。这样，高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。

电机54可包括精度略微小于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备所成像的区别性特征(特别是血细胞的各方面)的齿轮步进电机。前提条件是调节高光学分辨率成像设备24的位置以将光学物镜的位置定位于带形样品料流的宽度内，则带形样品料流中的细胞/粒子的视图在焦点内。自动对焦光栅44可位于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的视野的边缘处，并且因此不会干扰观察。

此外，当高光学分辨率成像设备在位移距离内移动并且自动对焦光栅偏离焦点时，出现在焦点内的特征是血细胞而非自动对焦光栅。在图15的实施例中，例如，自动对焦光栅由视野中的形状限定。所述形状为有限尺寸的相对薄的离散形式，并且因此在移动位移距离之后，当聚焦于带形样品料流时所述形式在数字化图像中变得基本上不可见。在尺度适合验尿成像应用的流通池中，典型的位移距离可为例如50至100μm。在一些实施例中，自动对焦特征保持高光学分辨率成像设备处于最佳焦距的1μm内。

可调节流通池内部轮廓以及PIOAL和样品流速以使得样品形成带形料流。料流可与被包围在带形样品料流中的粒子大约一样薄或甚至更薄。白血细胞可具有例如约10μm的直径。通过提供厚度小于10μm的带形样品料流，当带形样品料流被鞘液或PIOAL伸展时细胞可以取向。带形样品料流沿着变窄流路在粘度与带形样品料流不同(诸如更高粘度)的PIOAL层内的令人惊奇的伸展有利地趋于使非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，并对细胞施加力，从而提高细胞的细胞内结构的焦点内内容物。高光学分辨率成像设备24的光轴基本上正交(垂直)于带形样品料流的平面。带形样品料流在成像时的线速度可为例如20-200mm/s。在一些实施例中，带形样品料流的线速度可为例如50-150mm/s。鞘液的另一个实施例可为LAMINA^TM(IRIS国际公司(IRISInternational,Inc.))溶液。LAMINA^TM可具有约7.0的pH以及在20℃下1.007的比重。在相关实施例中，鞘液可以作为盐水溶液提供。在一些实施例中，鞘液为含水盐组合物。在一些实施例中，鞘液的粘度与样品流体的粘度相同或类似。

带形样品料流厚度可受样品流体和PIOAL的相对粘度和流速的影响。返回参照图1，样品源25和/或鞘液或PIOAL的源27(例如，包括精密往复泵)可被配置成以可控的流速提供样品和/或PIOAL以优化带形样品料流32的尺度，即作为至少与高光学分辨率成像设备24的视野一样宽的薄带。

在一个实施例中，鞘液或PIOAL的源27被配置成以预定的粘度提供PIOAL。该粘度可不同于样品的粘度，并且可高于样品的粘度。对PIOAL的粘度和密度、样品材料的粘度、PIOAL的流速和样品材料的流速进行协调以在离自动对焦光栅的位移距离处保持带形样品料流，并具有预定的尺度特性，诸如有利的带形样品料流厚度。

在实践实施例中，PIOAL具有比样品更高的线速度和比样品更高的粘度，从而将样品伸展成平带。在一些情况下，PIOAL粘度可为最多至10厘泊。

在图1C中所示的实施例中，用于分析从光敏元件阵列获得的像素数字图像的相同数字处理器18也用于控制自动对焦电机54。然而，通常高光学分辨率成像设备24并不会对每张捕获的图像自动对焦。自动对焦过程可周期性地(在当天开始时或在轮班开始时)或例如在适当传感器检测到温度或其他工艺变化时或在图像分析发现可能需要重聚焦时完成。在一些情况下，自动化自动对焦过程可在约10秒的持续时间内进行。在一些情况下，自动对焦工序可在处理一个齿条的样品(例如，每个齿条10个样品)之前进行。在其他实施例中还可以使尿样图像分析由一个处理器完成，并且使单独的处理器，任选地连同其自身光敏元件阵列，被布置用于处理自动对焦于固定靶标44的步骤。

数字处理器18可被配置成在程序化时间或在程序化条件下或根据用户需求自动对焦，并且还被配置成执行基于图像的粒子的分类和亚分类。示例性粒子包括细胞、白血细胞、红血细胞等等。

在一个实施例中，图1或图1C的数字处理器18被配置成检测自动对焦再引发信号。自动对焦再引发信号可由检测到的温度变化、如由像素图像日期的参数所识别的聚焦质量的降低、时间的流逝或用户输入而触发。有利的是，从测量图1中所描绘的位移距离52以重新校准的意义上说，不必要重新校准。任选地，自动对焦可程序化以在运行之间以某些频率/间隔重新校准以便进行质量控制和/或保持聚焦。

位移距离52在一个流通池与另一个流通池之间略有差异，但对于给定流通池而言保持恒定。作为装配图像分析仪与流通池时的安装过程，首先估计位移距离，然后在其中执行自动对焦和成像方面的校准步骤期间，测定流通池的准确位移距离并作为常数输入处理器18的程序设计中。

因此，如图1D中的流程图所示，并且参照图1和/或图1C的验尿分析仪，根据本发明所公开的方法和装置进行的方法可涉及校准一次或很少校准。校准可包括聚焦于对比靶标44、聚焦于带形样品料流32以及记录沿着光轴在这两个位置之间的位移，如步骤110d中所指示。该位移可作为常数记录。然后通过控制电机54并分析来自光敏元件阵列的图像数据，处理器18自动对焦于靶标44并且使高光学分辨率成像设备24和/或流通池22相对于彼此位移所记录的位移距离，如步骤120d中所指示。带形样品料流32进而在焦点内并且可每隔一定间隔，特别是在足以采集在观察口57处穿过观察区的带形样品料流的部分的基本上不重叠的相邻视图的间隔处，采集(如步骤130d中指示)和处理(如步骤140d中指示)其图像。当自行监测(如步骤150d中指示)揭示数据异常或温度变化(可能因热膨胀的差异而改变高光学分辨率成像设备24与流通池22的相对位置)时，则引发自动对焦(如步骤160d中指示)，之后才恢复常规操作。因此，自动对焦过程可包括检测自动对焦再引发信号，以及响应于自动对焦再引发信号而重复自动对焦和图像采集步骤。在一些实施例中，自动对焦再引发信号可包括或基于温度的变化、聚焦质量的降低、流逝的时间间隔、或用户输入。

带形样品料流的线速度可被充分限制以防止在光传感器阵列的图像曝光时间使数字化图像运动模糊。光源可任选地为闪烁以短时间施加高入射振幅的闪光灯。由于自动对焦光栅44和图像处于相同视野，光源被配置成同时照明带形样品料流和自动对焦光栅。然而，在其他实施例中，用于成像和用于自动对焦的视野可不同，例如单独地照明和/或成像。

主题开发具有方法以及装置方面。使视觉分析仪聚焦的方法包括使高光学分辨率成像设备24聚焦在相对于流通池22固定的自动对焦光栅44上，所述高光学分辨率成像设备24可为数字高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备，其中自动对焦光栅44位于离带形样品料流32位移距离52处。数字高光学分辨率成像设备24具有物镜，其光轴与带形样品料流32相交。物镜与流通池22之间的相对距离因电机驱动器54的操作而变化，而沿着光轴在高光学分辨率成像设备与最佳聚焦点之间的距离是已知的。数字高光学分辨率成像设备被配置成分辨和采集光敏元件阵列上的数字化图像。在自动对焦过程中操作电机驱动器以聚焦于自动对焦光栅上。然后在位移距离内操作电机驱动器，从而使高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流上。

可以使用对靶标的自动对焦和位移所述位移距离来获得适于对带形样品料流聚焦的距离。然而，有利的是，每次图像捕获不需要或不重复自动对焦。然而，在某些条件下开始自动对焦。可检测或生成自动对焦再引发信号，从而引起如下步骤：再聚焦于自动对焦光栅，在位移距离内操作电机驱动器，以及使高光学分辨率成像设备再聚焦于带形样品料流。自动对焦再引发信号可由例如温度的变化、聚焦质量的降低、时间的流逝、其他工艺参数或用户输入的检测而引起。

图1E为示例性模块系统的简化框图，该框图广义地例示了可如何以分离方式或更集成化的方式实施模块系统100e的个体系统元件。模块系统100e可以是根据本发明实施例的用于使体液样品诸如尿样中的粒子成像的粒子分析系统的一部分或与该粒子分析系统相连。模块系统100e非常适于生成与聚焦和成像技术相关的数据或指令、接收与聚焦和成像技术相关的输入、和/或处理与聚焦和成像技术相关的信息或数据，如本文别处所述。在一些情况下，模块系统100e包括经由总线子系统102e电耦合的硬件元件，包括一个或多个处理器104e、一个或多个输入设备106e(诸如用户界面输入设备)、和/或一个或多个输出设备108e(诸如用户界面输出设备)。在一些情况下，系统100e包括网络接口110e和/或成像系统接口140e，该成像系统接口可从成像系统142e接收信号以及/或者将信号传递到成像系统142e。在一些情况下，系统100e包括软件元件，所述软件元件例如在此处被显示为当前正位于存储器114e的工作存储器112e内，为操作系统116e和/或其他代码118e(诸如被配置为实施本文所公开技术的一个或多个方面的程序)。

在一些实施例中，模块系统100e可以包括存储子系统120e，该存储子系统可以存储提供本文所公开的各种技术的功能的基础编程和数据构造。例如，实现如本文所述方法各方面的功能的软件模块可以存储于存储子系统120e中。这些软件模块可由一个或多个处理器104e执行。在分布式环境中，所述软件模块可存储在多个计算机系统上并由所述多个计算机系统的处理器执行。存储子系统120e可以包括存储器子系统122e和文件存储子系统128e。存储器子系统122e可包括多个存储器，包括用于在程序执行期间存储指令和数据的主随机存取存储器(RAM)126e，以及其中存储固定指令的只读存储器(ROM)124e。文件存储子系统128e可为程序和数据文件提供永久性(非易失性)存储，并且可以包括有形存储介质，该有形存储介质可以任选地体现样品、患者、治疗、评估数据，或其他数据。文件存储子系统128e可以包括硬盘驱动器、连同相关联的可移动介质的软盘驱动器、紧凑型数字只读存储器(CD-ROM)驱动器、光盘驱动器、DVD、CD-R、CDRW、固态可移动存储器、其他可移动的介质盒或盘，等等。所述驱动器中的一个或多个可位于在其他位点处耦合到模块系统100e的其他连接计算机上的远程位置处。在一些情况下，系统可以包括存储一个或多个指令序列的计算机可读存储介质或其他有形存储介质，所述一个或多个指令序列在被一个或多个处理器执行时，可导致所述一个或多个处理器执行本文所公开的技术或方法的任何方面。实现本文所公开技术的功能的一个或多个模块可由文件存储子系统128e存储。在一些实施例中，所述软件或代码将提供允许模块系统100e与通信网络130e进行通信的协议。任选地，此类通信可以包括拨号连接通信或互联网连接通信。

应当理解，系统100e可被配置成实施本发明方法的各方面。例如，处理器部件或模块104e可以是微处理器控制模块，该微处理器控制模块被配置成从传感器输入设备或模块132e、从用户界面输入设备或模块106e、和/或从成像系统142e，任选地经由成像系统接口140e和/或网络接口110e以及通信网络130e接收温度参数信号和/或流通池操作参数。在一些情况下，传感器输入设备可包括粒子分析系统或为粒子分析系统的一部分，所述粒子分析系统被装配为获得体液样品诸如尿样的图像。在一些情况下，用户界面输入设备106e和/或网络接口110e可被配置成接收由粒子分析系统生成的图像参数信号，所述粒子分析系统被装配为获得图像参数。在一些情况下，成像系统142e可包括粒子分析系统或为粒子分析系统的一部分，所述粒子分析系统被装配为获得与体液样品诸如尿样相关的图像参数。

处理器部件或模块104e还可以被配置成将任选地根据本文所公开技术的任何一种处理的粒子分析参数信号或图像参数信号传递到传感器输出设备或模块136e、到用户界面输出设备或模块108e、到网络接口设备或模块110e、到成像系统接口140e、或到它们的任何组合。根据本发明实施例的设备或模块中的每一个可以包括位于被处理器处理的计算机可读介质上的一个或多个软件模块，或硬件模块，或它们的任何组合。可使用多种常用平台(诸如Windows、MacIntosh和Unix)中的任何一种，连同多种常用编程语言中的任何一种，来实现本发明的实施例。

用户界面输入设备106e可以包括(例如)触摸板、键盘、指示设备(诸如鼠标)、轨迹球、图形输入板、扫描器、操纵杆、结合到显示器中的触摸屏、音频输入设备(诸如语音识别系统)、麦克风、以及其他类型的输入设备。用户输入设备106e还可以从有形存储介质或从通信网络130e下载计算机可执行代码，该代码体现本文所公开方法或其各方面中的任何一者。应当理解，终端软件可以时常更新，并且在适当的情况下被下载到终端。一般来讲，使用术语“输入设备”旨在包括用于将信息输入模块系统100e中的多种传统和专属的设备和方法。

用户界面输出设备106e可以包括(例如)显示子系统、打印机、传真机、或非视觉显示器(诸如音频输出设备)。显示子系统可以是阴极射线管(CRT)、平板设备(诸如液晶显示器(LCD))、投影设备等等。显示子系统还可以诸如经由音频输出设备提供非视觉显示。一般来讲，使用术语“输出设备”旨在包括用于从模块系统100e向用户输出信息的多种常规和专属的设备和方法。

总线子系统102e提供用于使模块系统100e的各种部件和子系统彼此按预期或所需的方式进行通信的机制。模块系统100e的各种子系统和部件无需处于相同的物理位置，而是可以分布在分布式网络内的各个位置处。尽管总线子系统102e被示意性地显示为单根总线，但是总线子系统的另选实施例可以利用多根总线。

网络接口110e可提供通向外部网络130e或其他设备的接口。外部通信网络130e可被配置成根据需要或期望实现与其他部分的通信。该外部通信网络由此可以接收来自模块系统100e的电子数据包，并且根据需要或期望将任何信息传输回模块系统100e。如此处所描绘，通信网络130e和/或成像系统接口142e可向成像系统142e传输信息或接收来自成像系统142e的信息，该成像系统被装配为获得对应于体液样品诸如尿样的多个图像或图像参数。

除了提供系统内部的此类基础结构通信链接之外，通信网络系统130e还可以为诸如互联网之类的其他网络提供连接，并且可以包括有线、无线、调制、和/或其他类型的接口连接。

对技术人员显而易见的是，可以根据具体要求来使用大量的变型。例如，也可以使用定制的硬件并且/或者可以在硬件、软件(包括便携式软件，诸如小应用程序)或这两者中实现特定的元件。此外，可以采用至其他计算设备(诸如网络输入/输出设备)的连接。模块终端系统100e本身可以是包括计算机终端、个人计算机、便携式计算机、工作站、网络计算机、或任何其他数据处理系统的不同类型的模块终端系统。由于计算机和网络的不断变化的性质，因此图1E中描绘的模块系统100e的描述仅旨在作为出于举例说明本发明的一个或多个实施例的目的的具体例子。模块系统100e的比图1E中所描绘的模块系统具有更多或更少部件的许多其他构形是可能的。模块系统100e的模块或部件中的任何一个或此类模块或部件的任何组合可以与本文所公开的粒子分析和/或成像系统实施例中的任何一个耦合、或集成到其中、或以其他方式被配置成与其建立连接。相关地，以上论述的硬件和软件部件中的任何一个可以与在其他位置处使用的其他医疗评估或治疗系统集成在一起或被构造成与所述系统接合。

在一些实施例中，模块系统100e可以被配置成接收输入模块处的体液样品诸如尿样的一个或多个图像参数。可将图像参数数据传输到评估模块，在评估模块处，可基于图像数据的分析来预测或确定诊断或其他结果。图像或诊断数据可以经由输出模块输出至系统用户。在一些情况下，模块系统100e可例如通过使用诊断模块来确定体液样品诸如尿样的诊断结果。诊断信息可以经由输出模块输出至系统用户。任选地，该诊断的某些方面可以由输出设备确定，并且传输至诊断系统或诊断系统的子设备。可将与体液样品诸如尿样或从其获得样品的患者相关的多个数据中的任何一者输入到模块系统中，包括年龄、体重、性别、治疗史、病史，等等。可以基于这种数据来确定治疗方案或诊断评价的参数。

相关地，在某些情况下，系统包括被配置成接收图像数据作为输入的处理器。任选地，处理器、存储介质或这两者可以结合在验尿或粒子分析机器内。在一些情况下，验尿机器可以生成用于输入到处理器中的图像数据或其他信息。在一些情况下，处理器、存储介质或这两者可以结合在计算机内，并且该计算机可以与验尿机器进行通信。在一些情况下，处理器、存储介质或这两者可以结合在计算机内，并且该计算机可以经由网络与验尿机器进行远程通信。

流通池

流通池22的实际实施例进一步在图2和3中描绘。如此处所示，流通池22可以与样品源25并且还可以与鞘液或PIOAL材料的源27耦合。经由插管29，例如通过插管29的远侧出口31，将样品流体注射到流通池22中。通常，PIOAL鞘液在其通过流通池中的弯曲通道段41从源27向观察区23行进时不处于层流状态。然而，流通池22可被配置成使得PIOAL鞘液在流过远侧出口31(在此处样品流体被引入流动的鞘液中)时，PIOAL鞘液为层流式或变为层流式，或呈现平坦速度剖面。样品流体和PIOAL可沿着大致如箭头A所示的方向沿着流通池22流动，然后经由排放口33流出流通池22。流通池22限定在流动方向A上对称地变窄(例如，在过渡区21)的内部流路20。流路的对称性有助于样品料流的稳固且居中的流动。流通池22被配置成引导被PIOAL包围的样品流32通过流通池中的观察区23，即在观察口57背后。与观察口57相连的是自动对焦光栅44。流通池22还具有圆形或凹陷底座58，其被配置成接受或接收显微镜物镜(未示出)。

根据一些实施例，自动对焦光栅44可具有相对于流通池22固定并且位于离带形样品料流32的平面一定位移距离的位置。在此处所示的实施例中，在通过高光学分辨率成像设备(未示出)穿过观察口57采集的图像中可见的位置处，将自动对焦光栅(靶标44)直接应用于流通池22。流通池22可由第一或上区段或层22a和第二或下区段或层22b构造。如此处所示，玻璃或透明窗格60附接到第一区段22a或与第一区段22a一体化。窗格60可限定流通池内的样品流路的至少一部分。来自光源42的光可行进通过自动对焦光栅44的孔或通路以照明在流动料流32内流动的样品粒子。

在一些情况下，窗格60的厚度可具有约150μm至约170μm范围内的值。如上指出的，窗格60可限定或形成流路或鞘液(例如，PIOAL)通道的一部分。通过使用薄窗格60，可以将显微镜物镜放置在非常靠近样品流体带的位置，因此获得沿着流路流动的粒子的高度放大图像。

图3A描绘了流通池实施例的各方面，其中成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离为约8.24mm。远侧过渡区部分316与插管出口331之间的距离为约12.54mm。插管出口331与鞘液入口301之间的距离为约12.7mm。插管出口331与近侧过渡区部分318之间的距离为约0.73mm。图3B描绘了流通池实施例的各方面，其中插管出口已被移动到相对于过渡区更远侧的位置，如相比于图3A实施例。如此处所示，插管远端被推进到流通池的变窄过渡区中，并且成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离在约16mm至约26mm的范围内。在一些情况下，成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离为约21mm。

返回参照图1，流通池内部轮廓(例如，在过渡区21)以及PIOAL和样品流速可被调整成使得样品形成为带形料流32。料流可与被包围在带形样品料流中的粒子大约一样薄或甚至更薄。白血细胞可具有例如约10μm的直径。通过提供厚度小于10μm的带形样品料流，当带形样品料流被鞘液或PIOAL伸展时细胞可以取向。带形样品料流沿着变窄流路在与带形样品料流不同的粘度诸如更高粘度的PIOAL层内的令人惊奇的伸展，有利地趋于使非球形粒子配向在基本上平行于流动方向的平面中，并对细胞施加力，从而提高了细胞的细胞内结构的焦点内内容物。高光学分辨率成像设备24的光轴基本上正交(垂直)于带形样品料流的平面。带形样品料流在成像时的线速度可为例如20-200mm/s。在一些实施例中，带形样品料流的线速度可为例如50-150mm/s。

还参照图2和3，流通池的内部流路在带形样品料流向PIOAL中注射的点的下游变窄，以产生带形样品料流厚度，例如最多至7μm，和/或内部流路产生500-3,000μm的带形样品料流宽度。在示例性实施例中，如图1中所描绘，流通池的内部流路在样品料流向PIOAL中注射的点的上游开始出现变窄过渡区。

在另一个实施例中，内部流路变窄以产生厚度为2-4μm的带形样品料流厚度，和/或内部流路形成宽度为2000μm的带形样品料流。在一些情况下，样品料流具有约2190μm的宽度。在这种情况下料流的厚度小于一些粒子诸如处于其松弛状态的红血细胞的直径。因此，那些粒子可被重新取向以将其较宽的尺度面向成像轴，这有助于展现有区别的特性。

所述方法还可以包括使带形样品料流形成带形。呈现带形使得高光学分辨率成像设备的光轴基本上垂直于带形样品料流，即正交于带形料流的平面。

图4描绘了用于使尿样中的粒子成像的系统400的各方面。如此处所示，系统400包括样品流体注射系统410、流通池420和图像捕获设备430以及处理器440。流通池420提供任选地与样品料流相结合而传递鞘液流的流路422。根据一些实施例，样品流体注射系统410可包括插管或管412或与插管或管412耦合。样品流体注射系统410可与流路422流体连通，并且可以操作以将样品流体424注射穿过插管412的远侧出口413并进入流通池420内的流动鞘液426中以便提供样品流体料流428。例如，处理器440可包括存储介质或与存储介质操作性地相连，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配制成在被处理器执行时使样品流体注射系统410将样品流体424注射到流动鞘液426中。如此处所示，鞘液426可通过鞘液注射系统450引入流通池420中。例如，处理器440可包括存储介质或与存储介质操作性地相连，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配置成在被处理器执行时导致鞘液注射系统450将鞘液426注射到流通池420中。

样品流体料流428具有邻近注射管412的第一厚度T1(参见，例如图4A)。流通池的流路422具有流路尺寸的缩减段使得样品流体料流428的厚度从初始厚度T1降低到邻近图像捕获位点432的第二厚度T2。图像捕获设备430与图像捕获位点432配向以便在流通池420的图像捕获位点432处使来自第一样品流体的第一多个粒子成像。

处理器440与样品流体注射器系统410、图像捕获设备430和任选的鞘液注射系统450耦合。处理器440被配置成终止向流动鞘液426中注射第一样品流体并开始向流动鞘液426中注射第二样品流体使得样品流体瞬变被引发。例如，处理器440可包括存储介质或与存储介质操作性地相连，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配置成在被处理器执行时导致样品流体注射系统410将第二样品流体注射到流动鞘液426中使得样品流体瞬变被引发。

另外，处理器440被配置成在样品流体瞬变后并在对第一多个粒子成像的4秒内引发在流通池420的图像捕获位点432捕获第二样品流体中的第二多个粒子的图像。例如，处理器440可包括存储介质或与之操作性地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配制成在被处理器执行时在样品流体瞬变后并在对第一多个粒子成像的四秒内使图像捕获装置430引发在流通池420的图像捕获位点432捕获第二样品流体中的第二多个粒子的图像。

在一些实施例中，处理器440可包括存储介质或与存储介质操作性地相连，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配置成在被处理器执行时导致流通池移动控制机构442调节流通池420例如相对于图像捕获设备430的位置。在一些实施例中，处理器440可包括存储介质或与存储介质操作性地相连，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配置成在被处理器执行时导致图像捕获设备移动控制机构444调节图像捕获设备430例如相对于流通池420的位置。移动控制机构442、444可包括分别促进和产生流通池和图像捕获设备中的移动的电机、万向接头以及其他机械特征。在一些情况下，流通池控制机构442和/或图像捕获设备控制机构444可包括高精度步进电机控制器，其提供图像捕获设备相对于流通池的机动化和自动化聚焦。如图1中所描绘，处理器可控制图像捕获设备24的移动。相似地，如图1B中所描绘，处理器可控制流通池载体55的移动。

因此，本发明的实施例涵盖执行组合式粘度和几何流体聚焦以便使尿样中的粒子成像的粒子分析系统。示例性系统可包括具有带有注射管的流路以及具有带有从中穿过的成像轴的成像窗口的流通池。流通池的流路可具有流路尺寸的缩减段。另外，分析仪系统可包括与流路流体连通的鞘液输入口以及与注射管流体连通的尿液输入口。尿液输入口可被配置用于将尿样注射到流通池内的流动鞘液中以使得尿样以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动。鞘液可具有大于尿样的粘度的粘度。而且，分析仪系统可包括图像捕获设备和聚焦机构，所述聚焦机构设定图像捕获设备相对于流通池的焦点状态。此外，系统可包括具有相对于流通池固定的位置的成像靶标，其中成像靶标和样品流动料流限定沿着成像轴的位移距离。系统还可包括处理器和聚焦模块，所述聚焦模块具有体现机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便操作聚焦机构使用位移距离设定适于粒子表征和计数的图像捕获设备的焦点状态。鞘液与尿样之间的粘度差连同流路尺寸的缩减段可有效地在成像轴处流体聚焦第一和第二样品流体，同时保持尿样中的细胞的活力。在一些情况下，聚焦机构可包括被配置成调节图像捕获设备与流通池之间的距离的驱动电机。

在一些情况下，分析仪系统400可包括与流通池420热耦合的温度或热传感器448，如图4中所描绘。聚焦模块可与处理器操作性地相连，可包括体现机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在处理器上执行以便操作聚焦机构(例如，流通池控制机构442或图像捕获设备控制机构444)，从而响应于温度传感器所感测到的温度变化和温度与所需焦点之间的已知关系，而设定适于粒子表征和计数的图像捕获设备的焦点状态或焦平面。

因此，本发明的实施例涵盖用于对具有样品流体粘度的尿样424中的多个粒子成像的系统400。系统400可与鞘液426一起使用，该鞘液具有与样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘液粘度。系统400可包括具有流路422的流通池420和样品流体注射管412。流路422可具有流路尺寸的缩减段或变窄过渡区。此外，系统400可包括与流通池420的流路422流体连通的鞘液输入口401，以便沿着流通池420的流路422传递鞘液流。系统400还可以包括与流通池420的注射管412流体连通的尿样输入口402，以便将尿样的流或料流428注射到流通池420内的流动鞘液428中。例如，样品流体424可离开插管412的远侧出口423并进入流动鞘液426的包层中以在其中形成样品带428。

当鞘液426与样品流体424所形成的样品流体带428一起穿过流路尺寸的缩减段419流向成像位点432时，与粘度差相关的鞘液426和样品流体424之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用连同与流路尺寸的缩减段相关的鞘液426和样品流体424之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用在成像位点432在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态。如此处所示，系统400还包括在成像位点432使多个粒子成像的成像设备430。

如图4A中所描绘的流通池实施例中所示，流路尺寸的缩减段(例如，在过渡区419a)可由流路422a的相对壁421a、423a限定。相对壁421a、423a可沿着流路422a径向地向内成角度，总体上关于横向平面451a对称，所述横向平面平分样品流体料流428a。平面451a可平分样品料流428a，其中在样品料流428a离开插管或样品注射管412a的远侧部分427a的位置处，样品料流具有第一厚度T1。相似地，平面451a可平分样品料流428a，其中在样品料流428a通过图像捕获位点432a的位置处，样品料流具有第二厚度T2。根据一些实施例，第一厚度T1具有约150μm的值，而第二厚度T2具有约2μm的值。在此类情况下，样品带料流的压缩比为75:1。根据一些实施例，第一厚度T1具有约50μm至约250μm范围内的值，而第二厚度T2具有约2μm至约10μm范围内的值。当样品料流流体流过流通池时，随着其加速和伸展，带变薄。流通池的两个特征可有助于样品流体带的变薄。第一，鞘液包层与样品流体带之间的速度差可起到降低带的厚度的作用。第二，过渡区的渐缩几何形状可起到降低带的厚度的作用。如图4A中所描绘，插管412a的远侧出口413a可定位在沿着变窄过渡区419a的长度的中心位置。在一些情况下，远侧出口可定位在更靠近过渡区419a的开始处(近侧部分415a)。在一些情况下，远侧出口可定位在更靠近过渡区419a的末端处(远侧部分416a)。在一些情况下，远侧出口413a可完全定位在过渡区419a之外，例如如图3A中所描绘(其中远侧出口331设置在变窄过渡区的近侧)。

如图4A(以及图4和4B-1中)所描绘，过渡区419a可由近侧(415a)和远侧(416a)部分处的成角过渡段限定。还应当理解，过渡区419a可相反在近侧(415a)和远侧(416a)部分处呈现平滑或弯曲过渡段，类似于如图1、3、3A、3B和4B-2中所描绘的平滑或弯曲过渡段。

通常，第一厚度T1远大于样品粒子的尺寸，因此粒子完全包含于样品带料流内。然而，第二厚度T2可小于某些样品粒子的尺寸，因此这些粒子可延伸出样品流体并进入周围的鞘液。如图4A中所示，样品带料流可总体上沿着与其离开插管并朝图像捕获位点行进的相同平面流动。

流通池还可以在远侧插管部分427a与图像捕获位点432a之间提供间隔距离430a。根据一些实施例，样品流体注射管412a的远侧部分427a可定位在离图像捕获位点432a的轴向间隔距离430a处，其中轴向间隔距离432a具有约21mm的值。根据一些实施例，轴向间距430a具有约16mm至约26mm范围内的值。

插管出口与图像捕获位点之间的轴向间隔距离430a可影响样品流体从出口向图像捕获位点流体行进时的过渡时间。例如，相对更短的轴向间距430a可有助于更短的过渡时间，而相对更长的轴向间距430a可有助于更长的过渡时间。

插管远侧部分427a处的出口相对于流路过渡区419a或相对于流路过渡区419a的近侧部分415a的位置也可推断出样品流体从出口向图像捕获位点流体行进时的过渡时间。例如，鞘液可在近侧部分415a具有相对更慢的速度，而在近侧部分415a与远侧部分416a之间的位置具有相对更快的速度。因此，如果将远侧部分427a处的插管出口定位在近侧部分415a，则样品流体到达图像捕获位点将花费更长的时间，这不仅因为行进距离更长，还因为样品流体的初始速度在其离开插管远侧端口后更慢(由于鞘液速度更慢)。换句话说，样品流体存在于流通池的较厚部分(例如，靠近近侧部分415a)的时间越长，则样品到达图像捕获位点所花的时间越长。反之，如果将远侧部分427a的插管出口定位在近侧部分415a的远侧(例如，在近侧部分415a与远侧部分416a之间的中心位置，如图4A中所描绘)，则样品流体到达图像捕获位点所花的时间将更短，这不仅是因为行进距离更短，还因为样品流体的初始速度在其离开插管远侧端口后更快(由于鞘液速度更快)。如本文别处所讨论，鞘液在穿过过渡区419a流动时因区419a的变窄横截面积而被加速。

根据一些实施例，过渡时间越短，图像捕获位点处采集图像可用的时间越多。例如，随着从插管远侧顶端到成像区域的过渡持续时间缩短，可能的是在特定的时长内处理更多的样品，并相关地可能在特定的时长内获得更多的图像(例如，每分钟的图像数)。

虽然存在与将插管远侧部分427a的出口定位在更靠近图像捕获位点432a的位置相关的优点，但在所述出口与捕获位点之间保持一定的距离也是可取的。例如，如图3中所描绘，成像设备的光学物镜或前透镜可定位在流通池22的底座58中。如果插管的出口31太靠近底座58，则样品流体在被注射到鞘液中后可能不够稳定，而不能在图像捕获位点提供所需的成像性质。相似地，可能有利的是在离观察区23一定的距离处保持渐缩过渡区21，以使得渐缩区不干扰接收图像捕获设备物镜的底座58的定位。

继续参照图4A，样品流体注射管412a的下游端427a可定位在流路过渡区419a的近侧部分415a的远侧。相关地，样品流体注射管412a的下游端427a可定位在流路过渡区419a的远侧部分416a的近侧。因此，根据一些实施例，样品流体可从注射插管412a在过渡区419a内的某一位置注射到流通池中。

根据一些实施例，流路尺寸的缩减段的对称性(例如，在流路过渡区419a)起到限制尿样中的粒子失准的作用。例如，这种对称性可有效将尿样中的红血细胞成像取向失准限制到小于约20％。

根据一些实施例，本文所公开的方法可起到使血细胞计数分析期间的标记率低于样品的30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％或5％的作用。

根据一些实施例，图像捕获位点432a具有约800μm×800μm之间的视野433a。在一些情况下，图像捕获位点432a具有约275μm×275μm的视野433a。在一些情况下，视野可根据长度乘以宽度加以限定。如果表示为表面积，则275μm×275μm视野具有75,625μm²的面积。根据一些实施例，视野可由成像设备物镜及其放大倍数确定。在一些情况下，视野可对应于由采集光学器件(例如，物镜、镜筒透镜和相机)成像的场(区域)范围。在一些情况下，视野远小于图像捕获位点处的透明区的观察口。

图4A-1和图4A-2示出了当样品料流从插管出口向图像捕获位点行进时流体聚焦对样品料流的影响。如图4A-1中所示，样品料流可具有约150μm的高度H(S)和约1350μm的宽度W(S)。在一些情况下，宽度W(S)为约1600μm。在一些情况下，宽度W(S)的宽度为约2000μm。在一些情况下，样品料流具有约2190μm的宽度。在一些情况下，宽度W(S)具有约1350μm至约2200μm范围内的值。此处所描绘的样品料流尺度可对应于例如图4E中所描绘的插管出口尺度。另外，PIOAL鞘液料流可具有约6000μm的高度H(P)和约4000μm的宽度W(P)。在流体聚焦之后，如图4A-2中所示，样品料流可具有约2μm的高度H(S)和约1350μm的宽度W(S)。在一些情况下，宽度W(S)为约1600μm。在一些情况下，宽度W(S)的宽度为约2000μm。在一些情况下，样品料流具有约2190μm的宽度。在一些情况下，宽度W(S)具有约1350μm至约2200μm范围内的值。另外，PIOAL鞘液料流可具有约150μm的高度H(P)和约4000μm的宽度W(P)。在一个实施例中，PIOAL鞘液料流在插管出口处的横截面积是图像捕获位点附近的横截面积的40倍。

根据一些实施例，其可用于确定图像捕获位点处的流通池通道的横截面。这可对应于如图4A-2中所描绘的约150μm的PIOAL鞘液料流高度H(P)和约4000μm的宽度W(P)。其还可用于确定在图像捕获位点处流过流通池的合并样品和鞘液的体积流速。当已知横截面积和流速时，可能的是确定图像捕获位点处的合并样品和鞘液的速度。

根据一些实施例，样品和鞘液穿过流通池的流动可用平行板轮廓模型估算。相关地，样品流体料流的中心的流速(例如，如图4A-2中所描绘)可为合并样品和鞘液料流的平均流速的约1.5倍。

根据一些实施例，在插管出口处的样品流的横截面积(例如，图4A-1中的W(S)×H(S))比成像位点处的样品流的横截面积(例如，图4A-2中的W(S)×H(S))大40倍。在成像区域处的鞘液的体积流速可为约45μL/s。在成像区域处的样品流体的体积流速可为约0.232μL/s。在一些情况下，在成像位点处的合并的鞘液和样品料流的横截面积为600,000μm²。在一些情况下，在成像位点处的平均流动料流速度为75mm/s。

流速或速度可作为产生清晰和聚焦的细胞图像的速率而确定。示例性流速和速度基于据观察在成像位点实现某些样品流动料流带形或特性的两个样品的流速而发现。例如，在约75mm/s(或20-200mm/s范围内)的流速下，细胞不会流动得过慢以使得在连续图像中存在细胞的重叠，细胞也不会流动得过快以使得形成幻影效应(模糊的图像)。相关地，通过避免过高的流速，可能节省更多的试剂和样品。根据一些实施例，最佳的或所需的线速度可通过改变体积流量(泵速)或插管形状而实现。

穿过图像捕获区的样品料流的流动速度也可与图像捕获设备相对于流通池功能的性能相关。例如，如果样品料流流动得过快，则可能难以获得样品中所含的粒子的清晰图像(例如，图像捕获设备的快门速度可能过慢，从而产生模糊的图像)。相似地，如果样品料流流动得过慢，则图像捕获设备可能获得同一粒子的连续图像(例如，同一粒子在两次图像捕获过程中保持在捕获帧中)。在一些实施例中，样品带的速度可相对于图像捕获速率进行调节(例如，通过调整多个流通池操作参数中的任何一个)，以使得在帧捕获之间存在最少的流动，并因此对高百分比的样品成像。

根据一些实施例，粒子分析系统和相关部件可被配置成使得当鞘液和流体样品流过流通池时，鞘液可以45μL/s的鞘液体积流速流动，而流体样品可以0.232μL/s(或在0.2至0.35μL/s的范围内)的流体样品体积流速流动。在一些情况下，样品流体的流速可具有0.2μL/s至1μL/s范围内的值。在一些情况下，鞘液可具有约40μL/s的流速。在一些情况下，样品流体可具有约0.56μL/s的流速。在一些情况下，对于约19秒的成像持续时间，流过流通池的样品流体的体积可具有约8μL至约12μL范围内的值。在一些情况下，鞘液流速与样品流体流速的比率为约200。在一些情况下，鞘液流速与样品流体流速的比率具有约70至200范围内的值。在一些情况下，鞘液流速与样品流体流速的比率为约193。在一些情况下，鞘液流速与样品流体流速的比率为约70。在一些情况下，在流通池内流动的鞘液体积与流体样品体积的比率可在25:1至250:1的范围内。

根据一些实施例，所述系统和相关部件可被配置成使得当鞘液和流体样品流过流通池420时，鞘液可以75mm/s的鞘液速度在成像区域前流动，而流体样品可以130mm/s的流体样品速度在成像区域前流动。在一些情况下，在流通池内流动的鞘液体积与流体样品体积的比率可在100:1至200:1的范围内。

在一些情况下，流通池可具有约50:1的最小压缩比和约125:1的最大压缩比。在一些情况下，最小压缩比可为约30:1或20:1。该压缩比是指当将图4A-1与图4A-2相比时的流动料流厚度H(S):H(S)的比率。该压缩比可受到几何压缩(例如，在将图4A-1与图4A-2比较时，鞘液厚度H(P):H(P)的比率，其也可总体上对应于图4A所示的流通池变窄渐缩过渡区419a的尺度)和流体动力压缩(例如，也对应于速度差)的组合的影响。根据一些实施例，几何压缩比为约40:1。

对应于过渡区的流路尺寸的缩减段可由近侧流路部分和远侧流路部分限定，近侧流路部分具有近侧厚度或高度，而远侧流路部分具有比近侧厚度或高度小的远侧厚度或高度。例如，如图4B-1和4B-2的局部视图所示，流路的过渡区419b可在近侧部分415b与远侧部分416b之间具有长度L，其中近侧部分415b具有近侧高度417b，而远侧部分416b具有远侧高度418b。如图4B-2中所描绘，并如本文别处所述，过渡区的形状或轮廓可以为弯曲的或平滑的，并例如可以S形曲线、蛇形曲线(sigmoidalcurve)或正切曲线的形状提供。根据一些实施例，近侧高度417b具有约6000μm的值。在一些情况下，近侧高度417b具有约3000μm至约8000μm范围内的值。根据一些实施例，远侧高度418b具有约150μm的值。在一些情况下，远侧高度418b具有约50μm至约400μm范围内的值。

过渡区419a的几何形状可提供在第一流路边界403b与平分横向平面451b之间的第一角度α1，和在第二流路边界404b与平分横向平面451b之间的第二角度α2。在一些情况下，角度α1为约45度而角度α2为约45度。在一些情况下，角度α1具有约10度至约60度范围内的值。在一些情况下，角度α2具有约10度至约60度范围内的值。根据一些实施例，角度α1和α2具有相同的值。可对角度α1和α2进行选择以便在样品流体从近侧部分415b向远侧部分416b行进时维持样品流体的层流或最大程度降低样品流体的紊流，继而可增强样品内的粒子沿着横向平面451b的配向。如上文参照图4A所述，过渡区的远侧和近侧边界或部分可以为弯曲的或平滑的，而不是成角度的。

图4C描绘了根据本发明实施例的示例性插管或样品进料管400c的特征，其中插管具有长度L。图4D描绘了插管400d的纵向横截面。如此处所示，插管400d包括远侧平坦区段410d、中心渐缩区段420d和近侧管状部分430d。如图4C-1中所描绘，示例性插管或样品进料管400c-1可具有远侧部分410c-1和近侧部分430c-1。在一些情况下，远侧部分410c-1具有约1.359mm的长度和约1.43mm的宽度。在一些情况下，远端的出口具有约1.359mm的出口宽度W(E)。根据一些实施例，插管可具有与图4C和4D中所描绘的不同的内部流路几何形状。例如，如图4D-1中所示，插管400d-1不包括具有扩展流动区横截面的渐缩中心区段。如图4D-1中所描绘，插管400d-1具有远侧区段410d-1、内径渐缩的中心渐缩区段420d-1以及近侧区段430d-1。对应于中心区段420d-1的渐缩内径，410d-1的内部横截面积小于430d-1的内部横截面积。

根据本发明实施例的验尿系统可处理具有约900μL的体积的尿样。图4D中所示的插管或注射管400d具有约13uL的内部体积。根据一些实施例，插管或注射管具有低于约30μL的内部体积。

图4E示出了远侧平坦区段410e的横截面。如此处所示，远侧区段410e具有内部宽度W(I)和内部高度H(I)，样品料流从中流动。此外，远侧区段410e具有外部宽度W(O)和外部高度H(O)。如图4D和4E合在一起所描绘，样品流体注射管的远侧部分410e具有出口P，其具有高度H(I)和宽度W(I)，其中高度H(I)小于宽度W(I)。根据一些实施例，远侧部分410e的出口P的高度H(I)(或远侧部分410d的内部高度)可具有约150μm的值。在一些情况下，高度H(I)可在约50μm至约250μm的范围内。根据一些实施例，远侧部分410e的出口P的宽度W(I)(或远侧部分410d的内部宽度)可具有约1350μm的值。在一些情况下，宽度为约1194μm。在一些情况下，宽度W(I)可具有约500μm至约3000μm范围内的值。在一些情况下，高度H(I)可为约150μm并且宽度W(I)可为约1350μm。在一些情况下，宽度W(I)为约1600μm。在一些情况下，宽度W(I)的宽度为约2000μm。在一些情况下，宽度W(I)为约2190μm。在一些情况下，宽度W(I)具有约1350μm至约2200μm范围内的值。如本文别处所讨论，宽度W(I)的值可确定成像位点处的样品料流的宽度。在一些情况下，远侧平坦区段410d可通过向管或导管施加夹持力而制成。在一些情况下，插管可具有约1.23in的长度和约0.055in的内径。在一些情况下，插管可具有约48μL的内体积。

图4F示出了中心渐缩区段420f的横截面。如此处所示，中心渐缩区段420f具有内径D(I)，样品料流从中流动。另外，中心渐缩区段420f具有外径D(O)。图4G示出了近侧区段430g的横截面。如此处所示，近侧区段430g具有内径D(I)，样品料流从中流动。此外，远侧区段430g具有外径D(O)。

如图4D中所描绘，注射管或插管400d可具有近侧部分430d、远侧部分410d和设置在近侧部分430d与远侧部分410d之间的第三部分420d，近侧部分具有第一流动横截面积(例如，图4G中所示的π*(D/2)²)，远侧部分具有比第一流动横截面积小的第二流动横截面积(例如，图4E中所示的W(I)*H(I))。第三部分420d可具有大于第一和第二流动横截面积的第三流动横截面积(例如，图4F中所示的π*(D/2)²)。在一些情况下，近侧部分430g的外径D(O)为约1067μm，而近侧部分430g的内径D(I)为约813μm。

根据一些实施例，注射管的近侧部分可与样品入口配件的样品口耦合。例如，如图4H中所示，插管400h的近侧部分405h可在样品入口配件420h的出口处直接耦合到样品口410h。

用于使尿样中的粒子成像的系统的流通池可以相对于重力方向的任何所需角度或方向取向。例如，流通池可在向上方向上取向，以使得流通池内流动的流体(例如，鞘液，任选地与样品流体相结合)可克服重力在向上方向上行进。同样，流通池可在向下方向上取向，以使得流通池内流动的流体(例如，鞘液，任选地与样品流体相结合)可在重力作用下在向下方向上行进。图4I描绘了在向上方向上取向的流通池420i，以使得流通池420i内流动的样品流体424i和鞘液426i克服重力G流动。图4J描绘了在向下方向上取向的流通池420j，以使得流通池420j内流动的样品流体424j和鞘液426j不是克服重力G流动，而是在重力G作用下流动。

如图4K中所示，穿过流通池420k的图像捕获位点432k流动的样品料流带R可具有约2μm的厚度T。在一些情况下，样品料流带的厚度T可最多为约3μm。通常，小于样品料流厚度的细胞或粒子将被包含在带内。示例性红血细胞(RBC)可呈现为双面凹陷的圆盘并可具有约6.2μm与约8.2μm之间的直径D。此外，示例性红血细胞可具有约2μm与约2.5μm之间的最大厚度T1和约0.8μm与约1μm之间的最小厚度T2。在一些情况下，红血细胞的厚度可最多为约3μm。示例性人血小板的尺寸可以变化，并也可具有约2μm的厚度或直径。虽然这里未按比例示出，但是流通池可在图像捕获位点处限定值为约150μm的流路厚度F。在一些情况下，流路厚度F具有50μm与400μm之间的值。该流路厚度F还可对应于图4B-1和图4B-2中所描绘的远侧部分461b的远侧高度418b。

如图4K中所示，样品流体料流的厚度T与粒子(红血细胞)的厚度的比率为约1:1。根据一些实施例，在图像捕获位点处的样品流体料流的厚度T与粒子之一的尺寸的比率在0.25至25的范围内。在一些情况下，厚度T可具有0.5μm至5μm范围内的值。

如本文别处和共同待审的美国专利申请No.____中所讨论，样品带R的流体与鞘液之间的粘度差可起到沿着流动方向配向样品料流中的粒子(例如红血细胞)或使其取向的作用。当如此配向时，如图4K中所示，成像设备或相机可获取红血细胞的图像使得它们看起来为圆的，因为该血细胞的主表面面向相机。这样，红血细胞呈现的配向展示出相对于流动的低阻力。因此，鞘液和样品流体的相对粘度特性可有助于高百分比或数量的红血细胞面向相机，从而增强粒子分析系统的评估能力。

根据一些实施例，鞘液的粘度特性起到限制尿样中的粒子失准的作用。例如，粘度差可将尿液流体样品中的红血细胞成像取向失准有效限制到低于约10％。也就是说，样品中的100个红血细胞中的90个或更多个红血细胞可配向以使得其主表面面向成像设备。对称的变窄过渡区可提供20％的值。在没有粘性鞘液的情况下使用流通池的经处理尿样的图像在图4O中进行描绘，并且相比之下，在使用粘性鞘液的情况下使用流通池的经处理尿样的图像在图4P中进行描绘。如此处所示，使用粘性鞘液可限制样品流体料流内的粒子失准。根据一些实施例，鞘液具有类似于水的折射率(即n＝1.3330)。在一些情况下，鞘液具有约89％的水含量。除了因粘度差而观察到的配向作用外，还因双侧渐缩过渡区观察到了配向作用。在一些情况下，据观察，双侧(即，对称)渐缩过渡区在配向粒子方面的有效性是不对称渐缩过渡区设计的两倍。

红血细胞的有效配向可有助于改善诊断。在一些情况下，可将成像的红血细胞的形状用于确定从其获取样品的患者是否具有特定的生理病症或疾病。例如，具有镰状细胞病的患者展示出形状异常(即，镰刀形状)的血细胞。因此，通过获得配向红血细胞的高质量图像，可以确保准确的诊断。红血细胞的其他形状变化，例如具有薄周边区域和大平坦中心区域的红血细胞(由此红血细胞看起来具有自行车轮胎轮廓)，可用本发明的配向技术有效地成像。相似地，可出于诊断目的对具有小中心部分和厚周边区域，由此看起来具有卡车轮胎轮廓的红血细胞成像。本文所公开的改进的成像技术还可用于评估其他红血细胞特性，诸如血红蛋白含量、铁含量等等。

不受任何特定理论的束缚，据信，鞘液的粘度与样品流体的粘度之间的粘度差产生改变的抛物线剖面，其中该剖面总体上为抛物线的，并具有对应于加速度增大的流动中心区域的中心隆起，并且该中心隆起有助于样品粒子或粒子内细胞器的配向。根据一些实施例，鞘液与样品带之间的速度差和粘度差生成剪切力以增加细胞器或细胞内粒子的配向。鞘液抛物线剖面的示例性方面在共同待审的美国专利申请No.________中有所讨论，该专利申请的内容以引用方式并入本文。

白血细胞通常大于红血细胞和血小板。例如，示例性中性粒细胞和嗜酸性粒细胞可具有约10μm与约12μm之间的直径。示例性嗜碱性粒细胞可具有约12μm与约15μm之间的直径。示例性淋巴细胞(小)可具有约7μm与约8μm之间的直径，而示例性淋巴细胞(大)可具有约12μm与约15μm之间的直径。示例性单核细胞可具有约12μm与约20μm之间的直径。粒子分析系统的构形(包括鞘液和流体样品带在它们穿过流通池时之间的相互作用)可在白血细胞穿过图像捕获位点432l行进时起到压缩白血细胞的作用，如图4L中所指示。因此，例如，白血细胞(WBC)的中心部分可定位于样品料流带R内，而白血细胞的周边部分可定位于鞘液内。因此，当白血细胞通过样品带而穿过流通池传输时，白血细胞的侧面可延伸到鞘液中。

根据一些实施例，鞘液与样品流体之间的粘度差可起到配向存在于诸如白血细胞的细胞内的细胞器或其他细胞内特征的作用。不受任何特定理论的束缚，据信，与鞘液和样品流体之间的粘度差相关的剪切力可作用于白血细胞从而配向细胞内特征。在一些情况下，与鞘液和样品流体之间的速度差相关的剪切力可有助于这种配向。这些配向作用可受粒子之间的尺寸差异以及样品流体带的影响。例如，如果粒子的部分延伸到样品流体带之外并进入周围的鞘液中，则与粘度差相关的剪切力可对细胞内特征配向具有明显的影响。

如图4L中所描绘，细胞(诸如白血细胞)的部分可延伸到鞘液中。本发明的实施例涵盖鞘液组合物，该鞘液组合物在将细胞暴露于鞘液时不裂解或破碎细胞或者说是损害外部细胞膜的完整性。该鞘液中的粘度剂可起到保持样品流体料流中的细胞的活力的作用，从而在细胞膜或细胞壁横越样品流体带与鞘液包层之间的界面时或者说是从样品流体料流延伸到流动鞘液中时使细胞的结构(例如，形状)和内容物(例如，细胞核)保持完好无损。

通常，当细胞或粒子沿着流通池在样品流体带内流动时存在作用于细胞或粒子的压缩力。因此，当细胞因变窄的过渡区而处于压缩状态或者说是经受压缩力时细胞可与鞘液接触。鞘液的粘度剂可起到避免被压缩的细胞在它们从薄样品流体带出现并变为暴露于粘性鞘液时破碎或毁坏的作用，至少在细胞到达图像捕获位点之前。因此，鞘液的粘度剂组合物可起到细胞保护剂的作用，同时还增强粒子或粒子内内容物的配向。

参照图4K和图4L，在一些情况下，细胞或粒子的部分可延伸到薄样品流体带R之外并进入周围的鞘液中。如在共同待审的美国专利申请No.____中所讨论，鞘液可包含抑制或防止鞘液破坏或裂解细胞或粒子的细胞保护剂。例如，鞘液可包含当将细胞暴露于鞘液的化学环境时维持细胞壁的结构完整性的细胞保护剂。相似地，细胞保护剂也可在细胞经历由流通池几何形状和样品流体与鞘液之间的速度和/或粘度差所引起的任何剪切力时起到保持细胞壁的结构完整性的作用。相关地，保护剂可使细胞或粒子免受样品流体与鞘液之间的速度差所引起的力的影响。这样，细胞在它们到达图像捕获位点时保持其活力。

剪切力在样品流体带与鞘液包围之间的界面处可能是显著的。根据一些实施例，流通池流路内的流动可由抛物线流动剖面表征。图4L-1描绘了抛物线流动剖面400l-1a和400l-1b的示例性方面。上图中的抛物线剖面400l-1a是存在于本发明的某些流通池实施例内的流动中的典型速度剖面(例如，其中在被包围在鞘液流动料流内的样品流体流动料流之间存在很小的粘度差或不存在粘度差)。可以看出，在流体料流的中间观察到了最高的线速度，并在流通池壁附近观察到了较慢的线速度。剖面400l-1a也可在鞘液与样品流体之间具有轻微粘度差的流体料流中观察到。在鞘液与流体料流之间存在高粘度差的情况下，观察到了如剖面400l-1b中所示的中心隆起，其中存在具有放大的线速度的局部中心区域。根据一些实施例，尺寸足够大的粒子将经受一定量的剪切力，甚至在此类粒子被完全包含在单一流体相内时(即，在鞘液包层内或者在样品流体带内)。

在一些情况下，鞘液的速度可与样品流体的速度不同。例如，鞘液可以80mm/s行进而样品流体可以60mm/s行进。因此，在一些情况下，样品流体以慢于周围包层的鞘液速度的样品流体速度离开远侧插管端口。因此，鞘液可起到沿着插管的流路拖动样品流体的作用，从而加速样品流体并降低样品流体带的厚度。样品流体带保持总体体积和质量不变，因此当其行进得越快时变得越薄。根据一些实施例，鞘液和样品流体在图像捕获位点处具有约20与200mm/s之间的速度。

通常，当样品流体从插管出口向图像捕获位点行进时，样品流体的速度增加。在一些情况下，在图像捕获位点处样品流体的速度是样品流体离开插管远侧部分的插管端口时的速度的40倍。根据一些实施例，样品带的横截面积的减小与速度的增加呈线性关系。根据一些实施例，如果在插管出口处的鞘液速度高于样品带速度，则这也将增大成像区域处的最终样品带速度。

鞘液可起到对样品流体带和样品流体带内的粒子施加显著的剪切力的作用。一些力平行于流动方向，而粒子也可能遇到垂直于流动方向的力。通常，当鞘液和样品流体接近图像捕获位点或区时，鞘液和样品流体以相同的速度或接近相同的速度行进。因此，当鞘液和样品流体通过图像捕获位点时在它们之间的边界或界面可呈现出与远侧插管出口处或渐缩过渡区处的边界或界面相比更低的剪切力。例如，在渐缩过渡区处，鞘液包围与样品流体带之间的边界或界面可处于过渡中，以使得最初较慢较厚的样品带变得更快更薄，并且样品流体中的粒子变得更配向。换句话说，剪切力在渐缩过渡区可能是突出的，并可向图像捕获位点耗散。在图像捕获位点处的剪切力可由抛物线剖面表示，并可远低于渐缩过渡区处的剪切力。因此，细胞或粒子可在它们通过过渡区时经受更高的剪切力，并在它们通过图像捕获位点时经受更低的剪切力。根据一些实施例，鞘液与样品流体之间的粘度差可使红血细胞配向并因而聚焦。根据一些实施例，鞘液与样品流体之间的粘度差可使白血细胞配向并因而聚焦。相关地，可得到因料流的几何变窄和鞘液与样品流体之间的速度差而配向并聚焦的细胞和细胞器组分的增强的成像结果。

如本文别处所述，并参照图4K和4L，当鞘液和样品流体R流过流通池的流路尺寸缩减段或过渡区并流向成像位点432k或432l时，与鞘液粘度和样品流体粘度之间的粘度差相关的鞘液和样品流体R之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用连同与流路尺寸缩减段或过渡区相关的鞘液和样品流体R之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用在成像位点432k或432l处在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态。

在一些情况下，靶标成像状态是相对于成像位点处的焦平面F的靶标取向。例如，如图4K-1中所描绘，粒子(RBC)可从焦平面F位移一定的距离。在一些情况下，靶标取向涉及相对于成像位点432k-1的焦平面F的靶标粒子取向。粒子可以是血细胞，诸如红血细胞、白血细胞或血小板。如这里所示，成像位点432k-1处的流路可限定基本上与焦平面F平行或共平面的P平面。在一些情况下，粒子的一部分可沿着焦平面F定位，而粒子的中心部分则可从焦平面F偏移。在一些情况下，靶标取向涉及相对于成像位点432k-1处的焦平面F的靶标位置。例如，靶标位置可涉及对粒子进行定位以使得粒子的至少一部分沿着焦平面F设置。在一些情况下，靶标位置可涉及对粒子进行定位以使得粒子与焦平面F之间的距离不超过某一阈值。在一些情况下，靶标位置涉及相对于成像位点432k-1处的焦平面F的靶标粒子位置。在一些情况下，靶标位置与焦平面F相隔距离D或不到距离D，其中距离D对应于位置公差。可对鞘液与样品流体之间的粘度差进行选择以便在流通池内实现带状样品料流的所需定位(例如，相对于流路平面P和/或焦平面F)。在一些情况下，可对粘度差进行选择以便实现处于位置公差D或不到位置公差D的靶标粒子位置。

在一些情况下，焦平面F具有如图4K-2中所指示的视野厚度或深度，而粒子(RBC)具有相对于焦平面厚度的靶标成像状态。例如，粒子的靶标位置可在焦平面F内或至少部分地在焦平面F内。在一些情况下，高光学分辨率成像设备或相机可具有约7μm的视野深度或焦平面厚度。在一些情况下，视野深度或焦平面厚度具有约2μm至约10μm范围内的值。在一些情况下，相机的视野深度类似于或等于图像捕获位点处的样品带厚度。

在一些情况下，靶标取向可涉及相对于成像位点处的焦平面F的靶标配向。例如，靶标配向可指示由粒子限定的平面与焦平面F配向，不超过如图4K-3所示的相对于图像捕获位点432k-3处的焦平面F的特定角度α。在一些情况下，靶标成像状态可涉及对样品中的失准粒子的数量或百分比的限制。例如，鞘液与样品流体R之间的粘度差可将尿样中的红血细胞成像取向失准有效限制到小于约10％。也就是说，样品中的100个红血细胞中的90个或更多个红血细胞可配向以使得其主表面面向成像设备(如图4K-1和4K-2中所描绘)或使得那90个或更多个RBC的配向在基本上平行于流动方向的平面的20度内(例如，RBC配向角度α为20度或更小)。如本文别处所讨论，在一些情况下，至少92％的非球形粒子(诸如RBC)可在基本上平行于流动方向的平面中配向。在一些情况下，至少75％与95％之间的非球形粒子(诸如RBC)可基本上配向，即，在基本上平行于流动方向的平面的20度内(例如，配向角度α为20度或更小)。根据一些实施例，90％或更多的某些粒子(例如，红血细胞和/或血小板)可横向于成像设备的成像轴取向。

在一些情况下，本发明的实施例包括与如本文所述的验尿系统一起使用的组合物，诸如鞘液或粒子和细胞内细胞器配向液(PIOAL)。此类鞘液或PIOAL适用于组合式粘度和几何流体聚焦视觉分析仪。PIOAL可起到引导或促进给定粘度的尿样流体流过视觉分析仪的变窄流通池过渡区的作用。PIOAL可包含粘度比样品的粘度更高的流体。与粘度差相关的PIOAL流体和样品流体之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用连同与变窄流通池过渡区相关的PIOAL流体和样品流体之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用可有效地在视觉分析仪的成像位点处在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态，同时维持尿样流体中的细胞的活力。

图4M描绘了具有内部细胞器(诸如裂片410m)的示例性中性粒细胞400m(一种类型的白血细胞)。因样品流体与鞘液之间的粘度差，内部细胞器可在细胞内配向，如图4N所指示。因此，细胞内细胞器可通过图像捕获设备430m有效地成像，而细胞器不彼此重叠。也就是说，不是如图4M中所描绘的裂片彼此堆叠，当从图像捕获设备的成像轴或光轴观察时，裂片配向和并排放置，如图4N中所描绘。因此，可在捕获的图像中更有效地看见裂片。内部细胞器配向是样品流体与鞘液之间的粘度差的令人惊奇的且意料不到的结果。

如本文别处所述，并参照图4M和4N，当鞘液和样品流体R流过流通池的流路尺寸缩减段或过渡区并流向图像捕获设备430m或430n的成像位点时，与鞘液粘度和样品流体粘度之间的粘度差相关的鞘液和样品流体R之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用连同与流路尺寸缩减段或过渡区相关的鞘液和样品流体R之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用在成像位点处在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态。根据一些实施例，靶标成像状态可对应于成像状态的分布。

在一些情况下，靶标成像状态可涉及相对于成像位点处的焦平面的靶标粒子内结构取向(例如，配向和/或位置)。例如，如图4N中所描绘，内部结构410m(例如，细胞内结构、细胞器、裂片等)可相对于焦平面F取向。在一些情况下，靶标配向涉及相对于成像位点处的焦平面F的靶标粒子内结构配向，类似于图4K-3中所描绘的粒子配向关系。在一些情况下，靶标位置涉及相对于成像位点处的焦平面的靶标粒子内结构位置，类似于图4K-1中所描绘的粒子位置关系。在一些情况下，粒子内结构的靶标取向既可包括相对于焦平面的靶标配向也可包括相对于焦平面的靶标位置。在一些情况下，靶标成像状态可涉及成像位点处的靶标变形。例如，如图4N中所描绘，粒子400m具有与图4M中所描绘的粒子形状相比压缩的形状。因此，可以看出的是，流通池的运行可对粒子形状产生侧向压缩作用。相关地，粒子内特征可在粒子本身的形状被压缩时在位置或方向上取向(例如，相对于焦平面F和/或带状流平面配向)。根据一些实施例，鞘液与样品流体之间的速度差可在流动料流内产生摩擦，而鞘液与样品流体之间的粘度差可放大该流体动力摩擦。

实例

可使用流过流通池的样品流体的图像执行多种验尿或尿液粒子分析技术中的任一种。通常，图像分析可涉及确定某些细胞或粒子参数，或测量、检测或评价某些细胞或粒子特征。例如，图像分析可涉及评价细胞或粒子尺寸、细胞核特征、细胞质特征、细胞内细胞器特征等等。相关地，分析技术可涵盖某些计数或分类方法或诊断测试。相关地，参照图4，处理器440可包括存储介质或与存储介质操作性地相连，所述存储介质具有计算机应用程序，所述计算机应用程序被配置成在被处理器执行时导致系统400基于得自图像捕获设备的图像区分不同类型的细胞或粒子。例如，诊断或测试技术可用于区分存在于尿液中的各种粒子(例如，红血细胞、白血细胞、鳞状上皮细胞、管型、晶体和酵母)。

本文提供的实例仅用于举例说明的目的，并且本发明不限于这些实例，而是涵盖因本文所提供的教导而显而易见的所有变型形式。

在本文所述的实验之前，不存在公开的方案允许开发和使用下述方法，所述方法包括如本文所公开的用于配向尿液中的粒子和重定位细胞内内容物的PIOAL。这可用于体液(例如，尿液)样品中的粒子的基于图像的分析和区分性分类及亚分类。本文所公开的方法和组合物可任选地以适于实现白细胞染色、上皮细胞、细菌染色的方式对粒子染色和/或使粒子裂解，其增强显微镜载片上的差异目测观察。相关地，在本文所述的实验之前，不存在公开的方案允许开发和使用下述方法，所述方法包括用于基于图像的分析以及用于执行尿样中的粒子/细胞差异分类和亚分类的PIOAL)样品以及使用此类组合物的方法，同时维持细胞有活力或基本上完好无损，并且选择在流动时发生染色和透化步骤，以实现白细胞、上皮细胞、细菌染色，其会提高显微镜载片上的差异目测观察。

本文所述的示例性组合物允许在相对低的血液与试剂稀释度下发生染色，并且染色可快速地发生(例如，在30秒内)。如果需要，示例性方法可采用使用表面活性剂连同热来实现红细胞裂解。可对示例性制剂进行修改以保持RBC完整性，并仍实现WBC、网织红细胞和血小板染色效力。

本发明的各方面和实施例基于以下令人惊奇且意料不到的发现：某些PIOAL组合物在用于执行基于图像的粒子/细胞分析时具有意料不到的配向细胞和重定位细胞内结构的性质。

以举例的方式，开发了若干示例性PIOAL制剂及其使用方法。以下是具有所需性质的PIOAL制剂的一些示例。

本文所述的示例性组合物允许在相对高的尿液与试剂比率下发生染色，并且染色可快速地发生(例如，在30秒内)。如果需要，示例性方法可采用使用表面活性剂连同热来实现膜渗透以保持RBC完整性并且仍以所需分辨率实现WBC、上皮细胞和细菌染色效力。

图4O和4P示出了表明使用PIOAL(图4P)获得的图像与使用常规鞘液(图4O)获得的图像之间的比较的图像。在使用聚焦方案(在示例性自动对焦光栅上)将仪器聚焦之后，对包含iQ200阳性尿液对照物的浓缩版本的样品进行分析。将样品穿过插管注射到流通池内，从而在两层PIOAL或常规鞘(对照物中)之间生成大约2.5微米厚的带形样品料流。视觉分析仪然后生成将用于分析的带形样品料流中的粒子的聚焦图像(例如，以每秒约60帧)。如从图4O和4P可以看出，PIOAL显著增加浓缩尿样中的配向粒子的百分比。

以举例的方式，图4Q示出了使用本发明的示例性组合物和方法获得的所得图像，其表明了对以下粒子进行分类和/或亚分类的效力：红血细胞、白血细胞、鳞状上皮细胞、管型、晶体和酵母。图像展现了多种细胞组分并且对于各细胞类型而言细胞核裂片和颗粒状结构可明显地区分开。尿样使用以下方案采集：如下所示使样品与粒子造影剂组合物接触。将以下液体混合在一起以获得示例性粒子造影剂组合物：0.150mL1mg/mL的溶于裂解溶液的结晶紫(CDS5PD-Lytic)，以及0.150mL的PBS，pH为7.2。示例性样品最初通过将300uL的示例性粒子造影剂组合物移液到测试管内并将其与1.7mL的尿样混合而制备。将混合物在60℃水浴中温热30秒。使用以下条件在示例性分析仪上分析样品(例如，如图1所描绘)：0.56uL/s样品流速、和46uL/s鞘液流速。结果示于图4Q中。因此，可以看出，本文所公开的样品处理技术可提供有利的成像结果，使得粒子结构和内容物得以保持，并且参照成像轴的增强配向得以实现。

另据观察，基于在对称和不对称流通池中使用浓度渐增的甘油(gly)，PIOAL的实施导致了改善的配向。

这些结果为以下令人惊奇且意料不到的发现提供了证据：某些PIOAL组合物在用于执行基于图像的粒子/细胞分析时具有意料不到的配向细胞和重定位细胞内结构的性质。

以举例的方式，开发了若干示例性PIOAL制剂及其使用方法。以下是具有所需性质的PIOAL制剂的一些示例。PIOAL包含稀释剂和至少一种粘度改性剂。

示例性PIOAL制剂A包含具有300mL甘油的30％(v/v)甘油溶液，并用稀释剂适量(足够的或使最终体积定容至1L的量)定量到1L，所述稀释剂包含9.84g硫酸钠、4.07g氯化钠、0.11g盐酸普鲁卡因、0.68g磷酸二氢钾、0.71g磷酸氢二钠和1.86g乙二胺四乙酸二钠。然后将初始混合物用去离子水适量定量到1L，同时用氢氧化钠将pH调至7.2。

示例性PIOAL制剂B包含具有65mL甘油的6.5％(v/v)甘油溶液，并用合适的示例性稀释剂适量定量到1L，所述稀释剂包含9.84g硫酸钠、4.07g氯化钠、0.11g盐酸普鲁卡因、0.68g磷酸二氢钾、0.71g磷酸氢二钠和1.86g乙二胺四乙酸二钠。然后将初始混合物用去离子水适量定量到1L，同时用氢氧化钠将pH调至7.2。

示例性PIOAL制剂C包含在缓冲剂中具有1％PVP(w/v)的5％甘油(v/v)溶液，其具有50mL甘油、10gPVP(分子量：360,000)、1包SigmaPBS粉末，pH为7.4(0.01M磷酸盐缓冲盐水；0.138M氯化钠；0.0027M氯化钾)，并用去离子水适量定量到1L。

示例性PIOAL制剂D包含1.6％PVP(w/v)溶液，其具有16gPVP(分子量：360,000)和1包SigmaPBS粉末，pH为7.4(0.01M磷酸盐缓冲盐水；0.138M氯化钠；0.0027M氯化钾)，并用去离子水适量定量到1L。

通过量

图5描绘了与流通池中一种或多种样品流体的注射相对应的时间线500。如此处所示，可引发第一样品流体向流通池中的注射，如步骤510所指示。随后，可在流通池中使来自第一样品流体的粒子成像，如步骤515所指示。第一样品流体可具有约900μl的体积。在一些情况下，在成像区域处流速为0.232μL/s(或在0.2μL/s至0.35μL/s的范围内)。可终止第一样品流体的注射，如步骤520所指示，并且可引发第二样品流体向流通池中的注射，如步骤530所指示。由于第一样品流体注射的终止和第二样品流体注射的引发，可引发样品流体瞬变，如步骤535所指示。随后，流通池中的样品流体瞬变可耗散，如步骤445所指示。可在流通池中使来自第二样品流体的粒子成像，如步骤550所指示。可终止第二样品流体的注射，如步骤560所指示。在一些情况下，在约18℃至约40℃范围内的温度下执行注射和流动程序。

通常，在注射样品时并且在终止注射时，鞘液的料流保持流动于流通池内。因此，根据一些实施例，在样品流体脉冲式注射到流动鞘液的同时保持鞘液的连续流。当样品流体沿着流通池流动时，鞘液的连续流可有助于保持样品流体中的带形。

根据一些实施例，可在与步骤515相关的图像捕获的四秒内执行与步骤550相关的图像捕获。根据一些实施例，第一与第二样品流体注射之间(例如，步骤510与530之间)的时间为约30秒。相关地，根据一些实施例，第一与第二样品流体的成像的引发之间(例如，步骤515的引发与步骤550的引发之间)的时间为约30秒。这样，可以每小时处理120个样品流体。在一些情况下，图像捕获设备以180帧/秒(FPS)的帧速率操作，从而以高频率或高速率产生多个唯一的连续图像或帧。如此处所示，成像步骤(例如515或550)的持续时间可为15秒，从而每个样品流体产生2,700张图像。

在一些情况下，在将第一样品流体从样品流体注射管注射到流动鞘液中(例如，步骤510)后约1至3秒内，第一样品流体达到稳定状态。在一些情况下，在将第一样品流体从样品流体注射管注射到流动鞘液中(例如，步骤510)后小于1秒内，第一样品流体达到稳定状态。样品向流通池中的注射可为两步过程。根据该实施例，第一步为将所有稀释剂从插管清除的高速推进，并且在初始推进后，样品的流速显著下降。过渡时间可被定义为样品(例如细胞)在成像流动条件(较慢样品流速)下从插管出口行进到成像区域花费的时间。在一些情况下，在将第一样品流体从样品流体注射管注射到流动鞘液中(例如，步骤510)后约1.8秒内，第一样品流体达到稳定状态。在一些情况下，样品流体具有约2至4秒范围内通过流通池(例如，从插管出口到图像捕获位点)的运输时间。

根据一些实施例，流体稳定或从插管的远侧出口行进到成像区域要花费约5秒。在一些情况下，图像捕获持续时间段可为约20秒。

根据本发明实施例的验尿系统可处理具有约900μL的体积的尿样。根据一些实施例，插管或注射管具有小于约30uL的内部体积。根据一些实施例，插管或注射管具有大于约30μL的内部体积。在开始图像采集之前尿样的体积能有效地注满插管，因此可避免延长的样品流不稳定的时间段。例如，具有约13μL的内部体积的插管的使用可对应于约2至3秒的样品流不稳定时间段。根据一些实施例，插管内部体积可能不会影响样品流稳定性。根据一些实施例，如果初始高速样品推进不足以更换插管内的所有稀释剂，插管内部体积可能会影响样品带自身中的细胞浓度稳定性。相关地，可使用少量稀释剂在短时长内在样品之间清洗插管。这样，可以实现有利于捕获高质量图像的稳定样品流，并且同时实现高通过量，且具有低残留。根据一些实施例，具有高内部体积的插管可需要样品的高体积初始高速推进以清除管线和插管中的所有稀释剂。

根据一些实施例，验尿系统可被配置成限制瞬变和顺序的样品交叉污染以加速从尿样的图像采集。

方法

图6描绘了根据本发明实施例使用被配置用于组合式粘度和几何流体聚焦的粒子分析系统使多个粒子成像的示例性方法600的各方面。粒子可包含在具有样品流体粘度的尿液流体样品610中。如此处所示，尿样610包含粒子，并且可分成一个或多个样品流体，诸如包含粒子的第一样品流体612和包含粒子的第二样品流体614。

该方法可包括如步骤630所指示使鞘液620沿着流通池的流路流动。鞘液620可具有与样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘液粘度。该方法还可以包括将尿液流体样品610(第一样品流体612)从样品流体注射管注射到流通池内的流动鞘液中，如步骤630所指示，以便提供被鞘液包围的样品流体料流。

流通池的流路可具有流路尺寸的缩减段，使得穿过流路尺寸的缩减段流向成像位点的样品流体料流和鞘液的厚度从初始厚度降低到邻近图像捕获位点的第二厚度。方法600还可以包括在流通池的图像捕获位点处使来自第一样品流体的第一多个粒子成像，如步骤640所指示。当样品料流和鞘液穿过流路尺寸的缩减段或变窄过渡区时，与粘度差相关的鞘液和样品流体料流之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用(如步骤650中所描绘)连同与流路尺寸的缩减段相关的鞘液和样品流体料流之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用(如步骤660中所描绘)有效地在成像位点处在多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态，同时鞘液中的粘度剂保持样品流体料流中细胞的活力，使得细胞从样品流体料流延伸到流动鞘液中时细胞的结构和内容物完好无损(如步骤670中所描绘)。方法还可包括在成像位点对多个粒子成像，如步骤680中所描绘。

方法600还可包括引发样品流体瞬变。例如，通过如下方式引发样品流体瞬变：终止向流动鞘液中注射第一样品流体，以及将第二样品流体注射到流动鞘液中，如步骤650所指示。另外，方法600可包括在流通池的图像捕获位点处使来自第二样品流体的第二多个粒子成像，如步骤660所指示。根据一些实施例，使第二多个粒子成像可基本上在样品流体瞬变之后并在使第一多个粒子成像的4秒内进行。

图6A和6B描绘了与剪切力、侧向压缩、取向、差异粘度、鞘液与样品流体之间的相对运动等相关的示例性流动料流特性。

剪切应变速率

图7和8描绘了根据本发明实施例的对于流通池中某些流动条件的剪切应变速率值的各方面。在这些附图的每一个中，使用30％甘油鞘液。在一些情况下，粘度可具有2.45×10^-3的值。剪切应变值可等于粘度值乘以应变速率值得到的乘积。参照图7，样品可具有0.3μL/s的流速，而鞘液可具有21μL/s的流速。参照图8，样品可具有1μL/s的流速，而鞘液可具有70μL/s的流速。在这些图的每一个中，可以看出，流动展示出朝向中心(C)的更低的应变值和朝向周边(P)的更高的应变值。此类应变值在一些实施例中可对应于不对称流通池构形。

如图7中所描绘，根据一些实施例，朝向流动料流的中心(C)部分的更低的应变速率可具有约500(1/s)或更低的值，而朝向流动料流的周边(P)的更高的应变速率可具有约3000(1/s)或更高的值。如图8中所描绘，根据一些实施例，朝向流动料流的中心(C)部分的更低的应变速率可具有约1000(1/s)或更低的值，而朝向流动料流的周边(P)的更高的应变速率可具有约9000(1/s)或更高的值。

因此，可以看出，更低的样品和鞘液速率(例如，图7)对应于更低的应变速率，而更高的样品和鞘液速率(例如，图8)对应于更高的应变速率。应当理解，本发明的实施例涵盖使用对应于各种粘度值、各种应变速率值和/或各种剪切应力值的样品和/或鞘液。

PIOAL具有合适的粘度和密度，并且在样品引入流通池时的流速使得样品流体变平为薄带。带形样品料流与PIOAL一起被输运，以在观察口的前方通过，其中物镜镜头和光源被布置成允许观察带形样品料流。将样品流体引入，例如，在PIOAL的流路对称变窄的点处注射。因此，样品流体料流变平并伸展成薄带。本发明的PIOAL可作为鞘液与本发明的任何视觉分析仪一起使用。在一个实施例中，可将PIOAL引入流通池的末端以沿着样品流体向排放口输运。

观察区中的带形样品料流的尺度受PIOAL流路的几何变薄以及样品流体和PIOAL的差异线速度(导致带形样品料流的变薄和伸展)的影响。样品与PIOAL的初始差异线速度可在0.5:1至5:1的范围内。PIOAL流路横截面可通过降低深度而变薄约10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、105:1、110:1、115:1、125:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1或200:1的因子。在一个实施例中，几何变薄为40:1。在一个实施例中，几何变薄为30:1。所考虑的因素为流过流通池的运输时间，所需的样品通过量速率，实现与粒子尺寸相当的带形样品料流厚度，获得粒子和细胞器的配向，实现粒子的焦点内内容物，在操作限值内平衡压力、流动和粘度，优化带形样品料流厚度，获得所需的线速度，可制造性考量，以及所需的样品和PIOAL体积。

可对插管的长度和体积以及横截面变平进行选择以缩短样品流动不稳定的时期，从而增大通过量。在一些实施例中，流动不稳定的时期可短于约3、2.75、2.5、2.25、2、1.75、1.5、1.25或短于约1秒。较小的插管体积也可缩短所述时间并减小在样品运行之间清洗插管所需的稀释剂的体积。在一些实施例中，流过流通池的运输时间为1、2、3或4秒，或那些时间中任何两个之间的任何范围。在一些实施例中，该运输时间可短于4、3或2秒。

样品流体和PIOAL的粘度和流速以及流通池的轮廓被布置成使得PIOAL流变平并将样品流伸展成平带，所述平带在对应于图像捕获位点的可靠位置连续地(consistently)穿过观察区。样品流体料流可被压缩成约2至3μm的流体流厚度。若干血细胞类型都具有大于料流厚度的直径。在平行于流动方向的方向上的剪切力导致在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中粒子的图像投影增加和/或导致粒子内结构(例如，细胞内结构、细胞器或裂片)定位、重定位和/或更好地定位成基本上平行于流动方向。高光学分辨率成像设备视野深度最多为7μm，例如1-4μm。

与带形样品料流一起输运的PIOAL的流动横截面始终穿过观察口(物镜镜头被引导穿过其中)前方的观察区。物镜镜头可以是高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的物镜部件。带形样品料流在流通池内的已知且可重复的位置处(例如，在离流通池的两个壁的已知且可重复的距离处)顺着横跨观察区的路径流动，并在下游排放。

在一些实施例中，在本发明的任何组合物和/或方法中获得的图像可为数字化图像。在一些实施例中，所得的图像为显微镜图像。在某些实施例中，所述图像可以手动方式获得。在其他实施例中，获得图像的工序的至少一部分为自动化的。在一些实施例中，使用包括流通池、高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备(任选地具有自动对焦特征)的视觉分析仪获得图像。

当带形样品料流被输运穿过观察口前方的观察区时，来自样品中的粒子的光学信息通过分析仪中的检测段检测，从而生成样品中所含粒子/细胞的数据。使用该分析仪允许对样品中所含的细胞和/或粒子进行捕获、处理、分类及亚分类和计数。PIOAL液体可通过添加粘度改性剂、缓冲剂、pH调节剂、抗微生物剂、离子强度改性剂、表面活性剂和/或螯合剂而制备。本发明中的分析仪的示例性功能部件和/或特征可包括例如采集和/或处理来自图像分析的数据、样品染色处理、图像处理和/或粒子图像鉴定、计数和/或分类及亚分类的能力。

在一个实施例中，本发明基于以下令人惊奇且意料不到的发现：在PIOAL中添加适量的粘度剂明显改善流通池中的粒子/细胞配向，从而使焦点内细胞或细胞组分的百分比更高，以及使流动中的细胞和/或粒子的图像的质量更高。粘度差连同变窄过渡区的几何聚焦作用可实现增强的配向和聚焦结果。添加粘度剂增加对细胞(比如RBC)的剪切力，这改善在基本上平行于流动方向的平面中的细胞配向，从而导致图像优化。这还导致粒子内结构(诸如细胞内结构、细胞器或裂片)基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位，从而导致图像优化。粘度剂还减少细胞的失准，所述细胞通常为直径比流动料流小的细胞，但不限于这些细胞。

直径比流动料流小的细胞(例如，红血细胞)的配向可通过例如增大PIOAL的粘度或通过增大流速比而获得。这导致RBC平行于流动方向配向。在一些实施例中，RBC失准的减少和/或RBC配向的增加通过增大PIOAL的粘度而实现。

与带形样品料流一起输运的PIOAL的流动横截面始终穿过观察口(高光学分辨率成像设备被引导穿过其中)前方的观察区。带形样品料流在离流通池前壁和后壁任一者的已知且可重复的距离处顺着横跨观察区的路径流动，并在其下游排放。

本发明提供自动实现高光学分辨率成像设备的正确工作位置以对带形样品料流聚焦的技术。流通池结构被配置成使得带形样品料流在限定样品流体的流路的流通池壁之间具有固定且可重复的位置，以PIOAL层之间的薄带形式穿过流通池中的观察区。在例如图1-4G中所公开的流通池实施例中，PIOAL的流路的横截面可在过渡区对称变窄，并且样品可插入平坦的孔口，诸如在孔口具有矩形内腔的管。变窄流路(例如，以20:1至40:1的比率在横截面积上几何变窄)以及由于与样品流相比的PIOAL的任选较大线速度相互配合使样品横截面以约20:1至70:1的比率变平。根据一些实施例，该比率可在10:1至100:1的范围内，在50:1至100:1的范围内，在70:1至80:1的范围内。根据一些实施例，该比率为75:1。有效地，由于流速、粘度和几何形状的组合，样品形成薄带。变窄流路(例如，以40:1的比率或以20:1至70:1之间的比率在横截面积上几何变窄)以及与样品流相比的PIOAL的线速度差相互配合使样品横截面以约20:1至70:1的比率压缩。在一些实施例中，该横截面厚度比率可为40:1。在一些实施例中，该横截面厚度比率可为30:1。

因此，方法变量(诸如样品和PIOAL的特定线速度)不会倾向于使带形样品料流从其流动位置发生位移。相对于流通池的结构，带形样品料流位置是稳定且可重复的。

在另一个方面，本发明涉及包括本发明的粒子造影剂组合物的试剂盒。该试剂盒还可以包括根据本文所述的任何方法的粒子造影剂组合物的使用说明。该试剂盒还可以包括粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)。该试剂盒还可以包括可编程的存储介质和用于诸如以下粒子的基于图像的鉴定的相关软件：中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、网织红细胞、有核RBC、母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、细菌、真菌、原生生物、原生动物或寄生生物。该试剂盒还可以包括一种或多种缓冲剂，其可以包括等渗缓冲剂和/或稀释剂。该试剂盒或缓冲剂还可以包括表面活性剂、pH调节剂和/或抗微生物剂。在其他实施例中，该试剂盒还可以包括清洗溶液或冲洗溶液。该试剂盒还可以包括用于阳性和阴性对照的标准品。在一些实施例中，该标准品可以包括标准染色细胞试剂。该试剂盒还可以包括一次性用品，诸如用于转移试剂盒组分的一次性微量移液器、移液头或试管。该试剂盒可以包括这些试剂盒部件中的任一种，或两种或更多种的任意组合。

区分尿样中的血细胞或其他粒子是本发明实施例尤其适合的示例性应用。样品通过自动技术制备并作为薄带形样品料流呈递给高光学分辨率成像设备，以在带形样品料流流经视野的同时周期性地成像。粒子(诸如血细胞)的图像可用像素图像数据编程的处理技术完全自动地或以有限的人工辅助而彼此区分、分类、亚分类和计数，以鉴定和计数细胞或粒子。除了可以存储并使得就粒子的不寻常或关键特征而言可用的细胞图像之外，输出数据还包括在所记录的样品图像中区分的各特定类目和/或亚类目的细胞或粒子的出现次数。

存在于各图像中的不同粒子的计数可进一步处理，例如用于作为一个整体而累积样品中各区分类目和/或亚类目的细胞的准确且统计上显著的比率。用于视觉辨别的样品可被稀释，但在稀释的样品中表示各类目和/或亚类目中的细胞的比例，特别是在处理多个图像之后。

本文所公开的装置、组合物和方法可用于基于视觉区别而辨别和定量样品中的细胞。样品可以为生物样品，例如包含白血细胞的体液样品，包括但不限于血液、血浆、骨髓、灌洗液、积液、渗出液、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液和羊水。在一些实施例中，样品可为实体组织样品，例如，已进行了处理而产生细胞悬液的生物活检样品。样品也可以为通过处理粪便样品而得到的悬液。样品也可以为包含粒子的实验室或生产线样品，诸如细胞培养样品。术语样品可用于指代得自患者或实验室或其任何级分、部分或等分试样的样品。在一些方法中可将样品稀释、分成多个部分或进行染色。

在一个方面，本发明的系统、组合物和方法提供流动中的细胞的令人惊奇的高质量的图像。在一个方面，视觉分析仪可用于本发明的方法以提供自动化的基于图像的WBC微分计数。在某些实施例中，本发明的方法涉及视觉区别(包括形态特征和/或异常)的自动化鉴定，以用于对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常和/或感染和/或对治疗响应还是无响应进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断。该系统在一些实施例中还可以包括粒子计数器。应用包括分类和/或亚分类，以及对流体样品诸如尿样中的细胞计数。也设想了用于对另外类型的粒子和/或其他流体样品中的粒子计数的其他类似的用途。本发明的系统、组合物和方法可用于采用任何合适的自动化粒子识别算法进行实时分类及亚分类以及图像观察。可存储各样品的捕获图像以日后观察。

在另一个方面，本发明的装置、组合物和方法提供令人惊奇的更准确的基于图像的细胞分类及亚分类和标记，与使用目前的自动分析仪时的手动检查率相比，所述标记降低手动检查率。所述系统、组合物和方法降低手动检查率并允许在仪器上进行手动检查。此外，本发明的系统、组合物和方法还降低需要人工检查的在自动分析期间标记的样品的百分比。

因此，在一些实施例中，本发明提供用于分析包含粒子(例如，血细胞)的样品的装置和方法。根据本发明，提供视觉分析仪以获得包含悬浮在液体中的粒子的样品的图像。在一些实施例中，视觉分析仪包括流通池和自动对焦部件，其中使包含所关注粒子的液体样品流过具有观察口的流通池，而耦合到物镜镜头的相机通过所述观察口捕获粒子的数字图像。可使用本发明的实施例实施的示例性自动对焦技术在共同待审的美国专利申请No.____中有所公开，该专利申请的内容以引用方式并入本文。流通池耦合到样品流体源，诸如经稀释和/或处理的尿样或如本文所述的其他体液样品，并耦合到透明鞘液或粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)源。

在一个实施例中，所述装置还包括具有至少一个检测范围的粒子计数器，以及分析仪和处理器。所述分析仪和处理器被配置成提供另外的信息以纠正与粒子计数器相关的计数、分类和亚分类误差，并且还确定样品中不同类目和/或亚类目的粒子的准确粒子计数或浓度。

在其他实施例中，本发明涉及可用于如本文所述的基于图像的粒子分析的PIOAL。尿样中的细胞类目和/或亚类目计数在本发明中用作可以分析的该类样品的非限制性例子。在一些实施例中，存在于样品中的细胞还可以包括细菌或真菌细胞以及白血细胞和/或红血细胞。

根据一些实施例，用于样品稀释、透化和组织学染色的样品制备装置和方法的详情一般使用由一个或多个可编程控制器操作的精密泵和阀门来实现，并且不是本发明的重点。例子可见于转让给国际遥感成像系统公司(InternationalRemoteImagingSystems,Inc.)的专利，诸如关于可编程控件的US7,319,907。同样，用于按照其属性诸如相对尺寸和颜色区分某些细胞类目和/或亚类目的技术可见于与白血细胞有关的US5,436,978。这些专利的公开内容据此以引用方式并入。根据一些实施例，样品制备技术可包括染色、裂解、透化和其他处理模式，诸如在共同待审的美国专利申请No.____中所述的那些，这些专利的内容以引用方式并入本文。

术语高光学分辨率成像设备可包括能够获得粒子图像的设备，所述图像具有充分的视觉区别以区分形态特征和/或变化。示例性高光学分辨率成像设备可包括光学分辨率为1μm或更低(包括例如0.4至0.5μm，诸如0.46μm)的设备。

在一些实施例中，在本发明的任何组合物和/或方法中获得的图像可为数字化图像。在一些实施例中，所得的图像为显微镜图像。在某些实施例中，所述图像可以手动方式获得。在其他实施例中，获得图像的工序的至少一部分为自动化的。在一些实施例中，使用包括流通池、高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备(任选地具有自动对焦特征)的视觉分析仪获得图像。

在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或细胞核组分相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的颗粒组分和/或其他形态特征相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或颗粒组分相关的信息。颗粒和/或细胞核图像和/或特征独立地或彼此相结合地对于细胞分类及亚分类来说是决定性的。

自动对焦靶标

返回参照图1，粒子成像系统可包括相对于流通池22固定的自动对焦光栅或靶标44。自动对焦靶标44可用于获得流过流通池的尿液流体粒子的聚焦图像。

图9A描绘了根据本发明实施例的示例性自动对焦靶标900。如此处所示，靶标900包括不透明环形带910和透明中心或孔920。在操作中，成像设备聚焦于带910并通过孔捕获图像。如本文别处和共同待审的美国专利申请No.____中所讨论，图像捕获方法可涉及首先聚焦(或自动对焦)于带910，然后在通过孔920获得图像之前调节图像捕获设备与样品流体料流之间的距离。因此，带910可提供图像捕获设备的自动对焦系统可对其检测和聚焦的靶标，并且靶标的某些部分(例如，边缘或段)可包括在图像中。在一些情况下，靶标可以具有中心孔的铬圆盘的形式提供。示例性靶标可设置有胶粘或固定到流通池的直径为约0.5mm的中心针孔。中心针孔或孔920的尺寸可被选择为使得仅不透明环形带910的四个边缘部分930可见于捕获的图像940中，如图9B中所示。因此，环形带910不干扰细胞图像的捕获(例如，光可穿过孔920以照明样品粒子，并且视野基本上不受环形带妨碍)。这样，带910仅在图像的拐角中显现。

图10描绘了根据本发明实施例的示例性自动对焦靶标1000。靶标1000包括带或边界1010和中心孔1020。图11示出了根据本发明实施例的另一个示例性自动对焦靶标1100。靶标1100包括带或边界1110和中心孔1120。根据一些实施例，自动对焦靶标1100提供顶部和底部上具有50黑色像素的图像。在一些情况下，自动对焦靶标1100提供约65.3μm的流通池聚焦偏移(FCFO)。

图12A描绘了根据本发明实施例的示例性自动对焦靶标1200。靶标1200呈现为信箱设计，并且包括第一或上边界1210和第二或下边界1220。靶标1200还包括第一与第二边界之间的孔或透明通路1230。根据一些实施例，靶标具有约4mm的直径，并且信箱的高度为265μm。在一些情况下，上边界和下边界可呈现为半圆，并且可用沉积金属诸如氧化铬或一些其他不透明材料制备。

在本发明的方法的另一个方面，与粒子造影剂组合物接触和/或成像的细胞为异常细胞，诸如疟疾感染的细胞、非典型淋巴细胞。在本发明的一些方面，细胞是可用于对病症、疾病、感染和/或综合征进行鉴定、预测、诊断、预后或支持诊断的异常细胞。

图12B示出了自动对焦靶标1200的中心部分的近距离视图。如此处所示，第一边界1210包括负/正数值刻度和居中的零值。第二边界1220包括类似的刻度。在一些情况下，刻度增量为100μm。根据一些实施例，刻度可用于促进流通池的定位使得成像设备或相机的视野可居中于样品料流。如此处所示，样品料流1240在垂直于第一和第二边界的刻度的方向上流动。作为聚焦方案的一部分，图像捕获设备可有效地聚焦于存在于边界1210、1220上的数字或其他字符或可成像对象。

本发明的实施例涵盖用于解决与使用粒子分析系统相关的热漂移的技术，由于所述热漂移，此类热效应可损害用成像设备获得的图像的质量。图13A描绘了具有热传感器1370、反射器1380和自动对焦靶标1344的流通池1320的局部侧视图。在粒子分析系统的操作期间，热效应可导致样品料流缓慢漂移偏离成像设备的焦点。例如，热效应可由来自灯的辐射热使流通池热膨胀所引起。此外，热效应可由传导性和辐射性加热使流通池和光具座组件(OBA)组件热膨胀所引起。在一些实施例中，OBA的某些部件可膨胀，这可导致聚焦误差。例如，此类部件可包括将相机24保持在一起的金属板、保持或连接到流通池的金属板、或将流通池和相机24保持在一起的金属板。图13B描绘了具有热传感器1370和自动对焦靶标1344的流通池1320的局部透视图。此外，图13C描绘了具有热传感器1370、反射器1380和自动对焦靶标1344的流通池1320的另一个透视图。

图13C描绘了具有热传感器1370、反射器1380和自动对焦或成像靶标1344的流通池1320的另一个透视图。反射器1380可操作以减少或限制被流通池1320吸收的热的量。例如，反射器1380可阻断由闪光灯1342辐射的热，如图13A中所指示。因此，反射器1380可使灯的热冲击最小化。反射器1342也可减少灯所产生的炫光和光散射，从而得到改善的图像质量。热传感器1370定位在流体流通道附近并与图像捕获位点相邻，以使得可获得准确的温度读数。来自温度传感器的信息可用于使图像捕获设备聚焦于样品流体带料流。本文所公开的示例性自动对焦技术可基于出现于分析仪某些元件内的温度波动。

如图13D中所描绘，流通池1300d可包括流路1322d，所述流路1322d具有气泡1302d可通过其释放或移除的端口或排放口1301d。如此处所描绘，可通过其施加真空的管1303d可与端口1301d接触以便从流动料流抽出气泡1302d。此类气泡移除机构适用于从流通池内的流动流体移除气泡，并且可操作以防止气泡或微气泡驻留或滞留在流通池的内部。流动料流在图13D中在向上方向上进行描绘。应当理解，在一些实施例中，流动料流可在向下方向上穿过流通池行进。此处所示的气泡朝流通池内的流体的顶部悬浮。

根据一些实施例，用于使尿样中的粒子成像的方法可包括使鞘液沿着流通池的流路流动，以及将尿样注射到流通池内的流动鞘液中从而尿样以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动，使得流通池具有相关温度。此外，方法可包括在与流通池相关的温度处于第一温度时，使图像捕获设备沿着成像轴聚焦于流动料流达到第一焦点状态，以及使用处于第一焦点状态的图像捕获设备采集流动料流内的第一亚组粒子的第一聚焦图像。而且，方法还可包括确定与流通池相关的温度已经历从第一温度到第二温度的变化，以及响应于温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系而自动地将图像捕获设备的焦点从第一焦点状态调节到第二焦点状态。此外，方法可包括使用图像捕获设备在第二焦点状态下采集流动料流内的第二亚组的粒子的第二聚焦图像。

在一些情况下，调节图像捕获设备的焦点的过程包括使用温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系来调节图像捕获设备与流通池之间的距离。在一些情况下，调节图像捕获设备的焦点的过程包括使用温度的变化及流通池温度与所需焦点之间的已知关系来调节图像捕获设备的焦距。

聚焦图像

图14A和14B提供了根据本发明实施例的截面侧视图，其示出了成像系统和方法的各方面。参照图14A，粒子分析系统1400a诸如尿样分析仪可被配置用于例如使用流通池和粘性鞘液技术(诸如本文所述的那些)进行粘度和/或几何流体聚焦。使用粒子分析系统使尿样中的粒子成像的示例性方法可包括使鞘液1410a沿着粒子分析系统的流通池1430a的流路1420a流动。流路1420a可至少部分地由流通池的相对流通池壁1422a、1424a限定。鞘液1410a可具有与尿样的粘度不同的粘度。成像方法还包括将尿样注射到流通池1430a内的流动鞘液1410a中，以使得尿样流体在样品流动料流1440a中流动。样品流动料流1440a可具有大于流动料流厚度的流动料流宽度。样品流动料流1440a也可流过流路尺寸的缩减段并横越成像轴1450a。在图14A示意图中，流动的方向为从左到右。

另外，通过使具有相对于流通池1430a固定的位置的成像靶标1470a成像来使图像捕获设备1460a聚焦。例如，如此处所描绘，成像靶标1470a可具有相对于流通池的照明窗口1480a固定的位置。在一些情况下，成像靶标1470a可嵌入窗口1480a内或固定在窗口1480a上。方法也可包括用图像捕获设备1460a采集样品流体的粒子(例如，至少部分地设置在流动料流1440a内的粒子1490a)的聚焦图像。聚焦图像适用于粒子表征和计数。

可使用位移距离使图像捕获设备1460a聚焦于样品流动料流1440a。例如，位移距离可对应于样品流动料流1440a与成像靶标1470a之间的距离D。鞘液1410a与尿样之间的粘度差连同流路尺寸的缩减段能有效地在成像轴1450a处流体聚焦样品流动料流1440a中的样品流体，同时保持尿样中的细胞的活力。例如，与粘度差相关的鞘液1410a和样品流体料流1440a之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，连同与流路尺寸的缩减段相关的鞘液1410a和样品流体料流1440a之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用，可有效地在成像轴1450a处在流体样品粒子的至少一些中提供靶标成像状态，同时鞘液1410a中的粘度剂保持样品流体料流1440a中细胞的活力，使得细胞从样品流体料流1440a延伸到流动鞘液1410a中时细胞的结构和内容物完好无损。

当使用位移距离使图像捕获设备1460a聚焦于样品流动料流1440a时，图像捕获设备1460a可在成像轴1450a处或在与成像轴1450a相关的图像捕获位点处获得样品流动料流1440a内的粒子或细胞的图像。在一些情况下，可用照明源或灯1426a照明粒子。可在粒子接近成像轴1450a时，在粒子横越成像轴1450a时和/或在粒子远离成像轴1450a流动时，获得样品流动料流1440a的图像。

图14B描绘了替代形式流通池构形的各方面，其中成像靶标1470b具有相对于流通池1430b的观察口窗口1482b固定的位置。例如，成像靶标1470b可嵌入窗口1482b内或固定在窗口1482b上。如此处所示，成像方法可包括通过使具有相对于流通池1430b固定的位置的成像靶标1470b成像来使图像捕获设备1460b聚焦。此外，可使用位移距离使图像捕获设备1460b聚焦于样品流动料流1440b。例如，位移距离可对应于样品流动料流1440b与成像靶标1470b之间的距离D。

图14C描绘了流通池1430c的截面端视图，其示出了自动对焦或成像靶标的各种替代设置位置。例如，成像靶标1472c可位于流通池1430c的观察口窗口1482c。任选地，成像靶标1474c可位于流通池1430c的照明窗口1480c。还任选地，成像靶标1476c可位于侧向流通池壁(例如，1432c和/或1434c)中。可使用位移距离使图像捕获设备1460c聚焦于样品流动料流1440c，所述样品流动料流包围在鞘液1410c内。在一些实施例中，位移距离可对应于沿着成像轴1450c在样品流动料流1440c(或由流动料流1440c限定的中心平面1441c)与观察口窗口成像靶标1472c之间的距离D1或由该距离限定。在一些实施例中，位移距离可对应于沿着成像轴在样品流动料流1440a(或中心平面1441c)与照明窗口成像靶标1476c之间的距离D2或由该距离限定。在一些实施例中，位移距离可对应于沿着成像轴在样品流动料流1440a(或中心平面1441c)与流通池侧壁成像靶标1474c之间的距离D3或由该距离限定。在一些情况下，距离D3具有大于零的值。在一些情况下，距离D3具有零的值；即，样品流动料流1440a(或中心平面1441c)与成像靶标1474c共面的情形。在一些情况下，可以限定不基于距离D1、距离D2或距离D3计算的位移距离。例如，位移距离可为由流通池或血液学分析仪制造商提供的预定数或值。

根据一些实施例，样品流动料流1440c在成像轴处可具有约2μm至约10μm范围内的厚度T1。在一些情况下，流路或鞘液1410c在成像轴处可具有约150μm的厚度T2。如此处所示，成像靶标1472c可位于观察口窗口1482c上，所述观察口窗口设置在样品流动料流1440c与图像捕获设备1460c之间。在一些情况下，成像靶标(例如1474c)可位于照明窗口1480c与观察口窗口1482c之间。如本文别处所讨论，采集聚焦图像的方法可包括使用位移距离调节图像捕获设备1460c与流通池1430c之间的距离。在一些情况下，如本文别处所讨论，采集聚焦图像的方法可包括使用位移距离调节图像捕获设备1460c的焦距。在一些情况下，采集聚焦图像的方法可包括调节图像捕获设备1460c与流通池1430c之间的距离，并且调节距离的方法包括将流通池1430c移动到例如更靠近图像捕获设备1460c的位置，或离图像捕获设备1460c更远的位置。

如图14D中所描绘，图像捕获设备1460d的第一焦距可对应于图像捕获设备1460d与成像靶标1470d之间的距离D1(例如，沿着成像轴1450d)，并且图像捕获设备1460d的第二焦距可对应于图像捕获设备1460d与样品流动料流1440d(或由样品流动料流限定的中心平面)之间的距离D2(例如，沿着成像轴1450d)。在一些情况下，成像靶标可位于流通池中的另一个位置，例如如图14C中所描绘。根据一些实施例，位移距离可对应于第一焦距(或距离D1)与第二焦距(或距离D2)之间的距离差。可使用该位移距离(例如，D1与D2之间的差值)使图像捕获设备1460d聚焦于样品流动料流1440d。

图15描绘了正视图，示出了自动对焦光栅(或成像靶标)的实施例，所述自动对焦光栅(或成像靶标)例如可位于照明孔口或窗口上、观察口或窗口上，或位于另一流通池位置。随着高光学分辨率成像设备的距离或位置相对于带形样品料流移动，靶标可逐渐变弱。如图9-12B中所描绘，成像或聚焦靶标(自动对焦光栅)可位于将出现样品的视区的周边。返回参照图15，可以看出还可能的是，聚焦靶标可由位于视野中的对比形状限定。

当成像设备聚焦于自动对焦光栅(靶标)(图15中的图B)时，如由设备成像的形状被明确限定并且可用于如本文所述的自动对焦，即寻找靶标与成像设备之间的距离，在该距离处，在沿着与所述形状交叉的线(诸如如箭头所示的线)定位的相邻像素之间所述形状产生幅度上的最高对比度。图B中所描绘的焦点构形对应于图16A中所描绘的类似焦点构形。如图16A所示，图像捕获设备的焦平面与自动对焦靶标配向，并且因此图像捕获设备处于适当位置以获得自动对焦靶标的清晰图像。

返回参照图15，当例如通过调节物镜的工作距离或物镜与其焦平面之间的距离使工作位置(例如，成像设备的焦平面)远离自动对焦光栅移动时(在图15中的自动对焦光栅的左侧和右侧所示的图A和图C中示出)，聚焦靶标形状则会偏离焦点，并且在高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流的位置处，聚焦靶标形状完全不再能分辨(参见图15中的图D)。图D中所描绘的焦点构形可对应于图16B中所描绘的类似焦点构形。如图16B所示，图像捕获设备的焦平面与样品流体料流配向，并且因此图像捕获设备处于适当位置以获得样品流动料流中的粒子的清晰图像。图16A的焦平面与图16B的焦平面间隔距离D。如图16B所示，通过将图像捕获设备移动距离D，可以也将焦平面移动距离D，并且因此将焦平面从自动对焦靶标移动到样品流动料流。在一些情况下，可通过内部调节图像捕获设备的焦距同时保持图像捕获设备处于相对于流通池的固定位置，使焦平面从自动对焦靶标移动到样品流动料流。在一些情况下，可通过内部调节图像捕获设备的焦距同时调节图像捕获设备相对于流通池的位置，使焦平面从自动对焦靶标移动到样品流动料流。自动对焦形状可提供于视野内且相对于流通池固定的任何位置处，诸如在照明开口或窗口上、或在穿过其引导高光学分辨率成像设备的观察口或窗口的前方或后方、或在附接到光电单元以保持靶标处于待成像的位置的夹具处。

根据一些实施例，当高光学分辨率成像设备移动在位移距离内移动并且自动对焦光栅偏离焦点时，出现在焦点内的特征是血细胞而非自动对焦光栅。在图15的实施例中，自动对焦光栅由视野中的形状限定。所述形状为有限尺寸的相对薄的离散形式，并且因此在移动位移距离之后，当聚焦于带形样品料流时所述形式在数字化图像中基本上不可见。在尺寸设定为适合验尿成像应用的流通池中，典型的位移距离可为例如50至100μm。在一些实施例中，自动对焦特征结构保持高光学分辨率成像设备处于最佳焦距的1μm内。

因此，图15中所述的特征提供用于测定位移距离的示例性技术。例如，测定位移距离的方法可包括自动对焦过程，所述自动对焦过程涉及将测试流体样品注射到鞘液中以形成流通池内的测试样品流动料流，以及使用图像捕获设备获得成像靶标的第一聚焦图像。第一聚焦图像可对应于图15中的图B，其中聚焦成像靶标和图像捕获设备限定第一焦距。如此处所描绘，图像捕获设备的焦平面或工作距离/位置定位在成像靶标处。自动对焦过程也可包括使用图像捕获设备获得测试样品流动料流的第二聚焦图像。第二聚焦图像可对应于图15中的图D，其中聚焦测试样品流动料流和图像捕获设备限定第二焦距。如此处所描绘，图像捕获设备的焦平面或工作距离/位置定位在成像靶标处。自动对焦过程还可包括通过计算第一焦距与第二焦距之间的差值来获得位移距离。在一些情况下，测试流体样品与尿样相同并且测试样品流动料流与样品流动料流相同。在一些情况下，自动对焦过程建立与图像捕获设备相关的焦平面，并且焦平面相对于图像捕获设备保持静止。在一些情况下，自动对焦图像捕获设备的过程包括从多个焦点位置中确定最佳焦点位置。

根据一些实施例，可在不使用温度数据的情况下使图像捕获设备聚焦于样品流动料流。例如，图像捕获设备聚焦于样品流动料流的过程可独立于图像捕获设备的温度进行。在一些情况下，成像靶标可包括用于将图像捕获设备的成像轴相对于样品流动料流定位的刻度(例如，如图12B中所描绘)。在一些情况下，成像靶标可包括相对于成像轴配向的光圈，使得成像粒子设置在由光圈限定的孔内，并且在自动对焦期间使光圈的一个或多个边缘部分成像。

在示例性实施例中，自动对焦技术可将流通池定位在离样品料流的最佳焦点位置的±1μm内。在一些情况下，实施例涵盖这样的自动对焦技术，其可自动地使成像系统聚焦而不需要单独的聚焦液体或溶液或任何用户干预。示例性自动对焦技术也可考虑使聚焦性能未达最佳标准的机械原因，诸如漂移或热膨胀，其可造成成像设备物镜与流通池之间的距离的波动。在一些情况下，据观察样品流在流通池内的位置可以非常稳定并且与温度无关。因此，示例性成像技术可涉及聚焦于流通池中的成像靶标，以及使用固定偏移量实现对样品料流的最佳聚焦。

根据一些实施例，成像系统上使用的显微镜物镜具有0.75的数值孔径，产生±0.5μm的理论视野深度(DOF)。在某些实验性尝试中，据观察可在离最佳焦点±1.25μm处获得良好图像质量。还据观察，实际或实验视野深度可与理论视野深度不同。例如，在某些实验性尝试中，据观察，视野深度为约2.5至3μm。根据某些实验研究，已确定用于将流通池定位在±1.25μm内的自动对焦性能可确保良好图像质量。在一些实施例中，自动对焦系统可操作以将流通池定位在离样品料流的最佳焦点位置的±1μm内。在某些实验性尝试中，据观察如本文所公开的自动对焦技术可重复地定位流通池中的靶标，且标准偏差小于0.3μm。在一些情况下，试验自动对焦系统运行证实了出色的可重复性(标准偏差≤0.23μm)并且能够确定样品料流的焦点位置在离优化度量位置<0.6μm内，所述优化度量位置在±1μm位置公差内。在各种温度条件下进行的另外的自动对焦试验也表现出出色的定位性能(例如，流通池定位在最佳焦点位置的所需±1μm公差内)。自动化分析仪系统的该准确程度非常适于连续地且可靠地从在如本文别处所公开的薄带流动料流中流动的尿样在对应于标准实验条件的操作温度范围内获得粒子的高质量图像。

除非另外明确指明，否则本发明中提及的“粒子”应当理解为涵盖分散于流体中的任何离散或有形对象。如本文所用，“粒子”可包括生物流体中的所有可测量且可检测(例如，通过图像和/或其他可测量参数)的组分。粒子具有任何材料、任何形状和任何尺寸。在某些实施例中，粒子可包括细胞。粒子的例子包括但不限于细胞，包括血细胞、胎儿细胞、上皮细胞、干细胞、肿瘤细胞，或细菌、寄生生物或任何前述物质的碎片或生物流体中的其他碎片。血细胞可以为任何血细胞，包括可能存在于生物流体中的任何正常或异常、成熟或未成熟的细胞，例如红血细胞(RBC)、白血细胞(WBC)、血小板(PLT)和其他细胞。成员也包括未成熟的或异常的细胞。未成熟的WBC可包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和母细胞。除了成熟的RBC之外，RBC的成员还可以包括有核RBC(NRBC)、正常或异常的RBC、和网织红细胞。PLT可包括“巨大”PLT和PLT团块。血细胞和有形成分在本发明的别处进一步描述。

示例性例子可包括生物流体样品中的有形成分，包括例如球形和非球形粒子。在某些实施例中，粒子可包括非球形组分。非球形组分的图像投影可在高光学分辨率成像设备的焦平面中最大化。在某些实施例中，非球形粒子在高光学分辨率成像设备的焦平面中配向(在基本上平行于流动方向的平面中配向)。在一些实施例中，作为粒子对血小板、网织红细胞、有核RBC、和WBC计数和分析。如本文所用，示例性白血细胞(WBC)可包括例如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、未成熟的粒细胞(包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和母细胞)以及异常的白血细胞。

如本文所用，可检测和可测量的粒子参数可包括例如尺寸、形状、对称性、轮廓和/或其他特性的基于视觉和/或非图像的指标。

在另一个实施例中，本发明涉及在包括例如以下步骤的方法中使用例如本发明的试剂盒对粒子进行成像的方法：1)在视觉分析仪中用光照射粒子；2)获得包围在PIOAL中的样品粒子的数字化图像；以及3)基于图像信息分析包含粒子的样品。在其他实施例中，该方法还可以包括在照射经处理的样品之前将包含粒子的样品与粒子造影剂组合物接触。

在一个实施例中，所分析的粒子包括球形粒子、非球形粒子中的至少一种，或这两种。在另一个实施例中，粒子包括至少一种球形粒子。在又一个实施例中，粒子包括至少一种非球形粒子。在另一个实施例中，非球形粒子或具有非球形组分的粒子的图像投影在基本上平行于流动方向的平面中最大化。粒子可以为例如WBC、RBC和/或血小板。在一个实施例中，至少50％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。在另一个方面，在流通池中使用本发明的PIOAL允许至少90％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。

在一个实施例中，非球形粒子包括红血细胞。在本发明的另一个方面，球形粒子包括白血细胞或有核红血细胞。

小于包围在PIOAL中的带形样品料流的厚度的细胞的流动导致那些细胞平行于流动方向配向。在本发明的一个实施例中，至少92％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。在又一个实施例中，至少90％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。在另一个实施例中，至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或至少95％的粒子基本上配向，即在基本上平行于流动方向的平面的20度内。在另一个实施例中，在基本上平行于流动方向的平面中配向的非球形和/或球形粒子的百分比可为所列百分比中的任何两个之间的任何范围，例如至少75-85％、75-80％，和其他范围，诸如75-92％。

因包围在PIOAL中的样品中的较大细胞(诸如WBC)的流动而在平行于流动方向的方向中产生的剪切力导致细胞核结构、细胞质结构或颗粒或其他细胞内组分或结构更靠近平行于流动方向的平面而定位、重定位和/或更好地定位。

在本发明的一个实施例中，图像横截面包括在WBC(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)或未成熟的WBC(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)中差异染色的细胞核结构、差异染色的细胞质结构或差异染色的颗粒中的至少一种。在另一个实施例中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或至少95％的球形和/或非球形粒子在高光学分辨率成像设备的焦平面或视野深度中具有细胞核结构、细胞质结构或颗粒。

在本发明的方法的一些实施例中，图像信息是粒子的图像横截面。在一些方面，图像横截面包括在WBC(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)或未成熟的WBC(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)中差异染色的细胞核结构、差异染色的细胞质结构或差异染色的颗粒中的至少一种。

在一个实施例中，本发明的方法提供令人惊奇的高质量的细胞图像，其中流动中的高百分比的粒子和粒子内容物处于焦点内，这可用于获得自动化的、基于图像的WBC分类，以及自动化鉴定形态异常，其可用于对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常或感染和/或对治疗有响应还是无响应进行确定、诊断、预后、预测或支持诊断。

在另一个方面，本发明的组合物和方法提供更准确的基于图像的细胞分类及亚分类和标记，与目前的分析仪相比，其大大降低手动检查率。

如本文所用，粘度剂可包括粘度剂或粘度改性剂。示例性粘度剂/改性剂具有与样品的粘度不同的特性粘度，使得当混合PIOAL和粘度剂时，PIOAL的粘度发生改变和/或增加以便最大程度提高粒子的配向。在某些实施例中，带形样品料流与PIOAL之间的粘度差和/或速度差可引入剪切力而作用在处于流动中的粒子上，从而减少失准和/或引起粒子配向。

如本文所用，粒子造影剂组合物可适于与粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)组合用于视觉分析仪以分析得自受试者的样品中的粒子。示例性PIOAL可用于例如得自受试者的样品中的不同类型的粒子的自动化识别方法。

在另一方面，在获得图像时细胞可被包围在PIOAL中。本文描述了合适的示例性细胞内细胞器配向液。

在一个实施例中，本发明涉及用于视觉分析仪的PIOAL。在某些实施例中，PIOAL可包含以下至少一者：缓冲剂；pH调节剂；缓冲剂；粘度剂/改性剂；离子强度改性剂、表面活性剂、螯合剂和/或抗微生物剂。

在一个方面，PIOAL可包含两种或更多种粘度剂/改性剂。

在一个方面，本发明的PIOAL可具有约1至约10厘泊之间的粘度。在一个实施例中，本发明的PIOAL可包含粘度剂/改性剂。在一个实施例中，PIOAL包含最多100％的粘度剂。

如本文所用，粘度剂和/或粘度改性剂可包括适于实现约1至约10厘泊的粘度而光学特性(包括光学清晰度)适用于成像系统的任何物质。一般来讲，粘度剂或改性剂是无毒的、生物相容的并使细胞结构和内容物基本上完好无损。粘度剂和/或粘度改性剂可包含以下至少一者：甘油；甘油衍生物；乙二醇；丙二醇(二羟基丙烷)；聚乙二醇；水溶性聚合物和/或葡聚糖。在一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为甘油。例如，在一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为甘油衍生物。例如，在一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。又如，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为乙二醇。又如，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为丙二醇(二羟基丙烷)。又如，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为聚乙二醇。又如，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为水溶性聚合物或葡聚糖。在其他方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可包含以下两者或更多者：甘油、甘油衍生物；乙二醇；丙二醇(二羟基丙烷)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚乙二醇；水溶性聚合物或葡聚糖。粘度剂/改性剂可包括适于提供约1至约10厘泊的粘度而光学特性(包括光学清晰度)适用于成像系统的任何试剂。

如本文所用，其他示例性粘度剂/改性剂可包括例如天然水解胶体(及衍生物)，诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶、藻酸、角叉菜胶、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶、阿拉伯树胶、瓜耳胶、明胶、纤维素、海藻酸盐、淀粉、糖类(sugars)、葡聚糖；明胶；糖类(sugars)(及衍生物)，诸如右旋糖、果糖；聚右旋糖；葡聚糖；多聚葡聚糖；糖类(saccharides)；和多糖；半合成水解胶体(及衍生物)，诸如甘油、甲基纤维素、羟乙基淀粉(hetastarch)、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；合成水解胶体(及衍生物)，诸如聚乙烯醇(PVA)和/或也考虑了其他细胞相容性粘度剂/改性剂可用于该目的。

在另一方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为以PIOAL的约1至约50％(v/v)的浓度存在的甘油。例如，在一个实施例中，粘度剂/改性剂可以约5.0％至约8.0％(v/v)的浓度存在于PIOAL中。在另一方面，粘度剂/改性剂可以约6.5％(v/v)的浓度存在。在一个实施例中，粘度剂/改性剂是以约6.5％(v/v)的浓度存在的甘油。

在又一个实施例中，PIOAL可包含以约30％(v/v)的浓度存在的甘油粘度剂/改性剂。

在另一方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为以约0.5至约2.5％(w/v)的浓度存在的PVP。例如，在一个实施例中，粘度剂/改性剂PVP可以约1.0至约1.6％(w/v)的浓度存在于PIOAL中。在一个实施例中，PVP以约1.0％(w/v)的浓度存在。

在另一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为PVP和甘油。例如，在一个实施例中，甘油可以约5％(v/v)的浓度与约1％(w/v)的PVP相结合存在于PIOAL中。

在一个实施例中，本发明的PIOAL可用于视觉分析仪以对粒子进行成像。在一个方面，视觉分析仪包括具有对称流路的流通池，和自动对焦部件。

粘度剂和/或粘度改性/调节剂(诸如甘油)可包含在PIOAL中。粘度剂或粘度改性剂在引入时可适当地将PIOAL的粘度调节到所需的范围。可以使用足以增加PIOAL的粘度的任何合适的粘度剂，其具有允许对流动中的细胞进行高质量成像的合适的光学特性。PIOAL将具有合适的粘度以将细胞和/或细胞结构配向到基本上与流动方向平行的单个平面中，从而部分地增加粒子的焦点内内容物。

PIOAL可与本发明的任何分析仪一起使用。

如本文所用，术语“甘油”涵盖甘油和甘油的衍生物(下文称为甘油衍生物)。甘油衍生物的例子包括硫代甘油、聚甘油等。聚甘油的可用例子可包括双甘油、POLYGLYCERIN#310(坂本药品工业株式会社(SakamotoYakuhinKogyoCo.,Ltd.))、POLYGLYCERIN#750(坂本药品工业株式会社)、POLYGLYCERIN#500(坂本药品工业株式会社)等。

在另一个实施例中，本发明的PIOAL还包含pH调节剂。在一个方面，PIOAL和/或样品的最终pH在约6.0至约8.0之间。在另一个方面，PIOAL和/或样品的最终pH在约6.6至约7.4之间。在一个方面，PIOAL的最终pH可与制备的样品12A的pH相同(参见图1C)。

示例性pH调节剂可包括例如酸(示例包括有机酸和矿物酸)、碱(示例包括有机碱以及碱金属和碱土金属氢氧化物)。示例性有机酸可包括乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、草酸和尿酸。示例性矿物酸可包括例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、硼酸、氢氟酸、氢溴酸和过氯酸。示例性有机碱可包括例如吡啶、甲胺、咪唑、苯并咪唑、组氨酸、磷腈和阳离子氢氧化物。示例性碱金属和碱土金属氢氧化物可包括例如氢氧化钾(KOH)、氢氧化钡(Ba(OH)₂)、氢氧化铯(CsOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化锶(Sr(OH)₂)、氢氧化钙(Ca(OH)₂)、氢氧化锂(LiOH)和氢氧化铷(RbOH)。

在一些实施例中，使用缓冲剂，优选地将PIOAL的pH维持在约6.0至约8.5，更优选地约7.0至约8.0。在一些实施例中，优选的是向PIOAL添加缓冲剂以便调节PIOAL的pH。可以使用一种或多种任何合适的缓冲剂，只要所述缓冲剂能够将PIOAL调节到适当的范围即可。此类缓冲剂的例子包括可以单独使用或组合使用的PBS、Good缓冲剂(具体地讲，氨丁三醇缓冲剂、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS等)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、巴比土钠盐酸盐(veronalsodium-HCl)、可力丁盐酸盐(collidine-HCl)、三(羟甲基)氨基甲烷马来酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐。

在另一个实施例中，本发明的PIOAL包含离子强度改性剂以调节所得制剂的离子强度。示例性离子强度改性剂可包括Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg⁺⁺、Ca⁺⁺、Cl^-、Br^-、HCO^- ₃、硫酸盐、焦硫酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐(例如焦磷酸钾)、柠檬酸盐、卡可基酸盐或其他合适的盐。在一个实施例中，PIOAL可以为等渗的。

可将表面活性剂加入PIOAL中。表面活性剂的种类无特别限制，只要它们与PIOAL的其他组分相容且与带形样品料流和样品中的粒子相容即可。表面活性剂可包括例如阳离子、阴离子、非离子和两性表面活性剂。示例性表面活性剂可包括聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂、聚氧乙烯烷基苯基醚型表面性活性剂(例如，NISSANNONIONNS-240(日本油脂株式会社(NOFCORPORATION)，注册商标))、聚氧乙烯山梨糖醇烷基酯型表面活性剂(例如，RHEODOLTW-0120(花王株式会社(KaoCorporation)，注册商标))、多元醇共聚物(例如，PLURONICF-127、F-123、F-109、F-87、F-86、F-68、T-1107、T-1102(巴斯夫公司(BASFCorporation)，注册商标))、MEGA-8、蔗糖单癸酸酯、脱氧-BIGCHAP、正辛基-β-D-硫代葡糖苷、正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷、正庚基-β-D-硫代葡糖苷、正辛基-β-D-硫代葡糖苷、CHAPS、CHAPSO等。其他表面活性剂可包括处于样品和带形样品料流相容浓度的Triton-X-100和Tween20。

表面活性剂在PIOAL中的浓度优选地为样品中的粒子(诸如细胞)不受影响和/或保持基本上完好无损的浓度水平。具体地讲，该浓度优选地为5至5000mg/L，更优选地为100至3000mg/L。

当用分析仪分析样品中所含的粒子时，诸如磷酸铵、磷酸镁、碳酸钙的无定形盐可在样品中沉淀。可将螯合剂加入PIOAL中以便溶解这些无定形盐。添加螯合剂使得不仅能够溶解无定形盐，还能够抑制PIOAL的氧化。螯合剂的可用例子包括EDTA盐、CyDTA、DHEG、DPTA-OH、EDDA、EDDP、GEDTA、HDTA、HIDA、甲基-EDTA、NTA、NTP、NTPO、EDDPO等。螯合剂在PIOAL中的浓度优选地在0.05至5g/L的范围内。

在另一个实施例中，PIOAL还可以包含一种或多种抗微生物剂。在一些方面，抗微生物剂可以为例如具有杀真菌活性的物质(杀真菌剂)和/或具有杀细菌活性的物质(杀细菌剂)。在某些实施例中，合适的抗微生物剂可包括例如对羟基苯甲酸酯、异噻唑啉酮、酚类物质、酸性防腐剂、卤化化合物、quarternia和醇。示例性对羟基苯甲酸酯可包括尼泊金和对羟基苯甲酸酯盐。示例性异噻唑啉酮可包括甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、苯异噻唑啉酮、ProClin150、ProClin200、ProClin300和ProClin950。示例性酚类可包括苯氧基乙醇、苄醇和苯乙醇。示例性酸性防腐剂可包括脱氢乙酸、苯甲酸、山梨酸、水杨酸、甲酸、丙酸。示例性卤化化合物可包括2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、氯乙酰胺、氯代丁醇、氯二甲苯酚、氯苯甘油醚、二氯苄醇、丁基氨基甲酸碘代丙炔酯、甲基二溴戊二腈。示例性quaternia可包括苯扎氯铵、苄索氯铵、氯己定、己脒定二羟乙基磺酸盐和聚氨丙基双胍。示例性醇可包括乙醇和异丙醇。其例子包括三嗪抗微生物剂、噻唑杀菌剂(例如，苯并异噻唑啉酮)、吡啶硫酮、吡啶杀菌剂(例如，1-羟基吡啶-2-硫钠等)、2-苯氧基乙醇等。具体地讲，可以使用ProxelGXL(奥维斯公司(Avecia))、TOMICIDES(API公司(APICorporation))等。杀细菌剂和/或杀真菌剂有助于改善PIOAL的稳定性。

在一个实施例中，抗微生物剂的浓度可以为0.01％至0.5％(w/v)。该浓度可以为0.03至0.05％(w/v)。

在实施例中经受使用具有PIOAL的分析仪进行分析的样品无特别限制。通常使用得自活体的样品(生物样品)。或者，那些样品可用造影剂进行稀释、纯化、接触等以供使用。具体地讲，这样的样品的例子可包括血液、精液、脑脊髓液等。样品还可以包括源自组织样品的粒子悬液。在分析粒子(红血细胞、白血细胞、细菌等)时，该实施例中的PIOAL是适用的。

本发明的PIOAL可用于对粒子进行成像的视觉分析仪。在一个方面，视觉分析仪包括能够以预定的尺寸特性(诸如有利的带形样品料流厚度)维持带形样品料流的流动的流通池。在一些实施例中，流通池可具有对称流路，并与自动对焦部件结合使用。

本发明涉及对粒子进行成像的方法，其包括：1)将样品与粒子造影剂组合物接触；2)照明制备的粒子；3)获得包围在PIOAL中的带形样品料流中的粒子的数字化图像；以及4)分析图像信息以对粒子分类或亚分类。在一些实施例中，粒子可为本文所公开的任何粒子中的至少一者并且可基于粒子图像信息进行计数和分析。

在一些实施例中，视觉分析仪包括具有对称或不对称流路的流通池，和自动对焦部件。

在一般的方面，当与存在于研究和/或医学实验室中的自动化分析仪结合使用时，所述示例性PIOAL及其使用方法是有用的。示例性自动分析仪为被设计成以最少的人工辅助快速地测量多种生物样品(包括例如人类体液样品)中的不同有形成分和/或其他特性的仪器。示例性自动分析仪可包括例如验尿分析仪。示例性分析仪可逐一地、分批地或连续地处理样品。

在一个方面，示例性分析仪/系统包括被配置成检测符合一项或多项选择标准的多个粒子并提供其粒子计数的自动化粒子计数器，其中所述选择标准涵盖所述粒子中至少两种类目的成员。可包括处理器(其可包括计数器部件)的分析仪被程序化以区分所述至少两种类目的粒子。各粒子的分布使用该分析仪进行测定。所述处理器使用所述分布来校正所述至少两种类目和/或亚类目中至少一者的成员的粒子计数。在一些实施例中，粒子计数器包括至少一个通道，所述通道被配置成基于体积、尺寸、形状和/或其他标准的预定范围来提供所述至少一种类目和/或亚类目的粒子计数。例如，所述至少一种类目和/或亚类目的成员包括选自以下亚类目的至少一种类型的粒子：白血细胞(WBC)、红血细胞(RBC)、巨大血小板(PLT)和有核红血细胞(NRBC)。在粒子计数器上，由于相似的尺寸或其他测得的特性，诸如巨大PLT和NRBC的细胞可作为WBC计数。通过操作如本文所述的装置，可准确地测量巨大PLT和NRBC的粒子计数或浓度。

在一个方面，本发明的系统、组合物和方法提供流动中的细胞的令人惊奇的高质量的图像。在一个方面，视觉分析仪可用于本发明的方法中以提供自动化的基于图像的尿液沉渣粒子计数。在某些实施例中，本发明的方法涉及视觉区别(包括形态异常)的自动化鉴定，以用于对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常和/或感染进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断和/或用于监测受试者对治疗有响应还是无响应。应用包括分类和/或亚分类，以及特别是根据类目或亚类目对流体样品(诸如尿样)中的细胞计数。也设想了用于对另外类型的粒子和/或其他流体样品中的粒子计数的其他类似的用途。本发明的系统、组合物和方法可用于采用任何合适的自动化粒子识别算法进行的实时分类及亚分类以及图像观察。可存储各样品的捕获图像以日后观察。

在另一方面，本发明的分析仪、组合物和方法提供令人惊奇的更准确的基于图像的细胞分类及亚分类和标记，与使用目前的基于图像的自动分析仪时的手动检查率相比，其降低了手动检查率。所述系统、组合物和方法降低初始手动检查率并允许在仪器上进行初始手动检查。此外，本发明的系统、组合物和方法还降低需要手动检查的在自动分析期间标记的样品的百分比。

因此，在一些实施例中，本发明提供用于分析包含粒子(例如，尿液中的粒子)的样品的分析仪和方法。根据本发明，提供视觉分析仪以获得包含悬浮在液体中的粒子的样品的图像。在一些实施例中，视觉分析仪包括流通池和自动对焦部件，其中使包含所关注粒子的液体样品流过具有观察口的流通池，而耦合到物镜镜头的相机通过所述观察口捕获粒子的数字图像。流通池耦合到样品流体源，诸如经稀释和/或未经稀释的尿样等，并耦合到透明鞘液或粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)源。

在一个实施例中，分析仪还包括具有至少一个检测范围的粒子计数器，以及分析仪和处理器。分析仪和处理器被配置成提供信息以对样品中的精确粒子计数和/或浓度进行分类、亚分类和测定。

在其他实施例中，本发明涉及可用于如本文所述的基于图像的粒子分析的PIOAL。尿样中的粒子类目和/或亚类目计数在本说明中用作可分析的样品的类目的非限制性例子。在一些实施例中，存在于样品中的细胞还可以包括细菌或真菌细胞以及白血细胞、或红血细胞。在一些实施例中，可以分析得自组织或抽吸物的粒子悬液。

区分尿样中的尿液沉渣粒子是主题特别适合的示例性应用。将样品通过自动化技术制备并以带形样品料流形式呈递给高光学分辨率成像设备以在样品流过视野时使其周期性地成像。粒子(诸如尿液沉渣粒子)的图像可用像素图像数据编程的处理技术完全自动地或以有限的人工辅助而彼此区分、分类、亚分类和计数，以鉴定和计数细胞或粒子。除了粒子图像(其可在异常或关键特征的情况下存储和供使用)之外，输出数据包括所记录样品图像中区分开的每种特别类目和/或亚类目的细胞或粒子的出现的计数。可进一步处理存在于每个图像中的不同粒子的计数，例如用于积累整体样品中每种区分开的类目和/或亚类目的粒子的准确且统计上显著的成比例比率或其函数。也可高度稀释用于视觉区别的样品，但在稀释样品的分布中表示每种类目和/或亚类目中的细胞的比例，特别是在已处理多个图像后。如本文所用，使用基于图像的(例如，视觉)信息鉴定粒子/细胞涵盖200nm至10mm的紫外、可见和红外光谱范围。

在一些方面，样品以自动方式呈递、成像和分析。就尿样而言，可用水或盐水溶液充分稀释样品，所述水或盐水溶液降低了未稀释或稀释度较低的样品中一些细胞和/或粒子的视图可能被其他细胞和/或粒子遮挡的程度。可用增强一些细胞方面的对比度的试剂来处理细胞，例如使用透化剂使细胞膜具有透性以及使用组织学染液粘附于结构中并显示结构，所述结构诸如细胞中的细胞质。在一些实施例中，可能有利的是，对样品的等分试样进行染色以用于计数和表征粒子，以及粒子的亚群计数、表征和分析，所述粒子包括白血细胞、上皮细胞和/或细菌。

用于样品稀释、组织学染色的样品制备分析仪和方法的详情一般使用由一个或多个可编程控制器操作的精密泵和阀门来实现，并且不是本发明的重点。例子可见于转让给国际遥感成像系统公司(InternationalRemoteImagingSystems,Inc.)的专利，诸如关于可编程控件的US7,319,907。同样，用于在由B021染色时按照其属性诸如颜色区分某些细胞的技术可见于US5,436,978。这些专利的公开内容据此以引用方式并入。

为了提高对诸如细胞的粒子进行分类和亚分类的能力、速度和有效性，有利的是提供清晰的高质量尿液粒子图像以通过数据处理系统进行自动化分析。根据本发明，将制备的样品料流以在流通池的相对壁之间具有稳定位置的薄带形式布置。样品料流的定位及其变平成带形样品料流可通过引入流通池的PIOAL的层之间的流动而实现，所述PIOAL与样品流体的粘度不同并流过对称流动通道。

PIOAL和样品在引入样品流动池时具有经协调的粘度和流速，使得样品流体变平形成薄带形状。带形样品料流与PIOAL一起被输运，以在观察口的前方通过，其中物镜镜头和光源被布置成允许观察带形样品料流。将样品流体引入，例如，在PIOAL的流路对称变窄的点处注射。因此，样品流体料流变平并伸展成薄带。本发明的PIOAL可作为鞘液与本发明的任何视觉分析仪一起使用。在一个实施例中，可将PIOAL引入流通池的末端以沿着样品流体向排放口输运。

观察区中的带形样品料流的尺度受PIOAL流路的几何变薄以及样品流体和PIOAL的差异线速度(导致带形样品料流的变薄和伸展)的影响。样品与PIOAL的初始线速度比率可在0.5至5.0的范围内。PIOAL流路横截面可通过降低深度而变薄以实现流路的横截面积缩减约5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、105:1、110:1、115:1、125:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1或200:1的因子。在一个实施例中，该几何变薄为40:1。所考虑的因素为流过流通池的运输时间，所需的样品通过量率，实现与粒子尺寸相当的带形样品料流厚度，获得粒子和细胞器的配向，实现粒子的焦点内内容物，在操作限值内平衡压力、流动和粘度，优化带形样品料流厚度，获得所需的线速度，可制造性考量，以及所需的样品和PIOAL体积。

可对插管的长度和体积以及横截面变平进行选择以缩短样品流动不稳定的时期，从而增大通过量。在一些实施例中，流动不稳定的时期可短于约3、2.75、2.5、2.25、2、1.75、1.5、1.25或短于约1秒。较小的插管体积也可缩短所述时间并减小在样品运行之间清洗插管所需的稀释剂的体积。在一些实施例中，流过流通池的运输时间为1、2、3或4秒，或那些时间中任何两个之间的任何范围。在一些实施例中，该运输时间可短于4、3或2秒。

样品流体和PIOAL的粘度和流速以及流通池的轮廓被布置成使得PIOAL流变平并将样品流伸展成平带，所述平带在可靠位置连续地穿过观察区。样品流体料流可被压缩成约2至3μm的流体流厚度。若干尿液细胞类型都具有大于料流厚度的直径。在平行于流动方向的方向上的剪切力导致在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中粒子的图像投影增加和/或导致细胞内结构、细胞器或裂片定位、重定位和/或更好地定位成基本上平行于流动方向。高光学分辨率成像设备视野深度最多为7μm，例如1-4μm。

与带形样品料流一起输运的PIOAL的流动厚度始终穿过观察口(物镜镜头被引导穿过其中)前方的观察区。物镜镜头可以是高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的物镜部件。带形样品料流在流通池内的已知且可重复的位置处(例如，在离流通池的两个壁的已知且可重复的距离处)顺着横跨观察区的路径流动，并在下游排放。

当带形样品料流被输运穿过观察口前方的观察区时，来自样品中的粒子的光学信息通过分析仪中的检测段检测，从而生成样品中所含粒子/细胞的数据。使用该分析仪允许对样品中所含的细胞和/或粒子进行捕获、处理、分类及亚分类和计数。PIOAL液体可通过添加粘度改性剂、缓冲剂、pH调节剂、抗微生物剂、离子强度改性剂、表面活性剂和/或螯合剂而制备。本发明中的分析仪的示例性功能部件和/或特征结构可包括例如采集和/或处理来自图像分析的数据、样品染色处理、图像处理和/或粒子图像鉴定、计数和/或分类及亚分类的能力。

在一个实施例中，本发明基于以下令人惊奇且意料不到的发现：在PIOAL中添加适量的粘度剂明显改善流通池中的粒子/细胞配向，从而使焦点内细胞或细胞组分的百分比更高，以及使流动中的细胞和/或粒子的图像的质量更高。添加粘度剂增加对细胞(比如RBC)的剪切力，这会改善在基本上平行于流动方向的平面中的细胞配向，从而导致图像优化。这还导致粒子内结构(诸如细胞内结构、细胞器或裂片)基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位，从而导致图像优化。粘度剂还减少细胞的失准，所述细胞通常为直径比流动料流小的细胞，但不限于这些细胞。

直径比流动料流小的细胞(例如，红血细胞和/或杆状细菌)的配向可通过例如增大PIOAL的粘度或通过增大流动线速度比率而获得。这导致RBC或杆状细菌平行于流动方向配向。在一些实施例中，RBC或杆状细菌失准的减少和/或RBC或杆状细菌配向的增加通过增大PIOAL的粘度而实现。

在一个方面，本发明涉及使用基于图像的粒子分类、亚分类和计数对粒子进行差异分类和/或对粒子进行计数的方法。示例性方法可包括：使包含粒子或细胞的样品与粒子造影剂组合物以一定量接触，所述量能有效地产生视觉区别以对粒子进行分类和/或亚分类；将样品应用于至少一个流通池；用样品的所接触第一部分向所述至少一个流通池引入具有不同于经处理样品粘度的粘度的粒子和细胞内细胞器配向液(PIOAL)，并且可有效地支持样品流动、使粒子配向以及增大在流路中流动的细胞的粒子和细胞器的焦点内内容物；使用包括视觉分析仪和处理器的装置对细胞进行分析；通过确定一个或多个视觉区别进行粒子分类和亚分类；以及基于视觉区别对类目和亚类目中的粒子进行计数。

在本发明的这一方法和其他方法中的任何一者中，粒子可为存在于样品中的细胞的任何类目和/或亚类目，并且可包含选自红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片的粒子。

本发明提供自动实现高光学分辨率成像设备的正确工作位置以对带形样品料流聚焦的技术。流通池结构被配置成使得带形样品料流在限定样品流体的流路的流通池壁之间具有固定且可重复的位置，以PIOAL层之间的薄带形式穿过流通池中的观察区。在图1中示意性公开的流通池实施例中以及在图6和7的实践实施例中，PIOAL的流路的横截面在一定点处对称变窄，在该点处将样品插入穿过平坦孔口，诸如在孔口具有矩形内腔的管。变窄流路(例如，以20:1至40:1的比率在横截面积上几何变窄)并且还由于与样品流相比更大的PIOAL线速度相互配合使样品横截面以约20:1至70:1的比率变平和伸展。有效地，由于流速、粘度和料流厚度的组合，样品形成薄带。变窄流路(例如，以40:1的比率或以20:1至70:1之间的比率在横截面积上几何变窄)以及与样品流相比的PIOAL的线速度差相互配合使样品横截面以约20:1至70:1的比率变薄。在一些实施例中，该横截面厚度比率可为40:1。在一些实施例中，该横截面厚度比率可为30:1。

因此，方法变量(诸如样品和PIOAL的特定线速度)不会倾向于使带形样品料流从其中心流动位置发生位移。相对于流通池的结构，带形样品料流位置是稳定且可重复的。

高光学分辨率和成像设备光学器件具有给定焦距，并且首先将光学器件相对于流通池准确地定位，也就是通过将高光学分辨率成像设备聚焦于自动对焦光栅来进行。优选地由于初始校准步骤，精确地知道自动对焦光栅与样品料流之间的位移距离。在对自动对焦光栅自动对焦后，使流通池和高光学分辨率图像捕获设备或数字图像捕获设备在位移距离内相对于彼此位移。因此，高光学分辨率图像捕获设备精确聚焦于样品料流。

这样，不需要自动对焦或依靠于可在不同图像之间变化、或就对比度而言不太高度受限定、或可能位于一系列位置的某处的图像内容方面，作为确定供参考的距离位置的基础。由于发现了对于自动对焦光栅的最佳焦点的位置，高光学分辨率成像设备与流通池的相对位置发生位移，以使最佳焦点位置从自动对焦光栅的位置移至带形样品料流的位置。

在一个实施例中，本发明涉及可用于对细胞进行染色的粒子造影剂组合物。本发明的粒子造影剂组合物和方法可用于一个实施例中，例如，以用于对本文所公开的粒子中的任何一者进行分类、计数和表征，以及进行亚分类、计数、表征和分析。在一个实施例中，粒子造影剂组合物适用于与基于图像的自动或部分自动分析仪一起使用。

在一些实施例中，粒子造影剂组合物用于在某些条件下增强细胞和/或亚细胞特征，其中一个或多个细胞类型保持有生命力或活力和/或细胞和/或细胞的(cellular)和/或亚细胞特征保持基本上完好无损。粒子造影剂组合物可用于产生用于粒子分类和亚分类的视觉区别。在一些实施例中，粒子造影剂组合物可用于对白血细胞进行染色。在一些实施例中，除了白血细胞之外，粒子造影剂组合物还可增强例如上皮细胞、细菌和/或病理性管型中的内含物的可视化特征。在一些实施例中，粒子造影剂组合物可对白血细胞以及上皮细胞、细菌和/或病理性管型中的内含物进行染色。

本发明的方面和实施例源于以下发现：当用作用于增强基于图像的分析诸如分类、亚分类和计数的造影剂时，包含这些组分的某些染料制剂具有令人惊奇且意料不到的性质和功效。在一个实施例中，本发明涉及可用于对细胞进行处理和/或染色的粒子造影剂组合物。本发明的粒子造影剂组合物和方法可用于一个实施例中，例如，以用于对白血细胞进行计数和表征和对白血细胞差异表征和分析，以及用于对生物流体中的粒子进行粒子计数、表征和分析。在一个实施例中，粒子造影剂组合物适用于与自动或部分自动的分析仪一起使用。在本发明的一些方面，提供了进行基于图像的尿液沉渣分析的方法和组合物。在一个实施例中，组合物及相关方法使得用户能观察细胞及其细胞内容物，这可有利于基于对比度和/或形态进行异常细胞鉴定。

在其他实施例中，粒子造影剂组合物可对WBC以及上皮细胞、细菌、病理性管型中的内含物、或细胞碎片的亚细胞结构增强和/或进行染色。

本发明的方面和实施例基于以下令人惊奇且意料不到的发现：当用于执行尿液沉渣样品分析时，某些染料组合物和/或其组合具有意料不到的性质和功效。示例性染料组合物和/或其组合在共同待审的美国专利申请No.____中有所讨论，该专利的内容以引用方式并入本文。

在另一个方面，本发明涉及包括本发明的粒子造影剂组合物的试剂盒。该试剂盒还可以包含根据本文所述的任何方法的粒子造影剂组合物的使用说明。该试剂盒还可以包括粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)。该试剂盒还可以包含可编程的存储介质和用于诸如以下粒子的基于图像的鉴定的相关软件：红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片。该试剂盒还可以包括一种或多种缓冲剂，其可以包括等渗缓冲剂和/或稀释剂。该试剂盒或缓冲剂还可以包括表面活性剂、pH调节剂和/或抗微生物剂。在其他实施例中，该试剂盒还可以包括清洗溶液或冲洗溶液。该试剂盒还可以包括阳性和阴性对照的标准品。在一些实施例中，该标准品可以包括标准染色细胞试剂。该试剂盒还可以包括一次性用品，诸如用于转移试剂盒组分的一次性微量移液器、移液头或试管。该试剂盒可以包括这些试剂盒组分中的任一种，或两种或更多种的任意组合。

在另一个实施例中，本发明涉及用于执行基于图像的细胞分类和亚分类的方法，该方法包括：a)使包含粒子的样品与根据本文所述方法中的任何一者的粒子造影剂组合物接触；b)获得包括粒子内结构的粒子的图像；c)确定细胞的一个或多个特性；以及d)对粒子执行基于图像的分类和亚分类和/或分析。

如本文所用，本发明中的分析仪的示例性功能部件和/或特征结构可包括例如能够采集和/或处理图像和/或进行粒子图像鉴定、计数、分类和亚分类的视觉分析仪。分析仪可用于本发明的方法中以对尿样或其他样品进行分析来对存在于样品中的细胞进行分类和/或亚分类和/或计数，或者基于粒子特征分析来鉴定存在于样品中的细胞。

在某些实施例中，通过示例性分析仪获得图像。分析仪可包括耦合到样品源以及耦合到细胞器和配向液(例如PIOAL)源的流通池，其中流通池限定内部流路，该流通池被配置成将用PIOAL包围的样品流导向穿过流通池中的观察区。分析仪还可以包括在与带形样品料流相交的光轴上具有物镜的数字高光学分辨率成像设备，物镜与流通池之间的相对距离通过操作电机驱动器来改变，以便在光敏元件阵列上分辨和采集数字化图像。另外，分析仪可包括具有相对于流通池固定的位置的一个自动对焦光栅和/或多个自动对焦光栅，所述自动对焦光栅位于离带形样品料流的平面的预定距离处。而且，分析仪可包括被配置成照明带形样品料流和自动对焦光栅的光源，以及耦合的至少一个数字处理器以操作电机驱动器并分析数字化图像。处理器可被配置成测定自动对焦光栅的焦点位置并且使物镜和流通池在离聚焦位置的预定距离内相对地位移，以用于使高光学分辨率和成像设备聚焦于带形样品料流。

术语高光学分辨率成像设备可包括能够获得粒子图像的设备，所述图像具有充分的视觉区别以区分形态特征和/或变化。示例性高光学分辨率成像设备可包括分辨率为1微米或更低的设备，包括例如0.6至0.8微米，诸如0.7微米。又如，高光学分辨率成像设备可具有0.3至0.4微米的分辨率，诸如0.35微米。又如，高光学分辨率成像设备可具有0.4至0.5微米的分辨率，诸如0.43微米。

在一些实施例中，在本发明的任何组合物和/或方法中获得的图像可为数字化图像。在一些实施例中，所得的图像为显微镜图像。在某些实施例中，所述图像可以手动方式获得。在其他实施例中，获得图像的工序的至少一部分为自动化的。在一些实施例中，使用包括流通池、高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备(任选地具有自动对焦特征)的分析仪获得图像。

在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或细胞核组分相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的颗粒组分和/或其他形态特征相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或颗粒组分相关的信息。颗粒和/或细胞核图像和/或特征独立地或彼此相结合地对细胞分类及亚分类来说是决定性的。

在本发明的方法的一个方面，与粒子造影剂组合物接触的细胞可包括白血细胞、上皮细胞和/或细菌。在另一个方面，本发明的方法还可以包括白血细胞分类和亚分类。

在本发明的方法的一个方面，与粒子造影剂组合物接触的细胞和/或成像的细胞为红血细胞。在又一个方面，本发明的方法涉及执行基于图像的尿液粒子分类及亚分类的方法，该方法包括：a)使粒子细胞的一部分成像；以及b)确定成像粒子的形态。在一个实施例中，尿液中的粒子可为红血细胞。如本文所用，红血细胞(RBC)可包括例如正常红血细胞和/或变形红血细胞。在一些实施例中，使用本发明的分析仪(诸如包括视觉分析仪和处理器的分析仪)进行成像。

如本文所用，示例性全尿沉渣分析可包括医生或其他医学专业人员通常需要的测试板，从而提供与存在于患者尿样中的有形成分(例如，细胞和/或其他粒子)相关的信息。存在于尿液中的示例性有形成分通常可包括但不限于本文所公开的任何粒子。

如本文所用，异常高的计数可指示存在疾病、失调和/或病症。因此，全尿沉渣分析是常常进行的医学尿液检验中的一种，因为其可提供患者一般健康状态的概况。因此，尿沉渣分析通常在年度体检期间进行。

如本文所用，通常受试者一般在杯子中采集尿样。然后将样品送往实验室。在传统方法中，首先使尿样经受离心分离并浓缩，由此获得的沉渣在一些情况下被染色并随后加载到显微镜载片(例如，湿法封片或特化计数载片)上，并且在显微镜下经受手动测定和计数。在另一个实施例中，使用自动分析仪处理样品，其中在粒子包围在鞘液中时对粒子进行分类、亚分类和计数。

如本文所用，通常，尿液分析仪可通过窄管路抽吸非常少量的样本。传感器可检测通过管路的细胞的计数和/或数量，并且可识别细胞的类型。示例性传感器可包括光(例如，可见、UV或IR)和/或电阻抗的检测器。示例性检测参数可包括尺寸、体积和/或细胞特征。在某些实施例中，传感器可检测约200nm至约1.0mm范围内的波长谱中的可见和不可见光。在某些实施例中，传感器可检测约380nm与约760nm之间的波长。

在本发明的方法的另一个方面，与粒子造影剂组合物接触的粒子和/或成像粒子为诸如血细胞、鳞状和非鳞状上皮细胞、管型、滴虫或细菌。在本发明的一些方面，这些粒子的异常存在可用于对病症、疾病、感染和/或综合征进行鉴定、预测、诊断、预后或支持诊断，和/或监测受试者对治疗有响应还是无响应。

如本文所用，可检测和可测量的粒子参数可包括例如尺寸、形状、对称性、轮廓和/或其他特性的基于视觉图像和/或非图像的指标。

如本文所用，在一些方法中可将尿样稀释、分成多个部分或用粒子造影剂处理。

本文所公开的方法适用于来自广泛生物体的样品，所述生物体包括哺乳动物，例如人类、非人灵长类(例如，猴)、马、牛或其他牲畜、狗、猫或其他作为宠物饲养的哺乳动物、大鼠、小鼠或其他实验室动物；禽类，例如鸡；爬行动物，例如短吻鳄；鱼类，例如，鲑鱼和其他养殖物种；以及两栖动物。

可通过任何常规方法，例如排泄、抽取、收获、抽吸或活检，来获得样品。样品可来自被认为健康的受试者，例如作为日常体检的一部分而采集的样品。样品也可来自具有失调、有失调风险或疑似具有失调的受试者。失调可由疾病、遗传异常、感染、损伤或未知原因引起。作为另外一种选择或除此之外，方法可用于在治疗失调的过程期间监测受试者。如果存在对治疗和/或疗法的非响应性的迹象，临床医生可选择替代或辅助药剂。根据受试者的病症和具体失调(如果有的话)，可每日、每周、每月或每年采集一次(或两次、三次等等)样品。

粒子可根据尿样而有所差异。粒子可为存在于尿液中的细胞，例如，血细胞、胎儿细胞、干细胞、肿瘤细胞或其碎片。在一些实施例中，粒子可为感染因子，例如，病毒、细菌、原生生物、原生动物、真菌或寄生生物。

提及的“有形成分”应当理解为涵盖存在于生物流体样品中的非流体成分。有形成分包括例如基于科学分类或生理功能的血细胞的类别，包括红血球(RBC)、白血球(WBC)、WBC团块、白血球的亚类别，所述白血球的亚类别包括成熟的白血球，诸如单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。可用于本文的“有形成分”还将包括粒子，诸如管型、上皮细胞、酵母、晶体、细菌、真菌、微生物、细菌、真菌、原生生物、原生动物、寄生生物、囊肿(包括寄生虫性囊肿)或其碎片或其他细胞碎片。

除非另外明确指明，本发明中提及的一“类目”粒子应当理解为涵盖使用至少一种测量的、检测的或推导的检测标准诸如尺寸、形状、质构或颜色所检测的一群粒子。在一些实施例中，由本发明的分析仪计数的粒子的至少一种类目和/或亚类目的成员将为相同类型的有形成分。本发明中提及的一“类目”粒子应当理解为涵盖与测量的、检测的或推导的标准诸如尺寸、形状、质构或颜色相对应的一群粒子。在一些实施例中，由本发明的分析仪计数的粒子的至少一种类目和/或亚类目的成员将为相同类型的有形成分。

本发明中提及的一类目和/或亚类目粒子的“成员”或“多个成员”应当理解为涵盖一类目或亚类目粒子内的单独粒子。

如本文所用，术语高光学分辨率成像设备可包括能够获得粒子图像的设备，所述图像具有充分的视觉区别以区分形态特征和/或变化。示例性高光学分辨率成像设备可包括分辨率为1微米或更低(包括例如0.7至0.9微米，诸如0.8微米)的设备。另一个示例性高光学分辨率成像设备具有0.4至0.5微米(诸如0.43微米)的分辨率。示例性高光学分辨率成像设备可包括具有1微米或更低(包括例如0.46微米)的光学分辨率的设备。

如本文所用，粒子造影剂组合物可适于与粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)组合用于视觉分析仪以分析得自受试者的样品中的粒子。示例性PIOAL可用于例如得自受试者的样品中的不同类型粒子的自动化识别方法。

在另一方面，在获得图像时细胞可被包围在PIOAL中。本文描述了合适的示例性PIOAL。

如本文所用，“配向”可部分地由球形和/或非球形粒子的配向来表征。例如，粒子诸如非球形粒子可配向在基本上平行于流动方向的平面中。在某些实施例中，非球形粒子的配向通过这样的粒子取向来表征，该取向增大了非球形粒子在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中的图像投影。粒子诸如球形粒子可具有增加量的粒子和细胞的焦点内粒子内内容物。粒子诸如球形粒子的粒子内结构可定位、重定位和/或更好定位成基本上平行于流动方向。例如，细胞内结构、细胞器或裂片也可定位、重定位和/或更好定位成基本上平行于流动方向。

本发明中提及的一“类别”粒子应当理解为涵盖基于科学分类的一群粒子。例如，尿样中的有形成分的主要类别包括但不限于红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片。

在本发明中提及的粒子的“成员”或“多个成员”应当理解为涵盖一类目粒子中的亚类目粒子。例如，尿液沉渣的每一类别可进一步分成亚类目或亚类目。WBC的主要亚类目包括但不限于中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。除了成熟的RBC之外，RBC的成员还可包括异常形状的RBC。

提及的“异常”细胞或粒子应当理解为涵盖与某些疾病或病症相关的细胞，或者可能在某些情况下与某些疾病或病症相关的异常。粒子的尺寸、形状、颜色、数量、和/或细胞内结构的变化可与某些疾病或病症相关或指示不存在某些疾病或病症。

本发明中提及的粒子的“计数”或“粒子计数”应当理解为涵盖累积通过视觉分析仪检测以及分类或亚分类的所有粒子数而获得的粒子的数量。在本发明提及的粒子的类别、类目或亚类别或亚类目的“浓度”应当理解为意指每单位体积(例如，每升)或已知体积的每个样品中的粒子的数量。例如，视觉分析仪可为粒子的每个类目或亚类目提供计数、浓度、比率或其他基于浓度的参数。

本发明提供自动实现高光学分辨率成像设备的正确工作位置以对带形样品料流聚焦的技术。流通池结构被配置成使得带形样品料流在限定样品流体的流路的流通池内具有固定且可靠的位置，以PIOAL层之间的薄带形式穿过流通池中的观察区。在图1中示意性公开的流通池实施例中以及在图6和7的实践实施例中，PIOAL的流路的横截面在一定点处对称变窄，在该点处将样品插入穿过平坦孔口，诸如在孔口具有矩形内腔的管，或插管。变窄流路(例如，以20:1的比率或以20:1至70:1之间的比率在横截面积上几何变窄)以及与样品流相比的PIOAL的线速度差相互配合使样品横截面以约20:1至70:1的比率压缩和伸展。在一些实施例中，该横截面厚度比率可为40:1。

在一个方面，流通池的对称性质以及样品流体与PIOAL的注射方式为两层PIOAL之间的带形样品料流提供流通池内的可重复位置。因此，方法变量(诸如样品和PIOAL的特定线速度)不会倾向于使带形样品料流从其中心流动位置发生位移。相对于流通池的结构，带形样品料流位置是稳定且可重复的。

然而，流通池与光学系统的高光学分辨率成像设备的相对位置易于改变并且需要不时的位置调节以保持高光学分辨率成像设备与带形样品料流之间的最佳距离，从而提供带形样品料流中的被包围粒子的高质量聚焦图像。高光学分辨率成像设备与带形样品料流之间存在获得被包围粒子的聚焦图像的最佳距离。在图1中示意性地首先将光学器件相对于流通池准确地定位，也就是通过自动对焦技术使高光学分辨率成像设备位于离自动对焦光栅的最佳距离处来进行，所述自动对焦光栅具有相对于流通池的固定位置。优选地由于初始校准步骤，精确地知道自动对焦光栅与带形样品料流之间的位移距离。在对自动对焦光栅自动对焦后，随后使流通池和/或高光学分辨率成像设备位移，以提供流通池与高光学分辨率成像设备或者数字图像捕获设备与带形样品料流之间的已知位移距离。因此，高光学分辨率成像设备的物镜镜头精确聚焦于包含被包围粒子的带形样品料流。

在具有自动对焦方面的摄影系统中，通常的情况是自动对焦方法尝试增加图像中显现的主题的对比度。然而根据本发明技术，通过对自动对焦光栅自动对焦简化了自动对焦，在某些情况下所述光栅为高对比图形，其限定沿着平行于高光学分辨率成像设备或数字图像捕获设备的光轴的线的已知位置。自动对焦光栅具有相对于带形样品料流的位置的已知位移或距离。对比度测量算法可特别地用于自动对焦光栅的特征。在一个例子中，高光学分辨率成像设备的位置沿着平行于高光学分辨率成像设备的光轴的线改变，以找到这样的深度或距离，在该深度或距离处，在沿着图像中已知与对比图形的边缘交叉的像素的线出现的各像素亮度值中可发现一个或多个最大差异幅度。自动对焦光栅有利地沿着平行于高光学分辨率成像设备的光轴的线没有变化，该线也是这样的线，机动化控制器沿着该线操作以调节高光学分辨率成像设备的位置，从而提供记录的位移距离。

方法还包括使带形样品料流形成为带形。呈现带形使得高光学分辨率成像设备的光轴基本上垂直于带形样品料流，即正交于带形料流的平面。

视觉分析仪17还可以包括至少一个接触室26，所述接触室26被配置成提供能有效产生用于粒子分类和亚分类的视觉区别的至少一种化学品，所述化学品包括稀释剂、透化剂、造影剂中的至少一者。例如，如图1和别处所示，通过样品注射器29将接触的样品引入流通池中，并且从注射器27引入鞘液或细胞内细胞器配向试剂。

可使用稀释剂将样品稀释到合适的浓度。使用造影剂和/或透化剂产生用于分类和/或亚分类粒子的视觉区别。使用PIOAL使某些类型的细胞或细胞结构在更好成像的方向上配向。在一些实施例中，可施加所述至少一种化学品以首先接触样品，然后将所处理的样品提供于视觉分析仪17上。

通过至少添加至少一种化学品对样品进行的处理可在室温下进行。在一些实施例中，此类处理可在诸如10、15、20、25、30、35、36、37、38、38、39、40、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、或80℃的温度下进行。在所选温度下的处理可在培养箱中进行，所述培养箱与视觉分析仪17分隔开或在视觉分析仪17上，并且是温度受控的。

在一些实施例中，视觉分析仪可具有接触室以用于使样品与造影剂和/或透化剂或表面处理剂接触。在其他实施例中，可在注射到视觉分析仪中之前，使样品与造影剂和/或透化剂接触。在其他实施例中，视觉分析仪包含加热元件以用于在与造影剂和/或透化剂接触时将样品在受控温度下加热受控时间。视觉分析仪还可具有冷却元件以用于在加热步骤之后冷却样品混合物。

除了提供准确结果之外，视觉分析仪17还提供改善分析速度方面的显著优点。在图1C中，计数不同尿液沉渣的准确结果可通过显示器63输出。在分析过程期间，操作人员可通过终端65与处理器18进行交互。操作人员可能需要制备载片鉴定或验证样品中的细胞或其他粒子的类别或类别的成员，并且将信息输入处理器18。此前，最多约25％至30％的结果由操作人员通过使利用其进行检查的显微镜载片(例如，湿法封片或特化计数载片)处于显微镜下进行手动检查。通过操作如本发明中所述的分析仪，可在视觉分析仪上检查图像并且样品将需要更少频率的手动检查。

为了举例说明本发明中的分析仪的目的，对应用的以下类目进行描述。应用不限于下文所述的那些。

本发明提供用于进行粒子分析的新型组合物及其使用方法。具体地讲，本发明涉及用在分析仪中以分析样品中的粒子的粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)。术语鞘液和PIOAL在此整个公开内容中可互换使用。本发明还提供用于产生PIOAL的方法以及使用PIOAL分析粒子的方法。本发明的PIOAL可例如用于样品中粒子的自动化分类及亚分类方法。

PIOAL可包括一种或多种粘度剂或粘度改性剂。如本文所用，PIOAL为具有与样品粘度不同的特性粘度的化合物或组合物。在一些实施例中，增加或降低PIOAL的粘度以便使流动中的粒子的配向最大化并且在呈递用于成像时令人惊奇地还增加粒子和/或粒子的细胞内细胞器的焦点内内容物。例如，粒子和/或细胞可取向成在高光学分辨率成像设备的焦平面中在成像条件下增加粒子的图像投影。粒子内结构，诸如细胞内结构、细胞器或裂片，还可定位、重定位和/或更好地定位成基本上平行于流动方向。在一些实施例中，一种或多种粘度剂包括可包含另外盐分或其他组分的PIOAL的整个液体部分。在其他实施例中，增加或降低样品的粘度以使样品的粘度与PIOAL的粘度的相对差值最大化，以便使流动中的粒子的配向最大化并且在呈递用于成像时增加粒子和/或粒子的细胞内细胞器的焦点内内容物。

在某些实施例中，带形样品料流与PIOAL之间的粘度差和/或速度差和/或带形样品料流的厚度可引入剪切力以作用于流动中的粒子，从而使得粒子在视觉分析仪中的整个成像过程中配向或保持配向。在一些实施例中，样品将为造影剂增强的。在一些实施例中，PIOAL可包含最多100％的粘度剂。

在其他实施例中，本发明涉及可用于对尿样或其他生物流体样品(诸如与特定病症相关的脑脊髓液和积液)中的粒子进行基于图像的分析的PIOAL。如所述用于尿样的粒子类目和/或亚类目计数在本发明中为可以分析的样品的类目的非限制性例子。在一些实施例中，存在于样品中的细胞还可以包括细菌或真菌细胞以及白血细胞、或红血细胞。在一些实施例中，可分析从组织或抽吸物获得的粒子悬浮液。

在一些实施例中，可将样品流体的料流注射穿过具有平坦开口的插管以建立具有相当大的宽度的流路。PIOAL可被引入流通池并与样品流体一起输运穿过成像区，然后朝排放口输运。PIOAL具有与样品流体不同的粘度，例如相对更高的粘度，并且任选地，在向带形样品料流注射时的不同流速导致样品流体变平成薄带形状。样品流体的薄带与PIOAL一起被输运，以在观察口的前方通过，在观察口处布置高光学分辨率成像设备和光源以观察带形样品料流。

在一个实施例中，PIOAL的粘度可高于样品的粘度。对PIOAL的粘度、样品材料的粘度、PIOAL的流速和样品材料的流速进行协调以保持带形样品料流的流动，并具有预定的尺度特性，诸如有利的带形样品料流厚度。保持有利的带形样品料流厚度提供了例如高百分比的焦点内粒子，诸如细胞和/或焦点内细胞组分。

本发明基于以下发现：在PIOAL中添加适量的粘度剂显著改善流通池中的粒子/细胞配向，并增加焦点内的细胞的细胞内内容物，从而与使用非粘度改性的常规鞘液相比产生更高质量的流动中的细胞的图像。添加粘度剂增加对细胞(比如RBC)的剪切力，这随后配向在基本上平行于流动方向的平面中的细胞，从而导致图像优化。对于如WBC的细胞，这还导致细胞内结构、细胞器或裂片定位、再定位和/或更好地定位成基本上平行于流动方向。

直径比流动料流小的粒子的配向可通过增加PIOAL的粘度而获得。这导致那些粒子在基本上平行于流动方向的平面中改善的配向。

示例性PIOAL实施例用于在流通池中进行粒子分析。样品被包围在PIOAL的料流中并穿过分析设备的流通池。然后，采集穿过检测区时得自样品的信息，从而使得分析仪能够分析样品中所含的粒子/细胞。在此类分析仪上使用PIOAL允许对粒子(诸如样品中所含的细胞和其他粒子)进行准确的分类及亚分类和计数。

如本文所用，PIOAL可用于获得与本文所公开的以下细胞和/或粒子有关的信息。

如本文所用，粘度剂和/或粘度改性剂可包括适于实现0.1至10厘泊之间的PIOAL粘度与样品粘度之间的差值绝对值而光学特性(包括光学清晰度)适用于成像系统的任何物质。粘度剂和/或粘度改性剂可包括适于实现0.1至10厘泊(cP)之间的PIOAL粘度与样品粘度之间的差值绝对值而光学特性(包括光学清晰度)适用于成像系统的任何试剂。

另外的合适缓冲剂可包括例如pH缓冲剂，所述缓冲剂在生理范围pH6-8中起作用，包括2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇BioXtra，pH10.0-12.0(20℃，H₂O中0.5M)；ACES；ADA；BES；Bicine；BIS-TRIS；DIPSO；EPPS；Gly-Gly；HEPBS；HEPES；MES；MOBS；MOPS；MOPSO；Phosphates；PIPES；POPSO；碳酸钠；碳酸氢钠；TAPS；TAPSO；TES；麦黄酮；三乙醇胺盐酸盐；和Tris；Trizma。

在一个方面，示例性分析仪/系统包括自动化视觉分析仪部件，其中使得包含所关注的粒子的液体样品流过具有观察口的流通池，高光学分辨率成像设备通过该观察口捕获数字图像。流通池耦合到样品流体源，以及耦合到PIOAL源。可在成像分析之前用本文所述的示例性粒子造影剂组合物中的一者或多者来处理样品。在一些方法中可将尿样稀释、分成多个部分或进行染色，并且使其流过具有透明端口或窗口的流通池，使用包含数字相机的高光学分辨率成像设备通过所述端口或窗口捕获像素数据图像。像素数据图像可显示于监视器上，并且自动和/或交互进行分析以识别所关注的粒子的可见特征。特征使得能够对粒子进行区分、分类、亚分类和计数，诸如尿样中的有形成分。

可通过任何常规方法，例如尿样采集，来获得样品。样品可来自被认为健康的受试者，例如作为日常体检的一部分而采集的样品。样品也可来自具有失调、有失调风险或疑似具有失调的受试者。失调可由疾病、遗传异常、感染、损伤或未知原因引起。作为另外一种选择或除此之外，方法可用于在治疗过程期间监测受试者。如果存在响应性的迹象，临床医生可相应地调节剂量或治疗。如果存在对治疗的非响应性的迹象，临床医生可调节剂量或者选择替代或辅助药剂。根据受试者的病症和具体失调(如果有的话)，可每日、每周、每月或每年采集一次(或两次、三次等等)样品。

高光学分辨率成像设备和光源可设置在流通池的相对侧以获得粒子的背光图像。高光学分辨率成像设备通过流通池中的观察口捕获样品的像素数据图像。例如，高光学分辨率成像设备以与流速一致的重复率捕获图像，使得带形样品料流的截面在无大量空隙或重叠的情况下成像。

在系统的设计和操作中存在多种结构和功能挑战，以用于通过流通池采集前进式带形样品料流的高分辨率图像。其中一项需要为获得粒子的清晰聚焦图像，其足够透明以展现各种粒子类型的不同特征，所述特征允许粒子类型彼此区分开。

为了保持聚焦，需要设定高光学分辨率成像设备与带形样品料流之间的距离，使得带形样品料流位于沿着光轴离高光学分辨率成像设备的正确距离。高光学分辨率成像设备的物镜镜头分辨像素数据从中数字化的光敏元件阵列(诸如二维电耦设备阵列)上的聚焦图像。待成像的样品的区域的尺度以及样品中焦点内的视野深度由光学构形确定。可进行孔调节和变焦调节，但出于简明目的，本发明中的例子使得高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流中的粒子仅仅需要使高光学分辨率成像设备定位在离流通池中带形样品料流的预定正确距离，即生成光敏元件阵列上的聚焦粒子图像的距离处。

在一个方面，用于与本发明的组合物一起使用的视觉分析仪或图像分析仪可通过非常精确地设定带形样品料流与光学系统的高光学分辨率成像之间的距离来捕获可靠聚焦的样品图像。在一些实施例中，视觉分析仪可与本发明的组合物和算法联合使用以建立所述距离。

有利的是对薄层的制备样品成像。样品被布置在流通池中并且被照明以允许通过观察口进行观察。单独的粒子清楚地出现在捕获的像素数据图像中，并且例如具有展现属性的足够特征对比度，然后将所述属性与已知将粒子的各类目和亚类目彼此区分开的参数进行比较和对比。

一个目标是采用流通池，同时结合合适的粒子造影剂组合物以及示例性PIOAL，以允许分析仪采集用于粒子识别的最佳图像。另外，PIOAL和流通池为注射到PIOAL流中的带形样品料流提供稳定并且高度可重复的位置，同时与保持高光学分辨率成像设备到带形样品料流的最佳距离的自动对焦机构相结合，从而提供高质量聚焦图像。

已知通常在数字摄像并且具体地讲在数字图像显微镜中使用自动对焦方法，以用于在不确定深度位置处聚焦于受试者。然而，经编程的处理器不具有图像内容物的感测。通常，通过找到下述距离来评估焦点的质量，在该距离处受试者的图像具有如通过施加于图像中的像素数据的数值算法所测定的最高总体对比度。例如，图像中每个像素与其相邻像素的亮度幅度的差值总和可计算为测量总对比度。在其他条件都相同的情况下，以稍微不同距离存在于图像中的最高总和对应于最高对比度。然而，图像内容物影响此类数值测量的结果，并且图像内容物可在不同距离处不同。因此，当使用流通池而非玻璃载片安装的样品时，如同手动工序中一样，有利的是对例如厚度相当于细胞或粒子厚度的薄层经稀释染色样品成像。需要将样品布置在流通池中以能够通过观察口进行观察，并且进行照明。

因此，有利的是具有自动化聚焦方法，从而单独的粒子清楚地出现于捕获的像素数据图像中，并且具有展现可见属性的足够特征对比度，然后将所述属性与已知将粒子的各类目和亚类目彼此区分开的参数进行比较和对比。

一个目标是采用流通池，同时结合为注射到PIOAL流中的样品料流提供稳定且高度可重复的位置的本文所公开的示例性PIOAL，同时结合使高光学分辨率成像设备的焦平面保持在带形样品料流上的高光学分辨率成像自动对焦装置，该焦平面基本上平行于流动方向从而提供样品中粒子的高品质聚焦图像，但其不需要不断或甚至频繁地重复自动对焦过程。将图像聚焦于基本上平行于视觉分析仪流动方向的平面中。

例如，第一步骤为确定相对于输运示例性PIOAL和带形样品料流的流通池的高光学分辨率成像设备的精确相对位置。有利的是，流通池和/或高光学分辨率成像设备在自动对焦过程中相对于彼此移动，所述过程使用具有清晰对比边缘作为参考点的自动对焦光栅作为受试者。带形样品料流固定在相对于该参考点的适当位置。

PIOAL流路可对称地布置成使得相等的PIOAL流使样品料流伸展为薄带并且定位在沿着平行于高光学分辨率成像设备的光轴的线离自动对焦光栅固定距离处。在一个实施例中，自动对焦光栅包括在允许来自后照明源的光透过的开口周围的不透明边界，并且自动对焦光栅的距离能容易且明确地通过自动对焦对照物来定位。然后，通过使高光学分辨率成像设备从自动对焦光栅位置位移至带形样品料流的位置而使带形样品料流处于焦点内，其为固定位移距离，并且不需要自动对焦于样品的图像内容物，虽然进一步自动对焦是可以想到的。

提供电机驱动器并且通过处理器进行控制，所述处理器评估聚焦质量的量度(例如，对比度量度)，并且操作电机驱动器以便自动对焦。在正常操作中，处理器操作电机驱动器以自动对焦于自动对焦光栅上，并且随后将高光学分辨率成像设备与流通池之间的距离调节从自动对焦光栅至带形样品料流的记录位移距离。只要设备继续以相同方式移动带形样品料流并且不发生热膨胀或类似混杂因素，带形样品料流的图像就将保持在焦点内。

预先设置或校准方法可用于测定和记录自动对焦光栅与流通池中的带形样品料流的位置之间的位移距离。准确位移距离(不同流通池可能不同)通过初步测试来确定，诸如通过交替地对自动对焦光栅和测试带形样品料流自动对焦若干次，并记录平均结果作为与流通池相关的常数。

尿样中的粒子通过高光学分辨率成像设备成像，所述设备采集通过至少部分自动化图像分析方法进行分析的数字图像。自动对焦过程在自动对焦光栅或类似聚焦靶标上实现，该靶标优选为在光轴方向具有极少或不具有距离变化的平面靶标，并且不在受试者带形样品料流上实现。自动对焦光栅具有至带形样品料流的距离的已知距离位移。自动化聚焦构形包括电机驱动器，所述电机驱动器响应于来自采集一系列距离内的聚焦质量的一个或多个量度并寻找最佳距离的处理器的控制信号，而调节沿着光轴的流通池与高光学分辨率成像设备的相对位置。应用自动对焦以使高光学分辨率成像设备焦点固定在靶标光栅的深度处，所述靶标光栅位于离平行于流动料流的平带形样品料流位移距离处。

聚焦于自动对焦光栅后，处理器在固定位移距离内操作电机驱动器，从而使带形样品料流处于数字图像中的焦点内。自动对焦光栅可具有高度视觉对比度并且在一些实施例中可有助于平面配向，即，将流通池布置在正交于高光学分辨率成像设备的光轴的平面中。

在一个方面，本发明的方法提供令人惊奇地高质量的流动中粒子图像，其允许自动化的基于图像的尿液沉渣计数，以及自动化鉴定形态异常，其可用于对受试者是否具有疾病、病症、异常或感染进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断和/或监测受试者对治疗有响应还是无响应。在另一个方面，本发明的组合物和方法提供更准确的细胞分类、亚分类和更准确的标记，与目前的自动分析仪相比，其降低手动检查率。

在一些实施例中，本发明还涉及包含本发明的PIOAL的试剂盒。在另一个实施例中，本发明涉及包括本发明的PIOAL和至少一种粒子造影剂的试剂盒。在一些方面，除了PIOAL之外，试剂盒还可包含两种粒子造影剂。在一些实施例中，粒子造影剂为包含新亚甲蓝、结晶紫、番红O、曙红Y和/或甲基绿的组合物。

在一个实施例中，非球形粒子包括红血细胞、上皮细胞、管型、白血细胞团块、和/或出芽或菌丝酵母。在本发明的另一个方面，球形粒子包括白血细胞、脂肪体、滴虫。

待分析的尿样中的粒子包括特性沉渣或有形成分。有形成分可包括本文所公开的示例性粒子。

示例性管型可以包括非细胞色素管型、未分类管型(例如，颗粒状管型)。示例性非细胞管型可以包括例如蜡样管型、宽大管型、脂肪管型和晶体管型。示例性细胞管型可以包括例如RBC管型、WBC管型和细胞管型。

示例性晶体可以包括例如草酸钙、三磷酸盐、磷酸钙、尿酸、碳酸钙、亮氨酸、胱氨酸、酪氨酸和无定形晶体。

示例性非鳞状上皮细胞可以包括例如肾上皮细胞和移行上皮细胞。

示例性酵母可以包括例如出芽酵母和带有假菌丝的酵母。

示例性细菌病原体可包括例如炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌土拉弗朗西斯菌、布氏杆、沙门氏菌属(包括肠炎沙门氏菌)、大肠杆菌(包括大肠杆菌O157:H7)、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、衣原体属、贝氏柯克斯体、普氏立克次体、弧菌属、志贺氏杆菌属、单核细胞增多性李斯特菌、结核分枝杆菌、麻风杆菌、博氏疏螺旋体、胸膜肺炎放线杆菌、幽门螺杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、百日咳博德特氏杆菌、牙龈卟啉单胞菌、和空肠弯曲菌。真菌病原体可包括但不限于曲霉属、青霉菌属、葡萄穗霉属、木霉属、支原体属、荚膜组织胞浆菌属、新型隐球菌属、沙眼衣原体属和白色念珠菌属的成员。病原性原生动物可包括例如隐孢子虫属(例如，小球隐孢子虫属)、蓝氏贾第鞭毛虫属、小孢子虫目和弓形虫属(例如，布氏锥虫弓形体属、鼠弓形体属)、溶组织内阿米巴属、恶性疟原虫属、利什曼原虫属和卡耶塔环孢子球虫属的成员。

示例性尿沉渣粒子还可以包括RBC团块、脂肪、椭圆形脂肪体和滴虫。

与尿液中的血红蛋白相关的病症包括例如胆红素结晶或无定形沉积物，见于严重高胆红素血症；胱氨酸结晶，见于胱氨酸病；血铁黄素，见于铁过载；和红血球，见于阵发性冷性血红蛋白尿症。

在一些实施例中，可将获得的结果与参考值进行比较。

标准参考水平通常代表衍生自较大参考群体的细胞数量。参考群体可包括类似年龄、体格大小、种族背景或一般健康状态的个人作为所考虑的个人。

在一个方面，本文所公开的示例性染色组合物可用于分类、亚分类和计数本文所公开的粒子。

如本文所用，粒子造影剂组合物可在视觉分析仪中与PIOAL结合使用以生成包含较大数量的焦点内细胞内容物(例如，裂片、细胞核、细胞核内容物、细胞质和颗粒)的图像。

使用PIOAL使样品料流薄化，从而有助于将所述流引导为薄型的平带。在一些实施例中，使用PIOAL产生更多的焦点内细胞内容物，所述内容物可包括裂片、细胞质和细胞的颗粒组分。此外，在一些实施例中，流通池设计具有对称流路，与具有不对称流路的流通池相比，其产生较低的细胞失准。

如本文所用，造影剂用于对多种细胞类型进行染色，包括例如白血细胞、上皮细胞和/或细菌。

在一些实施例中，由本发明的粒子造影剂组合物染色的成像细胞的特征记录于表1中。

表1

	尺寸(相对于RBC)	形状	颜色	细节
					RBC	标准	圆形		光中心
WBC	大	圆形	细胞核染色	细胞核&颗粒
					上皮细胞	小至大	各种	细胞核染色	细胞核&颗粒
晶体	小至大	各种	天然	拐角
					细菌	非常小的和大的杆	点或杆	染色
酵母	非常小至大	单个圆形或团块
					精子	小	原丝		头部和尾部
管型	大至非常大	圆柱形		透明
					黏液	小至非常大	原丝或圆柱形		透明
滴虫	大	圆形	染色	尾部

在某些实施例中，粒子造影剂组合物为了稳定性、易于贮存、处理和/或有限毒性而配制。

在一些实施例中，本文所公开的方法和分析仪可用于监测细胞形态。细胞形态的改变与许多种失调相关。此类改变可根据具体失调和细胞类型而变化，但通常包括尺寸、形状、颜色和细胞内结构的异常或尺寸、形状、颜色和细胞内结构异常的任何组合。例如，RBC形状的改变可指示存在肾脏疾病/肾病。

在一些实施例中，可将获得的值与参考水平进行比较。标准参考水平通常代表衍生自较大个人群体的粒子数量。参考群体可包括类似年龄、体格大小、种族背景或一般健康状态的个人作为所考虑的个人。

细胞可为诱饵细胞或肿瘤细胞。

在其他实施例中，本发明包括含有用于本文所公开的方法中的一种或多种试剂的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒可包括一个或多个PIOAL单位。在其他实施例中，该试剂盒还可以包括一种或多种粒子造影剂组合物。该试剂盒还可以包括一种或多种缓冲剂，所述缓冲剂具有等渗性，和/或稀释剂。试剂盒和/或缓冲剂还可以包括表面活性剂、pH调节剂、离子强度改性剂、螯合剂、糖、糖醇、蛋白质稳定剂、抗微生物剂和/或血红蛋白试剂。在其他实施例中，该试剂盒还可以包括清洗溶液或冲洗溶液。该试剂盒还可以包括阳性和阴性对照的标准品。在一些实施例中，标准品可包括标准染色粒子试剂(校准物或对照物)。该试剂盒还可以包括上述中任一者的浓缩物。该试剂盒还可以包括一次性用品(诸如用于转移试剂盒组分的一次性微量移液器、移液头或试管)、连接器、清洗器(溶液)，或指令手册、操作手册、分析证书、MSDS等，以及将此类元件关联为一个单元的包装。

用于增强粒子、细胞或细胞结构(包括白血细胞、上皮细胞、病理性管型和/或细菌)的特征的粒子造影剂在提交于2014年3月17日的共同待审的美国专利No.14/216,562中有进一步描述，该专利的内容以引用方式并入本文。

本文所公开的分析仪和方法可用于评价包含尿液中粒子的任何样品。所述方法适用于来自广泛受试者范围的样品，所述受试者包括哺乳动物，例如，人类、非人灵长类(例如，猴)、马、牛或其他牲畜、狗、猫或其他作为宠物饲养的哺乳动物、大鼠、小鼠或其他实验室动物；禽类，例如鸡；爬行动物，例如短吻鳄；鱼类，例如，鲑鱼和其他养殖物种；以及两栖动物。

在一些实施例中，本文所公开的方法和组合物可用于监测细胞计数、细胞特征/形态和/或细胞特征/形态中的改变。此类改变可与失调相关并且可根据具体失调和细胞类型而变化，但通常包括尺寸、形状、颜色和细胞内特征/结构的异常或尺寸、形状、颜色和细胞内特征/结构异常的任何组合。例如，RBC形状的改变可指示存在肾脏疾病/肾病。

本发明还提供了用于对粒子进行分析的示例性粒子造影剂组合物及使用方法。粒子造影剂组合物可用于适用于检测和/或分析包含粒子的样品的任何分析仪中，包括本文所述的分析仪。在一般的方面，当与存在于研究和/或医学实验室中的自动分析仪结合使用时，所述示例性粒子对比组合物及其使用方法是有用的。示例性自动分析仪为被设计成以最少的人工辅助监测多种生物样品(包括例如人类体液样品)中的不同特征和/或其他特性的仪器。示例性自动分析仪可包括例如尿液沉渣自动分析仪。示例性分析仪可逐一地、分批地或连续地处理样品。在一个实施例中，本文所述的示例性粒子对比组合物还可用于常规显微镜应用而不要求使用自动粒子计数器和/或视觉分析仪。

样品可进行稀释、分成多个部分或浓缩。在一些方面，进行图像分析之前，可在打开或关闭分析仪的情况下使样品与本文所述的示例性粒子造影剂组合物接触。使用示例性粒子造影剂组合物进行处理也可在分析仪中在线执行。在某些实施例中，使包含粒子的样品与粒子造影剂组合物接触并且将制备样品传输穿过流通池，同时包围在示例性PIOAL中。在一些方面，可引导制备样品流过具有透明端口或窗口的流通池，使用高光学分辨率成像设备通过所述透明端口或窗口周期性或连续性地捕获像素数据图像。像素数据图像可显示于监视器上，和/或自动和/或至少部分地交互进行分析以识别所关注的可见特征。代表性物体的视觉上区别明显的特征用于对粒子诸如尿样中的有形成分进行分类、亚分类和/或归类或子归类以及计数。

在一个方面，本发明涉及用于使包含悬浮于液体中的粒子的样品成像的视觉分析仪，其中视觉分析仪包括耦合到样品源和耦合到PIOAL源的流通池，其中流通池限定内部流路，所述流通池被配置成将被PIOAL包围的带形样品料流的流引导穿过流通池中的观察区。与高光学分辨率成像设备相关的物镜镜头被定位成使得物镜光轴与流通池中的带形样品料流相交。物镜和流通池之间的相对距离可通过操作耦合到控制器的电机驱动器来改变，以便在光敏元件阵列上分辨和采集数字化图像。自动对焦光栅(例如，在数字化图像中可见)位于相对于流通池固定的位置，所述自动对焦光栅位于离带形样品料流的平面的预定距离处。光源照明带形样品料流和自动对焦光栅。至少一个数字处理器与耦合的控制器相连以操作电机驱动器。处理器还被布置用于分析数字化图像。处理器测定自动对焦光栅的焦点位置，并且使物镜和流通池在离聚焦位置的预定距离(例如，“位移距离”)内相对地位移，以将高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。

在另一个方面，视觉分析仪可包括便于图像的自动化分析的处理器。在一个方面，视觉分析仪可用于本发明的方法中以提供自动化的基于图像的尿液有形成分计数。在某些方面，本发明的方法涉及自动化鉴定形态异常以便对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常和/或感染进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断，和/或监测受试者对治疗有响应还是无响应。

在一个实施例中，PIOAL被引入流通池中并且将样品流体输运穿过成像区，随后朝排放口输运。可将样品流体的料流注射穿过具有平坦开口的插管以建立具有相当大的宽度的流路。在一些实施例中，注射的样品流体通过在注射之前使用粒子造影剂组合物进行处理而制备。在本发明的另一个方面，可通过操作一系列阀门和泵将样品注射到流通池中。在一个方面，通过精密流体泵以所选流速将样品流体和PIOAL的流引入流通池中。

样品流体和PIOAL的粘度和流速以及流通池的轮廓和尺度可被选择成使得PIOAL流变平并将样品流伸展成平带，所述平带在可靠位置连续地穿过观察区。例如，PIOAL可沿着具有对称变平横截面的流路流动，所述横截面趋于使注射样品以恒定水平保持在流中的适当位置。在一些实施例中，PIOAL具有比样品流体相对更高的粘度，并且在样品注射时的相对PIOAL和样品线性流速使得样品流体变平为薄带形样品料流。

带形样品料流与PIOAL一起被输运，以在观察口的前方通过，在观察口中布置高光学分辨率成像设备和光源(例如，UV、可见或IR)以观察带形样品料流中的粒子。高光学分辨率成像设备和光源可设置在流通池的相对侧以便获得粒子的背光图像。高光学分辨率成像设备通过流通池中的观察口捕获样品粒子的像素数据图像。例如，高光学分辨率成像设备以与样品流动速度一致的重复率捕获图像，使得带形样品料流的截面在无大量空隙或重叠的情况下成像。

本发明的实施例提供在用于采集流过流通池的带形样品料流的图像的系统的设计和操作中实施的多种独特结构和功能特征。示例性实施例被配置成获得粒子的充分聚焦图像，所述图像具有足够的清晰度和分辨率以揭示各种粒子诸如血细胞的不同特征，所述不同特征允许粒子和/或细胞类型彼此区分开。

在一个方面，流通池的对称性质以及样品流体与PIOAL的注射方式为PIOAL中的带形样品料流提供流通池内的可重复位置。然而，流通池与高光学分辨率成像设备的相对位置可易于改变并且需要不时的位置调节以保持高光学分辨率成像设备与带形样品料流之间的最佳距离，从而提供粒子的高质量聚焦图像。

本发明的实施例涵盖用于尿液和/或其他生物流体的自动化视觉分析仪系统和方法，其结合自动对焦设备/装置以通过非常精确地设定带形样品料流与高光学分辨率成像设备之间的距离来提供样品的可靠聚焦的图像。在一个方面，本文所公开的自动对焦系统实施例可非常精确地设定带形样品料流与高光学分辨率成像设备之间的距离并且捕获样品的可靠聚焦的图像。在一些实施例中，使用算法确定实现良好聚焦结果的距离。

一个目标是采用为被包围在PIOAL流中的带形样品料流提供稳定且高度可重复的位置的流通池，同时结合高光学分辨率成像设备及保持高光学分辨率成像设备和带形样品料流之间的最佳焦距的自动对焦设备/分析仪，从而提供高质量聚焦图像。

此类装置和方法在本文中公开并要求保护。提供了对称流通池，已发现其产生流通池内的可重复带形样品料流距离。聚焦涉及设定高光学分辨率图像设备相对于带形样品料流的精确的正确相对位置，以便保持聚焦于带形样品料流。

有利的是，可使用自动对焦光栅诸如高对比度光栅或类似聚焦靶标，优选具有清晰对比的特征诸如边缘的平坦光栅，在自动对焦过程中使流通池和/或高光学分辨率图像设备能够相对于彼此移动，所述自动对焦光栅固定在相对于流通池的适当位置并且用作聚焦对象代替样品自身。带形样品料流是沿着平行于高光学分辨率成像设备的光轴的线离自动对焦光栅在固定距离处的薄带。自动对焦光栅与带形样品料流位置之间的位移距离为恒定距离，该距离被初始测定并且编程到自动对焦设备/分析仪。其后的示例性技术是自动对焦于自动对焦光栅，然后使高光学分辨率图像设备和/或流通池相对于彼此位移预定距离，于是高光学分辨率图像设备与带形样品料流位置之间的距离是提供带形样品料流的高质量聚焦图像的最佳距离。例如，首先，自动对焦算法使高光学分辨率成像设备的位置聚焦于位于离带形样品料流的固定距离处的自动对焦光栅。聚焦于自动对焦光栅后，处理器在预定位移内操作电机驱动器，从而使带形样品料流处于高光学分辨率成像设备的焦点内。

示例性高光学分辨率图像设备包括物镜镜头和相关的像素图像传感器，所述像素图像传感器能够捕获图像，所述图像以足够的放大倍数和分辨率揭示粒子以提供分辨粒子的图像(例如，视觉)特征的足够细节。

PIOAL流路可对称地布置成使得样品料流上方和下方流过等量的PIOAL，这使样品料流伸展为薄带并定位于沿着平行于高光学分辨率成像设备的光轴的线离自动对焦光栅固定距离处。在一个实施例中，自动对焦光栅包括在允许来自后照明源的光透过的开口周围的不透明边界，并且自动对焦光栅的距离能容易且明确地通过自动对焦对照物来定位。不需要直接自动对焦于样品的图像内容，虽然进一步自动对焦是可以想到的。

自动化聚焦配置包括电机驱动器，所述电机驱动器响应于来自评估一系列距离内的聚焦质量的一个或多个量度并寻找最佳距离的处理器的控制信号，而调节沿着光轴的流通池与高光学分辨率成像设备的相对位置。例如，处理器可评估对比度的量度并操作电机驱动器以便自动对焦。在正常操作中，处理器操作电机驱动器以自动对焦于光栅上，并且随后将高光学分辨率成像设备与流通池之间的距离调节离自动对焦光栅的记录位移以使带形样品料流处于焦点内。只要设备继续以相同方式移动带形样品料流并且不发生热膨胀或类似混杂因素，带形样品料流的图像就将保持在焦点内。

预先设置或校准方法可用于测定和记录自动对焦光栅与流通池中的带形样品料流的位置之间的位移距离。准确位移距离(不同流通池可能略微不同)通过初步测试来确定，诸如通过交替地对自动对焦光栅和测试样品料流自动对焦若干次，并记录平均结果作为与流通池相关的常数。

因此，将待成像的样品诸如制备的尿样沿着限定的流路引导穿过流通池中的观察区。PIOAL流路优选地是对称的并且样品被注射到PIOAL流的中心，其中样品被PIOAL流包围。样品和PIOAL的流速和粘度及密度特性与流通池的轮廓一起配合，以便使样品形成为连续地在可重复位置处流过观察区的平带。

样品可通过高光学分辨率成像设备的相机部件成像，并且采集的数字图像将通过至少部分自动化的图像分析过程(包括如本文所述的自动对焦过程)进行分析。

一个目标是区分、分类、亚分类和/或计数本文所述的可能与特定病症相关的尿样中的粒子，诸如血细胞。在一个方面，本发明的粒子造影剂组合物可与分析仪诸如本文所述的分析仪在方法中结合以提供流动粒子的令人惊奇的高质量图像。可自动捕获并处理粒子的高质量图像。

图像允许自动化的基于图像的尿液有形成分计数，以及形态异常的自动化鉴定，其可用于对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常和/或感染进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断，和/或监测受试者对治疗有响应还是无响应。尿样中的细胞类目和/或亚类目计数在本发明中用作可以分析的流体的类目的非限制性例子。

一个目标是采用流通池，同时结合本文所述的示例性造影剂组合物以及示例性PIOAL，从而提供对于粒子识别具有最佳质量和细节的图像。此外，PIOAL和装置为包围在PIOAL流中的带形样品料流提供稳定且高度可重复的位置。这与高光学分辨率成像设备及保持高光学分辨率成像设备到带形样品料流的最佳距离的自动对焦设备/装置相结合，提供高质量聚焦图像。

相比之下，其他分析仪，例如基于图像的区分器诸如视觉分析仪，能够基于细胞或聚集细胞和/或粒子或聚集粒子的外观区分不同类目和亚类目的示例性细胞和/或粒子。在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞核或细胞核组分相关的信息。在一个实施例中，用本发明的粒子造影剂组合物处理的粒子的图像提供与细胞的颗粒组合物和/或特征相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞核细胞质和颗粒组分相关的信息。颗粒、细胞质和/或细胞核特征为基于图像的(例如，视觉)区别的，其可独立地或彼此相结合地对于细胞分类及亚分类来说是至少部分决定性的。

通过选择本发明的粒子造影剂组合物来通过自动化设备上的软件提供对于粒子识别的最佳对比度，本发明的组合物可用于粒子分类和亚分类诸如尿液沉渣粒子分类和亚分类的方法中。

在本发明方法的一个方面，与粒子造影剂组合物接触和成像的细胞可为白血细胞。在另一个方面，本发明的方法可包括白血细胞分类和亚分类。

在本发明方法的另一个方面，与粒子造影剂组合物接触和成像的细胞为异常粒子，诸如疟疾感染的细胞、癌细胞、细菌或寄生生物。

用于粒子成像系统中的常规鞘液基本上不配向粒子或增加焦点内粒子内容物。需要可用于粒子和/或细胞内细胞器配向液(PIOAL)以执行精确的自动化粒子分类和亚分类的方法和组合物。在本发明的一些方面还提供了PIOAL以用于本发明的系统的流通池中。

本发明提供用于进行粒子分析的新型组合物及其使用方法。具体地讲，本发明涉及用在分析仪中以分析样品中的粒子的PIOAL。本发明还提供用于产生PIOAL的方法以及使用PIOAL分析粒子的方法。本发明的PIOAL可例如用于样品中粒子的自动化分类及亚分类方法。

本发明的一个方面基于意料不到的观察：在PIOAL中添加至少一种粘度剂和/或粘度改性剂明显改善粒子、细胞和细胞内结构(诸如流过流通池的细胞的细胞内结构)的焦点内内容物的配向。PIOAL改善在基本上平行于流动方向的平面中的细胞配向，从而使高光学分辨率成像设备的焦平面中的非球形粒子的图像投影最大化，其导致图像优化和焦点内粒子数增加。这还导致粒子内结构(诸如细胞内结构、细胞器或裂片)基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位。因此，在一些方面，本发明的组合物和方法导致焦点内细胞内容物(诸如焦点内裂片、细胞质和/或颗粒)增加。本发明的组合物和方法还提供粒子的更精确分类和/或亚分类及计数并允许微分(differential)粒子计数。

本发明涉及适用于分析仪中的PIOAL。在一个方面，本发明提供了用于分析仪中的PIOAL，所述分析仪被配置成引导给定粘度的尿样在流路中流动，其中PIOAL包含：粘度与样品的粘度不同的流体，其中PIOAL可有效支持样品的流动以及使粒子配向和/或改善在基本上平行于流动方向的平面中的配向并增加在流路中流动的粒子和细胞的焦点内内容物，从而可以使配向的粒子和细胞的细胞内细胞器成像。在一个实施例中，PIOAL还包含以下至少一者：缓冲剂；pH调节剂；抗微生物剂；离子强度改性剂；表面活性剂和螯合剂。在一些实施例中，PIOAL可包含另外的相容组分。

在一个方面，粘度剂/改性剂以某种浓度存在于PIOAL中，在操作条件下该浓度足以有效实现PIOAL粘度与样品粘度之间约0.1至约10厘泊(cP)、约1.0至约9.0厘泊、3.0至7.0厘泊或约5.0厘泊的差绝对值。在一个方面，PIOAL可与具有更低粘度的样品一起使用。在另一个方面，PIOAL可与具有更高粘度的样品一起使用。在一个方面，PIOAL包含最多100％的粘度剂。

在另一个方面，本发明的PIOAL还包含pH调节剂。在一个实施例中，在将PIOAL引入样品中之前在操作条件下其pH在约6.0至约8.0之间。在一个实施例中，在操作条件下PIOAL的pH在约6.5至约7.5之间。在一个实施例中，在操作条件下pH在约6.8至约7.2之间。

在一个方面，本发明的PIOAL还可包含一种或多种抗微生物剂。在一些方面，抗微生物剂可以为例如具有杀真菌活性的物质(杀真菌剂)和/或具有杀细菌活性的物质(杀细菌剂)。

在某些实施例中，PIOAL可包含另外的相容组分，诸如盐酸普鲁卡因。

在某些实施例中，PIOAL还可包含适用于分批或批量鉴定的可检测惰性标记物。在一个方面，本发明提供了用于被配置成引导给定粘度的样品在流路中流动的视觉分析仪/分析仪中的PIOAL，其中液体包含粘度与样品的粘度不同的流体，例如，粘度比样品高的PIOAL，其中PIOAL可有效配向并增加在流路中流动的粒子和细胞的细胞内细胞器的焦点内内容物以及允许流动粒子和细胞高质量成像。

在另一个实施例中，本发明的PIOAL包含离子强度改性剂以调节离子强度。示例性离子强度改性剂可包括Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg⁺⁺、Ca⁺⁺、Cl^-、Br^-、HCO₃ ^-、硫酸盐、焦硫酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、柠檬酸盐、卡可基酸盐或其他合适的盐。在一个实施例中，PIOAL可以为等渗的。在一个实施例中，PIOAL为等渗的和/或包含具有等渗性的水溶液。在一个实施例中，PIOAL包含氯化钠。在一个实施例中，所述氯化钠以约0.9％的浓度存在。在一个方面，PIOAL与尿液具有相同渗透度。在一个实施例中，本发明的PIOAL中的氯化钠可以约0.1与约10％(w/v)之间的浓度存在。PIOAL中的氯化钠浓度可为例如100毫升中约0.9克氯化钠。

在一个方面，PIOAL在操作温度和条件下具有约1-10厘泊之间的靶标粘度。在一个实施例中，提供了浓缩的PIOAL的储备液，其中所述浓缩的储备液可被稀释以达到PIOAL粘度。在一个实施例中，储备液的浓度在操作条件下以PIOAL的至少约1.1x至至少约100x浓度存在。如本文所用，操作温度可在约10-40℃(包括约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30℃)的范围内。通常，在室温下或在约25℃下报告粘度测量。

在一个方面，本发明提供了浓缩的粒子和细胞内细胞器配向液的储备液，其中浓缩的储备液可被稀释以在操作条件下达到约1-10厘泊之间的粘度。

粘度剂为任何化合物，该化合物能够在基本上平行于流动方向的平面中配向细胞，和/或用于使粒子内结构(诸如细胞内结构、细胞器或裂片)基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位。在一个实施例中，PIOAL包含至少一种粘度剂，该粘度剂选自甘油、甘油衍生物、乙二醇、丙二醇(二羟基丙烷)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素(CMC)、水溶性聚合物和葡聚糖中的至少一者。在一个实施例中，粘度剂为甘油。在一个实施例中，粘度剂包含甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一个实施例中，粘度剂包含PVP。在一个实施例中，粘度剂包含丙二醇(二羟基丙烷)。在一个实施例中，粘度剂包含聚乙二醇。在一个实施例中，粘度剂包含水溶性葡聚糖。在一个实施例中，粘度剂包含甘油和羧甲基纤维素(CMC)。在一个实施例中，粘度剂包含甘油和葡聚糖，例如，硫酸葡聚糖。在一个实施例中，粘度剂包含甘油衍生物。在一个实施例中，粘度剂包含乙二醇。在一个实施例中，粘度剂包含丙二醇(二羟基丙烷)。粘度剂还可包含乳糖、蔗糖、三氯蔗糖、麦芽糖糊精、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素、玉蜀黍淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素(CMC)、羧甲基纤维素钠(NaCMC)、乙基纤维素(EC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素(CMC)钠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)以及它们的组合。此外，用以使粘度改性的另外试剂描述于Remington’sPharmaceuticalSciences；June1990,MackPublishingCo.(《雷明顿药物科学》，1990年6月，Mack出版公司)。可根据所需的最终渗透性和粘度选择这些试剂。粘度改性剂可包括适于提供约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5至约10厘泊的PIOAL粘度而光学特性(包括光学清晰度)适用于视觉分析仪的任何试剂。

在另一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂在操作条件下可以PIOAL的约1至约50％(v/v)的浓度存在。例如，粘度剂/改性剂在操作条件下还可以约3至约30％(v/v)的浓度存在于PIOAL中。例如，在一个实施例中，甘油粘度剂/改性剂在操作条件下可以约5.0％至约8.0％(v/v)的最终浓度存在于PIOAL中。在另一个方面，甘油粘度剂/改性剂在操作条件下可以约6.5％(v/v)的最终浓度存在。在又一个实施例中，甘油粘度剂/改性剂在操作条件下为以约5％(v/v)的浓度存在的甘油。在又一个实施例中，甘油粘度剂/改性剂在操作条件下为以约30％(v/v)的浓度存在的甘油。

在另一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂在操作条件下可为以PIOAL的约1至约50％(v/v)的浓度存在的PVP。例如，粘度剂/改性剂PVP可以约1.0至约1.6％(w/v)的浓度存在于PIOAL中。在一个实施例中，PVP以约1.0％(w/v)的浓度存在于PIOAL中。

在另一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可为甘油与PVP的组合，其中甘油以PIOAL的约1至约10％(v/v)的浓度存在，PVP以约0.5至约2.5％(w/v)的浓度存在。例如，在一个实施例中，甘油可以约5％(v/v)的浓度与约1％(w/v)的PVP相结合存在于PIOAL中。

在一个实施例中，本发明的PIOAL可与本发明分析仪中的任一者一起使用，例如包括视觉分析仪的分析仪，和处理器。在一个实施例中，视觉分析仪包括具有对称流路的流通池，和自动对焦部件。在一个实施例中，分析仪可包括粒子计数器。

在一个方面，本发明提供了使用示例性PIOAL通过为在液体中包含粒子的样品提供视觉分析仪/分析仪使粒子成像的方法。视觉分析仪具有耦合到样品源和耦合到PIOAL源的流通池，其中流通池限定内部流路，所述流通池将用PIOAL包围的带形样品料流的流引导穿过流通池中的观察区。分析仪可包括本发明的高光学分辨率成像设备。

建立层流，其包括由至少两个PIOAL层包围或包围在至少两个PIOAL层之间的带形样品料流。带形样品料流和PIOAL可具有不同粘度。在一个实施例中，样品的粘度低于PIOAL的粘度。在另一个实施例中，PIOAL的粘度低于样品的粘度。

在一个实施例中，分析的粒子包括可包括球形粒子的球形粒子、非球形粒子中的至少一者，或者这两者都包括。在具体实施例中，粒子可包括红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片。在一个实施例中，粒子包括至少一种球形粒子。在一个实施例中，球形粒子为白血细胞或微生物。在一个实施例中，粒子包括至少一种非球形粒子。在一个实施例中，在分析仪的焦平面中增加在成像条件下的非球形粒子的图像投影。在一个实施例中，非球形粒子为红血细胞、上皮细胞、管型、白血细胞团块和/或出芽或菌丝酵母。

在一个方面，本发明提供了对粒子进行差异分类和/或亚分类的方法，包括：a)使样品中的粒子与粒子造影剂组合物接触；b)在视觉分析仪中用光照明所制备样品中的粒子；c)获得包围在PIOAL中的粒子的数字化图像；d)基于图像(例如，视觉)特征分析样品中的粒子；以及e)根据粒子的各类目和/或亚类目的特性视觉特征对粒子进行分类和/或亚分类。

在一个实施例中，图像信息包括粒子/细胞(包括球形粒子)的焦点内内容物。在一个实施例中，所述粒子、细胞或其部分可选自红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、颗粒物、细胞团块或者细胞碎片或组分中的至少一者。在一个实施例中，粒子的所述焦点内内容物包括差异染色的细胞核结构、差异染色的细胞质结构或差异染色的成分中的至少一者。

在一个实施例中，至少50％的非球形粒子在基本上平行(例如，平行)于流动方向的平面中配向，或具有在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中最大化的图像投影。在另一个方面，在流通池中使用本发明的PIOAL允许至少90％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，或具有在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中最大化的图像投影。在本发明的一个方面，至少92％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，或具有在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中最大化的图像投影。在另一个实施例中，至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，和/或具有在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中最大化的图像投影。在另一个实施例中，在基本上平行于流动方向的平面中配向或具有在成像条件下在高光学分辨率成像设备的焦平面中最大化的图像投影的非球形粒子的百分比可为所列百分比中的任何两个之间的任何范围，例如至少75-85％、75-80％、75％-92％、92％-95％或其他范围。

在一个实施例中，球形粒子具有基本上平行于流动方向更好地定位、重定位和/或更好地定位的细胞器、细胞核结构、细胞质结构或颗粒，并且至少50％的细胞核结构、细胞质结构或颗粒基本上平行于高光学分辨率成像设备的焦平面中的流动方向。在一个实施例中，球形粒子具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％或至少92％的细胞核结构、细胞质结构或颗粒基本上平行于高光学分辨率成像设备的焦平面中的流动方向，或在基本上平行(例如，平行)于流动方向的平面中配向。在另一个实施例中，在基本上平行于高光学分辨率成像设备的焦平面中的流动方向的球形粒子结构的百分比可在所列百分比中的任何两个之间的范围内。在一个实施例中，至少75％的非球形粒子内容物基本上平行于高光学分辨率成像设备的焦平面中的流动方向。在另一个方面，在流通池中使用本发明的PIOAL允许至少90％或92％的非球形粒子内容物基本上平行于高光学分辨率成像设备的焦平面中的流动方向。

在本发明的方法的一些实施例中，图像信息是粒子内容物的图像。在一些方面，粒子内容物包括粒子中差异染色的细胞核结构、差异染色的细胞质结构或差异染色的成分中的至少一者。对染色敏感的粒子的例子为WBC和上皮细胞。

在一个方面，本发明的方法提供令人惊奇的高质量的流动中细胞图像，其可用于获得自动化的基于图像的尿液有形成分分析，以及自动化鉴定形态异常，其可用于对受试者是否具有疾病、病症、异常或感染进行确定、诊断、预后、预测和或支持诊断，和/或监测受试者对治疗有响应还是无响应。

在一个方面，本发明涉及可用于对生物流体诸如尿液中的粒子染色的粒子造影剂组合物。本发明的组合物和方法可用在一个方面，例如，用于增强用于计数和表征粒子的粒子特征，所述粒子诸如红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片，以及用于白血细胞微分计数和白血细胞分类、亚分类、表征和分析。在本发明方法的一些方面，可使用内嵌在分析仪上的粒子造影剂组合物处理样品。在其他方面，可在引入视觉分析仪之前用粒子造影剂组合物来处理样品。

在一个方面，粒子造影剂组合物用于在其中一种或多种细胞类型保持基本上完好无损的条件下增强粒子和/或细胞的特征。在其他方面，粒子造影剂组合物用于处理细胞碎片或其他粒子。在一些方面，粒子造影剂组合物可用于对白血细胞和/或上皮细胞和/或细菌的细胞特征染色和/或增强。

本发明的各方面和实施例基于这样的令人惊奇且意料不到的发现：当用于执行基于图像的自动化尿样分析时，某些粒子造影剂组合物(包括例如染液/染料组合物和/或它们的组合)具有意料不到的性质和功效。在一个方面，本发明涉及粒子造影剂组合物，其包含结晶紫、番红O、伊红Y、新亚甲蓝和/或甲基绿中的至少一者。染液/染料可以一定量存在，所述量能有效地对有活力细胞和/或基本上完好无损的细胞染色并且产生用于基于图像的分类和亚分类的视觉区别。在某些实施例中，所关注的粒子可包括细胞粒子，其还包括细胞膜。在某些实施例中，可通过使用透化剂和/或固定剂改变或调节细胞膜的渗透性，以增强造影剂对这些细胞粒子中的细胞内内容物的可及性，从而增强在观察或成像时的细胞内容物的特征。在一个实施例中，透化剂包含季铵盐。

在某些方面，粒子造影剂组合物的各种组分以有效允许快速一步粒子染色工序的量存在。

在一些方面，提供了用于纯化粒子造影剂的方法。纯化用于本发明的组合物和方法中的多种染液/染料中的一种可减少在与样品接触时形成的沉淀物的水平，从而减少背景并且改善基于图像的尿样分析的结果，且降低了进一步检查图像或手动准备显微镜的需要。

在一个方面，使用粒子造影剂组合物与粒子接触，所述粒子可为细胞或其他粒子，以产生用于分类和亚分类粒子的视觉区别，例如，通过在细胞保持基本上完好无损的条件下增强细胞特征。示例性粒子造影剂组合物可用于本发明的方法中以使用非基于醇的溶剂体系中的造影剂获得有活力和/或基本上完好无损的细胞的染色图像。在另一个方面，粒子造影剂组合物还可以包括粒子透化剂以渗透细胞膜和/或细胞壁。在一些方面，令人惊奇地发现，包括透化剂的本发明的粒子造影剂组合物能够渗透细胞膜，所述细胞膜允许造影剂渗透到细胞的内部，同时细胞保持基本上完好无损。

在一些方面，粒子造影剂组合物可用于处理白血细胞、上皮细胞和/或细菌。例如，在一些方面，粒子造影剂组合物可用于处理白血细胞、上皮细胞、细菌中的至少一者，和/或用于分析细胞的形态。在另一个方面，本发明的方法还可以包括白血细胞分类和亚分类。

在本发明方法的一个方面，与粒子造影剂组合物接触和/或成像的细胞为例如细菌、寄生生物或滴虫。在本发明的一些方面，细胞为异常细胞，其可用于对病症、疾病、感染和/或综合征进行鉴定、预测、诊断、预后或支持诊断和/或监测受试者对治疗有响应还是无响应。示例性造影剂组合物及其使用和制造方法在共同待审的美国专利申请号_____中有所公开，所述专利的内容以引用方式并入本文中。

在另一个方面，本发明提供了试剂盒。在一个方面，试剂盒包括如本文所述的一个或多个PIOAL单元。在另一个方面，本发明涉及包括本发明的粒子造影剂组合物或其组分和/或浓缩物的试剂盒，所述组分或浓缩物可组合以形成本发明的粒子造影剂组合物，并且本文所述的组合物中的任一者可包括在试剂盒中。该试剂盒还可以包括根据本文所述的任何方法的粒子造影剂组合物的使用说明和/或试剂盒的任何其他组分的使用说明。该试剂盒还可以包括一种或多种缓冲剂和/或稀释剂。该试剂盒和或缓冲剂还可以包括pH调节剂、离子强度改性剂、表面活性剂、螯合剂、糖、糖醇、蛋白质稳定剂和/或抗微生物剂中的至少一者。在其他实施例中，该试剂盒还可以包括清洗溶液或冲洗溶液。该试剂盒还可以包括阳性和阴性对照的标准品、校准物或对照物。在一些实施例中，该标准品可以包括标准包含校准物和/或对照物。该试剂盒还可以包括用于转移试剂盒组分的一次性微量移液器、移液头或管。

在另一个方面，本发明涉及包括本发明的PIOAL和至少一种粒子造影剂的试剂盒。在一些方面，除了PIOAL之外，试剂盒还可包含两种造影剂。在一个实施例中，试剂盒包括至少一种透化剂和结晶紫、新甲基蓝、番红O、曙红Y和/或甲基绿中的至少一者，其量能有效地对有活力细胞和/或基本上完好无损的细胞进行染色以用于分类和亚分类。

试剂盒可用于本文所公开的方法中并且可用于鉴定尿液有形成分，诸如红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、细胞滴虫、团块和/或细胞碎片。试剂盒还可以包含用于诸如以下尿液有形成分的基于图像的鉴定的相关软件：红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和/或细胞碎片。

在另一个方面，本发明提供了使用示例性试剂盒执行差异粒子/细胞分类和亚分类的方法。

在一个方面，该方法涉及使用例如本发明的试剂盒对粒子进行分类、亚分类和/或计数的方法，其中方法包括：1)使包含粒子的样品与粒子造影剂组合物接触，2)将所得经处理样品引入视觉分析仪中；3)在视觉分析仪中用光照明经处理的样品粒子；4)获得包围在PIOAL中的经处理样品粒子的数字化图像；以及5)基于图像信息对粒子进行分类、亚分类和计数。在一个实施例中，方法包括自动内嵌式染色。在另一个实施例中，可在将样品与粒子造影剂组合物接触之前将其引入视觉分析仪中。

在另一个方面，本发明提供了制备本文所述的PIOAL液体组合物的方法。

在另一个方面，本发明提供了使用基于图像的粒子分类和亚分类对粒子/细胞进行差异分类和/或亚分类的方法，该方法包括：a)使粒子样品与本文所述的粒子造影剂组合物以一定量接触，所述量能有效地例如通过增强呈递用于成像时的样品中的粒子的细胞内内容物特征而产生用于对粒子分类和亚分类的视觉区别；b)获得粒子的图像及其内部细节；以及c)基于视觉区别执行基于图像的粒子分类和亚分类。在一些方面，粒子造影剂以一定量包含至少一种透化剂、至少一种固定剂以及结晶紫、新亚甲蓝、番红O、伊红Y和甲基绿中的至少一者，所述量能有效地产生用于粒子分类和亚分类的视觉区别。在一个实施例中，包含粒子的样品与粒子造影剂组合物的接触在高温下进行。

在一些方面，分类、亚分类和计数可以包括a)使包含粒子的样品与粒子造影剂组合物接触，b)将包含经处理粒子的带形样品料流包围在PIOAL中；c)在视觉分析仪中用光照明经处理的样品粒子；d)获得被包围在PIOAL中的经处理样品粒子的数字化图像或使用视觉分析仪使粒子成像；以及e)基于图像特性对粒子分类和/或亚分类及计数，其中粒子可为本文所公开的粒子中的任何一者。在一些方面，PIOAL可以包括本文所公开的粘度剂中的任何一者。分析仪可以为本文所公开的分析仪中的任何一者。

在另一个方面，本发明提供了用于分析仪中的PIOAL的流体组合物，该分析仪被配置成支持输运粒子和/或细胞中至少一者的样品的流动。该流体组合物可以包括包含粒子的样品流体，并且该样品流体可以具有给定粘度。另外，该流体组合物可以包括沿着界面表面邻接样品流体的PIOAL，PIOAL为基本上透明的，具有比样品流体的粘度更高或更低的粘度，使得粒子和细胞被配向。可以如本文所公开的来配向或定位粒子。

在一个实施例中，PIOAL和样品流体在样品流体与PIOAL之间的初始接触点处具有不同的平均线速度。在一个实施例中，将样品流体布置在两层PIOAL之间，从而限定两个所述界面表面，PIOAL在所述界面表面处邻接样品流体，所述界面表面间隔开一定距离。在一个实施例中，将界面层间隔开的距离小于或等于粒子和细胞中的所述至少一者的较宽尺度。在一个实施例中，将界面层间隔开的距离沿着PIOAL和样品流体的至少一者的流动方向变窄。在一个实施例中，将界面层间隔开的距离在流动方向上的过渡区中变窄到小于或等于所述粒子中的至少一者的较宽尺度的距离。在一个实施例中，在过渡区中增大所述粒子中的至少一者的较宽尺度以及细胞的细胞内细胞器或细胞器的部分的相对位置在平行于流动方向的方向上的配向。在一个实施例中，PIOAL的粘度与样品流体的粘度的差为约0.1厘泊至约10厘泊。粘度差使得能够生成有利/合适的剪切力以作用在带形样品料流上。

本发明在用于分析包含粒子的样品的合适分析仪中提供示例性粒子造影剂组合物及其使用方法。在一般的方面，当与存在于研究和/或医学实验室中的自动分析仪结合使用时，所述示例性组合物及其使用方法是有用的。示例性自动分析仪为被设计成以最少的人工辅助和高通过量检测多种生物样品(包括例如尿液)中的粒子和生物化学组分的不同参数的仪器。示例性自动化分析仪可包括例如自动化尿液显微分析仪和/或细胞计数器，其可执行例如全尿有形成分计数。在一些方面，所述分析仪可逐一地、分批地或连续地处理样品。

在一些方面，可在成像分析之前用本文所述的示例性粒子造影剂组合物来处理样品。在一些方面，用示例性粒子造影剂组合物进行的处理还可以在分析仪中在线执行或在将样品提供给分析仪之前执行。在一些实施例中，可以在粒子染色过程的部分或全部期间加热样品。还可以在加热之后冷却样品。

在一个方面，本发明提供了一种用于分析尿样的方法，该方法包括：a)将样品引入被配置成沿着流路引导样品流动的至少一个流通池中；b)与样品一起，将具有与样品粘度不同的粘度的PIOAL引入流通池中，其中PIOAL可有效地支持样品以平带流动；c)在分析仪(包括视觉分析仪)上使粒子成像；d)检测和计数具有一种或多种视觉区别的粒子，其中粒子包括红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片中的至少一者。

在另一个方面，本发明还提供了一种聚焦用于尿液分析的视觉分析仪的方法，该方法包括：a)使高光学分辨率成像设备聚焦于相对于流通池固定的自动对焦光栅，b)自动对焦光栅位于离尿液带形样品料流的预定的位移距离，c)高光学分辨率成像设备在与带形样品料流相交的光轴上具有物镜，d)高光学分辨率成像设备与流通池之间的相对距离可通过操作电机驱动器来改变，e)高光学分辨率成像设备被配置成分辨和采集光敏元件阵列上的数字化图像；以及使电机驱动器在位移距离内操作以使高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。在一个实施例中，方法还包括使带形样品料流形成为带形。在另一个实施例中，光轴基本上垂直于带形样品料流。在另一个实施例中，自动对焦光栅包括具有有限尺寸的形式并且位移距离是足够的使得当聚焦于带形样品料流时所述形式在数字化图像中基本上不可见。在又一个实施例中，方法包括：a)检测自动对焦再引发信号；b)重聚焦于自动对焦光栅；c)使电机驱动器在位移距离(自动对焦光栅与带形样品料流之间的预定距离)内操作；从而高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。在一个实施例中，自动对焦再引发信号包括温度的变化、聚焦质量的降低、时间或用户输入中的至少一者。

在一个实施例中，内部流路形成带形样品料流。在一个实施例中，样品源被配置成以可控的样品流速提供样品。在一个实施例中，PIOAL源被配置成以可控的PIOAL流速提供PIOAL。在一个实施例中，PIOAL具有预定粘度。在一个实施例中，PIOAL具有与样品不同的粘度。在一个实施例中，对PIOAL的粘度、样品材料的粘度、PIOAL的线速度和样品材料的线速度进行协调以在离自动对焦光栅的位移距离处保持带形样品料流。在一个实施例中，PIOAL在与带形样品料流初始接触时具有比带形样品料流更高的线速度。在一个实施例中，自动对焦光栅位于高光学分辨率成像设备的视野的边缘处。

在一个实施例中，所述至少一个所述数字处理器进一步被配置成对以下各项执行基于图像的分类和亚分类：红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片。在一个实施例中，所述至少一个所述数字处理器还被配置成：检测自动对焦再引发信号；其中自动对焦再引发信号由温度变化、聚焦质量的降低或用户输入中的至少一者而触发。在一个实施例中，分析仪使分析仪的内部流路变窄以产生厚度为2-4μm的带形样品料流厚度。在一个实施例中，内部流路产生宽度为500-3,000μm的带形样品料流。在一个实施例中，内部流路产生宽度为1500-2500μm的带形样品料流。在一个实施例中，分析仪被配置成其中样品中粒子的线速度使得粒子在图像中为基本上不模糊的。在一个实施例中，分析仪被配置成其中光源被进一步配置成照明带形样品料流和自动对焦光栅。

在一个方面，本发明提供了一种使用如本文所述的PIOAL使尿液中的粒子成像的方法，该方法包括：为包含悬浮于液体中的粒子的样品提供视觉分析仪；在所述分析仪中建立具有粘度更高和更低的层状截面的流，其中所述分析仪还包括：耦合到样品源和耦合到PIOAL源的流通池，其中流通池限定内部流路，流通池引导被PIOAL包围的样品流穿过流通池中的观察区；在与带形样品料流相交的光轴上具有物镜的高光学分辨率成像设备，并且高光学分辨率成像设备与流通池之间的相对距离可通过操作电机驱动器来改变，以便在光敏元件阵列上分辨和采集数字化图像；具有相对于流通池固定的位置的自动对焦光栅，自动对焦光栅位于离带形样品料流的平面的位移距离处；被配置成照明带形样品料流和自动对焦光栅的光源；以及耦合的至少一个数字处理器以操作电机驱动器并分析数字化图像，其中处理器被配置成测定自动对焦光栅的焦点位置并且使高光学分辨率成像设备和流通池在离聚焦位置的位移距离内相对地位移，从而使高光学分辨率成像设备聚焦于带形样品料流。在一个实施例中，粒子包括至少一种球形粒子。在一个实施例中，粒子包括至少一种非球形粒子。在一个实施例中，方法包括下述特征，其中非球形粒子在成像条件下的图像投影在高光学分辨率成像设备的焦平面中被增大。在一个实施例中，粒子包括红血球(RBC)、变形红血球、白血球(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、鳞状上皮细胞、移行上皮细胞、诱饵细胞、肾小管上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母、寄生生物、椭圆形脂肪体、脂肪滴、精子、黏液、滴虫、细胞团块和细胞碎片中的至少一者。

在一个实施例中，至少50％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，从而使非球形粒子在成像条件下的图像投影在高光学分辨率成像设备(HORID)的焦平面中增大或最大化。在一个实施例中，至少90％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，从而使非球形粒子在成像条件下的图像投影在HORID的焦平面中增大或最大化。在一个实施例中，至少92％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，从而使非球形粒子在成像条件下的图像投影在HORID的焦平面中增大或最大化。

在一个实施例中，配向至少50％的球形粒子，即，球形粒子的粒子内结构基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位。例如，球形细胞在分析仪的焦平面中具有至少50％的细胞器、细胞核结构、细胞质结构或颗粒。在一个实施例中，至少90％的球形粒子(诸如细胞)的粒子内结构基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位。在一个实施例中，至少92％的球形粒子(诸如细胞)的粒子内结构基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位。

在一个实施例中，粒子分类、亚分类和计数基于选自尺寸、形状、对称性和轮廓中的至少一者的视觉区别。在一个实施例中，成像为数字化成像。在一个实施例中，通过显微镜法执行成像。在一个实施例中，使用常规的显微镜法手动执行成像。在一个实施例中，成像为自动化的。在一个实施例中，粒子可以包括本文所公开的粒子中的任何一者。在一个实施例中，使用本文所公开实施例中的任何一者中的分析仪执行成像。

可使用计算机或具有硬件、软件和/或固件的其他处理器来执行本文描述的计算或操作中的每一个。各个方法步骤可通过模块执行，并且所述模块可包括被布置用于执行本文所述的方法步骤的多种多样的数字和/或模拟数据处理硬件和/或软件中的任何一种。所述模块任选地包括数据处理硬件，该数据处理硬件由于具有与其相关联的适当机器编程代码而适于执行这些步骤中的一个或多个，用于两个或更多个步骤(或两个或更多个步骤的部分)的模块被集成到单个处理器板中或采用多种多样的集成式和/或分布式处理架构中的任何一种被分成不同的处理器板。这些方法和系统通常将采用有形介质，该有形介质体现具有用于执行上述方法步骤的指令的机器可读代码。合适的有形介质可包括存储器(包括易失性存储器和/或非易失性存储器)、存储介质(诸如软盘、硬盘、磁带等上的磁记录；光学存储器诸如CD、CD-R/W、CD-ROM、DVD等上的磁记录；或任何其他数字或模拟存储介质)，等等。

本文参考或提及的所有专利、出版物、科技文献、网站以及其他文件和材料指示了本发明所属领域技术人员的水平，并且每个这种被引用的文件和材料均据此以引用方式并入，达到如其全文单独以引用方式并入或全文在本文示出的相同程度。申请人保留将来自所有这类专利、出版物、科学文献、网站、电子可用信息和其他被引用的材料或文件的任何以及所有材料和信息物理并入本说明书的权利。

本文所述的具体方法和组合物代表优选实施例，并且为示例性的，不旨在限制本发明的范围。在本领域技术人员考虑到本说明书的情况下将想到其他目标、方面和实施例，并且它们包括在由权利要求范围定义的本发明精神内。对本领域技术人员将显而易见的是，可在不脱离本发明范围和精神的前提下对本文所公开的发明进行不同的替代和修改。本文以示例性方式适当描述的发明可在不存在本文未具体公开为不可缺少的任何一种或多种要素、或者一种或多种限制的情况下实施。因此，例如，在本文的各种情况下，在本发明的实施例或例子中，术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”中的任何一者在本说明书中可以用其他两个术语之一替换。另外，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当宽泛解读并且没有限制。本文中示例性描述的方法和工艺可适当地以不同的步骤顺序被实施而不必限于本文或权利要求中指示的步骤顺序。另外，除非上下文另有明确表示，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/一种”和“该/所述”包括多个指代物。在任何情况下，本专利都不能被解释为受限于本文具体公开的具体例子或实施例或方法。在任何情况下，本专利都不能被解释为受限于专利与商标局的任何审查员或任何其他官员或雇员所作的任何陈述，除非这种陈述被申请人特别地并且无限制或保留地明确采纳于书面答复中。

所采用的术语和表达作为描述性而非限制性术语使用，不旨在表示在此类术语和表达的使用中将所示及所述特征的任何等同形式或其部分排除在外，而是应当认识到在受权利要求书保护的发明范围内可能存在各种修改。因此，应当理解，虽然本发明通过优选实施例和任选特征进行了具体公开，但是本领域的技术人员可对本文所公开的概念作出修改和变化，并且此类修改和变化被视为落在所附权利要求所限定的本发明范围内。

本文以宽泛性和一般性方式描述了本发明。落在该一般性公开范围内的每种更窄的种类和一般性亚组也构成本发明的一部分。这包括具有从类别中删除任何主题的前提条件或负面限制的发明一般性描述，而不论移除的材料在本文中是否具体列举。

其他实施例在以下权利要求书内。此外，如果本发明的特征或方面以马库什组的形式被描述，则本领域的技术人员将认识到，本发明还因此以马库什组的任何个体成员或成员亚组的形式被描述。

在附图中描绘或上文所述的部件的不同布置，以及未示出或描述的部件和步骤也是可行的。相似地，一些特征结构和子组合是可用的，且它们可以在与其他特征结构和子组合无关的情况下被采用。出于例示性和非限制性的目的描述了本发明的实施例，但可供选择的实施例对于本专利的读者而言将是显而易见的。在某些情况下，方法步骤或操作可按不同的顺序执行或实施，或者可对操作进行添加、删除或修改。应当理解，在本发明的某些方面，可用多个部件来替换单个部件，并且可用单个部件来替换多个部件，以提供元件或结构或者执行给定的一种或多种功能。除了这种替换将不能有效实践本发明的某些实施例的情况之外，这种替换被视为在本发明的范围之内。因此，本发明不限于上文所述或在附图中描绘的实施例，并且可以在不脱离以下权利要求的范围的前提下，创造各种实施例和进行各种修改。

Claims (21)

1.一种使用被配置用于几何流体聚焦的粒子分析系统使粒子成像的方法，所述粒子包含在体液样品内，所述方法包括：

沿着粒子分析仪的流通池的流路注射鞘液；

将所述体液样品以一定流速从样品流体注射管注射到所述流通池内的所述流动鞘液中以便提供具有邻近所述注射管的第一厚度的样品流体料流，所述流通池的所述流路具有流路尺寸的缩减段使得所述样品流体料流的厚度从初始厚度降低到邻近图像捕获位点的第二厚度；

通过使具有相对于所述流通池固定的位置的成像靶标成像来使图像捕获设备聚焦，所述成像靶标和样品流动料流限定沿着成像轴的预定位移距离；以及

使用所述图像捕获设备在所述流动料流内沿着所述流通池的所述图像捕获位点处的成像轴采集适用于粒子表征和计数的来自所述第一样品的第一多个粒子的聚焦图像，其中使用所述聚焦步骤和所述预定位移距离使所述图像捕获设备聚焦于所述样品流动料流，

其中所述流路尺寸的缩减段由具有近侧厚度的近侧流路部分和具有小于所述近侧厚度的远侧厚度的远侧流路部分限定，

其中所述样品流体注射管的下游端定位在所述近侧流路部分的远侧，

其中所述鞘液与所述血液流体样品之间的速度差，连同所述流路尺寸的缩减段和所述样品的所述流速能有效地在四秒或更短时间内将所述样品中的细胞从所述样品流体注射管递送到所述图像捕获位点。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液样品为尿液流体样品。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品流体在约1.5秒内从所述样品流体注射管的出口行进至所述图像捕获位点处的所述成像轴。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述流路尺寸的缩减段由所述流路的相对壁限定，所述相对壁沿着所述流路径向地向内成角度，总体上关于横向平面对称，所述横向平面平分所述样品流体料流第一和第二厚度。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述流通池被配置成在第一流动方向上在所述流路中接收来自鞘液源的所述鞘液，所述第一流动方向垂直于沿着所述成像位点处的所述流路的所述鞘液的第二流动方向。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述成像靶标固定在所述流通池上。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液样品具有样品粘度，并且所述鞘液具有与所述样品粘度不同的鞘液粘度。

8.一种粒子分析系统，所述粒子分析系统执行几何流体聚焦以便使体液样品中的粒子成像，所述系统包括：

流通池，其具有被配置用于传递鞘液流的流路；

样品流体注射系统，所述样品流体注射系统与所述流路流体连通并且被配置用于将所述样品注射到所述流通池内的所述流动鞘液中以便提供具有邻近所述注射管的第一厚度的样品流体料流，所述流通池的所述流路具有流路尺寸的缩减段使得所述样品流体料流的厚度从初始厚度降低到邻近图像捕获位点的第二厚度；

图像捕获设备，所述图像捕获设备与所述图像捕获位点配向以便在所述流通池的所述图像捕获位点处使来自所述样品流体的多个所述粒子成像；

聚焦机构，所述聚焦机构被配置成设定所述图像捕获设备相对于所述流通池的焦点状态；

成像靶标，所述成像靶标具有相对于所述流通池固定的位置，所述成像靶标和样品流动料流限定沿着所述成像轴的位移距离；

处理器；以及

聚焦模块，所述聚焦模块包括体现机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在所述处理器上被执行以便操作所述聚焦机构使用所述位移距离设定适于粒子表征和计数的所述图像捕获设备的所述焦点状态，

其中所述样品流体注射系统被配置成递送所述样品流体，使得所述样品流体具有约2至4秒范围内的穿过所述流通池的运输时间。

9.根据权利要求8所述的系统，其中所述体液样品为尿液流体样品。

10.根据权利要求8所述的系统，其中所述流路尺寸的缩减段由所述流路的相对壁限定，所述相对壁沿着所述流路径向地向内成角度，总体上关于横向平面对称，所述横向平面平分所述样品流体料流第一和第二厚度。

11.根据权利要求8所述的系统，其中所述流通池被配置成在第一流动方向上在所述流路中接收来自鞘液源的所述鞘液，所述第一流动方向垂直于沿着所述成像位点处的所述流路的所述鞘液的第二流动方向。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述成像靶标固定在所述流通池上。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述体液样品具有样品粘度，并且所述鞘液具有与所述样品粘度不同的鞘液粘度。

14.一种使用被配置用于几何流体聚焦的粒子分析系统使体液样品中的粒子成像的方法，所述粒子包含在具有样品流体粘度的所述流体样品中，所述方法包括：

将所述流体样品注射到流通池内以使得所述流体样品流体以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动，所述样品流动料流流过流路尺寸的缩减段并横越成像轴；

通过使具有相对于所述流通池固定的位置的成像靶标成像来使图像捕获设备聚焦；以及

使用所述图像捕获设备在所述流动料流内采集适用于粒子表征和计数的所述粒子的聚焦图像，其中使用位移距离使所述图像捕获设备聚焦于所述样品流动料流。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述体液样品为尿样。

16.一种粒子分析系统，所述粒子分析系统执行几何流体聚焦以便使体液样品中的粒子成像，所述系统包括：

流通池，所述流通池具有带有注射管的流路以及具有带有从中穿过的成像轴的成像窗口，所述流通池的所述流路具有流路尺寸的缩减段；

流体输入口，所述流体输入口与所述注射管流体连通，所述流体输入口被配置用于将所述流体样品注射到流通池内以使得所述流体样品以流动料流宽度大于流动料流厚度的样品流动料流流动；

图像捕获设备；

聚焦机构，所述聚焦机构被配置成设定所述图像捕获设备相对于所述流通池的焦点状态；

成像靶标，所述成像靶标具有相对于所述流通池固定的位置，所述成像靶标和所述样品流动料流限定沿着所述成像轴的位移距离；

处理器；以及

聚焦模块，所述聚焦模块包括体现机器可读代码的有形介质，所述机器可读代码在所述处理器上执行以便操作所述聚焦机构使用所述位移距离设定适于粒子表征和计数的所述图像捕获设备的所述焦点状态。

17.根据权利要求16所述的系统，其中所述体液样品为尿样。

18.一种使用被配置成用于组合式粘度和几何流体聚焦的粒子分析系统对多个粒子进行成像的方法，所述粒子包含在具有样品流体粘度的体液样品中，所述方法包括：

使鞘液沿着流通池的流路流动，所述鞘液具有与所述样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘液粘度；

将所述体液样品注射到所述流通池内的所述流动鞘液中以便提供被所述鞘液包围的样品流体料流；

使所述样品流体料流和所述鞘液穿过流路尺寸的缩减段流向成像位点，使得与所述粘度差相关的所述鞘液和所述样品流体料流之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，连同与所述流路尺寸的缩减段相关的所述鞘液和所述样品流体料流之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用有效地在所述成像位点在所述多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态，同时所述鞘液中的粘度剂保持所述样品流体料流中细胞的活力，使得所述细胞从所述样品流体料流延伸到所述流动鞘液中时所述细胞的结构和内容物完好无损；以及

在所述成像位点处对所述多个粒子成像。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述体液样品为尿样。

20.一种用于对具有样品流体粘度的体液样品中的多个粒子成像的系统，所述系统与具有鞘液粘度的鞘液一起使用，所述鞘液粘度与所述样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差，所述系统包括：

流通池，所述流通池具有流路和样品流体注射管，所述流路具有流路尺寸的缩减段；

鞘液输入口，所述鞘液输入口与所述流通池的所述流路流体连通以便沿着所述流通池的所述流路传递所述鞘液流；

体液样品输入口，所述体液样品输入口与所述流通池的所述注射管流体连通以便将所述体液样品流注射到所述流通池内的所述流动鞘液中，使得当所述鞘液和所述样品流体穿过所述流路尺寸的缩减段流向成像位点时，与所述粘度差相关的所述鞘液和所述样品流体之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，连同与所述流路尺寸的缩减段相关的所述鞘液和所述样品流体之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用在所述成像位点在所述多个粒子的至少一些中提供靶标成像状态，同时所述鞘液中的粘度剂保持所述样品流体料流中细胞的活力，使得所述细胞从所述样品流体料流延伸到所述流动鞘液中时所述细胞的结构和内容物完好无损；以及

在所述成像位点处对所述多个粒子成像的成像设备。

21.根据权利要求20所述的系统，其中所述体液样品为尿样。