CN104825464B - Cdca在制备治疗骨性关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单体化合物CDCA的新用途，具体涉及CDCA在制备治疗骨性关节炎药物中的应用和一种治疗骨性关节炎药物组合物。治疗骨性关节炎药物组合物可通过纯度98％以上的CDCA添加通用的药用辅助成分，制成针剂、片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、颗粒剂或软膏剂。药理实验结果显示，CDCA能明显改善骨关节炎部位炎细胞浸润、纤维组织增生及软骨表层破坏等情况，降低关节液中MMP‑1,MMP‑3，IL‑1β和PGE₂的水平，CDCA具有强效抗骨性关节炎的作用。因此，CDCA可用于制备治疗骨性关节炎的药物。本发明为骨性关节炎的治疗提供了新的药物来源。

Description

CDCA在制备治疗骨性关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是CDCA在制备治疗骨性关节炎药物中的应用

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种退行性疾病，为关节软骨发生退行性病变，主要表现为关节软骨代谢异常和关节骨结构损坏，严重时导致功能丧失。OA多见于中、老年人，起病过程大多缓慢，手、膝、髋及脊柱关节易受累，而掌指、腕及其他关节较少受累，病情通常随活动而加重或因休息而减轻。

骨关节炎OA已经成为50岁以上人群丧失劳动力的重要原因，仅次于缺血性心脏病。其中膝关节发生率最高，全世界约有3.6亿关节炎患者。随着中国老龄化的进程，OA患者逐年增多，给社会及患者家庭带来了极大的经济负担和精神压力。

目前对骨性关节炎的治疗主要以一些非特异性药物减轻临床症状为主，通过口服阿片类止痛药(对乙酰氨基酚、中枢镇痛药)及非甾体类抗炎药来缓解关节炎患者的症状，但并不能从根本上治愈骨性关节炎，同时该类药物在心血管系统及胃肠道系统的不良反应较多，限制了其应用的范围，因此亟待研发新型抗骨性关节炎药物。天然药物是我国重要的瑰宝，由于其来源广泛、成分丰富、不良反应少，开发成新药易于人体接受的特点，越来越受到国内外研究学者的关注。目前尝试从天然药物中寻找治疗骨性关节炎的新颖、有效的活性药用物质已经成为研究的热点。

Chenodeoxycholic acid(CDCA)，化学名称为：3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸，白色粉末，mp:140-142℃，易溶于甲醇，是动物胆汁中的主要有效成分，结构式如下。

CDCA作为一种已知单体化合物，尽管有确切的分子式和结构式，但其研究的活跃性不高，目前关于CDCA的药理作用报道非常少，其药理学研究报道主要为镇咳、平喘、促进胆汁分泌和溶解胆结石的作用，临床主要应用于治疗胆结石证的防治或肝胆疾病的防治方面。至今，CDCA作为单体化合物在制备治疗骨性关节炎药物中的应用还未见研究报道。

发明内容

本发明所要解决第一方面的技术问题是，提供CDCA的新用途，即CDCA在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。

为解决上述问题，本发明第一方面提供的技术方案是：CDCA在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。

本发明的优选技术方案中，所述药物包括惰性、无毒、药理学合适的赋形剂。

本发明第二方面提供一种治疗骨性关节炎的药物，该药物含有治疗有效剂量的CDCA活性成分。

优选地，所述药物还包括一种或多种惰性的、无毒的、药理学合适的赋形剂的药物。

优选地，所述赋形剂为载体、溶剂、乳化剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、稳定剂、着色剂、香料。

优选地，所述药物为片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、冻干物、颗粒剂、软膏剂或针剂。

上述技术方案中，所述治疗骨性关节炎药物组合物可通过纯度98％(质量百分数)以上的CDCA添加通用的药用辅助成分，制成片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、冻干物、颗粒剂、软膏剂或针剂。

根据本发明的药物组合物可以全身和/或局部地起作用，为此，可以以合适的方式，例如通过口、肠胃外、肺或者鼻的途径服用，根据本发明的组合物可以适合于这些给药途径的服用形式服用。

适于口服的是根据现有技术水平起作用和迅速地和/或以改进方式释放本发明的药物组合物的给药形式，并且包含以结晶和/或无定形的和/或溶解形式，例如片剂(无涂层或有涂层的片剂，其例如具有抵制胃液或者延迟溶解或不溶解的涂层，根据本发明的组合物释放)，在口中迅速破碎的片剂，或膜片，膜/冻干物，胶囊(例如硬或软胶囊)，糖衣片，颗粒，小丸，粉末，乳剂，悬浮液，烟雾剂或者溶液的根据本发明的药物组合物。

肠胃外投药可以避免吸收步骤(例如静脉内，动脉内，心内，脊柱内或者腰内或者关节内)或者同时包括吸收(例如肌肉内，皮下，皮内，经皮或者腹膜内)进行。适合于肠胃外投药法的合适的服用形式特别地是用于注射和注入以溶液，悬浮液，乳剂，冻干物或者无菌粉末形式的制剂。

适合于另一个给药途径的是例如用于吸入的药物形式，例如粉末吸入七或者雾化器，或者可以鼻服用的药物形式，录入滴剂，溶液或者喷雾剂。

根据本发明的药物组合物可以转化为所述的服用形式。这可以以本身已知的方式通过与惰性的、无毒的、药理学合适的赋形剂混合进行。这些赋形剂特别地包括载体(例如微晶纤维素、乳糖、甘露糖醇，淀粉)，溶剂(例如液体聚乙二醇)，乳化剂和分散剂或者湿润剂(例如十二烷基硫酸钠，油酸聚氧失水山梨糖醇酯，丙二醇)，粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)，合成和天然聚合物(例如白蛋白)，稳定剂(例如抗氧化剂，如抗坏血酸)，着色剂(例如无机颜料，如铁氧化物)和掩盖性香料和气味。

CDCA有效的剂量可以根据给药方式、病人的年龄体重、病情严重程度以及其它相关的因素而改变，口服给药时推荐剂量为500-1000mg/次，每日1-2次；肠胃外给药推荐剂量为15-45mg/次，每日1次。

本发明的技术方案是：通过切断前交叉韧带方法建立兔膝骨关节炎模型，首次选用CDCA作为治疗药物，通过关节腔注射的方式给药，研究其对兔膝骨关节炎模型的炎症细胞因子等指标以及关节病理学改变的影响，观察CDCA对兔膝骨关节炎动物模型的防治作用，从而为CDCA防治骨性关节炎提供实验依据。

本发明的优点在于：(1)本发明的优点在于：(1)提供CDCA具有高效抗骨性关节炎的用途：能明显改善骨关节炎部位炎细胞浸润、纤维组织增生及软骨表层破坏等情况，降低关节液中MMP-1，MMP-3，IL-1β和PGE₂的水平，显示CDCA具有强效抗骨性关节炎的作用。

(2)本发明提供的CDCA具有高效抗骨性关节炎的用途，具有潜在的重大经济效应。CDCA或其药学上可接受的载体制备的制剂具有治疗骨性关节炎药物的应用前景，按照国家创新药物审批办法开发研制，有望成为具有我国独立自主知识产权的国家1类高效低毒治疗骨性关节炎新药，产业化前景明确。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1A为各组兔子膝关节标本的大体图片；图1B为CDCA对兔子膝关节大体评分的影响；

图2A为各组兔子膝关节部位关节软骨病理组织改变图片；图2B为CDCA对兔子膝关节部位关节软骨病理评分的影响；

图3A为各组兔子膝关节部位滑膜病理组织改变图片；图3B为CDCA对兔子膝关节部位滑膜病理评分的影响；

图4为各组兔子膝关节的micro-CT图片；

图5A为CDCA对兔子关节液中MMP-1水平的影响对照图，图5B为CDCA对兔子关节液中MMP-3水平的影响对照图，图5C为CDCA对兔子关节液中IL-1β水平的影响对照图，图5D为CDCA对兔子关节液中PGE₂水平的影响对照图；

其中，Sham为假手术组；Model为模型组。CDCA为Chenodeoxycholic acid；CDCA-10为10mg/kg治疗组；CDCA-50为50mg/kg治疗组；Celecoxib-15为阳性对照药Celecoxib15mg/kg对照组。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所详细描述的本发明。

一、材料

1.实验动物

新西兰大白兔，40只，雄性，体重3.0～3.5kg，清洁级，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号(SCXK(沪)2012-0002)。试验期间饲养室温度20±3.2℃，相对湿度为65～75％，自由摄食和饮水。

2、药品和试剂：

2.1药品

Chenodeoxycholic acid(CDCA，含量为≥98％)和塞来昔布(Celecoxib，含量为≥98％)均由Sigma-Aldrich(Louis,MO,USA)公司提供。4℃冰箱保存，现用现配。0.9％氯化钠溶液，中国大冢制药有限公司生产，国药准字：H12020025；青霉素针剂(80万单位)，华北制药股份有限公司生产，国药准字：H13020657；水合氯醛溶液，苏州大学附属第一医院生产，苏药制字：H04001504。

2.2试剂

MMP-1，MMP-3和IL-1β的ELISA试剂盒(TSZ Scientific LLC,Framingham,MA,USA)公司生产；PGE₂的ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)公司生产。

2.3仪器

电子天平秤，EL104型，上海越平科学仪器有限公司生产；3K15型台式冷冻离心机，德国Sigma公司生产；Sunrise酶标仪，由瑞士Tecan公司生产；BX41光学显微镜(日本OLYMPUS公司)。

二、实验方法

1、造模及给药

取40只雄性的健康新西兰大白兔，体重3.0～3.5kg，随机分为5组，每组8只，分为假手术组、模型组、CDCA低(10mg/kg)、CDCA高(50mg/kg)治疗药物组和阳性对照药Celecoxib(15mg/kg)组。所有动物造模前一天右膝备皮，术前称重，用10％水合氯醛按300mg/kg经腹腔注射麻醉，将动物仰卧位固定于手术台上，消毒铺单。假手术组仅做皮肤切口，不切断前交叉韧带。模型组和各治疗组的动物均采用前交叉韧带切断法诱发骨性关节炎。具体操作步骤如下，取髌骨内侧切口，显露关节腔，切断前交叉韧带，并切除断端1～2mm,防止术后粘连，术中注意保护关节软骨，逐层缝合切口，术后3d肌肉注射青霉素，40万U/d。各组实验动物四周后观察切口愈合良好后，再进行关节腔注射给药，每次注射药物体积为0.5mL，每周1次，连续进行5周。治疗药物CDCA组，关节腔注射给予低(10mg/kg)、高(50mg/kg)两种剂量；阳性药物组，关节腔注射给予Celecoxib(15mg/kg)；模型组仅给予空白溶媒0.5ml；假手术组不予任何处理正常饲养。所有各组动物于末次给药后7天采用空气栓塞法处死。

2、大体观察

处死动物取材时，观察右膝关节的关节面是否光泽，有无软化灶、糜烂、溃疡和缺损，有无软骨剥脱，软骨下骨质暴露，关节局部有无骨赘形成。并用大体评分规则进行评估：0分：关节面光滑，色泽正常；1分：关节面粗糙，有小的裂隙，色泽灰暗；2分：关节面糜烂，软骨缺损达软骨表层或中层；3分：关节面溃疡形成，缺损达软骨深层；4分：软骨剥脱，软骨下骨质暴露。

3、组织病理学观察

采用空气栓塞法处死各组实验动物后，矢状位切取右膝关节，股骨内侧骼负重部分标木，厚约0.5cm，包括关节软骨和软骨下骨，置于10％中性甲醛溶液中固定24h,10％EDTA脱钙，酒精脱水，透明、浸蜡，5μm层厚连续切片，烤片1h，脱蜡、水化，HE染色，脱水、透明，中性塑胶封片。光学显微镜下观察关节软骨结构是否清晰，软骨细胞排列是否整齐，有无软骨细胞增生、缺失，有无软骨裂隙、溃疡及缺损、软骨层纤维成分是否增多等病理改变情况。观察滑膜组织有无肥厚及增生，有无血管侵入，有无炎细胞浸润等情况。根据骨关节病组织分类方法中关节软骨与滑膜的病变计分标准，对各动物膝关节标本的病变程度进行计分和组间比较。

4、显微CT(micro-CT)的检测

实验结束后，将各组试验兔子右膝关节标本平置于micro-CT系统的检查槽中，捆绑固定防止标本移动。沿标本的长轴方向进行扫描，扫描完成后用NRecon软件进行三维重建，然后用CT分析软件对图像进一步处理，对各动物膝关节标本骨结构的破坏程度进行检测。

5、关节液中MMP-1，MMP-3，IL-1β和PGE₂的水平测定

实验结束后，取各组动物右膝关节，脱毛、消毒后用装有1ml生理盐水注射器行关节腔穿刺，将lml生理盐水从髌上囊部位注入关节腔，反复冲洗后抽出，然后立即将关节冲洗液标本在4℃下离心(3500r/min)10min，吸取上清，做好标记后-70℃保存备用，以测定兔子关节液中MMP-1，MMP-3，IL-1β和PGE₂的水平，所有检测实验验均按照ELISA试剂盒使用说明书操作。

6、统计方法

采用SPSS 16.0统计软件处理系统，实验数据以表示，统计分析采用Mann–Whitney U检验，P<0.05有统计学意义。

三、实施结果

1CDCA对兔子大体观察的影响

假手术组显示：软骨面完整光滑，色泽正常，无关节积液及滑膜增生。模型组显示：软骨剥脱，软骨下骨暴露，股骨外髁有明显骨赘及溃疡生成(图1A)。CDCA(10mg/kg、50mg/kg)和Celecoxib(15mg/kg)治疗组中显示：关节软骨表面欠光滑，有散在溃疡点，软骨边缘无骨赘形成，未见裂纹及软化灶，大体破坏程度明显降低，其中CDCA(50mg/kg)和Celecoxib(15mg/kg)治疗组与模型组比较，治疗效果明显(P<0.001)。各组的大体评分见图1B。

2CDCA对兔子膝关节病理观察的影响

关节软骨HE染色结果：假手术组中显示：动物软骨表层完整，软骨结构清晰可辨，细胞排列整齐，潮线结构完整；模型组中显示：软骨表层剥脱，细胞明显增生，排列严重紊乱，潮线结构破坏(图2A)。Celecoxib(15mg/kg)治疗组显示：软骨病变程度较轻,表面光滑，但仍可见软骨表层细胞的染色加深及细胞排列紊乱；CDCA(10mg/kg、50mg/kg)治疗组显示：软骨表层轻微破损，可见一定程度的表层细胞增生，部分细胞的染色加深等软骨病变，但与模型组比较有明显的改善。各组动物关节软骨的病理评分见图2B。

滑膜HE染色结果：假手术组中显示：滑膜织无肥厚及增生，无血管侵入，无炎细胞浸润；模型组中显示：滑膜内衬细胞增生，排列杂乱，毛细血管及纤维组织增生，大量炎症细胞浸润(图3A)。CDCA(10mg/kg、50mg/kg)治疗组中显示：滑膜细胞数量较模型组减少，轻度纤维组织增生，少量炎证细胞浸润。其中CDCA(50mg/kg)和Celecoxib(15mg/kg)治疗组与模型组比较，治疗效果明显(P<0.001)。各组动物滑膜的病理评分见图3B。

3CDCA治疗对兔子膝关节micro-CT检测的影响

对兔子膝关节进行micro-CT检查，结果显示：模型组中关节部位骨结构破坏严重，骨赘形成增多；假手术组中骨关节表面光滑，未见骨结构破坏和骨赘形成；CDCA(50mg/kg)和Celecoxib(15mg/kg)治疗组中兔膝关节表面趋于光滑，未见明显的骨赘形成，骨结构破坏程度明显降低，见图4。

4CDCA对关节液中MMP-1，MMP-3，IL-1β和PGE₂水平的影响

取兔子的关节液，采用ELISA检测方法，对关节液中MMP-1，MMP-3，IL-1β和PGE₂的水平进行测定。检测结果分析显示：模型组动物关节液中MMP-1，MMP-3，IL-1β和PGE₂的含量明显高于假手术组(P<0.001)；CDCA(10mg/kg、50mg/kg)和Celecoxib(15mg/kg)治疗组与模型组比较，均能明显降低关节液中MMP-1，MMP-3，IL-1β和PGE₂的水平，其中CDCA(50mg/kg)和Celecoxib(15mg/kg)治疗组与模型组比较，抑制作用显著(P<0.001)，见图5A-5D。

实施结果小结

1.兔子关节腔注射CDCA，每周1次，连续进行5周治疗后，CDCA(50mg/kg)可显著的降低实验动物的大体破坏程度，膝关节无明显骨赘形成，未见裂纹及软化灶。

2.病理组织学观察结果显示，CDCA治疗后兔子膝关节部位炎细胞浸润、纤维组织增生及软骨表层破坏等情况均明显降低。

3.micro-CT检查显示，兔子关节腔注射CDCA，每周1次，连续进行5周治疗后，CDCA(50mg/kg)治疗组的兔膝关节表面趋于光滑，未见明显的骨赘形成，骨结构破坏程度明显降低。

4.CDCA治疗后兔子关节液中MMP-1，MMP-3，IL-1β和PGE₂的水平明显降低。

综上所述，CDCA可以降低兔子关节液中MMP-1，MMP-3，IL-1β和PGE₂水平，减轻关节软骨的降解与损害，对骨性关节炎具有一定的防治作用。

本发明通过下面的实验例进一步说明。

制备药剂的实施例1：

取CDCA单体化合物20g，加入1,2-丙二醇100m1，充分溶解，加灭菌注射用水稀释至1000m1，混匀后分装到1000支安瓶中，每支lml，含CDCA20mg。

制备药剂的实施例2：

取CDCA单体化合物20g，加入药用淀粉280g，二者充分混合，制成1000粒胶囊，每粒重0.3g，含CDCA 20mg。

制备药剂的实施例3：

取CDCA单体化合物100g，加入药用淀粉200g，二者充分混合，制成1000片，每片重0.3g，含CDCA 100mg。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (4)

1.CDCA在制备治疗骨性关节炎药物中的用途，该CDCA的结构式是：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物包含惰性、无毒、药理学合适的赋形剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、冻干物、颗粒剂、软膏剂或针剂。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述赋形剂为载体、溶剂、乳化剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、稳定剂、着色剂、香料。